FACULTAD DE QUETZALTENANGOUNIVERSIDAD RAFAEL LANDIVARFACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUDCARRERA DE LICENCIATURA EN NUTRICION

Practica No. 3PROTEINAS II AISLAMIENTO DE CASEINA DE LECHE

FECHA DE REALIZACION: 17/02/2015FECHA DE ENTREGA: 24/02/2015CURSO: Bioqumica ISECCION: 03INSTRUCTOR: Inga. Lisa CaldernNOMBRES:Karina Yesenia Orozco Orozco 1606414Paula Mara Andrade Gonzales 15361-14Dulce Andrea Roca Ortiz 15056-14Luisa Mara Gmez Rodas 15883-11

1. RESUMENLos lpidos son biomolculas de muy baja solubilidad en agua y que pueden extraerse de los materiales biolgicos con solventes orgnicos. En esta prctica se realizara un anlisis cualitativo para los extractos alcalino, acuoso, con el fin de identificar protenas en muestra de la leche materna, de vaca (en presentacin de caja y tambin leche fresca) y de cabra; para lo cual empleamos cido actico, ya que es ampliamente conocido que la casena puede ser coagulada y precipitada para dar productos como queso, yogur, nata o leche agria. Para que la casena precipite se puede utilizar una precipitacin cida, en el cual utilizamos este cido; con la finalidad de disminuir el pH de la leche hasta su punto isoelctrico que es aproximadamente de 5 y provocando como resultado una precipitacin de la misma. En esta prctica se coloc en un matraz 20ml de leche materna y se puso a calentar por 5 minutos, despus se le agreg 5 gotas de cido actico para lograr un pH 5, posteriormente se coloc en dos tubos de ensayo la leche materna y se puso a centrifugar, quedando un slido color amarillento en la superficie del tubo y en el fondo un sobrenadante. Se prepar un embudo y un matraz de kitasato, en el embudo se coloc el papel filtro y se procedi a filtrar el para obtener solamente el slido blanco sin exceso de agua siendo este la casena, la finalidad de obtener en el filtrado solamente el slido color blando que era la casena; despus el filtrado fue secado al vaco y fue expuesto al calor por un corto tiempo para obtener la casena pesando esta 0.9416 g. El mismo procedimiento se utiliz para la leche de vaca proveniente de caja, la leche de cabra, y leche fresca de vaca; obteniendo para cada una distintas cantidades de casena al final del procedimiento de filtracin y secado de la misma; debido a que el contenido de casena es mayor en la leche de vaca y de oveja y menor en la humana.2. PALABRAS CLAVEProtena, Casena, concentracin, leche, pH, cido actico, filtracin, Precipitado, centrifugado.

3. INTRODUCCION La preparacin pura de una protena es esencial antes de determinar sus propiedades, estructura y composicin, por lo que es necesario aislarla y purificarla. Los mtodos de separacin de protenas aprovechan propiedades tales como la carga, tamao y solubilidad, que vara entre una y otra protena.Las protenas de la leche se dividen en tres grupos: las casenas, las protenas del lactosuero y las que forman parte de la membrana del glbulo graso. Estas ltimas representan solamente el orden del 1% total de la protena de la leche.La casena es un slido blanco-amarillento, sin sabor ni olor, insoluble en agua. Se dispersa bien en un medio alcalino, como una solucin acuosa de hidrxido de sodio: NaOH, formando caseinatos de sodio. (1) La casena se separa de la leche la cual tiene un pH aproximadamente de 7 por acidificacin llevando a la casena a su punto isoelctrico aproximadamente de 4.6 donde esta precipita. El cuajado y la acidificacin son las tcnicas ms empleadas para la preparacin de leche agria y de algunos quesos suaves.Las casenas son las principales protenas de la leche. Se sintetizan exclusivamente en la glndula mamaria, y en la leche se encuentran en su mayor parte formando agregados multimoleculares conocidos como micelas de casena. En la leche de vaca, la casenas representan alrededor del 80% del total de protenas, es decir, de 25 a 28 gramos por litro de leche, en la leche humana la presencia de protenas de lactosuero es mucho mayor, de tal forma que las casenas son solamente del orden de la mitad de las protenas totales, entre 5 y 8 gramos por litro. El trabajo contiene lo que son objetivos, los antecedentes, as mismo contiene la metodologa empleada para extraer la casena de las distintas muestras de leche, resultados obtenidos, discusin de resultados, las conclusiones, las fuentes bibliogrficas empleadas para realizar el trabajo.

