UNIVERSIDAD AUTNOMA DE GUERREROUNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICASMAESTRA EN CIENCIAS BIOMDICAS

MICROBIOLOGA MOLECULAR

REPORTE DE PRCTICA DE LABORATORIO

PRESENTAN ELENA SALAZAR HERNNDEZOLIVER VILLALVA NJERA

CATEDRTICO:M.C. ROMINA BELEN RADILLA VZQUEZ

Chilpancingo, Guerrero. Mayo de 2015

PRCTICA DE PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

1. INTRODUCCINEl uso indiscriminado de antibiticos est llevando a que las bacterias incrementen su posibilidad de adquirir o evolucionar sus mecanismos de resistencia a stos, siendo un gran problema al ir en aumento por dificultar el tratamiento y erradicacin de enfermedades infecciosas (Gonzlez, P., 2002). Varioss mtodos de laboratorio pueden ser usados para determinar in vitro la susceptibilidad de bacterias ante agentes microbianos. Un mtodo recomendado por el Instituto de Estndares Clnicos y de Laboratorio (CLSI) est basado en el mtodo originalmente descrito por Bauer et al., (mtodo de Kirby-Bauer). Este es el mtodo de difusin en disco en que se han desarrollado estndares para su interpretacin y est apoyado por datos clnicos y de laboratorio. El principio del mtodo involucra el uso de una cantidad constante de antimicrobianos en un reservorio (discos de papel) aplicado sobre la superficie del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo en cuestin. Se formar as por difusin, un gradiente de concentracin del antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo estar indicada por el tamao de la zona de inhibicin del crecimiento alrededor del reservorio. El dimetro obtenido depender no solo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino tambin del espesor de la capa del agar, su pH y composicin, de la capacidad de difusin de la droga en ese medio, la temperatura, la velocidad de duplicacin bacteriana, y el tamao y fase de crecimiento del inculo. El medio de eleccin para la prueba es el agar Mueller-Hinton por las siguientes razones: Reproducibilidad aceptable lote a lote para ensayos de susceptibilidad. Es bajo en inhibidores de sulfonamida, trimetoprim, y tetraciclina. Crecimiento satisfactorio para la mayora de los patgenos no fastidiosos. Slo las formulaciones del medio Mueller-Hinton que han sido controladas con la cepa de referencia de acuerdo al CLSI pueden ser usados (Prat, n.d.).

Los macrlidos, junto con las lincosamidas y las estreptograminas B (MLSB) son tres grupos de antimicrobianos de estructuras qumicas diferentes pero con mecanismos de accin similares. La resistencia a la eritromicina y lincosamidas es codificado por el gen erm que induce la metilacin de la subunidad 23S ribosomal lo que conlleva a la modificacin del sitio de unin de estos antibiticos. Estas cepas se han dividido en dos clases fenotpicas mayores: a) Cepas con resistencia constitutiva, las cuales pueden crecer en presencia de altas concentraciones de antimicrobianos MLS sin requerir induccin previa (MLSc) y b) Cepas con resistencia inducible, cuya resistencia a los antimicrobianos MLS pude ser inducida por concentraciones subinhibitorias (0,01 a 0,1 ug/ml) de eritromicina (MLSi).

La resistencia inducible para MLSB no se detecta usando los test de susceptibilidad a antimicrobianos estndar. Para identificar in vitro las cepas de Staphylococcus que poseen una resistencia inducible a la clindamicina, existe un mtodo de laboratorio conocido como test de difusin de doble disco (D test).

Los fenotipos que se observan mediante difusin con discos son: 1) resistencia a la eritromicina y a la clindamicina; 2) resistencia a la eritromicina y sensibilidad a la clindamicina pero con un achatamiento del halo de la clindamicina en la proximidad de la eritromicina (Dtest positivo); 3) resistencia a la eritromicina y sensibilidad a la clindamicina sin achatamiento del halo (D-test negativo). En el primer caso se trata de resistencia constitutiva a la eritromicina y a la clindamicina (fenotipo cMLSB), en el segundo de resistencia constitutiva de expresin inducible (fenotipo iMLSB) y en el tercero de resistencia a la eritromicina mediada por una bomba de expulsin activa (fenotipo MSB). Se puede identificar tambin un cuarto fenotipo de resistencia a la clindamicina y sensibilidad a la eritromicina debido a la accin de enzimas que inactivan las lincosamidas (codificadas por los genes lnu) aunque es poco frecuente (Daza Prez, 1998; Montoya et al., 2009).

