AMPLIFICACIN DE UNA REGIN DEL GEN DE LA BETA GLOBINA MEDIANTE LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

NDICEIntroduccin (Fundamento)_______2Objetivo___________________________4Material___________________________5Metodologa_______________________6Resultados________________________13Conclusin________________________15Bibliografa________________________15

IntroduccinUna de las herramientas de biologa molecular ms tiles en el anlisis de cidos nucleicos es la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). Es una tcnica in vitro utilizada para amplificar enzimticamente una regin determinada de ADN situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras que antes solo podan obtenerse cantidades mnimas de un gen especfico, ahora incluso un nico ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR hasta un milln de ejemplares en tan solo unas pocas horas.Las tcnicas de PCR se han hecho indispensables para muchos procedimientos comunes, como la clonacin de fragmentos especficos de ADN, la deteccin e identificacin de genes para diagnstico y medicina legal, y en la investigacin de modelos de expresin de los genes. Ms recientemente, la PCR ha permitido la investigacin de nuevos campos, como el control de la autenticidad de los alimentos, la presencia de ADN modificado genticamente y la contaminacin microbiolgica. FundamentoDurante la Reaccin en Cadena de la Polimerasa se multiplica in vitro un fragmento de cido nucleico, y la reaccin imita un fenmeno de replicacin del DNA que ocurre en forma natural en la clula. La reaccin necesita la presencia de:- Una cadena de DNA blanco donde se encuentra el fragmento que se desea amplificar. - Un par de iniciadores (cadenas sencillas de DNA entre 15-30 nucletidos, tambin llamados cebadores o primers, que son diseados especficamente para secuencia a amplificar) que limita de forma especfica la longitud del segmento que se va amplificar.- Nucletidos que son precursores de las nuevas cadenas de DNA (adenina, timina, guanina y citosina).- La enzima Taq DNA polimerasa, la cual una vez que los iniciadores flanquean la secuencia blanco, va a formar las cadenas nuevas. En esta sntesis artificial de segmentos de DNA en ciclos, las cantidades del segmento a estudiar son producidas en progresin geomtrica durante el transcurso de 30 ciclos de sntesis de DNA. Al final se obtienen cientos de millones de copias del segmento amplificado en un tubo de reaccin. Los pasos de la sntesis en cada ciclo son los siguientes:1-. Desnaturalizacin: En este paso, realizado a 94C, las cadenas moldes del DNA se separan.2-. Alineamiento: En este paso, los iniciadores se unen por complementariedad de bases al DNA molde en estudio en sitios que flanquean el fragmento que se desea amplificar.3-. Extensin: La enzima Taq DNA polimerasa, que es una enzima que resiste altas temperaturas, polimeriza el segmento de DNA complementario al molde a partir de los iniciadores.Estos pasos son llevados a cabo de manera automatizada por un aparato llamado termociclador, el cual programa los ciclos de tiempos y temperaturas apropiadas para cada reaccin de PCR.

ObjetivoEntender el fundamento de la metodologa de amplificacin de material gentico mediante la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).En esta prctica se realizar la amplificacin por PCR, a partir de DNA genmico humano, de un segmento de 268 pb del gen de la -globina que puede analizarse en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio y observado con luz ultravioleta.

Material

Juego de micropipetas de precisin 10, 20 y 200 L. Guantes. Puntillas para micropipetas de 10, 20 y 200 L. Tubos Eppendorf de 0.2 mL.Equipo: Termociclador con tapa caliente. Cmara de electroforesis horizontal. Fuente de poder. Transiluminador UV. Fotodocumentador UVP.Reactivos: Iniciador BG-1 (5 M). Iniciador BG-2 (5 M). Dinucletidos trifosfatados de dNTPs (10 mM). Solucin de MgCl2 para PCR (25 mM). Taq DNA polimerasa (5 U/L). Amortiguador para Taq DNA polimerasa (10X). Agua ultra pura. Jugo naranja. Buffer Tris-Borato-EDTA (TBE) 1X. Agarosa al 2% en TBE 1X. Solucin de Bromuro de etidio (0.3 g/mL).

Metodologa

Nota: El montaje de la reaccin de amplificacin (PCR) se deber de hacer con guantes y sin hablar para evitar la contaminacin con DNA diferente al que se quiere analizar.

1. Se realizara la mezcla de reaccin con los siguientes reactivos y medidas (preparacin: ver la tabla 1).Tabla 1. Mezcla de reaccin para la PCR.ReactivoVol. Por tubo (L)

Buffer Taq (10x)15 L

Iniciador BG1 (M)15 L

Iniciador BG2 (M)15 L

dNTPs (0.2 mM) 3 L

MgCl2 (2 mM)12 L

Agua ultra pura57 L

Taq DNA polimerasa (5 U/L) 3 L

Pasos para la mezcla de reaccin (segn la tabla anterior).1.2. Buffer Taq.3.4. 5.6. 7.8.