4. OBJETIVOS

Objetivo general Separar y diferenciar los distintos componentes de la leche.

Objetivos especficos Determinar el valor del pH agregando el cido indicado a la leche. Identificar, a travs del proceso de filtracin, la protena restante de la leche.

5. ANTECEDENTES:

5.1 CASEINA: Es una fosfoprotena (un tipo de heteroprotena) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogurt o queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseingeno. (1)La casena es una protena de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las fosfoprotenas son un grupo de protenas que estn qumicamente unidas a una sustancia que contiene cido fosfrico, por lo tanto su molcula contiene un elemento fsforo. La casena representa cerca del 77 al 82 por ciento de las protenas presentes en la leche y el 2.7 por ciento en la composicin de la leche lquida.Cuando coagula con renina, es llamada paracasena, y cuando coagula a travs de la reduccin del pH es llamada casena cida. Cuando no est coagulada se le llama caseingeno. (1)La casena se obtiene coagulando leche descremada con cido clorhdrico diluido, as se imita la acidificacin espontnea. Los cogulos se decantan, se lavan con agua, se desecan y finalmente se muelen. Dentro de las principales aplicaciones que tiene la casena, se encuentran:5.2 USOS Y APLICACIONES DE LA CASENALa casena generalmente se emplea en la industria para la fabricacin de pinturas especiales y el preparacin de tejidos, clarificacin de vino, elaboracin de preparados farmacuticos, la fabricacin de plsticos (botonera, peines y mangos de utensilios), pinturas, la cual ha sido usada desde la antigedad por los egipcios, pegamento en relojera, carpintera (recomendadas para maderas terciadas), papel, vidrio, porcelana. (1)La casena industrial se vende en grano, fino o grueso. La harina de casena est finamente molida.5.3 PRECIPITACIN DE LA CASEINA: Las casenas de la leche pueden precipitar (pierden su estabilidad coloidal) por acidificacin hasta el PH isoelctrico que es 4,6 o por la accin de enzimas proteolticas (de origen animal o cuajo, de origen microbiano, vegetal, gentico). (1)

5.4 CONCENTRACION DE LA CASENATabla no. 1 Valores de las fracciones de casena respecto a la casena total en distintas leches. (3)Especie animalVacaOvejaCabra

Fracciones de casena A50.830.212.6

Fracciones de casena B33.047.175.3

Fracciones de casena K9.47.38.2

Fracciones de casena Y6.815.43.9

Las diferentes casenas difieren en su contenido en fosforo y en su comportamiento frente al cuajo (enzima proteoltica). (3)

Tabla no. 2 Contenido proteico y caseinico de la leche de algunas especies de animales. (2)ComponenteHumanaBovinaOvina Caprina

Protenas (% de total lcteo)1,3 1,53,2 3,55,4 6,03,1 4,0

Casena (% al total proteico)44,982,584,881,3

5.5 CMO SE OBTIENE? Coagulando leche descremada con HCL diluido, as se imita la acidificacin espontanea. Los cogulos se decantan, se lavan con agua, se desecan y finalmente se muelen. (4)La casena es un slido blanco-amarillento sin sabor ni olor, insoluble en agua. Se dispersa bien en un medio alcalino. Despus de neutralizar la casena con hidrxido sdico o clcico el producto final es caseinato sdico o clcico.Representa cerca del 77 al 82%de las protenas presentes en la leche y el 2.7 % en la composicin de leche lquida. 5.6 FUENTES: Queso, Requesn, Leche, Yogurt. (4)

6. METODOLOGIA Materiales y Reactivos Vaso de precipitados de 100 ml. Goteros Esptula Papel indicador de pH. Centrifuga de mesa y tubos cnicos de 15ml. Estufa. Matraz kitasato. Embudo Buchner. Bomba de vaco. Papel filtro.