Los antibiticos betalactmicos comparten un anillo -lactmico central y su principal modo de accin es la inhibicin de sntesis de la pared celular. Anillos adicionales a la estructura o grupos agregados al anillo -lactmico determina si el agente es penicilina, cefem, carbapenem, o monobactam.

La resistencia a los betalactmicos, se puede producir por varios mecanismos, pero el mecanismo ms importante en las enterobacterias es la produccin de betalactamasas. Muchos miembros de la familia Enterobacteriaceae poseen betalactamasas cromosmicas naturales, probablemente derivadas de las propias protenas fijadoras de penicilina (PBP, del ingls penicillinbinding protein), con las que tienen analoga secuencial y estructural. Los genes que codifican estas enzimas se pueden encontrar en el cromosoma o en elementos genticos mviles, y su produccin puede ser constitutiva o inducible. Las betalactamasas de espectro extendido (BLEE) se definen como enzimas capaces de hidrolizar las penicilinas, todas las cefalosporinas (menos las cefamicinas) y las monobactamas, pero no las carbapenemas. Se caracterizan por ser inhibidas por el cido clavulnico, sulbactam y tazobactam.

Las pruebas para betalactamasas determinan si los agentes betalactmicos de espectro limitado (ej. Penicilina y ampicilina) pueden ser utilizadas para tratar unas pocas especies claves de bacterias. Una de las pruebas se basa en la deteccin visual de los productos finales de la hidrolisis de betalactmicos, demostrada con cambio de color. Esta prueba es realizada con un disco de nitrocefina el cual utiliza un sustrato betalactmico cromognico (una cefalosporina) que cambia de color cuando la amida de su anillo es hidrolizada por accin de una betalactamasa

2. Material y mtodos

2.1 Prueba de difusin en disco1. A partir de un cultivo fresco tomar de 4 a 5 colonias aisladas del mismo tipo morfolgico y realizar una suspensin ajustada al 0.5 de Mc Farland, agitar la suspensin para homogenizar.2. Humedecer con la suspensin un hisopo estril, quitar el exceso de caldo presionando y girando el hisopo sobre la pared interna del tubo, por arriba del nivel de la suspensin.3. Con el hisopo estriar en tres direcciones sobre la totalidad de la superficie delagar, asegurando que el inculo sea distribuido homogneamente, hacer el ltimo barrido del hisopo sobre el borde de la caja. 4. Cuando el inculo ha secado (de 3 a 5 minutos) colocar los discos con pinzas estriles, presionar ligeramente para asegurar el contacto con la superficie. Deber prevenirse una sobreposicin de las zonas de inhibicin con la distribucin adecuada de los discos y con un lmite menor de 15 mm de los bordes de la placa.5. Despus de 15 minutos de haber colocado los discos, invertir las cajas de Petri e incubar a 37C durante 16 a 18 horas.6. La medicin de los halos de inhibicin se hace con compases de calibracin, vernier, regla o plantilla diseada para ese propsito, por el fondo de la caja, sobre un fondo negro no reflejante y se ilumina con luz reflejante.Interpretacin de resultados: Las interpretaciones de las medidas de los dimetros de las zonas de inhibicin son informadas y definidas como: Susceptibles (S)Implica que una infeccin debida a una cepa puede ser tratada apropiadamente con dosis del antimicrobiano recomendado para ese tipo de infeccin y microorganismo aislado. Intermedia (I)El trmino intermedio puede aplicarse clnicamente a sitios corporales donde las drogas se concentran fisiolgicamente o cuando se pueden utilizar una alta dosificacin de la droga. Resistente (R)Estas cepas no son inhibidas por las concentraciones sistmicas habitualmente alcanzadas cuando se administran en dosis normales y su eficacia clnica no ha resultado fiable en los estudios de tratamiento.

A) Las cepas Gram (+) utilizadas para esta parte fueron:

Cepa control: ATCC 25925. Staphylococcus aureus. Cepa problema: M-026. Staphylococcus coagulasa +

B) Las cepas Gram (-) utilizadas para esta parte fueron:

Cepa control: ATCC 25922. Escherichia coli. Cepa problema M-031. Escherichia coli2.2 Deteccin de -lactamasasPrueba de nitrocefinaColocar una gota de nitrocefina sobre un halo de inhibicin correspondiente a un antibitico -lactmico, esperar 30 segundos para observar un cambio de coloracin.

