Upload
vonhan
View
332
Download
19
Embed Size (px)
Citation preview
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
1
PRAKTIKUM IZ
HEMIJE PRIRODNIH PRODUKATA
izabrane vježbe
akademska 2016/2017
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
2
Vježba br. 1
________________________________IZOLACIJA ALKALOIDA
PIPERIN I PIPERINSKA KISELINA IZ BIBERA
1. UVOD
Alkaloidi se obično definišu kao bazni nitrogenovi produkti biljaka koji imaju specifino
dejstvo na organizam ljudi i životinja.
Strukturna karakteristika većine alkaloida je više ili manje složeni heterociklički sistem.
Biološka funkcija alkaloida u biljkama još je gotovo nepoznata, a na životinjske organizme i
ljude već mala količina alkaloida pokazuje izvanredno fiziološko djelovanje. Na primjer
kurare-alkaloidi, kojima se zbog njihove otrovnosti južnoamerički urođenici služe za
premazivanje vršaka strelica. Muskarin je isto tako snažan otrov koji sadrži gljiva muhara
U početku su u terapijama primjenjivane alkaloidne droge, a da njihove komponente nisu bile
poznate. Razvojem savremenih ekstrakcionih i instrumentalnih metoda bilo je moguće
izolovati i odrediti aktivne sastojke mnogih alkaloidnih droga.
U biljkama se alkaloidi nalaze uglavnom u obliku soli s kiselinama, kao što su oskalna,
sirćetna, mliječna, vinska.
Nosioci ljutog okusa bibera su alkaloidi koji sadrže piperidinsku jezgru. Piperin je alkaloid
piperidinskog niza. Glavni je sastojak crnog bibera (Piper nigrum) koji se ubraja u porodicu
Pipereceae.
Alkaloid piperin nalazi se u zrnu crnog i bijelog bibera, i u nekim drugim srodnim biljkama.
U zrnu crnog bibera ima ga 6-9%.
C17H19NO3
O
O
N
O
Informacije za eksperiment:
Reagensi: Etanol, C2H5OH
Metanol CH3OH
10% Kalijumhidroksid, KOH
Hloridna kiselina, HCl
1,3,5-trinitrobenzol
Pribor: Soxletov aparat
Balon
Vodeno hladilo
Vodeno kupatilo
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
3
Rotavapor
Produkt: Piperin t.t 125-126°C
Piperinska kiselina t.t. 216-217°C
Postupak rada
Ekstrakcija
U Soxletov aparat za ekstrakciju stavi 20 g samljevenog crnog
bibera (Stavi biber u filter papir i umotaj tako da visina bude u
visini bočne cjevčiće kojom se preljeva rastvarč).
Nasuti etanol ili hloroform u balon i zagrijavaj na vodenom
kupatilu toliko dugo dok se ne dobije bezbojan ekstrakt.
Sakupljeni ekstrakt koncentruj na rotavaporu na temperaturi ne
višoj od 60°C.
Ostatak poslije koncentrovanja tretira se sa 20 mL 10%
kalijimhidroksida u etanolu.
Poslije 10 minuta alkoholni rastvor se dekantiranjem odvoji od
taloga i ostavi piperin da iskristališe u obliku žutih kristalića.
Odrediti prinos piperina.
Filtrat ohladiti da bi se formirali kristali piperina, profiltrirati i
isprati kristale sa 2 mL hladne vode. Odrediti prinos piperina.
Uraditi bojenu reakciju piperina s koncentrovanom H2SO4. Otopiti
par kristalića izoliranog spoja u etanolu i dodati par kapi
koncentrovane H2SO4, u prisustvu piperina nastaje intenzivno
crveno obojenje koje nestaje pažljivim dodatkom vode. OPREZ!!!!
Uraditi bojenu reakciju piperina s koncentrovanom HNO3. Otopiti
par kristalića izoliranog spoja u etanolu i dodati malo HNO3, u
prisustvu piperina nastaje zeleno-žuto obojenje koje brzo prelazi u
narandžasto i na karaju u intenzivno crveno. OPREZ!!!!
Piperin sa 1,3,5-trinitrobenzolom (1:1) gradi kompleks u obliku
crvenih iglica.
Hidroliza
piperina
Hidrilizom piperina alkoholnim rastvorom kalijumhidroksida
dobiva se piperinska kiselina i piperidin
U balon od 50 mL, sa povratnim hladilom, stavi se 1 g piperina i 10
mL 10%-tnog alkoholnog rastvora kalijumhidroksida.
Reakciona smjesa se zagrijava 90 min na vodenom kupatilu.
Alkohol se predestilira iz reakcione smjese pod vakuumom na
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
4
rotavaporu
Ostatak u balonu se ohladi na ledenom kpatilu
Izdvojena kalijumova so piperinske kiseline suspenduje se u malo
vruće vode i zakiseli hloridnom kiselinom
Nastali voluminozni žuti talog odvoji se filtriranjem i ispere s malo
hladne vode
Prekristaliziraj nastali talog iz etanola, nastaju igličasti žuti kristali.
Alkalni rastvor etanola dobiven destilacijom, zakiseli do jako kisele
reakcije i otpari do suha
Kristalizacijom ostatka iz metanola dobiva se piperidinhlorhidrat
t.t. 244°C
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
5
IZVJEŠTAJ
Ime i prezime: ____________________________________ Grupa:__________
IZVJEŠTAJ
Izračunaj prinos piperina
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
6
Vježba br. 2
2a IZOLACIJA KOFEINA IZ ČAJA
UVOD
Alkaloidi su prirodni organski spojevi koji sadrže nitrogen, a tako su nazvani zbog njihovog bazičnog
("alkalijama sličnog") karaktera kojem je razlog upravo nitrogen. Danas je poznato više od 12 000
alkaloida, pa pripadaju jednoj od najbrojnijih grupa prirodnih spojeva.
Izrazitog su, ali različitog, fiziološkog djelovanja na organizam čovjeka i životinja. Djeluju već u vrlo
malim količinama. Neki se u malim dozama koriste kao jaki i nezamjenjivi lijekovi, dok su gotovo svi
u većim količinama vrlo jaki otrovi. U biljkama alkaloidi ne dolaze u slobodnom obliku, već su vezani
za neke organske kiseline (na primjer: oksalnu, octenu, mliječnu, vinsku, limunsku i druge) ili u obliku
estera, amida i glikozida. Čisti alkaloidi većinom su bijeli sitnokristalni prašci ili tekućine. Netopivi su
u vodi, ali topivi u anorganskim kiselinama i u organskim otapalima. Njihove su soli čvrste, topive u
vodi, a netopive u organskim otapalima.
Zbog raznolikosti i složenosti alkaloidnih struktura ne postoji sistematizovana klasifikacija ovih
jedinjenja. Prema hemijskoj klasifikaciji alkaloidi se mogu podijeliti u sljedeće grupe:
a) Derivati piridina i piperidina,
b) Derivati tropana
c) Derivati hinolina
d) Derivati izohinolina
e) Derivati indola
f) Derivati imidazola
g) Derivati purina
h) Aciklični alkaloidi
i) Sterodini alkaloidi
Spojevi koji se javljaju u prirodi imaju različite vrste primjene. Jedan od često korištenih je i kofein
Koristi se kao stimulans u nekim lijekovima, a većina nas ga koristi svakodnevno u pićima dobivenim
ekstrakcijom iz kafe ili čaja vrućom vodom. Kofein poticajno djeluje na središnji živčani sistem,
osobito na koru velikog mozga i neka središta u produženoj moždini. Pića koja ga sadrže izazivaju
stanje budnosti, te prolazno i kratkotrajno uklanjaju znakove umora. Kofein umor ne uklanja u cijelosti
već samo privremeno ublažava simptome, a kad djelovanje popusti, osjećaj umora još je intenzivniji.
To obično navodi na uzimanje nove doze kofeina čime zakidamo jedan od osnovnih načina kojim nas
tijelo upozorava da mu je potreban odmor.