Leche. Solucin de cido actico al 10%. Etanol al 96%.

PROCEDIMIENTOColocamos 20 ml de leche materna en un vaso de precipitados y lo calentamos por 5 min, luego medimos el PH y agregamos gota a gota cido actico al 10% y lo agitamos analizando el PH constantemente hasta alcanzar un ph5, luego trasladamos a tubos cnicos y lo centrifugamos por 10 min, depositando despus el sobrenadante en un vaso de precipitados para agregarle 5 gotas ms de cido actico y comprobar si no precipitaba ms.Despus resuspendimos en una cantidad baja de agua, el precipitado y lo depositamos en un papel filtro que colocamos en el embudo de Buchner. Una vez seco el papel filtro lavamos el precipitado con 10ml de agua destilada y 6 ml de etanol al 96% y lo colocamos en el mechero cuidadosamente hasta hacerlo secar lo ms posible, pesamos el papel filtro con la protena.

7. RESULTADOSA continuacin se presentarn los resultados obtenidos en la prctica Aislamiento de Casena De Leche realizada dentro del laboratorio. A. AISLAMIENTO DE LA CASEINA PRESENTE EN LA LECHE MATERNA (Procedimiento realizado por mi mesa de trabajo)Tabla No.1 DISMINUCIN DEL pH DE LA LECHE EMPLEANDO ACIDO ACETICOmL de leche empleadospHResultado en tiras de papel pHGotas de cido Actico agregadas Observaciones

pH inicial7 0Al terminar de agregar las gotas de cido Actico observamos que la solucin no precipito inmediatamente a comparacin de las otras muestras de leche.

20 mL

pH Final 55

TABLA No.2 PRECIPITACION DE LA CASENA

DESPUES DE CENTRIFUGAR DURANTE 10 MINUTOS

Apariencia en el tubo de ensayo IMAGEN

DESPUES DEL PROCESO DE FILTRACION ; SECADO AL VACIO Y DEJAR SECAR AL CALOR LA MUESTRA ObservacionesIMAGEN

En la parte superior quedo un sobrenadante color blanco conocido como suero de la leche- Quedan unos grumos color blanco con amarillo.- La muestra obtenida estaba todava algo hmeda debido que no tenamos el tiempo suficiente para dejarlo secar bajo el calor correctamente.

En la parte inferior quedo un precipitado color blanco-amarillento que es la protena de la leche.

Tabla No.3 SOBRENADANTE DE LA LECHE MS ACIDO ACETICO AL 10%Gotas de cido Actico agregadas Observaciones

5En la solucin todo qued en forma lquida sin formar ningn precipitado.

Tabla No.4 OBTENCION FINAL DE LA CASEINA Peso del papel filtroPeso del papel filtro+ casenaPeso de la casena

0.711.65160.9416

B. AISLAMIENTO DE LA CASENA PRESENTE EN LA LECHE DE VACA EN PRESENTACION DE CAJATabla No.5 DISMINUCIN DEL pH DE LA LECHE mL de leche empleadospHResultado en tiras de papel pHGotas de cido Actico agregadas Observaciones

pH inicial60Se form un precipitado color blanco.