Interpretacin:Positivo: Coloracin rojizaNegativo: No hay cambio de coloracin

Prueba de doble disco combinado1. A partir de un cultivo fresco hacer una suspensin ajustada al 0.5 de Mc Farland (Se puede ajustar con el espectrofotmetro a una longitud de onda de 625 nm con una densidad de 0.08-0.10 A.2. Sumergir un hisopo estril dentro de la suspensin, rotar y presionar firmemente contra la pared interna del tubo sobre el nivel del lquido para eliminar el exceso de inoculo.3. Posteriormente inocular la superficie de una placa de agar Mueller-Hinton por rayado con un hisopo, repitiendo de 3-4 veces con la finalidad de una distribucin homognea del inculo. Por ultimo deslizar el hisopo sobre los bordes de la placa.4. Colocar discos con CAZ (30g) y CTX (30g) y discos de los mismos antibiticos con cido clavulanico (10g).5. Colocar los discos con una distancia mayor de 30 mm uno de cada otro, presionando ligeramente para asegurar el contacto con la superficie, despus de 15 minutos invertir las cajas de Petri e incubar a 35C durante 16-18 horas.

Las cepas utilizadas para ambas partes fuern: Cepa control: Klebsiella pneumoniae. Cepa problema: M-031. Escherichia coli.2.3 Prueba de Clindamicina 1. Hacer una suspensin al 0.5 Mc Farland, segn lo descrito en los pasos anteriores. Utilizando las cepas correspondientes para esta prueba.2. Posteriormente colocar un disco de eritromicina (15 g) y un disco de clindamicina (2 g), separados por una distancia de 15 mm.3. Incubar por 24 horas a 35C.Las cepas utilizadas para esta parte fueron: Cepa control: 1031. Staphylococcus epidermidis. Cepa problema: M-022. Staphylococcus coagulasa -

3. Resultados3.1 Prueba de difusin en discoA) Para la valoracin del antibiograma se utiliz la cepa control ATCC 25925. En la tabla 1 se indican los dimetros de los halos de inhibicin obtenidos y la interpretacin de los mismos de acuerdo al CLSI (Clinical and Laboratory standards Institute).

Tabla 1. Medidas de los halos obtenidos de la prueba de sensibilidad e interpretacin.AntibiticoHalo de controlHalo cepa problemaResultado

Penicilina35 (26-37 mm)40 mmSensible

Ciprofloxacino27 (22-30 mm)26 mmSensible

Eritromicina25 (22-30 mm)26 mmSensible

Trimetroprim-sulfametoxazol26 (24-32 mm)25 mmSensible

Oxacilina12* (18-24 mm)15 mmSensible

B)

Para la valoracin del antibiograma se utiliz la cepa control ATCC 25922. En la tabla 2 se indican los dimetros de los halos de inhibicin obtenidos y la interpretacin de los mismos de acuerdo al CLSI (Clinical and Laboratory standards Institute).

Tabla 2. Medidas de los halos obtenidos de la prueba de sensibilidad e interpretacin.AntibiticoHalo de controlHalo cepa problemaResultado

Trimetoprim-Sulfametoxazol29 (23-29 mm)5 mmResistente

Cefuroxima21 (23-27 mm)21 mmSensible

Amoxicilina-cido clavulanico22 (18-24 mm)5 mmResistente

cido nalidxico21 (22-28 mm)11 mmResistente

Ampicilina17 (16-22 mm)5 mmResistente

3.2 Deteccin de -lactamasas

Prueba de nitrocefina Las cepas utilizadas para la prueba de deteccin de -lactamasas por el mtodo la cefalosporinas cromognica (Nitrocefna) fueron: Una cepa de Klebsiella pneumoniae como control positivo y una cepa problema que corresponda a Escherichia coli. Los resultados obtenidos se mencionan en la tabla 3.Tabla 3. Resultados de la prueba de nitrocefina.CepaColoracinResultado

Klebsiella pneumoniaeRojizaPositivo

M-031. Escherichia coliRojizaPositivo

Prueba de doble disco combinadoLas cepas utilizadas para la deteccin de la produccin de - lactamasas de amplio espectro (BLEEs) fueron las mismas que para la prueba de nitrocefina, los resultados obtenidos para ambas pruebas pueden apreciarse en las imgenes siguientes. 12312