Primarni izvor kofeina je zrno kafe koje sadrži oko 2-3% kofeina. Sadržaj kofeina u napitku varira od
40 do 120 mg, u zavisnosti od načina pripreme. Kafa takođe sadrži tragove srodnog alkaloida
teofilina, ali ne i teobromina. Čaj je drugi važan izvor kofeina i mada sadrži više kofeina nego kafa,
uobičajeni čajni napitak sadrži mnogo manje kofeina. Za razliku od kafe, čaj sadrži male količine
teobromina i nešto viši nivo teofilina.
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
7
KOFEIN TEOBROMIN TEOFILIN
Listovi biljke čajevac, Camellia sinensis, od kojih se spravlja čaj, vrući aromatični napitak blago
gorkog i oporog mirisa, sastoje se primarno od celuloze kao osnovnog gradivnog materijala svih
biljnih ćelija. Na sreću, celuloza nije topiva u vodi, pa korištenjem ekstrakcije vrućom vodom, mnogo
topiviji kofein može se razdvojiti. Takođe u vodi su topivi i složeni spojevi, tanini. Ovo su obojeni
fenolski spojevi velikih molekulskih masa(500-3000) koji imaju kiseli karakter. Ako se neka bazna so
kao što je natrijum karbonat doda vodenoj otopini, tanini će reagovati i formirati soli. Ove soli su ne
topive u organskom otapalu, kao što su hloroform ili dihlormetan, ali su topivi u vodi. Kako je kofein
slabije topiv u vodi (2g/100g hladne vode), a mnogo je topiviji u organskom otapalu (14g/100g
dihlormetana), kofein možemo ekstrahovati iz bazne otopine čaja dihlormetanom, a natrijumove soli
tanina ostaju u vodenoj otopini. Otparavanjem dihlormetana ostaje sirovi kofein, koji se može
prečistiti sublimacijom.
EKSPERIMENTALNI RAD
ZADATAK VJEŽBE
- Izvršiti izolaciju kofeina
- Naučiti tehnike ekstrakcije
- Izvršiti prečišćavanje izoliranog produkta
HEMIKALIJE I REAGENSI
- Čaj ili filter vrećice čaja
- Natrijum karbonat, Na2CO3
- Dihlormetan, CH2Cl2
- Toluen C6H5CH3
- Heptan C7H16
- Bezvodni natrijumsulfat, Na2SO4
- Destilovana voda
OPREMA I PRIBOR
- Čaše od 100, 250, 600 mL
- Erlenmajerova tikvica od 50, 125 mL
- Menzura od 10, 100 mL
- Lijevak za odvajanje od 500 mL
- Büchnerov lijevak
- Vakuum boca
- Rešo
MJERE OPREZA
- Ne udišite pare organskih rastvarača
- Oprez pri radu sa vrućim priborom
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
8
SAVJETI
- Ekstrakcije dihlormetanom i prekristalizaciju radite u digestoru
PRODUKT
- Kofein, bijeli igličasti kristali t. t. 230°C
IZVOĐENJE VJEŽBE
I Postupak
Izolacija
U čašu od 600 mL naspi oko 200 mL vode i dodaj 15 g natrijum karbonata.
Zagrijavaj na rešou uz mješanje dok se karbonat ne rastvori.
Izvagaj oko 15 g čaja
Dodaj čaj u čašu sa vodom i zagrij do ključanja
Smanji grijanje i pusti da lagano ključa poklopljeno satnim staklom oko 30
min
Prekini zagrijavanje i pusti da se rastvor ohladi (hlađenje možeš ubrzati
stavljanjem čaše pod mlaz hladne vode).
Profiltriraj dobivenu smjesu preko Büchnerovog lijevka
Pokvasi ostali čvrsti ostatak sa 10 mL destilovane vode i profiltriraj uz
pritiskanje malom erlenmajericom kako bi dobili maksimalnu količinu
tečnosti.
Ostavite čašu u ledeno kupatilo da se ohladi ispod sobne temperature
Ekstrakcija
Prebaci filtrat u lijevak za odvajanje od 500 mL
Dodaj 30 mL dihlormetana
Promućkaj sadržaj nekoliko puta i ostavi da se razdvoje slojevi. (Nemojte
mućkati previše intenzivno kako bi izbjegli stvaranje pjene)
Ispusti dihlormetanski dio u čistu čašu od 250 mL pazeći da se slojevi što
preciznije odvoje ne ispuštajući vodu iz gornjeg sloja.
Ponovi ekstrakciju na isti način još 3 puta sa po 15 mL dihlormetanu
Sušenje Dodaj 15-20 g anhidrovanog natrijumsulfata u čašu sa dihlormetanskim
slojem kako bi izvršili sušenje
Uz povremeno miješanje ostavi da stoji 10 min (ako je rastvor mutan
prebaci ga u novu čašu i dodaj novu porciju natrijumsulfata).
Otparavanje
orgasnkog
radtvarača
Sastavi aparaturu za destilaciju, koristeći vodeno kupatilo kao sredstvo za
zagrijavanje, a destilat sakupite u tikvicu koja je uronjena u ledeno kupatilo.
Predestiliraj dihlormetan uz lagano zagrijavanje kako bi izbjegli stavranje
pjene.
Kada je rastvarač otpario kofein bi trebao da kristalizira.
U ovoj fazi kofein je oko 90% čist, žućkastih kristala.
Prekristalizacija Naspi po 5 mL toluena i heptana u balon u kome se nalazi kofein
Zagrijte dok se kristali kofeina ne otope (možda će biti potrebno po još 2
mL svakog rastvarača kako bi se rastvorili nastali kristali).
Prekinite zagrijavanje kada se otope kristali kofeina
Prebacite sadržaj balona u čašu od 50 mL i pustite da dođe do
rekristalizacije pri halđenju na ledenom kupatilu
Ovako nastali kristali kofeina su bijele boje i obično 96-98% čisti
Nastali produkt profiltriraj kroz Buchnerov lijevak
Izvagajte nastali produkt i izračunajte prinos
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
9
Shema izolacije kofeina
II Postupak
U čaši ugrijati 100 mLvode i u ključalu vodu staviti tri vrećice indijskog čaja. Vrećice držati u vodi 5
minuta. Kofein je dobro topiv u vreloj vodi pa će preći u vodeni sloj. Izvaditi vrećice iz čaše i istisnuti
iz njih tečnost koju su upile.
Iz dobivene otopine se kofein ekstrahira u lijevku za odvajanje uz dihlormetan ili hloroform, tri puta sa
po 15 mL rastvarača. Kofein prelazi u organski sloj.
Nakon ekstrakcije organski sloj isprati dva puta sa po 20 mL hladnog 6M rastvora NaOH i jednom sa
20 mL hladne vode. Nakon toga organski sloj osušiti s anhidrovanim Na2SO4. Nakon sušenja
dekantirati rastvor u suhu i izvaganu kristalizirku i upariti do suha. Nakon otparavanja rastvarača
ostaju bijeli talog kofeina.
2b IZOLACIJA TEOBROMINA IZ KAKAO PRAHA
Kakao prah
zagrijavanje
Ekstrakcija
CH2Cl2
ČAJ Nerastvorljivi
ostatak
KOFEIN u CH2Cl2
Soli tanina u
vodi
KOFEIN
Otparavanje
CH2Cl2
UZORAK
ČAJA
Na2CO3 u vrućoj vodi
Teobromin
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
10
POSTUPAK I
U balon ogruglog dna (500 mL) pripremi se smjesa kakao praha (20g) i metanola (20 mL), a zatim
se doda rastvor MgO (6 g u 40 ml vode). Zagrijavati na vodenom kupatilu 30-45 minuta uz
mješanje (do stvaranja mrvičaste polu čvrste forme). Ohladiti smjesu i dodati dihlormetan ili
hloroform (150 mL) i zagrijavati pod refluksom 30 minuta. Smjesu ponovo ohladiti, filtrirati preko
Bihnerovog lijevka, filtrat osušiti sa Na2SO4 i potom prebaciti u balon okruglog dna (250 mL).
