PRECIPITAZIONE FRAZIONATA DI PROTEINE

Obiettivo:separare proteine sfruttando

differenze di solubilità

SOLUBILITA’ DELLE PROTEINE

• pH• FORZA IONICA• SOLVENTI• POLIMERI ORGANICI

• TEMPERATURA

Effetto del pH

Precipitazione isoelettrica

• Si modifica il pH avvicinandolo al pI

• Può essere utilizzata per allontanare proteine estranee o per purificare la proteina desiderata

Ioni in acqua• Gli ioni interferiscono con la struttura naturale

dei legami idrogeno dell’acqua• L’effetto netto è la riduzione della viscosità• Alcuni ioni si comportanoi come

• agenti chaotropi o denaturanti distruggono le interazioni intramolecolari che stabilizzano le macromolecole

• agenti cosmotropi o stabilizzanti rinforzano la struttura dell’acqua (interazioni idrogeno dell’acqua forti ) così stabilizzando le interazioni intermolecolari tra le proteine

La relazione tra solubilità di un sale e la forza ionica è esponenziale

log S = β - kSμ

Relazione di Cohn, dove:μ = ½ Σ ci zi

2 forza ionicaβ = log S0 solubilità a μ = 0kS costante di “salting-out”

dipende dal sale e dalla proteina

Efficacia precipitante dei sali.La serie di Hofmeister (1888)

Cationi: NH4+ > Cs + > Rb+ > K+ > Na+ > Mg++ > Ca++ > Al3+

Anioni: citrate3- > SO4-- > HPO4

-- > Cl- > I- > NO3- > ClO4

- > SCN-

Effetto chaotropico crescente(denaturanti)

Effetto cosmotropico crescente(stabilizzanti e precipitanti)

Jonathan N. Sachs† and Thomas B. WoolfJ. AM. CHEM. SOC. 2003, 125, 8742-8743

L’effetto chaotropo è legato alla capacità di penetrare il bilayerlipidico

O

CH2OH

OH

OH

OH

OHOH

OH

CH2OH

O

O

Il trealosio (α,α-glucosio) è un agente cosmotropo

Abbondante nell’emolinfa degli insetti

Effetto della forza ionica

Salting-out

Salting-in

Precipitazione frazionata con ammonio solfato

• Sale molto solubile e buon precipitante• La concentrazione si esprime in % saturazione

(soluzione satura: circa 4 M)• Si può aggiungere sale solido oppure una

soluzione satura• Si procede per aggiunte successive• La tecnica non è denaturante• La densità delle proteine è maggiore della

soluzione (non vero per sale di potassio)

Frazionamento con solventi organici

• Si usano solventi polari (acetone, metanolo, etanolo, dimetil-solfossido…)

• Diminuisce la costante dielettrica del mezzo e aumentano le interazioni soluto-soluto

• Occorrono temperature basse (forte rischio di denaturazione)

• Pericoloso su larga scala (infiammabilità)

Precipitazione con solventi.Acetone a 0°C e pH 6.5

Frazionamento con polimeri organici

• Rimuovono acqua di idratazione dalle proteine

• Si utilizzano polimeri idrofili come il poli-etilenglicole (PEG) con massa molecolare 6000-20000

Effetto della temperatura

• In un certo intervallo, parte delle proteine globulari aumentano la solubilità con T

• A T > 40° C, molte proteine tendono a denaturarsi e a precipitare

• L’aumento di temperatura può essere impiegato per precipitare proteine termo-labili, recuperando proteine termostabili

DIALISI eULTRAFILTRAZIONE:

OBIETTIVO

Separare molecole o particelle tramite una membrana semi-permeabile,

sfruttando differenze di dimensioni

Dialisi Passaggio di molecole (cristalloidi) secondo gradiente di concentrazione attraverso le membrane . Le membrane sono impermeabili alle macromolecole (colloidi) e sono dette MEMBRANE DA DIALISI

c c cM M

H2O

h = pressione oncotica,pressione osmotica dovuta allemacromolecole

h

A B A B

a bd

bda bc

da bc

da Ripetere per rimuovere

completamente cEmodialisi (glucosio, NaCl, etc.)

c

Dialisi selettiva

all’equilibrioinizio della dialisi

RL

R-L

L L

Dialisi all’equilibrio.Si può calcolare la costante di affinità di un ligando (L)per il suo recettore (R)

equilibrio

• Microfiltrazione 0.1 - 10 μm

• Ultrafiltrazione 103 – 106 Dalton

• Nanofiltrazione (non interessa)

FiltrazioneLe particelle più piccole si muovono attraverso la membrana assieme al fluidosotto l’azione di una forza

DIALISI e ULTRAFILTRAZIONE:APPLICAZIONI

• Eliminazione di molecole a basso PM (desalting)• Sostituzione del tampone• Concentrazione• Studi di interazioni con ligandi (binding)• Recupero di frammenti di DNA• Rimozione di batteri (sterilizzazione)• Funzioni terapeutiche (emodialisi)

Concentratori per ultrafiltrazione

Per far passare il solvente attraverso la membrana si possono utilizzare:

• Pressione (in genere, azoto)

• Forza centrifuga (provette Centricon)

• Sostanze igroscopiche al di là della membrana

Ultrafiltrazione a pressione

Cella con ilcampione

Azoto

Serbatoio

Valvola

AgitatoreUltrafiltrato

Liquido di lavaggio

In

Out

Membrana filtrante

Diafiltrazione:celle per campioni

Dischi per ultrafiltrazionePer concentrare o desalificare soluzioni diluite, si usano membrane di cellulosa. La microstruttura idrofilica assicura la maggiore ritenzione possibile Con il minore adsorbimento di proteine, DNA o altre macromolecole.

Per campioni più ricchi in proteine (es., siero) si usano membrane in polieteresulfone (PES)

Filtrazione a flusso tangenziale (TFF)

Apparato per TFF

Pompa Filtrato

FiltratoMembrana

Recipiente del campionelunghezza

ingresso recuperato

valvola

Applicazioni della TFF• Concentrare e desalificare proteine e peptidi. • Concentrare e desalificare acidi nucleici [DNA, RNA,

oligonucleotidi]. • Recuperare e purificare anticorpi o proteine recombinanti da

terreni di cellule in coltura. • Recuperare e purificare DNA plasmidici da lisati cellulari o

DNA cromosomico da sangue intero. • Frazionare miscele diluite di proteine. • Chiarificare lisati cellulari o omogenati di tessuti. • Depirogenare (rimuovere endossine) da acqua, tamponi e altre

soluzioni. • Preparare i campioni prima di una cromatografia su colonna. • Raccogliere cellule. • Ricuperare o rimuovere virus.

Concentratore Centricon

Campione

Campione concentrato

Tappo di raccolta

Filtrato

Serbatoio di raccolta

Membrana ultrafiltranteCampo

centrifugo

Sistema Amicon

Concentra 500 ul in 15 ulResa 90%15-30 min a 14.000 g

Rimozione di sali

Concentratore statico

Pozzetti per i campioni

Adsorbente igroscopico

di cellulosa

Membrana

campione

Setto non permeabile

Campione concentrato

Concentratore statico: applicazioni

• Concentrazione di campioni clinici (urina, siero, CSF)

• Concentrazione di campioni per ricerca• Aumento del titolo di anticorpi• Rimozione di sali per ripetuta diluizione/

concentrazione• Concentrazione di enzimi

Concentratore Savant SpeedVac

camera trappola refrigerata trappola per pompacentrifuga per il solvente vapori (opzionale)