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Izquierda correspondiente a la cepa control: Los discos de cefotaxima y ceftazidima corresponden a los nmeros 1 y 2 respectivamente, los discos de cefotaxima y ceftazidima ambos ms cido clavulanico corresponden a los nmeros 3 y 4 respectivamente.Derecha correspondiente a la cepa problema: Los discos de cefotaxima y ceftazidima corresponden a los nmeros 1 y 2 respectivamente, los discos ce cefotaxima y ceftazidima ambos ms cido clavulanico corresponden a los nmeros 3 y 4 respectivamente.Las flechas indican el resultado de la prueba de nitrocefina en este caso positiva en ambos casos por el cambio de coloracin.

3.3 Prueba de Clindamicina La cepa control utilizada para la prueba de clindamicina inducible fue la 1031, para contrastar contra la cepa problema (M-022). La prueba result clindamicina sensible (no inducible por eritromicina) para la cepa M-022, al no deformarse el halo de inhibicin, es decir, la forma caracterstica D.

4. Discusin

Difusin en disco. Para su realizacin, se utilizaron cinco diferentes antibiticos que se evaluaron dos cepas control (ATCC 25925; de Staphylococcus aureus y ATCC 25922; de Escherichia coli) cada una con sus respectivos antibiticos. Sin embargo, en oxacilina para la primera cepa control se determin que no entr dentro del rango establecido por el CLSI para el dimetro del halo de inhibicin. Esto se debi a que los discos del antibitico ya estaban expirados. A pesar de ello la cepa problema si fue sensible a oxacilina (A). Pero esto remarca la importancia de respetar los tiempos de viabilidad de los antibiticos para su uso, ya que stos suelen perder su efectividad. Para la segunda cepa control los antibiticos utilizados se difundieron correctamente en el agar por los que no se observ alteracin alguna asociada a la viabilidad de los antibiticos por su tiempo y condicin de almacenamiento. La cepa problema resulto resistente a la mayora de los antibiticos, no as a la Cefuroxima a la cual resulto sensible. Los resultados de sensibilidad a los antibiticos son muy distintos a pesar de que ambas cepas son del mismo gnero y especie esto podra explicarse si a partir de que muestra fueron aisladas cada una (B).La determinacin de susceptibilidad por el mtodo de difusin por agar es una tcnica que nos permite saber la resistencia a un mayor nmero de antibiticos en un solo paso, sin gastar mucho material y adems de que es fcilmente reproducible, los puntos de corte ya estn establecidos por consenso lo permite confiar en los resultados obtenidos. Pero presenta algunas limitantes dado que a travs de esta tcnica no se puede predecir el mecanismo de resistencia que confiere el fenotipo observado en las placas, por lo que es necesario apoyarse de otro tipo de tcnicas para poder interpretar de mejor manera el antibiograma.Prueba de nitrocefina. Se sabe que existen diversos mecanismos de resistencia para un solo grupo de antibticos, por lo que puede ser importante determinar este mecanismo para determinar qu mecanismos de resistencia posee la bacteria y evitar utilizar algn antibitico de manera errnea. Por ejemplo, en las betalactamasas pueden ser tres mecanismos, tales como modificacin del blanco de accin, produccin de enzimas modificadoras o sistemas de eflujo. Para la deteccin de betalactamasas se pueden utilizar discos impregnados con una cefalosporina cromognica (nitrocefin) que al hidrolizarse en presencia de la betalactamasa experimenta un cambio en su estructura, lo que resulta en un producto coloreado (naranja-rojo). Una prueba de betalactamasa positiva indica, asimismo, resistencia a todas las penicilinas (Ardanuy, C., n.d.). La prueba de nitrocefina se aplic a la cepa M-027, presentando un cambio de coloracin a la aplicacin del reactivo. Esto indica que es una bacteria productora de betalactamasas, por lo que sta ser resistente a cualquier antibitico de los betalactmicos.Prueba de doble disco combinado. Esta prueba nos permite determinar si algunas cepas son productoras de betalactamasas de amplio espectro (BLEEs). Estas han sido recientemente descritas como enzimas que aparecen por mutacin en los genes TEM-1, TEM-2, y SHV-1.BLEEs pueden conferir resistencia a cefotaxime, ceftazidine, aztreonam, penicilinas de espectro expandido a cepas aisladas en clnica de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, y unos pocos otros gneros de la familia Enterobacteriaceae que usualmente son susceptibles para betalactmicos de espectro extendido. Se han reportado cepas de Klebsiella spp aisladas en clnica y E. coli con zonas de inhibicin pequeas alrededor de cefpodoxime, ceftazidime, aztreonam, cefotaxime, o ceftriaxone pueden ser sospechosas de producir BLEEs (Garca et al., 2010).Para la cepa control (K. pneumoniae) se confirm que era productora de betalactamasa por el mtodo de nitrocefina y observa una ligera resistencia a cefotaxima y ceftazidima (1 y 2), se esperaba que no hubiera una halo de inhibicin para ambos antibiticos en presencia de cido clavulanico dado que este inhibe a las betalactamasas. Una posible explicacin es que por el tiempo de almacenamiento los discos con antibiticos ya no eran viables para su uso. Otra es que el fenotipo observado en la placa es por otro mecanismo de resistencia diferente a la produccin de betalactamasas (p.ej. alteracin en la permeabilidad de la membrana por sistemas de eflujo) este mecanismo debe ser estudiado por otro tipo de tcnicas (p. ej. Moleculares). La cepa problema resulto productora de BLEEs, y de acuerdo al fenotipo observado cefotaxima y ceftazidima no seran recomendadas para el tratamiento contra esta cepa. Se observa que el cido clavulanico no logra inhibir la accin de las betalactamasas posiblemente esto confirma lo anterior, que los disco con antibiticos ya no eran viables para su uso. Prueba de Clindamicina. El CLSI recomienda el mtodo de difusin con doble disco para la deteccin de la resistencia inducible a clindamicina en Staphylococcus spp., debido a que la utilizacin de clindamicina en pacientes con infeccin por estafilococos con este tipo de resistencia podra conducir a un posible fracaso teraputico por la aparicin de resistencia a clindamicina durante el tratamiento. La clindamicina es un antibitico de eleccin para el tratamiento de las infecciones de piel y tejidos blandos por estafilococos debido a su buena absorcin oral, excelente penetracin y a que no necesita ajustarse la dosis en insuficiencia renal. Es una opcin teraputica por va oral en pacientes ambulatorios as como para la continuacin de una terapia intravenosa. As mismo, la clindamicina es el tratamiento alternativo en pacientes alrgicos a penicilina (Merino-Daz et al., 2007). En este caso la cepa M-022 se reporta como sensible a clindamicina, ya que el halo de inhibicin observado no se deform, el antibitico sigui actuando de manera homognea. A pesar de ser una bacteria eritromicina resistente, esto no induci la resistencia para claritromicina.