Rastvor se koncentrira na rotavaporu do volumena 10 mL, a potom dekantirati u čistu
kristalizirku, doda se dietileter (30 mL) i ostavi da kristalizira. Izračunati prinos.
POSTUPAK II
U erlenmajericu (250 mL) odvagati 10g kakao praha, dodati 75 mL vode i promješati. Pomoću
magnetne mješalice sadržaj u erlenmajerici mješati, zagrijavati i održavati na temperaturi 900C u
toku od 90 minuta. Sadržaj u erlenmajerice se ohladi na sobnu temperaturu, prebaci u posude za
centrifugiranje i centrifugira se 20 minuta na 3000 obrtaja u minuti. Supernant se odvoji
flitriranjem od taloga, a potom se sadržaj koncentrira upravanjem na vodenom kupatilu.
PRPIREMNA VJEŽBANJA
IZVJEŠTAJ
Ime i prezime: ____________________________________ Grupa:__________
1. Zašto je važno dobro ohladiti vodeni ekstrakt čaja prije dodatka dihlormetana za ekstrakciju?
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
1. Izračunaj prinos dobivenog produkta u odnosu na početnu masu materijala!
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
11
2. Kojim metodama je moguće izvršti prečišćavanje kofeina?
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
12
Vježba br. 3
IZOLACIJA I EKSTRAKCIJA ESENCIJALNIH ULJA
1 UVOD
Prirodni produkti su podjeljeni u dvije velike grupe spojeva. Metaboliti koji su uobičajeni za veliki
broj organizama, poznati kao primarni metaboliti, npr. amino kiseline. Općenito oni imaju dobro
definisan ulogu u biohemijskom sistemu. Druga velika grupa prirodnih produkata poznata je pod
imenom sekundarni metaboliti među koje spadaju i esencijalna ulja.
Esencijalna ulja su volatilne tečnosti konzistencije ulja. Izolacija iz biljnog materijala vrši se različitim
metodama. Ulja imaju karakterističan miris biljke iz koje su izolirane.
Prije izolacije biljni materijal iz kojeg se dobiva esencijalno ulje se mora osušiti i usitniti. Izolacija
esencijalnog ulja iz biljnog materijala se može vršiti slijedećim metodama:
a) hidrodestilacija;
b) destilacija vodenom parom;
c) eskstrakcija rastvaračima;
d) anfleriranje;
e) maceracija;
f) presovanje.
Hidrodestilacija je metoda koja se najčešće koristi za izoliranje esencijalnih ulja. Ovaj metod se
bazira na činjenici da su navedene supstance veoma slabo rastvorljive u vodi. Procedura se sastoji u
destilaciji vode iz vodenog rastvora koji sadrži organske spojeve pri čemu para nosi sa sobom i
organske spojeve. Para se može stvarati u sistemu i van njega. U sistemu se para stvara intenzivnim
ključanjem vode pomiješane sa materijalom koji sadrži spojve koje je potrebno izolirati, uz povremeno
dodavanje vode kako bi se nivo vode održavao konstantnim.
Biljni materijal se kuha u vodi. Pare koje nastaju kondenzuju se u hladilu i sadrže smjesu vode i
esencijalnog ulja. Iz destilata se ulje i voda odvajaju ekstrakcionim postupcima. Prilikom destilacije
dolazi do hidrolize pojedinih komponenata ulja što je uzrokovano visokom temperaturom.
Esencijalna ulja razlikuju se od masnih ulja po njihovoj isparljivosti i činjenici da nisu saponibilni
(saponifikacija je proces nastanka sapuna iz masti i baze), daju specifičan miris cvijetu, listu i drvetu
ili su izvedeni iz komponenata biljaka enzimatskom reakcijom. Esencijalna ulja često su zapaljiva,
rastvorljiva u alkoholu i eteru i samo slabo rastvorljivi u vodi. Mogu sadržavati, ugljikovodike,
alkohole, fenole, etere, aldehide, ketone, kiseline i estere.
Začini su često kompleksne smjese različitog sastava. Mirisne komponente su najčešće povezane sa
esterima, a kakakteristični okus i aroma mnogih začina rezultat je prisustva aromatskih aldehida i
ketona. Primjeri takvih aldehida su vanilin (štapići vanilija), cimetaldehid (cimet), eugenol (klinčići),
karvon (kim)
OH
O
H
O CH3 O
H
OH
O CH3
CH2
CH3CH2
CH3
O
Vanilin Cimetaldehid Eugenol Karvon
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
13
Od davnina, posebno kada nije bilo frižidera, začini su se dodavali da maskiraju nepoželjne mirise.
Antiseptici i antioksidansi prisutni u začinima bili su efikasni u produženju roka trajanja hrane.
U ovom eksperimentu, vršićete izolaciju esencijalog ulja iz klinčića. Klinčići su pupoljci jednog
zimzelenog drveta iz istočne Indije. Esencijalno ulje se uglavnom sastoji od eugenola. Koristi se u
parfimeriji, za sintezu vanilina, kao anelgetik i antiseptik.
Cimetaldehid je glavni sastojak esencijalnog ulja koji se može izolirati iz suhih dijelova biljke
Cinnamomum, porjeklom iz istočne Indije i jugoistočne Azije. Cimetaldehid je i sintetiziran za
komercijalne svrhe, koristi se kao vještački začin. Cimetaldehid je među nekoliko aldehida za koji se u
IUPAC sistemu zadržalo uobičajeno ime.
Karvon je keton, pronađen u ulju kima, Carum carvi, i mirođije. Nema komercijalnu primjenu. Kim
je dvogodišnja biljka iz familije peršuna, koja se uzgaja zbog sjemenki koje imaju intenzivan,
privlačan miris. Sjemenke kima se koriste kao začin za peciva i služe da poboljšaju probavu.
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
14
EKSPERIMENTALNI RAD
ZADATAK VJEŽBE
- Izolirati esencijalno ulje iz klinčića*1
- Izvršiti ekstrakciju esencijalnog ulja iz destilata
- Odrediti prinos
HEMIKALIJE I REAGENSI
- 5% kalijum hidroksid, KOH
- 5% hloridna kiselina, HCl
- Dihlormetan, CH2Cl2
- Destilovana voda, H2O
- Bezvodni natrijum sulfat, Na2SO4
- Zasićeni rastvor natrijum hlorida, NaCl
PRIBOR I OPREMA
- Aparatura za destilaciju
- Erlenmeyerove tikvice 250 mL, 125 mL
- Menzura 100 mL
- Lijevak za odvajanje, 150 mL, 250 mL
- Vodeno kupatilo
- Univerzalni pH papir
MJERE OPREZA
- Nemoj udisati pare organskih otapala
- Budi oprezan pri radu sa kiselinama i bazama, u slučaju posipanja isperi kožu velikim
količinama vode
- Ekstrakciju dihlormetanom izvodi u digestoru
SAVJETI
- Nemoj bacati nijednu otopinu koja bi mogla sadržavati željeni produkt. Ostavite ih u propisno
označenim posudama do kraja eksperimenta. Uobičajena greška je korištenje pogrešne otopine
za nastavak eksperimenta tokom ekstrakcije. Ako nisi siguran prati upute u Shemi
- Prinos primarno određuju destilacija i ekstrakcija dihlormetanom. Uspješnost destilacije
određuje količina predestiliranog organskog materijala vodom, dok je uspješnost ekstrakcije
određena količinom materijala koji se iz vodenog dijela prenese u organski.
- Formiranje emulzije može predstavljati ozbiljan problem tokom ekstrakcije, usporava cijeli
postupak i uzrokuje gubitak produkta.
- Pri drugoj destilaciji ili jednostavnom otparavanju otapala, produkt će ostati na dnu u malim
količinama, može ga biti tako malo da je gotovo nevidljiv, ali će vaganje potvrditi njegovo
postojanje.
