Pratikum Mikrobiologi II

Pewarnaan Ziehl Neelsen

Pewarnaan Ziehl Neelsen atau pewarnaan tahan asam merupakan suatu cara

pewarnaan untuk bakteri tahan asam. Bakteri tahan asam memiliki banyak zat lipid (lemak)

sehingga bersifat permeable terhadap zat pewarna biasa. Selain itu, dinding sel bakteri

terdapat mycolic acid yang bersifat soluble terhadap carbol fuchsin. Sejumlah jenis bakteri

terutama dari genus Mycobacterium seperti M. tuberculosis dan M. leprae tidak dapat atau

sulit dilakukan dengan pewarnaan sederhana maupun pewarnaan Gram. Pewarnaan ini bisa

untuk mewarnai golongan Actinomyces juga.

Pada pewarnaan tahan asam, bakteri tahan

asam akan mengikat pewarna carbol fuchsin

sehingga berwarna merah. Sedangkan bakteri tidak

tahan asam akan melepas carbol fuchsin saat

permberian alcohol asam dan mengikat methylene

blue sehingga berwarna biru.

Pada permeriksaan TB atau Koch Pulmonum (KP) digunakan bahan pemeriksaan

sputum (berasal dari saluran napas bawah dan lebih kental dari air liur), cerebrospinal fluid

(CSF), urine, ulkus, getah lambung, biopsy kulit, dan lain-lain. Hasil pembacaan BTA

(bakteri tahan asam) menggunakan skala IUATLD (International United Against

Tuberculosis and Lung Disease). Tingkat positivitas memperkirakan berat ringan infeksi.

Cara Membuat Sediaan

Bersihkan objek gelas, beri label

Buat batasan bentuk oval uk. 2x3 cm di tengah objek gelas

Sterilkan ose, dinginkan

Ambil 1 ose sputum yang kental (hijau kuning) letakkan diatas objek gelas, ratakan.

Sediaan biarkan kering pada suhu kamar.

Setelah kering fiksasi dengan melewatkkan diatas nyala api sebanyak 3 x, sediaan siap untuk

diwarnai

Pada pembuatan sediaan ketebalan bahan untuk diisolasi memengaruhi hasil. Bila

terlalu tebal, koloni akan tertutup oleh bakteri lain. Bila terlalu tipis, koloni akan banyak tak

terlihats sehingga menurunkan hasil interpretasi.

Prosedur pewarnaan :

Bahan:

Carbol Fuchsin 0,3% Alkohol Tahan Asam 3% (Alkohol dan HCl 3%) Methylen Blue 0,3% Lampu Spritus Air

Cara Kerja :

1. Menuangkan Carbol Fuchsin ke seluruh permukaan object glass 2. Panaskan selama 3-5 menit sampai keluar uap pertama dan lapisan lilin (wax) cair.

(Memanaskan dengan menggerakan lampru spritus dibawah object glass sampai

muncul uap lalu pemanasan dihentikan dan diulangi sebanyak 2-3 kali, bila mendidih dinding sel hancur membuat semua bakteri berwarna biru)

3. Mendiamkan selama 5 menit (lapisan lilin mengeras) 4. Mencuci dengan air 5. Dekolorisasi dengan alcohol asam selama 10-30 detik (sampai warna pink pucat atau

putih bening) 6. Mencuci dengan air 7. Menuangkan methylene blue dan diamkan selama 20-30 detik 8. Mencuci dengan air 9. Keringkan dengan menempelkannya ke tisu (jangan digesek-gesek) 10. Periksa di bawah mikroskop dengan mencari bakteri berwarna merah (BTA)

Cara menggerakan mikroskop

untuk menghitung bakteri

Cara sensitif utk diagnosa tuberculosis

Masa Inkubasi TB adalah 6-8 minggu. Biasanya media yang digunakan untuk pembiakan

adalah Lowenstein-Jenses dan Ogawa

Tes Biokimia

Tes Sensitifitas obat:

Rifampisin, Isoniazid, Pirazinamid, Etambutol, Streptomisin, dll.

Skala IUATLD

Tidak ditemukan BTA dalam 100 lp, disebut negatif

Ditemukan 1-9 BTA dalam 100 lp, ditulis jumlah kuman yang ditemukan

Ditemukan 10-99 BTA dalam 100 lp, disebut + atau (1+)

Ditemukan 1-10 BTA dalam 1 lp, disebut ++ atau (2+)

Ditemukan >10 BTA dlam 1 lp, disebut +++ atau (3+)

Gambar-gambar berikut merupakan gambar koloni KP

pada media Ogawa. Kolini ini memiliki ciri :

Warna kuning kecoklatan diatas media yang berwarna hijau kebiruan

Berbentuk seperti kembang kol (seperti berbusa)

Pada pemeriksaan mikroskopis dapat ditemui bakteri TB yang mimiliki ciri berwarna

merah (BTA) dan berbentuk basil. Pada lapangan pandang akan tampak epitel yang berwarna

biru muda (dominan sitoplasma) dengan inti di tengah atau tak berinti serta bentuknya yang

oval dan terdapat leukosit yang berbentuk bulat dengan warna biru tua (dominan inti).

BTA

Leukosit

Epitel BTA

Koloni BTA