10 mL

pH Final 510

Tabla No. 6 PRECIPITACIN DE LA CASENADESPUES DE CENTRIFUGAR DURANTE 10 MINUTOS

Apariencia en el tubo de ensayoDESPUES DEL PROCESO DE FILTRACION ; SECADO AL VACIO Y DEJAR SECAR AL CALOR LA MUESTRA Observaciones

En el fondo del frasco qued el sobrenadante (suero de leche) aproximada_ mente 3.5 mL y tambin el precipitado blanco 2.5 mL. Quedo totalmente seca la protena en forma de varios grumos. Aqu el grupo si tuvo el tiempo suficiente para secar la protena bajo el calor.

Tabla No.7 SOBRENADANTE DE LA LECHE MS ACIDO ACETICO AL 10%Gotas de cido Actico agregadas Observaciones

5

Se formaron unos grumos en el fondo del vaso, dando como resultado una precipitacin pero en menor cantidad.

Tabla No.8 OBTENCION FINAL DE LA CASEINA Peso del papel filtroPeso del papel filtro+ casenaPeso de la casena

0.691.12250.4325

C. AISLAMIENTO DE LA CASEINA PRESENTE EN LA LECHE DE CABRATabla No.9 DISMINUCIN DEL pH DE LA LECHE mL de leche empleadospHResultado en tiras de papel pHGotas de cido Actico agregadas Observaciones

pH inicial60La leche se termin cortando, formando grumos en el fondo del vaso.

15 mL

pH Final 59

Tabla No.10 PRECIPITACION DE LA CASENA

DESPUES DE CENTRIFUGAR DURANTE 10 MINUTOS

Apariencia en el tubo de ensayo

DESPUES DEL PROCESO DE FILTRACION ; SECADO AL VACIO Y DEJAR SECAR AL CALOR LA MUESTRA Observaciones

Se formaron dos capas donde en la capa superior quedo el precipitado y en la parte de abajo quedo la parte liquida (suero). Quedaron varios grumos color blanco, que era la casena.

Tabla No.11 SOBRENADANTE DE LA LECHE MS ACIDO ACETICO AL 10%Gotas de cido Actico agregadas Observaciones

5No precipit ms el sobrenadante.

Tabla No.12 OBTENCION FINAL DE LA CASEINA Peso del papel filtro (g)Peso del papel filtro+ casena (g)Peso de la casena en (g)

0.712.681.97

D. AISLAMIENTO DE LA CASEINA PRESENTE EN LA LECHE DE VACA (LECHE FRESCA)

Tabla No.13 DISMINUCIN DEL pH DE LA LECHE mL de leche empleadospHResultado en tiras de papel pHGotas de cido Actico agregadas Observaciones

pH inicial60La leche presenta la formacin de grumos que se depositan ene l fondo del vaso de precipitado.

5 mL

pH Final 55

Tabla No.14 PRECIPITACION DE LA CASENA

DESPUES DE CENTRIFUGAR DURANTE 10 MINUTOS

Apariencia en el tubo de ensayo

DESPUES DEL PROCESO DE FILTRACION ; SECADO AL VACIO Y DEJAR SECAR AL CALOR LA MUESTRA Observaciones

En el tubo cnico observamos que el precipitado qued en la parte superior y el lquido en la parte inferior. Quedaron varios grumos color blanco, algo pastosos, siendo estos las casena obtenida.

Tabla No.15 SOBRENADANTE DE LA LECHE MS ACIDO ACETICO AL 10%Gotas de cido Actico agregadas Observaciones

5El sobrenadante no precipit ms.

Tabla No. 16 OBTENCION FINAL DE LA CASEINA

Peso del papel filtro (g)Peso del papel filtro+ casena (g)Peso de la casena en (g)

0.711.590.88

8. DISUCIN DE RESULTADOS :

A nuestro grupo le toc realizar la prctica con leche Materna, debido a que el contenido de la casena en este tipo de leche es muy escaso, no se utiliz la cantidad que indicaba el manual, si no se utiliz una cantidad mayor para extraer un buen contenido de Casena tal y como se indica en la tabla No.1.