- Ovaj eksperiment zahtijeva dobro planiranje i koordinaciju različitih poslova unutar grupe
kako bi se eksperiment mogao završiti na vrijeme. Počnite sa destilacijom što prije, to je dio
vježbe koji najduže traje, a ostale poslove podijelite unutar grupe.
PRODUKT
- Esencijalno ulje klinčića je žuta volatilna tečnost, t. k. 243°C
1 Ista procedura može se koristiti i za izolaciju esencijalnog ulja iz cimeta i kima
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
15
- Eugenol je bezbojna tečnost, t. k. 253°C, slabo topiv u vodi.
- Karvon je bezbojna tečnost t. k.245°C.
- Cimetaldehid je žuta volatilna tečnost, t.k. 245°C
IZVOĐENJE VJEŽBE
a) Izolacija eugenola
Destilacija Sastavi aparaturu za hidrodestilaciju, zagrijavanje vrši na električnom
grijaču, a koristi vodeno hladilo.
Izvagaj 14-16 g klinčića, smrvi ih u avanu kako bi voda lakše prodrla u
njih. (20-25 g kima, 15-20 g štapića cimeta)
Stavi biljni uzorak u tikvicu za destilaciju i preko njega naspi oko 2/3
vode
Priključi vodu na hladilo i uključi grijač kako bi smjesa lagano
proključala da se ne stvara pjena. Kada ključanje otpočne, pojačaj
grijanje.
Prikupljaj destilat u Erlenmeyerovu tikvicu dok god vidiš emulziju koja
izlazi iz hladila (destilacija obično traje 45-60 min). Trebalo bi da
prikupiš najmanje 150-200 mL destilata.
Izbaci ostatke biljnog materijala iz balona dok je još vruć ili ga napuni
do vrha vodom, snažno izmješaj i prebaci u veću čašu, otopinu iz čaše
dekantiraj u odvod, a čvrsti ostatak baci u kantu za smeće.
Ekstrakcija
Prebaci destilat u lijevak za odvajanje od 250 mL i dodaj oko 25 mL
dihlormetana.
Protresi lijevak nekoliko puta, (previše intenzivno miješanje može
prouzrokovati stvaranje emulzije; ako se emulzija stvori pokušaj izvršiti
isoljavanje). Okrećući lijevak za odvajanje naopako, kroz ventil možeš
ispusti gasove koji nastaju pri ekstrakciji.
Ostavi lijevak da stoji na prstenu dok se slojevi ne razdvoje.
U Erlenmeyerovu tikvicu od 125 mL, ispusti donji organski sloj i ponovi
ekstrakciju još dva puta na isti način sa po 20 mL dihlormetana.
(Sljedeći dio vrijedi samo za ekstrakciju eugenola iz esencijalnog ulja)
Prebaci dihlormetanski dio u drugi lijevak za odvajanje i dodaj 30 mL
5% otopine KOH. Otopina u lijevku je topla jer se pri reakciji oslobađa
toplota.
Sačuvaj vodenu otopinu u Erlenmeyerici od 125 mL i vrati
dihlormetanski dio u lijevak za odvajanje.
Ekstrahuj dihlormetanski dio još dva puta sa po 25 mL 5% otopinom
KOH i spoji vodene slojeve.
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
16
Prebaci vodeni sloj ponovo u lijevak za odvajanje i još ga jednom isperi
novom porcijom dihlormetana.
Prebaci vodeni rastvor u čašu od 250 mL i polako zakiseli do pH 1
koristeći 5% rastvor HCl-a. Kiselinu dodaj u kapima i uz miješanje. pH
vrijednost kontroliši univerzalnim pH papirom; biće potrebno 20-50 mL
kiseline. Primjetićeš da se razvija toplota i da otopina postaje zamućena
kad pH postane kisela.
Prebaci zakiseljenu otopinu ponovo u lijevak za odvajanje i dodaj 20 mL
dihlormetana.
Sačuvaj dihlormetanski dio i ponovi ekstrakciju još dva puta sa po 25 mL
dihlormetana. Pazi pri razdvajanju da u organskom sloju ne bude vode.
Koristi isti lijevak za odvajanje da opereš sakupljeni organski dio sa 15
mL destilovane vode.
Nakon pranja vodom operi organski dio sa poluzasićenom otopinom
NaCl (napravi ga miješanjem 8 mL zasićene otopine NaCl sa 7 mL
destilovane vode).
Prebaci dihlormetanski dio u čistu i suhu Erlenmeyericu, dodaj 15 g
bezvodnog natrijum sulfata, Na2SO4, da osušiš organsku otopinu (ako
otopina ostaje mutna dodaj još bezvodnog natrijum sulfata).
Otparavanje
organskog
otapala
Izvagaj balon okruglog dna od 150 mL koji će biti korišten za destilaciju,
a ne za prikupljanje destilata.
Dekantiraj osušeni organski sloj iz Erlenmeyerice u izvagani balon i
sastavi aparaturu za destilaciju, koristeći vodeno kupatilo kao sredstvo za
zagrijavanje.
Predestiliraj dihlormetanski dio. Zagrijavanje vrši lagano, kako bi izbjegli
stvaranje pjene, sve dok otapalo izlazi iz hladila.
Kad je otapalo otparilo, izvagaj balon i iz razlike masa izračunaj masu
dobivenog produkta.
b) Izolacija ulja cimeta
Sastavi aparaturu za destilaciju vodenom parom, zagrijavanje vrši na
električnom grijaču, a koristi vodeno hladilo.
Izvagaj 20-25 g štapića cimeta, smrvi ih u avanu kako bi voda lakše
prodrla u njih. (20-25 g kima).
Stavi biljni uzorak u tikvicu za destilaciju i preko njega naspi oko 100-
150 mL destilovane vode.
Priključi vodu na hladilo i uključi grijač kako bi smjesa lagano
proključala da se ne stvara pjena. Kada ključanje otpočne, pojačaj
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
17
grijanje. Sakupiti 150-200 mL destilata.
Prebaci destilat u lijevak za odvajanje i dodaj oko 25 hloroforma.
Protresi lijevak nekoliko puta, (previše intenzivno miješanje može
prouzrokovati stvaranje emulzije; ako se emulzija stvori pokušaj izvršiti
isoljavanje). Okrećući lijevak za odvajanje naopako, kroz ventil možeš
ispusti gasove koji nastaju pri ekstrakciji.
Ostavi lijevak da stoji na prstenu dok se slojevi ne razdvoje.
U Erlenmeyerovu tikvicu od 125 mL, ispusti donji organski sloj i ponovi
ekstrakciju još dva puta na isti način sa po 20 mL hloroforma
Sakupljeni ekstrakt osusiti sa anhidrovanim magnesiz sulfatom, višak
rastvaraca upariti na rotavaporu do volumena 10 mL.
Nakon uparavanja ostatak prebaciti u izvaganu kristalizirku.
Kad je otapalo otparilo, izvagaj kristalizirku i iz razlike masa izračunaj
masu dobivenog produkta.
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
18
PRIPREMNA VJEŽBANJA
1. Navedi metode kojima možeš izolirati esencijalna ulja iz biljnog materijala!
________________________________________________________
________________________________________________________
__________________________________________________
________________________________________________________
________________________________________________________
__________________________________________________ 2. Na koji način se vrši sušenje organskog ekstrakta?
________________________________________________________
________________________________________________________
__________________________________________________
______________________________________________________
IZVJEŠTAJ
Ime i prezime: ____________________________________ Grupa:__________
1. Izračunaj prinos esencijalnog ulja u odnosu na početnu masu biljnog
materijala!
2. Izračunaj prinos eugenola u odnosu na masu dobivenog esencijalnog ulja
i u odnosu na početnu masu biljnog materijala!
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
19
1. Šta može uticati na prinos eugenola?
