Folleto de Prácticas Biología Molecular

Técnicas básicas en el laboratorio de biología

molecular Daniel Yero Corona Yamilé López

INSTITUTO FINLAY INVESTIGACIONES

Cronograma Horario Día 1 Día 2 9:30 – 10:15 Técnica 1: PCR (lab) Discusión de la teoría (aula) 10:20 – 11:00 Pregunta de entrada

Discusión de la teoría (aula) 11:05 – 11:50 Técnica 2: Transformación por Electroporación

y siembra en medio selectivo (lab)

Técnica 3: Purificación de plasmidio (lab)

11:55 – 12:30 Discusión de resultados (lab) Discusión de resultados Pregunta escrita final (aula)

Basamento teórico para las prácticas. Extracción y purificación de ADN plasmídico. El procedimiento más comúnmente usado en biología molecular es la purificación de ácidos nulceicos, en particular de plasmidios. Se han desarrollado muchos métodos para purificar plasmidios a partir de bacterias. Estos métodos invariablemente cuentan con tres etapas básicas. Primero, el crecimiento del cultivo bacteriano; segundo, la cosecha y lisis de las bacterias; y finalmente, la purificación del material plasmídico. Muchos de los plasmidios que se usan actualmente (ejemplo, serie pUC, serie pET) que se replican en alto número de copias en Escherichia coli pueden ser purificados en grandes cantidades a partir de cultivos que simplemente se dejan crecer hasta la fase logarítmica en medio de cultivo selectivos estándares (medio LB). Después del cultivo las bacterias son cosechadas por centrifugación y lisada por uno de los métodos que se han reportado para este fin. La elección del método adecuado para la lisis depende de la talla del plasmídio, la cepa de E. coli empleada como hospedero, y la técnica elegida para la subsiguiente etapa de purificación del plasmidio. Un método ampliamente utilizado es la lisis alcalina, un método que permite la purificación de plasmidios en un amplio rango de tallas (< 15 kb). En la lisis alcalina después de la adición de EDTA y, en algunos casos, lisosima, las células se exponen a un detergente (dodecil sulfato de sodio, SDS) y son lisadas por calentamiento o por un tratamiento con álcalis. Este tratamiento, el cual distorsiona el apareamiento de bases del ADN, causa que el ADN cromosomal del hospedero se desnaturalice. Sin embargo, las dos hebras del ADN de los plasmidios, que son moléculas pequeñas circulares y cerradas, permanecen inseparables (a pesar de estar desnaturalizadas) por la propia topología del ADN plasmídico. Cuando las condiciones vuelven a la normalidad (se neutraliza el medio alcalino), las dos hebras del plasmídio se complementan y se reconstruye una molécula completamente superenrollada como en su estado nativo. Finalmente los plasmidios son purificados de esta mezcla mediante cromatografía de intercambio iónico o de filtración en gel, o por precipitación diferencial con polietilenglicol. Estos métodos rinden plasmidios con gran pureza pero son métodos que consumen mucho tiempo. Sin embargo, para el trabajo rutinario del laboratorio de biología molecular, la purificación mediante extracción con una mezcla de fenol y cloroformo y la posterior precipitación con Etanol, son suficientes para lograr plasmidios de la calidad necesaria. La extracción con fenol:cloroformo es el método estándar para eliminar proteínas de soluciones de ácidos nucleicos. El proceso de eliminar las proteínas es más eficiente cuando dos solventes orgánicos son empleados en lugar de uno. La técnica más ampliamente usada para concentrar el ADN es la precipitación con Etanol o Isopropanol. Los precipitados de ADN, los cuales se forman en presencia de cationes monovalentes, se colectan por centrifugación y se disuelven nuevamente en el tampón y la concentración deseada. Las sales más comúnmente empleadas para precipitar ácidos nucleicos son el Cloruro de Sodio (0.2 M) o el Acetato de Sodio (0.3 M; pH 5.2). Electroforesis del ADN en gel de Agarosa. Electroforesis a través de geles de agarosa es el método estándar para separar e identificar fragmentos de ADN. La técnica es simple, rápida y capaz de resolver fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otro procedimiento. La localización del ADN dentro del gel puede ser determinada directamente por tinción con el agente intercalador fluorescente Bromuro de Ethidium; bandas que contienen cantidades tan pequeñas como 10 ng de ADN, pueden ser detectadas a simple vista examinando el gel bajo luz ultravioleta. La corrida electroforética se realiza colocando el gel que contiene el ADN en un campo eléctrico, y las moléculas migran a una velocidad que es inversamente

