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Práctica: Práctica: Práctica: Práctica: Reacción en Cadena de la Reacción en Cadena de la Reacción en Cadena de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) Polimerasa (PCR) Polimerasa (PCR) Polimerasa (PCR)
Dra. Diana OrtizCátedra de Inmunología
Escuela de Medicina José María Vargas - UCV
Genoma:“Es la totalidad de la información genética que posee unorganismo en particular y que codifica para él.En humanos, el genoma consiste de 23 pares de cromosomas”
Alelo:“Diferentes formas o variantes de una gen”
Genotipo:“Conjunto particular de alelos para todos los genes portados porun individuo”
GenotipificaciónGenotipificaciónGenotipificaciónGenotipificación::::
Determinación del genotipo de un individuo.
Algunos conceptos
Para determinar la estructura tridimensional o disposición espacial de las
moléculas de ADN, se hace incidir un haz de rayos X sobre fibras de ADN y se
recoge la difracción de los rayos sobre una película fotográfica. La película se
impresiona en aquellos puntos donde inciden los rayos X, produciendo al
revelarse, manchas. El ángulos de difracción presentado por cada una de las
manchas en la película suministra información sobre la posición en la molécula
de ADN de cada átomo o grupo de átomos. Mediante esta técnica de
difracción de rayos X se obtuvieron los siguientes resultados:
1. Las bases púricas y pirimidínicas se encuentran unas sobre otras, apiladas a
lo largo del eje del polinucleótido a una distancia de 3,4. Las bases son
estructuras planas orientadas de forma perpendicular al eje (Astbury,
1947).
2. El diámetro del polinucleótido es de 20 °A y está enrolladlo
helicoildalmente alrededor de su eje. Cada 34°A se produce una vuelta
completa de la hélice.
3. Existe más de una cadena polinucleotídica enrollada helicoidalmente
(Wilkins et al., 1953, Franking y Gosling, 1953).
Estudios de difracción por rayos X del ADN
Rosaling Frankling
Watson (23 años) y Crick (34 años)Laboratorio Cavendish, Cambridge,
Inglaterra 1953.
Descripción de la estructura y propiedades fisicoquímicas del ADN.
Premio Nobel 1962 junto con Maurice Wilkins (colega
de Franklin)
Diagnóstico Microbiológico
Detección rápida y la caracterización de patógenos específicos
Identificación demicroorganismos
Características fenotípicas.Caracterización bioquímica.
Identificación demicroorganismos Identificación genotípica .
Avances en Biología Molecular
Hasta el siglo pasado
Identificación Características
Tradicional fenotípicas
- Habilidad para crecer en un medio determinado
- Resistencia a los antimicrobianos
- Propiedades bioquímica
Identificación de distintas especies de microorgani smos
Menor número de características observables
No cultivables
Tasa de mutación elevada mayor variabilidad genética
Flexibilidad en la adquisición de material genético
Influencia ambiental más pronunciada
En microorganismos
… Limitaciones
Identificación de distintas especies de microorgani smos
Ventajas el ADN
� Biomolécula muy fuerte
� Fácil de manipular
� Se puede obtener de diferentes fuentes.
Diagnosticar e investigar múltiples procesos patológicos
al nivel más fundamental.
Consideraciones
� ¿ Qué organismos se pueden analizar?
� ¿ Cuáles son los tipos de muestras clínicas que sepueden utilizar?
� ¿ Si las pruebas moleculares disponibles incluyenlos criterios de alta sensibilidad y especificidad,rapidez, simplicidad, y relevancia clínica?
EXTRACCIÓN DE ADN
� El éxito en la obtención de ácidos nucleicos depend e de:� Inhibición de las endonucleasas que degradan a los á cidos
nucleicos.
� Eliminación de las proteínas.
� Separación del ácido nucleico del resto de los comp onentes.
FUENTES DE ADN
� Gotas de sangre seca� Semen� Tumores� Cabellos� Tejidos Antiguos� Raspados bucales� Sangre Periférica (Más frecuente)
Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN
• Cantidad de material• Número de copias de las moléculas de ADN• Cantidad de tejido
• Condiciones en las que se encuentra el material (fresco, congelado, fijado)
• Contaminantes e interferentes en el material biológico.