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
1. Objasni šta se dešava sa eugenolom u svakom koraku ekstrakcije!
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
Eugenol u
klinčićima
Destilacija
Ekstrakcija sa CH2Cl2
Ekstrakcija sa KOH
Eugenol u baznom
ekstraktu
Ekstrahuj sa CH2Cl2
Isperi sa CH2Cl2
Zakiseli sa HCl
Eugenol u
CH2Cl2
ekstraktu
Isperi sa H2O
Isperi sa NaCl
Osuši sa Na2SO4
Otpari CH2Cl2
Eugenol
Eugenol u destilatu
Eugenol u CH2Cl2
ekstraktu
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
20
Vježba br. 4
IZOLACIJA LIKOPENA IZ PARADAJZA
1 UVOD
Karotenoidi su organska jedinjenja koja se svrstavaju u terpenoide; po formuli su tetra-
terpenoidi, zbog obojenosti pigmenti, a po fizičkim osobinama su lipidi. Osnovni biohemijski
značaj karotenoida je u tome što učestvuju uz hlorofile i fikobilinske pigmente u fotosintezi.
Karotenoidi u toku fotosinteze štite ćeliju od fotodinamičke destrukcije koju katalizuje
hlorofil, i apsorbuju i prenose svjetlosnu energiju do hlorofila A.
Dejstvo svjetlosti i molekulskog kiseonika može biti letalno za ćeliju. Pokazalo se da
karotenoidi inhibiraju fotodinamičku akciju svjetlosti i kiseonika na hlorofil.
Centralni dio molekule sastavljen je od dugog konjugovanog niza, najčešće osam izoprenskih
jedinica CH2=CHC(CH3)=CH2, vezanih tako da dvije CH3 grupe najbliže centru zauzimaju
položaj 1,6, a ostale su u položaju 1,5. Na krajevima ovog niza nalaze se bilo dva otvorena
niza, bilo dva prstena ili je na jednom kraju otvoren niz, a na drugom prsten.
Posljedica ovakve strukture je velika reaktivnost karotenoida, podložnost autoksidaciji,
intezivna boja, kao i karaktersitični apsorpcioni spektri.
Karotenoidi koji su ugljovodonici nazvani su karotenima, a oksidovani derivati karotena
ksantofilima.
Svi karotenoidi su rastvorni u mastima, većina je rastvorna u organskim rastvaračima
(karoteni), dok su neki rastvorni u alkoholu i alkalijama (ksantofili). Karotenoidi koji su
vezani za bjelančevine i ugljikohidrate-oblik u kojem se najčešće nalaze u prirodi-jesu
jedinjenja rastvorna u vodi.
Nekoliko pigmenata obično dolazi zajedno i to u malim količinama. U višim biljkama
najčešće se i u najvećim količinama nalaze β-karoten, lutein, kao i violaksantin i neoksantin,
koji su najvažniji ksantofili u višim biljkama. U nekim biljkama je prisutan i α-karoten, mada
u mnogo manjim količinama.
Likopen je polien sa 11 dvostrukih veza (C40H56, aciklički tetraterpen). Svrstava se u grupu
karotenoida i strukturni je izomer karotena, ali ne pokazuje vitaminske aktivnosti. Nalazi se u
plodovima voća i povrća (jabuka, paradajz) da daje plodovima crvenu boju. Apsorpcioni
maksimum je na 504 nm.
Po strukturi su vrlo slični i njihovo čišćenje pomoću uobičajenih metoda kristalizacije je bilo
vrlo teško. Nagli razvoj na području hemije karotenoida započeo je primjenom
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
21
hromatografske apsorpcije na aluminijevom oksidu, magnezijevom oksidu ili kalcijevom
karbonatu. Upravo pri odvajanju karotenoida ova se tehnika ubrzano razvijala.
likopen
-karoten
ksantofil
2. EKSPERIMENTALNI DIO
Izolacija
Postupak 1
Odvagati 20 grama paradajz pirea u erlenmajericu (150-200 mL) i dodati 20 mL acetona.
Smjesu mješati 15-20 minuta na magetnoj mješalici i nakon toga je profiltrirati. Filtrat
odbaciti, a talog prenjeti u novu erlenmajericu, dodati dihlormetan (25 mL) i sadržaj mješati 5
minuta. Sadržaj dekantirati preko Bihnerovog lijevka, ostavljajući glavninu taloga u
erlenmajerici. Ponoviti ekstrakciju sa novom količinom dihlormetana (10 mL). Sadržaj
profiltrirati u istu bocu, a potom ga osušiti sa Na2SO4 i filtrirati u čistu izvaganu posudu. Na
vodenom kupatilu otpariti višak rastvarača i izračunati prinos. Nakon toga snimiti spektar
dobijenog likopena otopljenog dihlormetanu.
Postupak 2
Odvagati 10 g paradjaz pirea u balon okruglog dna (250 mL) i dodati 15 mL metanola i 35
mL dihlormetana. Smjesu zagrijavati 10 minuta pod refluksom. Nakon hlađenja, smjesu
profiltrirati, prebaciti u lijevak za odvajanje i oprati zasićenom otopinom NaCl (100 mL). Ako
dođe do stvaranja pjenastog sloja na dnu lijevka, ispustiti nastali sloj u posebnu posudu, a
zatim organski sloj u čistu čašu. Organski sloj ponovo isprati sa 100 mL zasićene otopine
NaCl. Osušiti organski sloj, prebaciti u izvaganu kristalizirku da višak rastvarača otpari.
Izračunati prinos i snimiti spektar dobijenog likopena otopljenog dihlormetanu.
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
22
Priprema
1. Šta su karotenoidi?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
2. Kakva je uloga karotenoida u biljakama?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
3. Kakva je razlika u strukturi između likopena, -karotena i ksantofila?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
4. IZVJEŠTAJ
masa uzorka ___________
masa kristalizirke ___________ masa kristalizirke likopena _____________
masa likopena _______________ prinos _________________
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
23
Vježba br. 5
__ SINTEZA 7-HIDROKSI-4-METILKUMARINA
UVOD
Kumarini spadaju u heterociklične spojeve koji u svojoj skeletnoj strukturi sadrže atome oksigena kao
heteroatome. Kao prirodni produkti nađeni su u mnogim biljkama. Samo ime kumarin potiče od
karipske riječi „coumarou“ za biljku tonkovac (Dipteryx odorata Willd.) iz koje je kumarin (Slika 1)
prvi put izoliran 1820. godine. Do danas je izolirano preko 2000 kumarinskih struktura iz različitih
biljnih vrsta.
O O
Slika 1. Struktura kumarina.
Značajne koncentracije kumarinskih struktura se mogu naći u voću. Najviše u marelicama, višnjama,
jagodama, te začinskim biljkama kao što je cimet i lavanda.
Proizvodnja kumarina počela je 1868. godine kada su se prvi put počeli koristiti u industriji parfema i
pojačivača okusa. Njihova današnja upotreba se najviše zasniva na njihovim antikoagulacijskim
svojstvima, te kao otrov za pacove, upravo zbog tog svojstva. Zagrijavanjem kumarina nastaju
dikumaroli koji su jaki antikoagulanti. Kumarini također imaju snažan uticaj na biosintezu vitamina K.
Pored ovih svojstava, kumarini posjeduju i antibakterijska i antigljivična svojstva.
Neke od bitnijih kumarinskih struktura nađenih u biljnom svijetu su (Slika 2):
a) umbeliferon (1) – kumarin prisutan u aromatičnim biljkama familije Umbelliferae sa
izrazitim antigljivičnim svojstvima;
b) eskulin (2) – glikozidni kumarin iz ploda kestena sa vaskularnim terapeutskim
svojstvima;
c) skopoletin (3) – kumarin iz bljke noni koji regulira krvni pritisak, ima značajna
antibakterijska svojstva, te regulira hormon serotonin, te smanjuje depresiju i
anksioznost;
d) bergapten (4) – kumarin iz citrusnog voća bergamota koji spada u grupu furokumarina
(psoralena) koristi se kao aktivna komponenta krema i losiona za sunčanje.
O OOH
O
O
HHOH
H
H
OH OH
H
OH
O OOH O O
OH
O
CH31 2 3
O O
OCH3
O
4 Slika 2. Neke kumarinske strukture.
Biosinteza kumarina u biljkama kreće od cimetne kiseline koja se ciklizacijom prevodi u
kumarinsku strukturu. U laboratoriji se najčešće koriste mnoge sintetičke metode, a među
njima Perkinova, Knoevenagelova i Pechmannova reakcija.