proporcional al log10 de su talla en pares de bases. Esta velocidad de migración está también afectada por la concentración de la agarosa en el gel, la conformación del ADN, el voltaje, la composición de bases, la presencia de agentes intercalantes, la temperatura y la composición del tampón de corrida. Los plasmidios con exacto número de bases pero con diferente conformación, tienen velocidades de migración diferentes.

Aplicación de la muestra Corrida de la electroforesis Visualización del gel

Preparación y Transformación de células competentes de E. coli Existen métodos basados en principios químicos o físicos para introducir artificialmente material genético en el interior de la célula. Muchos métodos químicos de transformación en bacterias son basados en el hecho que cuando las bacterias son tratadas con una solución fría de CaCl2 y posteriormente calentadas (shock térmico), estas pueden ser transfectadas con ADN del Bacteriófago Lambda. El mismo método ha sido subsecuentemente utilizado para transformar bacterias con ADN plasmídico. Aparentemente, este tratamiento induce un estado de “competencia” en la bacteria receptora, durante el cual ellas son capaces de tomar ADN proveniente de diferentes fuentes. Las bacterias tratadas con este procedimiento original rinden entre 105 y 106 colonias transformantes por cada µg de ADN plasmídico superenrollado. Muchas variaciones de este método básico se han reportado, todas con vistas a mejorar la eficiencia de este proceso en términos de transformantes por µg de ADN. El método de electroporación, un método físico para la transformación de bacterias, tiene una eficiencia de entre 109 y 1010 colonias transformantes por cada µg de ADN plasmídico empleado. En este procedimiento una mezcla del ADN y las células receptoras es sometida a una diferencia de potencial muy alta (2,500 Volts) por un periodo de tiempo muy corto (milisegundos). Esta mezcla debe ser en un pequeño volumen y debe poseer una resistencia muy alta. Este procedimiento se logra con un aparato llamado electroporador (Figura). En el momento que ocurre el pulso eléctrico las células se hacen “competentes” para la entrada de los plasmidios con una eficiencia mayor que cualquier método químico utilizado. La eficiencia de esta técnica se ve fuertemente afectada por la cepa de E. coli empleada, la talla y calidad del ADN plasmídico, volumen y fuerza iónica de la mezcla y parámetros físicos empleados durante el pulso eléctrico. La preparación de las células para la electroporación es relativamente fácil en comparación con el método químico de CaCl2. Las bacterias son crecidas hasta la fase logarítmica, cosechadas y lavadas en frío con tampones pobres en sales para reducir la fuerza iónica de la suspensión. Finalmente se resuspenden en glicerol al 10% a una concentración de 3x1010 células/mL y se conservan a -700 hasta su uso.

Electroporador Cubetas de electroporación Identificación de colonias bacterianas que contienen plasmidios recombinantes Aquellas células bacterianas que fueron transformadas con un plasmidio son fácilmente detectadas ya que la mezcla de transformación es sembrada en placas de medio sólido que contiene un antibiótico de selección para el cual el plasmidio porta un gen de resistencia. Los antibióticos comúnmente utilizados son Ampicilina o Kanamicina y los genes que confieren resistencia a estos antibióticos son beta-lactamasa y neomicina-phosphotransferasa respectivamente. La Ampicilina inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana mientras que la Kanamicina interfiere con la función del ribosoma. En estos medios selectivos solo se duplicarán aquellas células bacterianas que replican un plasmidio en su interior. Por otro lado durante la construcción de plasmidios recombinantes las células de E. coli son transformadas con mezclas que contienen plasmidios recombinantes (correctos o deseados) como no recombinantes (incorrectos o no deseados). Existen métodos para identificar aquellas colonias bacterianas que contienen plasmidios recombinantes, este procedimiento se denomina pesquisaje o screening de clones recombinantes. Entre estos métodos, los más comunes son: el análisis de restricción de plasmidios purificados de estoas colonias, la inactivación por inserción, la hibridización con sondas marcadas y la alpha-complementación. La selección por alpha complementación o por colonias blancas y azules, se basa en la actividad de la enzima Beta-galactosidasa (lacZ) de E. coli y en la regulación del operón lactosa. La enzima Beta-galatosidasa esta formada por dos dominios uno N-terminal pequeño (péptido alpha) y otro C-terminal (fragmento omega). Estos dos dominios por separados no presentan actividad enzimática pero al unirse, incluso de manera no covalente, se restablece la actividad enzimática de esta enzima, y este fenómeno se denomina alpha complementación. Se ha tomado ventaja de este fenómeno para construir un sistema de plasmidios que permiten la búsqueda rápida de clones recombinantes. Estos vectores portan ADN que codifica para la subunidad alpha de la Beta-galactosidasa bajo el promotor y el operador del operón lactosa. Cuando células de E. coli que portan la enzima mutada en la subunidad alpha (lacZ-) son transformadas con estos plasmidios se restablece la actividad Beta-galactosidasa (Ver figura anexa). La actividad de la enzima Beta-galactosidasa puede detectarse in vivo usando el