2. Se le entregar a cada equipo 4 tubos Eppendorf de 0.2 mL y se les agregar 20 L de mezcla de reaccin a cada uno.

3. Marcar el tubo No. 1 como control +. A este se le agrega 250 ng de DNA control volumen total de 5 L, mismo que le ser entregado por el responsable a cargo.4. Marcar 3 tubos como problema 1, 2, y 3. En cada tubo se colocar 5 L del DNA obtenido mediante la tcnica de TSNT en la prctica de extraccin de DNA.

5. Marcar el ltimo tubo Eppendorf de 0.2 mL como testigo negativo y colocar en este 5 L de agua ultra pura.

6. Mezclar y centrifugar por 5 segundos en la microcentrfuga.

7. Mantener los tubos en hielo hasta que sean colocados todos los tubos del grupo en el termociclador programado con las siguientes temperaturas y tiempos.

Programa del termociclador:PasoTemperaturaTiempoObservaciones

194C5 minDesnaturalizacin inicial

294C30 segDesnaturalizacin

357C30 segAlineamiento

472C2 minExtensin

5Ir al paso 2,25 ciclos

672C5 minExtensin final

7Fin

8. Encender el Termociclador, elegir la opcin Run y encontrar el programa de la -globina con las condiciones de temperatura y tiempos correspondientes.

9. Depositar los tubos dentro del Termociclador y cerrar (verificar que la tapa del Termociclador quede en contacto con la tapa de los tubos).10. Se inicia el programa de PCR seleccionando Enter.

11. El programa de PCR en el Termociclador dura 2 horas. Cuando termina la amplificacin los tubos se almacenan a 4 C.12. Mezclar 5 L de cada producto amplificado con 1 L de jugo naranja.13. Agregar los 6 L de cada producto en los pocillos de un gel de agarosa al 2%.

14. Colocar en un carril 5 L del marcador de peso molecular pBS cortado con la enzima Msp I.15. Activar la electroforesis a 100 V por 40 minutos.

16. Teir el gel con bromuro de etidio por 5 a 10 min y visualizar con luz ultravioleta en el Transiluminador.17. Documentar la imagen en el fotodocumentador UVP.

Resultados1. Anexar la imagen del gel con los resultados obtenidos del PCR, identificando cada carril.2. Realizar la interpretacin del gel, incluir la descripcin de cada carril, comparar el tamao del producto amplificado con el marcador de peso molecular, as como la descripcin del control negativo.3. Anotar sus comentarios finales sobre el desarrollo y los resultados de esta prctica.MPM: Marcador de peso molecular.C (+): Control positivo de amplificacin.C (-): Control negativo (agua ultra pura).

En esta prctica se muestra el gen de la -globina y la regin amplificada por PCR, donde se obtiene un fragmento de 268 pb que se analiz en un gel de agarosa al 2% teido con bromuro de etidio y fue observado con luz ultravioleta. Para verificar el resultado de una reaccin de PCR, es necesario emplear un control negativo al que se le agrega agua ultra pura en lugar del DNA (por lo cual no debe amplificar), lo que permite monitorear la presencia de contaminacin con producto amplificado o DNA que repercutira en un diagnstico errneo.

ConclusinEl estudio de los cidos nucleicos (DNA y RNA) mediante la PCR tiene numerosas aplicaciones dentro de la medicina como el estudio y diagnstico de enfermedades infecciosas, cncer y enfermedades genticas entre otras.La PCR es una tcnica poderosa usada para amplificar el ADN millones de veces, por la repetida rplica de una plantilla, en un corto perodo de tiempo. El proceso utiliza sistemas de oligonucletidos sintetizados in vitro especficos para preparar la sntesis del ADN. La tcnica se realiza durante muchos ciclos (generalmente 30) para derretir la plantilla de ADN a alta temperatura, permitiendo que los primers se alineen a las secuencias complementarias dentro de la plantilla de ADN y despus la replicacin de la plantilla con la polimerasa de ADN.En esta prctica se cumpli con el objetivo de la amplificacin por PCR, a partir de DNA genmico humano, de un segmento de 268 pb del gen de la -globina que se analiz en un gel de agarosa y observado con luz ultravioleta.

Bibliografahttp://themedicalbiochemistrypage.org/es/molecular-medicine-sp.phphttp://web.udl.es/usuaris/e4650869/docencia/segoncicle/genclin98/temes_teoria/diagostic_mol/diagno2.htmlhttp://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/pcr-13299http://revistas.ucr.ac.cr/index.php/medica/article/view/7869

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