1 TEORIJSKE OSNOVE EKSPERIMENTA
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
24
U ovoj vježbi sinteza 7-hidroksi-4-metilkumarina će se izvršiti prema jednoj od najpoznatijih
sintetičkih metoda za dobivanje kumarina – Pechmannova reakcija. Hans von Pechmann je 1883.
godine sintetizirao kumarinsku strukturu kondenzirajući fenolski derivat sa β-ketonskim esterom.
Kondenzacija ove dvije molekule se uspješno provodi u prisustvu jake kiseline koja ima ulogu
katalizatora, pri čemu nastaje novi prsten u molekuli.
Cijeli tok kondenzacije zavisi od vrste fenolskog spoja, od estera, i od kiselog kondenzacionog
katalizatora.
Generalno, fenolski spojevi koji imaju aktivatorske grupe u meta- i para-položaju (CH3, OH, OCH3,
NH2) vrlo lako podliježu Pechmannovoj kondenzaciji. Ako je supstituent u orto-položaju, onda je već
zauzeta pozicija kondenziranja estera sa fenolom u novi prsten.
Slično, β-ketonski esteri koji imaju jednostavne alkilne grupe u α-položaju također lako podliježu
kondenzaciji.
U ovoj vrsti kondenzacije katalizator ima veliki uticaj na tok reakcije. Najčešće korišteni katalizatori
su koncentrovana sulfatna kiselina i polifosforna kiselina. Generalno, postoje dvije vrste mogućih
produkata Pechmannove kondenzacije: kumarin i hromen (Slika 3).
OH
+CH3
O CH3
O OO
CH3
O
O
O
CH3 Slika 3. Produkti Pechmannove kondenzacije
Koji će od ova dva produkta nastati, zavisi od upotrebljenog katalizatora. Uopšteno, važe slijedeća
pravila:
a) U prisustvu koncentrovane sulfatne kiseline nastaje kumarin. Jedino u slučaju kada se kao
fenolski derivat koristi β-naftol nastaje smjesa kumarina i hromena.
b) Fenoli koji u prisustvu koncentrovane sulfatne kiseline daju kumarinske strukture, u prisustvu
polifosforne kiseline također daju iste strukture.
U upotrebi su još neki katalizatori, pretežno Lewisove kiseline: aluminijum (III)-hlorid, cink (II)-
hlorid, indij (III)-hlorid, samarijum (III)-nitrat, bizmut (III)-nitrat, te kationske smole.
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
25
EKSPERIMENTALNI RAD
2 ZADATAK VJEŽBE
- Uradi pripremu za vježbu i ispiši je u svoj laboratorijski dnevnik
- Pripremi čisto i laboratorijsko posuđe za sintezu.
- Izvrši sintezu 7-hidroksi-4-metilkumarina prema navedenim uputama.
- Prekristaliziraj sirove produkte.
- Odredi masu prektristaliziranog produkta.
- Odredi tačku topljenja prektristaliziranog produkta.
- Upiši rezultate u svoj laboratorijski dnevnik.
3 HEMIKALIJE I REAGENSI
- koncentrovana sulfatna kiselina
- rezorcinol
- etilacetoacetat
- 5% otopina natrijum-hidroksida
- etanol
- destilovana voda
- aktivni ugalj
4 PRIBOR I OPREMA
- Erlenmajerova tikvica od 250 mL
- čaše od 50 mL, 100 mL i 400 mL
- lijevak za dokapavanje
- stakleni štapić
- pipeta, 20 mL
- Bucherov lijevak
- lijevak
5 MJERE OPREZA
- Natrijum hidroksid je nagrizajuća supstanca i u slučaju kontakta sa kožom treba ga isprati
velikim količinama vode.
- Koncentrovana sulfatna kiselina je takođet veoma nagrizajuća supstance. U kontaktu sa
kožom nagriženi dio isprati velikim količinama vode.
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
26
6 IZVOĐENJE VJEŽBE
6.1 Sinteza 7-hidroksi-4-metilkumarina
U Erlenmajerovu tikvicu od 250 mL pažljivo nasuti 10 mL
koncentrovane sulfatne kiseline.
Tikvicu sa kiselinom prenijeti u ledeno kupatilo i pričvrstiti je za
laboratorijski stalak.
Iznad tikvice postaviti lijevak za dokapavanje.
U čaši od 50 mL otopiti 1 g rezorcinola u 3-5 mL etilacetoacetata i
smjesu pomoću uliti u lijevak za dokapavanje.
Pažljivo dokapavati smjesu rezorcinola i etilacetoacetata u
Erlenmayerovu tikvicu sa sulfatnom kiselinom (u porcijama od 1-2
mL). Pri tome paziti da temperatura reakcione smjese ne pređe 10°C.
Nakon svakog dodavanja smjese rezorcinola i etilacetoacetata,
Erlenmayerovu tikvicu energično promiješati.
Kad je sva smjesa prenesena u tikvicu, tikvicu ostaviti na sobnoj
temperaturi 15-20 minuta.
Pripremiti 200 g smjese leda i vode u čaši od 400 mL.
Preliti reakcionu smjesu u smjesu leda i vode uz veliki oprez, i snažno
promiješati. U prisustvu vode nastaju žuti kristali 7-hidroksi-4-
metilkumarina.
Sirovi produkt profiltrirati na Büchnerovom lijevku i isprati ga sa 50
mL hladne destilovane vode.
Sirovi 7-hidroksi-4-metilkumarin otopiti u čaši sa 50 mL 5% vodene
otopine natrijum-hidroksida.
Nastalu otopinu profiltrirati i filtrat zakiseliti do neutralne reakcije.
Tokom neutralizacije smjesu snažno miješati. Zakiseljavanjem
otopine ponovo dolazi do taloženja 7-hidroksi-4-metilkumarina.
Prečišćeni produkt ponovo profilrirati na Buchnerovom lijevku i talog
isprati s 50 mL hladne destilovane vode.
Sirovi 7-hidroksi-4-metilkumarin prekristalizirati iz 95% etanola
koristeći aktivni ugalj.
Osušti prekristalizirani kumarin, izvagati svoj produkat na papirnoj
lađici i odrediti tačku topljenja.
Rezultate upiši u svoj dnevnik.
Na papirnoj lađici upiši svoje ime, podatke i naziv spoja kojeg si
sintetizirao, te predaj asistentu.
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
27
7 PRIPREMNA VJEŽBANJA
1. Objasni pojam reakcija kondenzacije!
________________________________________________________
________________________________________________________
__________________________________________________
________________________________________________________
________________________________________________________
__________________________________________________
2. Napiši reakciju sinteze 7-hidroksi-4-metilkumarina!
3. Objasni ulogu sulfatne kiseline u sintezi 7-hidroksi-4-metilkumarina!
________________________________________________________
________________________________________________________
__________________________________________________
________________________________________________________
____________________________________________________
4. Napiši sve moguće izomere rezorcinola i imenuj ih po IUPAC nomenklaturi?
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
28
8 IZVJEŠTAJ
Ime i prezime: _______________________________________ Grupa:___________
Datum: ___________________ Asistent: ___________________________________
masa rezorcinola: ____________ g
količina rezorcinola: ____________ mol
teorijski prinos 7-hidroksi-4-metilkumarina
masa sintetiziranog 7-hidroksi-4-metilkumarina:
____________ g
____________ g
prinos 7-hidroksi-4-metilkumarina: ___________ %
tačka topljenja 7-hidroksi-4-metilkumarina (interval topljenja) ______°C (_______°C)
PITANJA:
Koliki je prinos 7-hidroksi-4-metilkumarina ako si za sintezu uzeo/la 3 g rezorcinola, a
dobio/la si 4 g 7-hidroksi-4-metilkumarina?