sustrato cromogénico 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactosido (X-gal) que toma una coloración azul intenso cuando es procesado por la enzima. Al insertarse un gen de interés, mediante biología molecular, en los plasmidios que portan la subunidad alpha, esta secuencia se interrumpe y este fragmento no se expresa más, por tanto las colonias que portan los plasmidios recombinantes (que portan el gen de interés) son de coloración blanca cuando se crecen en medio sólido que contiene X-gal e IPTG. Mientras que aquellos clones no recombinates serán azules en este mismo medio. El isopropylthiogalactosido (IPTG) es una molécula sintética análoga a la alolactosa que se une eficientemente al represor del operón lactosa, convirtiéndola en un inductor del sistema.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR: del inglés Polymerase Chain Reaction) El propósito de este método es la obtención de gran número de copias de un fragmento de ADN de interés. El PCR es un método in vitro para sintetizar de manera enzimática secuencias específicas de ADN. La reacción utiliza dos oligonucleótidos (entre 15 y 40 pb) como cebadores que hibridizan en extremos opuestos de la secuencia que se quiere amplificar. La elongación de estos cebadores es catalizado por una ADN Polimerasa termoestable (Ej. Taq polimerasa). Una serie repetida de ciclos

que involucra, la desnaturalización del molde, la hibridización de los cebadores y la elongación de los cebadores por la polimerasa, resulta en la acumulación exponencial del fragmento de ADN a amplificar (figura B). La especificidad de la reacción está dada por la secuencia de los oligonucleótidos cebadores y en esto radica el éxito y la gran utilidad de esta técnica.

A B

Los componentes de la reacción de PCR son los que siguen, los cuales deben mezclarse adecuadamente en el tubo de reacción. La cantidad y calidad de estos componentes influyen significativamente en la especificidad, calidad y rendimiento de esta reacción; igualmente influye el diseño de los ciclos de temperatura, como se describen más abajo.

1. El ADN molde del cual se quiere amplificar un fragmento 2. Los oligonucleótidos cebadores 3. ADN polimerasa 4. MgCl2 5. Desoxiribonucleótidos libres (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) 6. Tampón (pH, fuerza iónica y aditivos adecuados para la enzima empleada)

Los ciclos de reacción son: Hay tres etapas fundamentales en un PCR, las cuales son repetidas entre 30 y 40 veces. Esto es realizado en un termociclador automático que realiza estos cambios de temperatura en muy corto tiempo.

1. Desnaturalización (940C): La doble hebra del ADN se separa en dos cadenas independientes. En esta etapa todos los procesos enzimáticos están detenidos.

2. Hibridización o anneling (450C – 600C): Los oligonucleótidos se unen a sus secuencias específicas por complementación de bases, la polimerasa se une al ADN y usando el oligonucleótido como cebador comienza a polimerizar.

3. Extensión (720C): Es la temperatura ideal para que polimerase la enzima. La polimerasa adiciona los desoxiribonucleótidos (dNTPs) complementarios a la cadena molde de 5´ a 3´ (la cadena molde se lee de 3´ a 5´).