SELECCIÓN DEL MÉTODOSELECCIÓN DEL MÉTODOSELECCIÓN DEL MÉTODOSELECCIÓN DEL MÉTODO
«Caseros»:- Cloroformo-fenol-isoamil alcohol.
- Calentamiento.
- Lisis por ruptura mecánica y
extracción con disolventes
orgánicos.
- Método de salting-out.
Comerciales: - Estuches «kits»
ADN:ADN:ADN:ADN:TotalTotalTotalTotalPlasmídicoPlasmídicoPlasmídicoPlasmídico
A la hora de escoger que método de extracción
de ADN utilizar se tienen en cuenta varios
factores:
• La cantidad de muestra de la que se
dispone para extraer el ADN.
• El tipo de muestra o fuente de la que se
quiere obtener el ADN.
• La pureza con la que se quiere obtener el
ADN extraído.
• El tiempo que consume cada método, su
costo y el rendimiento esperado.
• Uso que se le va a dar al ADN extraído.
EXTRACCIÓN DE ARNEXTRACCIÓN DE ARNEXTRACCIÓN DE ARNEXTRACCIÓN DE ARN
1.- a)Tejidos: b) Monocapa de células: c) Células en suspensión: TRIZOL
---- Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.---- El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.---- Trabajar todo en fríoTrabajar todo en fríoTrabajar todo en fríoTrabajar todo en frío....
Determinación de absorbanciaDeterminación de absorbanciaDeterminación de absorbanciaDeterminación de absorbancia
Cuantificación: Cuantificación: Cuantificación: Cuantificación: una unidad de absorbancia a 260nm = 50 μg por ml de ADN doble hebra de en una cubeta de
1cm de camino óptico.
Pureza: Pureza: Pureza: Pureza: Abs 260/ Abs 280 = 1, 8 – 2 (alto grado de pureza de ADN)
< 1,8 alto grado de contaminación con proteínas
CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSCUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSCUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSCUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSMÁS UTILIZADAS
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos
Amplificación de blancos
RT- PCR
Multiplex PCR
Nested PCR
PCR
PCR en tiempo real
Amplificación de BlancosReacción en Cadena de la Polimerasa
� Desarrollada en 1985.
� Permite replicar pequeñascantidades de ADN.
� Se basa en la actividad de laenzima ADN polimerasa defabricar una cadena de ADNcomplementaria a otra yaexistente.
Kary Mullis
Aplicaciones practicas más comunes de la PCR
Diagnóstico de Enfermedades Hereditarias
� Aislar y marcar segmentos de ADN� Seleccionar sitios de mutación� Terapia genética� Complementa la clonación
� Leucemia mieloide crónica� Cáncer de cervix uterino y el VPH� Cáncer de Córnea� Todo tipo de oncogenes
� Drepanocitosis� Talasemia� Fibrosis quística� Hemofilia
Investigación
Diagnóstico delcáncer
Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas
Pruebas de paternidadPolimorfismos
Expresión génica
� VIH
� Hepatitis
� Identificación de una muestra de sangre, semen o cabello.
Diagnóstico de
Infecciones
Patología Forense
Antropología
RT- PCR
� Amplifica blancos de ADN.
� Detección de las infecciones por virus de ARN.
� Detección de las especies de Mycobacterium.
� Determinación de la terapia antimicrobiana.
5´ 3´
5´3´
3´
3´
3´
3´
5´
5´
5´
5´
5´ 3´
5´ 3´
5´ 3´
Síntesis cDNA con laTranscriptasa reversa
RNAm
cDNA
cDNA con los reactivosde PCR
Amplificación del cDNA
SecuenciaciónMicroorganismo
Secuenciación
Genoma
Banco de genes
bioinformática
Pruebas en animales
Ensayos clínicos
Desarrollo de nuevos agentesTerapéuticos y/o vacunas
Métodos para la Identificación de losProductos Amplificados
Electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida.
Transferencia del ADN • Southern Blot• Dot Blot y Slot Blot
Sistemas de Detección con híbridos marcadoscon digoxigenina.
� Fenotipo de Adherencia localizada está
correlacionado con ECEP.