OVJERA VJEŽBE
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
29
Vježba br 6
HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU (TLC)
TLC je jednostavna, brza i jeftina procedura koja hemičaru daje odgovor koliko se komponenti
nalazi u smjesi. Ona se koristi za identifikaciju komponente upoređujući njenu Rf vrijednost sa Rf
vrijednošću poznate komponente (obje se nalaze na istoj ploči).
Kod TLC-a stacionarna faza (adsorbens) je u tankom sloju nanešena na staklenu ploču određenih
dimenzija, najčešće 20 x 20 cm (10 x 10 cm). Kao adsorbensi koriste se silika gel, aluminij-oksid,
celulozni prah i poliamid. Može biti impregniran i cink-sulfid (fluerescirajuća supstanca) zbog
detekcije pod UV-svjetlom.
Izbor adsorbensa se vrši na osnovu njegove aktivnosti koja je određena njegovom selektivnošću
(jačina aktivnih centara), kapacitetom (gustoća rasporeda aktivnih centara na površini adsorbensa),
veličinom čestica i aktivitetom (sadržaj vode).
Veze kojima se organska komponenta veže na adsorbens zavise od jačine slijedećih tipova
interakcije: ion-dipol, dipol-dipol, vodikove veze, dipol inducirani dipol, i Van der Walsove sile. Kod
silika gela dominantne interakcije između adsorbensa i materijala koji treba biti razdvojen su dipol-
dipol tipa. Polarnije molekule djeluju poprilično jako sa polarnim Si-O vezama ovog adsorbensa i
nastojat će da se adsorbuju na fine čestice adsorbensa, dok slabije polarna molekule nisu tako jako
vezane. Slabije polarne molekule zbog toga nastoje da prođu kroz adsorbens brže od polarnih.
Različite komponente u uzorku putuju različitim brzinama zbog razlika u rastvorljivosti u
rastvaraču i razlikama u privlačnosti sa stacionarnom fazom. Rezultati ovise od upotrebljenog
rastvarača.
Vizualizacija tačaka se može napraviti tako što ploču prskamo sa odgovarajućim detekcionim
reagensima. Za svaku klasu organskih spojeva postoje karakteristični detekcioni reagensi koji sa
komponentema uzorka daju karakteristična obojenja ili pojavu fluorescencije.
Uzorak rastvoren u odgovarajućem rastvaraču se nanosi u vidu mrlje na jednu stranu ploče, na
udaljenosti 1 cm od ivice. Ploča se unosi u komoru na čijem dnu se nalazi rastvarač koji kapilarnim
silama prolazi kroz adsorbens noseći sa sobom komponente uzorka, koje se kreću do određene
udaljenosti na ploči. Zbog različitog afiniteta komponente se zaustavljaju na različitim mjestima na
ploči, što omogućava njihovu identifikaciju
Za svaku komponentu karakteristična je njena Rf vrijednost koja se dobije iz omjera dužine
pređenog puta komponente i dužine pređenog puta mobilne faze. Rf vrijednost nije fizikalna konstanta
i ona zavisi od:
a) vrste mobilne faze i stepena zasićenosti atmosfere mobilnom fazom u kadi za razvijanje;
b) aktiviranja i uslova čuvanja ploča za hromatografiju;
c) veličine čestica adsorbensa;
d) debljine sloja adsorbensa.
Da bi se mogao identificirati određeni spoj potrebno je imati standard određene čistoće. Spoj je
identificiran TLC-om ako je nakon detekcije određenim detekcionim reagensom isto obojen kao
njegov standard i ako ima istu Rf vrijednost kao i standard pod istim uslovima.
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
30
Hromatografija na tankom sloju ima široku primjenu u analizi organskih spojeva. Njome se vrše
preliminarna ispitivanja, separacija, identifikacija i određivanje čistoće različitih spojeva.
2.1 Alkaloidi
Većina biljnih alkaloida su tercijarni amini; drugi sadrže primarni, sekundarni ili kvanterni nitrogen.
Slika 1-4. Bazičnost alkaloida varira u zavisnosti kojem tipu od ova četiri pripada. Veličina uzorka
alkaloida koja će se aplicirati na TLC ploču mora biti izračunata prema srednjoj vrijednosti sadržaja
alkaloida specifičnog ekstrakkta. Ekstrakcija se vrši na slijedeći način: usitnjena droga 1 g dobro se
izmiješa sa 1 ml 10% rastvorom amonijaka ili 10% rastvoromm Na2CO3 i onda se ekstrahira sa 5 ml
metanola 10 minuta pod povratnim hladilom. Filtrat se koncentrira prema sadržaju ukupnih alkaloida
specifične droge, tako da 100 μl sadrži 50 – 100 μg ukupnih alkaloida. Većina istraživača koristi
silika gel 60 F254, ali aluminij oksid je također pogodan. Mnoge mobilne faze sadrže hloroform, čija
se moć eluacije može smanjiti dodatkom cikloheksana ili povećati dodatkom acetona, etanola ili
metanola. Mobilna faza je obično bazna dodatkom amonijaka ili dietilamina do manje polarnih
rastvarača, ali dietilamin nije tako lako ukloniti prije prskanja. Najčešći eluenti su hloroform-metanol
(90:10) ili hloroform-dietilamin (90:10). Također se može koristiti i mješavina koja je pogodna za
većinu alkaloida toluen-etil acetat-dietilamin (70:20:10).
Detakcija alkaloida je moguća pod UV svjetlom 254 nm i 365 nm kao i sa dva reagensa. Dragendorff i
jodoplatinat.
2.4 Esencijalna ulja
Esencijalna ulja su mirisne komponente koje se nalaze u različitim djelovima biljke zbog toga što
isparavaju kada se izlože zraku na sobnoj temperaturi zovu se i volatilna ulja, eterična ulja ili
esencijalna ulja. Najčešće se sastoje od (a) terpena npr. alkohola (borneol, geraniol, linalol, mentol),
aldenihda (anisaldehid, citral), ketona (tujon), estera (bornil acetat, linalil acetat) ili (b) fenil
propanskih derivata (eugenol, safrol) itd. Rastvorljiva su u etanolu i toluenu i najčešće se dobivaju
hidrodestilacijom biljnog materijala. Za pripremanje ekstrakta, mikro-destilacija je metod koji se
koristi da bi se izvuklo i sačuvalo esencijalno ulje. Esencijalno ulje se ekstrahuje toluenom, ili
ksilenom i sadrži uzorak koji će biti analiziran metodom TLC, ali tkođer možemo ga izolovati i sa
heksanom, eterom ili acetonom.
Najčesće stacionarna faza koja se koristi je silika gel, a mobilne faze koje se koriste su : benzen,
toluen, hloroform. Zbog svoje toksičnosti benzen se ne preporučuje kao rastvarač za TLC. Mobila faza
toluen-etil acetat (97:3) je pogodan za sva važna esencijalna ulja.različiti rastvarači mogu se primjeniti
u posebnim slučajevima npr. toluen (Pimpinella anisum), hloroform (Melissa officinalis), metilen
hlorid (Pimpinella, Juniperus, lavandula, Rosmarinus i Salvia), toluen-etil acetat (Eucaliptus,
Mentha), hloroform-toluen (75 : 25) za Thyms vulgaris i Chamomilla recutica.
Detekcija pod UV svjetlom na 254 nm za komponente koje sadrže najmanje dvije konjugirane
dvostruke veze i gase tamne zone naspram zelenoj fluorescirajućoj pozadini. Ovo je slučaj kad su u
pitanju derivati fenil-propana (anetol, šafrol, eugenol itzd). Reagensi koji se koristi za prskanje su:
anisaldehid-sulfat koji daje plavo, zeleno, crveno i smeđe obojenje i fosfomolibdenska kiselina koja
daje plave mrlje na žutoj pozadini. Reagens koji se najčešće koristi je vanilin-sulfat koji daje širok
dijapazon boja.
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
31
EKSPERIMENTALNI RAD
1 ZADATAK VJEŽBE
- Pripremi ploče za tankoslojnu hromatografiju.