5. ConclusinLa determinacin de la susceptibilidad a antimicrobianos ha tomado gran importancia debido a que las cifras de resistencia han ido en aumento a lo largo de los aos, incluso han llegado encontrar que las bacterias han sido capaces de adquirir mecanismos de resistencia que no eran propios de su gnero. Es por ello que en caso de una enfermedad infecciosa, para asegurar xito en su erradicacin se debe realizar dicho perfil de resistencia; as como el seguimiento de la resistencia, ya que ste puede ser un fenotipo que se transmite entre las bacterias por medio de plsmidos que le confieran sta caracterstica.

6. Referencias

Ardanuy C, Cercenado E, Morosini M, Torres C. Deteccin Fenotpica de Mecanismos de Resistencia en grampositivos. Procedimientos en Microbiologa Clnica. Recomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica. Madrid: disponible. en: http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap39.

Bush K, Jacoby GA. Updated Functional Classification of -Lactamases. Antimicrobl Agents Chemother 2010; 54:969-976.

Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibiliy Testing; Twentieth Informational Supplement. CLSI document M100-S20. Wayne, PA. 2010.

Daza Prez R.M. Resistencia bacteriana aantimicrobianos: su importancia en la toma de decisiones en la prctica diaria. Informacin Teraputica del Sistema Nacional de Salud. Vol. 22.N.o 3-1998

Seral, C. Garca, et al. Betalactamasas de espectro extendido en enterobacterias distintas de Escherichia coli y Klebsiella. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2010;28(Supl 1):12-18