En la primera parte de la prctica se le agrego Acido Actico a la leche con la finalidad de disminuir el pH presente en la leche, a este tipo de precipitacin se le denomina cida, tal como se indic en la seccin de resultados en la tabla No. 1, el pH de la leche fue disminuyendo conforme ms cido Actico agregamos, esto se dio debido a que cuando disminuye el pH de la leche se tienden a formar grumos o pequeas micelas que conforman lo que se conoce como casena, estas partculas normalmente no son homogneas, por lo que se esperbamos verlas esparcidas en el vaso en cuanto el pH de la leche bajara, que en nuestro caso esto no sucedi inmediatamente.

Al principio observamos que la leche empezaba a cortarse, pero debido a que la casena en la leche materna es muy escasa que aproximadamente constituye de un 30 al 40% de las protenas presentes en la misma, el efecto que esperbamos observar no fue inmediato, a comparacin de la leche de vaca y de cabra, donde s se present el precipitado despus de terminar de agregar el cido actico y disminuyera el pH, ya que el contenido de casena en el tipo de leche de origen animal es mayor constituyendo de un 80 a 82% del total de las protenas en la misma.

La formacin de los pequeas partculas que se obtuvieron en la leche, se deben primero a que disminuye el pH, ya que cuando la leche sobre todo la materna se encuentra a un pH fisiolgico las protenas poseen una carga que normalmente se encuentra entre 6,7 a 6,8; lo que proporciona que la carga sea negativa, en nuestro caso la leche materna tena un pH de 7 (Tabla No.1), por lo que se encontraba dentro de las condiciones que se requeran en cuanto a pH. Cuando se le agreg el cido actico, se provoc un cambio drstico en el pH de la leche, provocando que las partculas de casena comenzaran atraer iones Hidronios que poseen cargas positivas, de esta manera se genera una unin de casenas, lo que provoca que se formen esos grumos dentro de la leche. En el pH al que sucede esta unin o coagulacin, existen tanto cargas positivas como negativas en la solucin, y se alcanza por lo tanto un equilibrio en la solucin; por lo que aqu se alcanza lo que conocemos como Punto Isoelctrico, por lo que al realizar la prctica se llev el pH de la solucin hasta 5; debido a que a este pH es el ideal para las casenas; y de esta manera permite su precipitacin y as poder identificarlas dentro de la leche. Despus de cierto tiempo en reposo en la leche materna se empezaron a formar unos pequeos grumos, pero eran demasiado escasos, por lo que la muestra se coloc en un tubo cnico para centrifugar la muestra, por lo que despus de este procedimiento al sacar la muestra observamos que si se haba formado un precipitado blanco-amarillento (Tabla No.1); que es algo mayor a lo que habamos obtenido al agregar solamente el cido actico y dejarlo reposar, esto que se obtuvo es la casena presente en la leche, solo que ahora ya no tiene forma de grumos, si no tiene la consistencia de un gel, lo que se conoce como cuajo de leche o coagulacin cida, esto es liso, frgil poroso y granuloso; con una consistencia muy distinta a la inicial. Lo que sucedi en este caso es que al someter a centrifugacin la muestra, se acelera el movimiento de las partculas en la mezcla, por la misma fuerza centrfuga a la que se est sometiendo la solucin; y como al agregar el cido actico, se empezaron a formar unos pequeos grumos al pasar por este procedimiento se termin de separar la solucin en dos fases, una slida que contena el precipitado que era la casena localizada en la parte superior del tubo y una liquida que contena lo que se conoce como suero de la leche, que es todo el restante que queda de la leche compuesto en gran cantidad por agua; esto queda localizado en la parte inferior del tubo cnico; por lo que se obtuvo una precipitacin completa de la casena ya que se separ totalmente en dos fases. Posteriormente pasamos a filtrar la casena, debido a que necesitbamos separar el suero de leche del precipitado obtenido, para lo cual se le sometieron a varios procesos para as obtener la casena sin excedentes de agua, ya que solamente nos interesaba conocer el peso de casena total que se haba obtenido durante la prueba. Al suero de leche obtenido y que se le agreg ms cido actico, se observ que no precipit ms, debido a que ya habamos obtenido la cantidad de casena total que se encontraba presente en la leche, por lo que este sobrante ya solo posea protenas de suero que suelen ser ms abundantes que las protena de casena sobre todo en la leche materna aproximadamente de un 60 al 70% ; lo cual explica porque el sobrante no form ms cogulos ya que no haban partculas con las cuales se pudieran unir los iones hidronio, debido a que la cantidad de micelas de casena se extrajeron totalmente en el primero proceso, dejando solamente suero de leche y agua, lo cual no tena grandes cambios al estar en un pH bajo. Al final se obtuvo la casena presente en la leche (tabla No.4) aunque el peso final puede tener un margen de error, ya que cuando se pes la casena esta todava tena un exceso de humedad, lo cual pudo alterar el peso de la misma, obteniendo as un resultado al final con un porcentaje de error, ya que el peso que debamos tomar era el de la casena ya estando totalmente seca despus de haberla colocado sobre el calor para acelerar su proceso de secado; tal y como lo hizo el grupo con la leche de vaca en presentacin de caja, por lo que la cantidad de casena obtenida en este caso fue ms exacta (tabla No. 8). Al igual que el resto de grupos ya no alcanzaron a secar correctamente la protena, por lo cual tambin los resultados no son tan exactos y pueden tener un excedente en el peso final.