- Izvrši separaciju komponenti esencijalnog ulja tankoslojnom hromatografijom.
- Rezultate analize upiši u svoj laboratorijski dnevnik.
2 HEMIKALIJE I REAGENSI
- dihlormetan
- iod/škrob reagens za detekciju*
- vanilin/sulfatna kiselina reagens za detekciju*
- silika gel (GF-245)
- anhidrovani natrijum sulfat
- etilacetat
- toluen
3 PRIBOR I OPREMA
- Erlenmayerova tikvica, 250 mL
- čaša od 100 mL, 2 komada
- staklene kapilare
- ploče za tankoslojnu thomatografiju
- kada za tankoslojnu hromatografiju
- sprejalica za tankoslojnu hromatografiju
- UV-lampa
- eksikator
4 IZVOĐENJE VJEŽBE
Preliminarna ispitivanja heterogenosti uzorka ulja, rade se tankoslojnom hromatografijom.
Kao rastvarač koristi se sistem toluen – etilacetat (97:3)
Priprema reagenasa
Anisaldehid – sulfatna
kiselina
0,5 ml anisaldehida, 10 ml glacijalne sirćetne kiseline, 85 ml
metanola i 5 ml koncentrovane sulfatne kiseline, se pomiješa
navedenim redom i priprema neposredno pred upotrebu
Vanilin – sulfatna kiselina
C8H803/H2SO4 a) 1 % etanolni rastvor vanilina – rastvor I
b) 10 % etanolni rastvor sulfatne kiseline – rastvor II
Jod / škrob (pare joda /
1 % rastvor škroba)
2 g topivog škroba pomiješa se sa 5 ml vode i ulije u 45 ml
ključale vode, smjesa se zagrijava 2 min i spremna je za
upotrebu nakon hlađenja
Fosfomolibdenska
kiselina
P20524MoO3xH2O
20 % etanolni rastvor fosfomolibdenske kiseline
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
32
Tankoslojna hromatografija
Pripremi dvije hromatografske ploče. Na svaku nanesi pripremljene
uzorke
Odredi startnu liniju na hromatografskoj ploči, oko 1,5-2,0 cm od
ruba ploče.
Na startnu liniju nanesi uzorke esencijalnog ulja, tako da je najmanji
razmak među mrljama 2 cm.
Na hromatografske ploče nanesi i uzorak standarda kojeg ćeš dobiti
od asistenta.
Kao mobilnu fazu pripremiti otopinu toluen – etilacetat u volumnom
omjeru 97:3.
Pažljivo prenesi hromatografske ploče u kadu u kojoj se nalazi
mobilna faza.
Startna linija mrlja uzoraka mora biti iznad površine mobilne faze.
Kada mobilna faza pređe određeni put na hromatografskoj ploči,
ploče pažljivo izvadi iz kade, označi front i ostavi ploče da se osuše.
Detekcija komponenata esencijalnog ulja
DETEKCIJA POD UV LAMPOM 365 nm i 254 nm
Suhu Ploču stavi pod UV lampu i uoči da li je neke od komponata
moguće detektovati na ovaj način
DETEKCIJA REAGENSOM IOD/ŠKROB*
Suhu hromatografsku ploču prenesi u eksikator u kojoj se nalaze
kristali ioda. Uočit ćeš ljubičaste pare ioda koji sublimira u
eksikatoru.
Kada na hromatogramu uočiš žuto-smeđe mrlje ioda koji se adirao na
komponente esencijalnog ulja, ploče pažljivo izvadi iz eksikatora.
Da bi se fiksirale detektirane žute mrlje, razvijene hromatograme
sprejaj otopinom škroba koju ćeš dobiti od laboranta.
Detektovane žute mrlje postat će modro-plave.
* Reagens iod/škrob je univerzalni detekcioni reagens na sve organske spojeve.
DETEKCIJA REAGENSOM ANISALDEHID – SULFATNA KISELINA
Ploča se prska sa 10 ml reagensa, zagrijava na 100 - 105°C, 5-10 min,
dok mrlje ne postignu maksimum intenziteta boje. Detekcija se vrši
na dnevnoj svjetlosti ili/i pod UV 365 nm. Reagens je specifičan za
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
33
različite prirodne materijale, posebno derivate terpena, ali i za fenole,
šećere i steroide, koji daju različito obojene produkte (ljubičasto,
plavo, crveno, žuto ili zeleno) zavisno o vrsti jedinjenja.
DETEKCIJA REAGENSOM VANILIN – SULFATNA KISELINA
Ploča se prvo prska rastvorom I, a zatim odmah rastvorom II.
Zagrijavaj u sušnici na 110°C, 5-10 min. Reagens je specifičan za
komponente esencijalnog ulja, npr. terpenoide i fenilpropanoide.
Nastaju mrlje sličnih boja kao kod detekcije s anisaldehidom.
Hromatografsku ploču stavi pod UV svjetlost. Uočit ćeš
fluorescenciju različitih boja.
* Reagens vanilin/sulfatna kiselina je univerzalni detekcioni reagens na komponente
esencijalnih ulja.
DETEKCIJA REAGENSOM FOSFOMOLIBDENSKA KISELINA
Ploča se prska sa 10 ml rastvora, nakon čega se zagrijava na 100
- 110°C, 5 min nastaju plave mrlje na žutoj pozadini.
Univerzalni reagens za reducirajuća jedinjenja uključujući
terpene.
Identifikacija komponenata esencijalnog ulja
Prebroj komponente svakog uzorka na oba razvijena hromatograma.
Odredi Rf vrijednosti standarda koje si dobio od asistenta i odredi da
li imaš iste komponente u svom uzorku.
Upiši rezultate u svoj laboratorijski dnevnik.
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
34
Rezultati vježbe
Uzorci___________________________________________________________________
Standardi _______________________________________________________________
Mobilna faza _____________________________________________________________
Stacionarna faza __________________________________________________________
Upiši Rf vrijednosti i odgovarajuću boju detektovane komponente u prvu kolonu, a u drugu
kolonu upiši podatke za korišteni standard
Uzorak Standard
Rf vrijednost Boja Rf vrijednost Boja
OVJERA VJEŽBE
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
35
Vježba br 7
IZOLACIJA I IDENTIFIKACIJA PRIRODNIH PRODUKATA
Naziv spoja
CAS broj
Molekulska masa
Molekulska
formula
Strukturna formula
Prirodni izvori
Maksimović et al, 2007
Načini izolacije
Navesti literaturni izvor
Identifikacija
Navesti literaturni izvor
Separacija
Navesti literaturni izvor
Kvantitativno
određivanje
Navesti literaturni izvor
Literatura:
Napomena :
Na web stranici predmeta nalazi se isti ovaj formular u word-formatu koji možete koristiti
pri pripremi ove vježbe.
Ovjera
HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe
36
UPUTE
Zadatak je predstaviti način izolacije i identifikacije određenog prirodnog produkta,
pregledom dostupne literature.
Navesti ;
Ime, molekulska i strukturna formula, CAS broj, molekulska masa
prirodne izvore za zadati spoj (npr; biljnog porjelka, specificirati vrstu –e u kojima se
može naći i u kojim količinama)
specifičnosti ( nije obavezno ali ukoliko ima neku specifičnost npr. vezanu za
upotrebu, uticaj na živi organizam......)
način izolacije (npr; destilacije, ekstrakcije.......)
način separacije (npr; hromatografije, ekstrakcije........)
način identifikacije (npr; spektroskopske metode, IR, NMR....)
kvantitativno određivanje (navesti instrumentalnu tehniku)
spisak literature (za svaki od navedenih koraka navesti literaturu predstavljenu
spiskom po harvardskom načinu pisanja literature) npr;
Maksimovic, M., Vidic, D., Milos, M., Solic, M. E., Abadzic, S., Siljak-Yakovlev, S. (2007)
Effect of the environmental conditions on essential oil profile in two Dinaric Salvia species: S.
brachyodon Vandas and S. officinalis L., Biochemical Systematics and Ecology, 35, 473-
478.