Protocolos para las técnicas. DIA 1

Técnica 1: PCR. Se amplificará por PCR el gen que codifica la proteína de membrana externa P6 de la bacteria patógena humana Haemophilus influenzae. Esta proteína de la membrana es un componente importante en la respuesta inmune hacia este patógeno y un posible componente para una vacuna. Se utilizarán para el siguiente par de oligonucleótidos cebadores. Oligo extremo 5´ (upper): 5´GCTCTAGATAGTTCCTCTAACAAC 3´ Oligo extremo 3´ (lower): 5´GCTCTAGAGAATTAGTACGCTAACA 3´ Temperatura óptima de hibridización de este par de oligos: 51.40C Talla del fragmento a amplificar: 424 pb

1. Tomar un tubo de microcéntrifuga de 0.5mL, colocarlo en hielo y adicionar los siguientes reactivos en ese orden.

a) Agua doble destilada estéril Volumen final 50µL b) Tampón (10X) c) MgCl2 2mM d) dNTPs 200µM/cada uno e) Oligonucleótidos cebadores 0.6µM/cada uno f) DNA molde (Cromosoma de H. influenzae) 10ng g) Taq polimerasa 1U

2. Ajustar los parámetros en el termociclador Programa:

Paso 1 940C 5min Paso 2 940C 1min Paso 3 480C 1min Paso 4 720C 1min Paso 5 repetir pasos 2, 3 y 4 30 veces Paso 6 720C 5min

3. Resuspender bien todos los componentes de la mezcla de PCR y colocar el tubo en el termociclador. Correr el programa.

4. Aplicar 2µL de esta muestra en una electroforésis de agarosa 0.8% previamente preparada. Visualizar el gel bajo la luz ultravioleta y discutir el resultado.

¡Atención!: Las soluciones para la electroforesis contienen Bromuro de Etidium un potente mutágeno. Debe usarse guantes. ¡Atención!: La luz ultravioleta es dañina, particularmente para los ojos. Use las mascaras o espejuelos de protección. Evite la exposición prolongada.

Técnica 2: Transformación por electroporación y siembra en medio selectivo. Se transformarán células de E.coli XL1-blue con el plasmidio pUC19. E.coli XL1-blue: Es una cepa de E.coli ampliamente utilizada en el laboratorio de biología molecular debido a que tiene mutaciones artificiales que la hacen apropiada para el trabajo con plasmidios recombiantes (mutaciones endA1, recA, hsdR) y permite la selección de recombinantes por alpha complementación (mutaciones lacIq y Z∆M15). Z∆M15 es una mutación en el gen LacZ que hace se exprese la enzima Beta-galactosidasa sin la subunidad alpha. XL1-Blue genotipo:

recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proABlacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)] Plasmidio pUC19: Se puede decir que es uno de los plasmidios más usados. Contiene el gen de resistencia a ampicillina (amp), y el péptido alpha (lazZα) bajo el promotor Lac para la alpha complementación. Este es un plasmidio con alto núero de copias (pMB1ori).

1. Se toma un vial de células de E.coli XL1-blue electrocompetentes conservadas a -700C y se coloca en hielo para descongelar suavemente.

2. Se mezclan suavemente 40µL de estas células con 1ng del plasmidio pUC19 (Mezcla A) y se colocan en un tubo de microcentrífuga en hielo.

3. Se colocan en otro tubo 40µL de células sin adicionar plasmidios (Mezcla B). Este son los controles del experimento.

4. Se pasan estas mezclas a diferentes cubetas de electroporación previamente enfriadas en hielo. 5. Se ajustan los parámetros del electroporador. Voltaje 2,500 volts; Resistencia 200Ω;

Capacitancia 25µF. Se coloca la cubeta y se da el pulso eléctrico. Se debe anotar el parámetro τ (tiempo medio de exposición al alto voltaje) que reporta el equipo y que da idea de la calidad de la mezcla y la eficiencia del proceso.