� Inducen el fenotipo de adhesión- destrucción.
� Las cepas ECEP presentanun plásmido de 50 a 70 Mda(FAE) y el gen cromosomaleaeA.
Escherichia coli Enteropatógena(ECEP)
APLICACIONES DE LA PCR•Detección del gen cromosomal eaeA y FAE de Escherichia coli
Análisis de la Presencia del GenCromosomal eaeA. Línea 1: PM;Línea 2: Control Negativo;Línea 3 y 4: Cepas ECEP.
Análisis de la Presencia del Factor de Adherencia . Línea 1: PM; Línea 2: Control Negativo; Línea 3: Controlpositivo;Líneas 4, 5 y 6: Cepas ECEP.
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6
400 pb
1000 pb
DetecciónMicroscópica
Carece de sensibilidad y especificidad.
Microscopia directa
No permite distinguir entre MTB y las (MNTB).
Necesidad de utilizar pruebas diagnósticasespecíficas para el inicio de un tratamiento
específico en forma rápida y oportuna.
Identificación Por cultivo
Requiere hasta cuatrosemanas.
DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS
DETECCIÓN DE Mycobacterium tuberculosisPOR PCR
� Se puede detectar a partir de:sangre, LCR, líquido pleural,esputo, lavadobronquioalveolar, orina ybiopsia.
� Se pueden identificar muestras con concentraciones de menos de 500 bacilos/ml.
VirusPapilomaHumano
Cáncer de Cuello Uterino
Incidencia25.54% 3000 nuevos
casosCada año
Edad entre25 y 64 años
DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VPH
Tipos de VPH más comunes
Lesiones Tipos de VPH más comunes
Verrugas comunes de mano
2, 4
Verrugas plantares 1, 2, 4
Verrugas planas cutáneas
3, 10
Verrugas genitales 6, 11
NIC, SCC cervical 16, 18
Otras neoplasias anogenitales
16, 18
NIC = Neoplasia intraepitelial cervical; SCC = Carcinoma de células escamosas
Procesamiento de la Muestra
� Lisis Alcalina
� Amplificación
� Multiplex
Detección:� Primers MY09/ MY11
Tipificación:�Enzimas de Restricción
Multiplex PCR.
� Alto Riesgo : 16, 18 y 31
� Bajo Riesgo : 6 y 11
1 2 3 4 5 6 7
Detección de VPH medianteLa RCP.
Tipificación del VPH utilizandoEnzimas de restricción.
Visualización del Producto Amplificado
Foto.- Detección y Tipificación del VPH:
Línea 1: PM; Línea 2 y 3:ADN de pacientes;
Línea 4 y 5 : Control Positivo (multiplex).
144 pb (tipo 11)
263 pb (tipo 6)
360 pb (tipo 33)
401 pb (tipo 18)
601 pb (tipo 16)
1 2 3 4 5
Multiplex PCRDetección del gen cagA de H. pylori
• Bacilo gram- negativo.
• Coloniza la mucosa gástrica
• Infección está influenciada por :la susceptibilidad genética delhospedador, por factoresambientales y por la virulenciade la cepa infectante.
1 2 3 4 5 6 7 8
600bp
Figure 1. PCR amplification of m1/m2 region of the
vacA gene. Lane 1: ladder, lane 2 -6 DNA samples from
strains, lane 7: positive control, lane 8: negative control.
Figure 3. PCR amplification of urec gene. Lane 1: ladder,
lane 2 -11 DNA samples from strains, lane 12: negative
control, lane 13: positive control.
294 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura No. 8 .- Análisis deHelicobacterpyloricon MPCR. Línea 1: Marcador de PM;Línea 2:Control Positivo; Líneas 3- 7: ADN dePacientes;Línea 8: Control Negativo.
Cag A ( 348 pb )UreaC ( 315 pb )Flagelina ( 152 pb )16S ( 110 pb )
Fig.No.9.-Análisis deHelicobacter pylori conMPCR. Línea 1: Marcador de PM; Líneas 2-4:ADN de Pacientes; Línea 5 : Control Positivo ;Línea 6: Control Negativo.
1 2 3 4 5 6