9. CONCLUSIONES

La casena presente en la leche se puede extraer de la misma, mediante varios procesos dentro de los cuales se encuentra la precipitacin cida en la cual se debe emplear un agente cido, para que se alcance el punto isoelctrico (aproximadamente de 5) de la protena y de esta manera obtener la casena en forma de cogulos. Para acelerar cualquier proceso de sedimentacin se puede utilizar el proceso de centrifugacin. La cantidad de casena obtenida vara de acuerdo al tipo de leche utilizada ya que al utilizar una cantidad menor en mL de leche de origen animal se obtiene una cantidad mayor en gramos de casena, o casi igual que al utilizar una cantidad mayor en mL de leche materna, ya que hay una concentracin mayor de esta protena en la leche de vaca y en la de cabra, en comparacin a la humana. Al obtener la divisin de la solucin de leche en dos fases comprobamos que la leche est conformada mayormente de suero de leche, agua y otros componentes; y en menor cantidad de protenas tal como la casena, por lo que el precipitado color blanco era menor en comparacin a la fase liquida que se observ en el tubo de ensayo cnico. Comprobamos que la casena es la protena que se encuentra en mayor cantidad presente en la leche, por lo que su extraccin muestra un gel blanco amarillento que se puede proceder a filtrar para obtener en gramos la cantidad de casena que est presente en los mL de leche que utilizamos para la prctica.

10. BIBLIOGRAFA

1. Quiminet.com [En internet] Sa, Sf [actualizado 28 de julio 2006; Consultado 15 febrero 2015] Disponible en: http://www.quiminet.com/articulos/caseina-una-proteina-de-la-leche-13367.htm2. Wikipedia la enciclopedia libre [en internet] Sa, Sf, [actualizado 13 de diciembre 2014. Consultado 15 de febrero 2015] Disponible en: http://eswikipedia.org/wik/case%c3%adna.3. Infocarne.com [en internet] Sa,Sf: [ Consultado 15 de febrero 2015] Disponible en: http://www.infocarne.com/documentos/composicion_leche_vaca_oveja_cabra_elaboracion_quesos.htm4. Fundocomfedra.org [En internet] Sa, Sf [Consultado el 16 de febrero 2015] Disponible en: http://www.fundoconfedra.org/ingredientes_para_piensos/caseina

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