6. Se colocan nuevamente las cubetas en hielo y se le adiciona 1mL de LB fresco sin antibióticos. 7. Se incuban las células recién electroporadas en LB por 40min a 370C. 8. Se toman 100µL de la suspensión celular y se siembran en placas de medio LBA sólido (LB +

ampicillina). Se deja incubar a 370C toda la noche, al otro día aparecen las colonias sobre el medio. Control de viabilidad: 100µL Mezcla B en LB sólido sin antibióticos Control negativo: 100µL Mezcla B en LBA sólido Control para la identidad del plasmidio: 100µL Mezcla A en LBA sólido + XGal + IPTG Control del promotor Lac: 100µL Mezcla A en LBA sólido + XGal

DIA 2 Técnica 3: Purificación de plasmidios. Se procederá a purificar el plasmidio pUC19 a partir de células de E.coli XL-1blue transformadas con este plasmidio en la práctica anterior. Se utilizará el método de purificación por lisis alcalina seguida de la extracción con fenol:cloroformo.

1. Se toma un cultivo bacteriano (5mL en LB) y se centrifuga a 5000 rpm por 5 min para colectar las células. Esto se hace en tubos de microcentrífuga de 1.5mL.

Este cultivo proviene de una colonia de E.coli transformada con el plasmidio pUC19 que fue inoculada al cultivo el día anterior. 2. Se resuspende el pellet bacteriano en 100µL de Solución I y se agita vigorosamente con

Vortex o con la ayuda de una pipeta. 3. Se añaden 200µL de Solución II, recién preparada. Se cierra el tubo y se agita suavemente por

inversión. Se deja reposar por 5min. ( La muestra debe volverse viscosa). El SDS solubiliza los fosfolípidos y proteínas de la membrana permitiendo la lisis, el NaOH desnaturaliza el ADN cromosomal, los plasmidios y las proteínas. La exposición por un mayor tiempo de los plasmidios a las condiciones alcalinas provoca la desnaturalización irreversibles de los mismos. La RNAasa presente digiere el RNA eficientemente durante la lisis alcalina. Un tratamiento vigoroso de las muestras durante la lisis provocará rompimientos del ADN cromosomal, los fragmentos generados contaminarán el producto final. 4. Se añaden 150µL de Solución III, se agita para mezclar todo y se deja reposar por 10min. (Se

observa la formación de un precipitado blanquecino). El precipitado esta formado por DNA cromosomal, proteína y debris celular atrapado en complejos formados por el exceso de sal y SDS. El ADN plasmídico por su menor tamaño se renaturaliza correctamente y se mantiene en solución. 5. Se centrifuga a 10 000 rpm por 5min y se transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo. Se

desecha el precipitado. 6. Se adiciona igual volumen (400µL) de una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol-isoamílico

(25:24:1). Se mezcla por Vortex y se centrifuga a 10 000 rpm por 2min. Después de este paso se forman dos fases en el tubo, tomamos la fase superior acuosa con mucho cuidado.

¡Atención!: Los solventes Fenol y Cloroformo son fuertemente tóxicos por inhalación y al contacto con la piel. Debe usarse guantes. 7. Se precipita el ADN con 2 volúmenes de Etanol absoluto frío. Dejar reposar por 2min y

centrifugar a 10 000 rpm por 10min. 8. Lavar el pellet de ADN con Etanol 70% frío. Volver a centrifugar como en el paso anterior,

eliminar el sobrenadante y dejar que se seque el pellet. 9. Redisolver el pellet de ADN en 30µL de Agua doble destilada y estéril. 10. Aplicar 2µL de esta muestra en una electroforésis de agarosa 0.8% previamente preparada.

Visualizar el gel bajo la luz ultravioleta y discutir el resultado. ¡Atención!: Las soluciones para la electroforesis contienen Bromuro de Etidium un potente mutágeno. Debe usarse guantes. ¡Atención!: La luz ultravioleta es dañina, particularmente para los ojos. Use las mascaras o espejuelos de protección. Evite la exposición prolongada.

Soluciones y Medios Solución I Solución II Solución III Glucosa 50mM NaOH 0.2 M KAc 3M Tris-Cl 25mM pH 8.0 SDS 1% pH 5.5 (ajustado con HAc) EDTA 10mM pH 8.0 RNAasa 10µg/mL Medio Luria-Bertani (LB) Medio LBA sólido Triptona 10g Medio LB 1L Extracto de levadura 5g Agar 15g NaCl 10g Esterilizar 20min 1200C 1atm Disolver en 1L de agua Ampicillina 50mg Esterilizar 20min 1200C 1atm Dispensar en placas de vidrio