Predložak za diplomski/seminarski/konstrukcijski radbib.irb.hr/.../746840.Anamarija_Perkovic_diplomski_rad.docx · Web viewSDS-poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE) je provedena

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

PREHRAMBENO-BIOTEHNOLOŠKI FAKULTET

DIPLOMSKI RAD

Zagreb, prosinac 2011. ANAMARIJA PERKOVIĆ

90/BPI

Selekcija autohtonih bakterija

mliječne kiseline za pripravu

probiotičkih starter kultura

Ovaj rad je izrađen u Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter

kultura Zavoda za biokemijsko inženjerstvo Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta

Sveučilišta u Zagrebu, pod mentorstvom dr. sc. Blaženke Kos, izv. prof.

Zahvaljujem se mentorici dr. sc. Blaženki Kos, izv. prof. na pruženoj prilici izrađivanja

diplomskog rada te stručnom vodstvu.

Također se zahvaljujem, dr. sc. Jagodi Šušković, red. prof. na susretljivosti prilikom izrade

i pisanja mog rada.

Posebno se zahvaljujem Kseniji Habjanič, dipl. ing. na pomoći tijekom izvođenja

eksperimentalnog dijela i pisanja ovog rada.

Veliko hvala dr. sc. Slobodanu Grbi (pok.), red. prof. na dragocijenim savjetima tijekom

studiranja.

Veliko hvala roditeljima na ljubavi i podršci koju su mi pružali tijekom studija,također

veliko hvala Goranu i svim mojim prijateljima na podršci.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Diplomski rad

Sveučilište u ZagrebuPrehrambeno-biotehnološki fakultetZavod za biokemijsko inženjerstvoLaboratorij za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kulturaZnanstveno područje: Biotehničke znanostiZnanstveno polje: Biotehnologija

Selekcija autohtonih baterija mliječne kiseline za pripravu probiotičkih starter kulturaAnamarija Perković 90/BPI

Sažetak: Autohtoni izolati bakterija mliječne kiseline (BMK) identificirani su sekvencioniranjem 16S rRNA gena te su provedena istraživanja u okviru probiotičkog koncepta s ciljem in vitro odabira potencijalnih probiotičkih kultura. Kako bi se isključila mogućnost širenja antibiotičke rezistencije, ispitivana je osjetljivost autohtonih izolata BMK na različite skupine antibiotika. Autohtoni izolati BMK su pokazali osjetljivost na svih 12 ispitanih antibiotika, a jedino su predstavnici Lactobacillus vrsta bili rezistentni na vankomicin, zbog urođene rezistencije na taj antibiotik. Kako je glavni zahtjev pri izboru probiotičkih sojeva njihovo preživljavanje u gastrointestinalnom traktu (GIT), ispitano je preživljavanje autohtonih izolata BMK u simuliranim uvjetima GIT. Osobito visok stupanj preživljavanja pri pH vrijednosti simuliranog želučanog soka 2 i u simulaciji soka tankog crijeva, pokazali su bakterijski sojevi: ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14, ZG1-54, BGGO5-3 , BGLE1-6, BGAL1-1 i ZG5-9. Za postizanje probiotičkog učinka potrebno je u organizam unijeti visok broj živih probiotičkih bakterija u koncentriranom, praškastom pripravku koji se može dobiti liofilizacijom. Stoga je u ovom radu ispitano preživljavanje autohtonih izolata BMK, odabranih na temelju in vitro testa simuliranih gastrointestinalnih uvjeta, tijekom liofilizacije, uz dodatak različitih lioprotektora. Autohtoni izolati BMK preživljavaju proces liofilizacije u većem broju kad su prisutni lioprotektori obrano mlijeko, inulin i oligosaharidi. Lactococcus lactis subsp. lactis BGLE1-6 najbolje preživljava u prisutnosti inulina, Lactobacillus pentosus/paraplantarum/plantarum BGGO5-3 uz dodatak prebiotika oligosaharida, dok Lactococcus lactis BGAL1-1 i Lactobacillus pentosus ZG3-17 najbolje preživljavaju proces liofilizacije u obranom mlijeku. Liofilizacija odabranih sojeva BMK s različitim lioprotektorima, doprinosi povećanju broja živih bakterijskih stanica u probiotičkim pripravcima što doprinosi iskazivanju njihovog probiotičkog učinka kad se primjene kao bioterapeutici.

Ključne riječi: autohtoni izolati bakterija mliječne kiseline, inulin, liofilizacija, obrano mlijeko, oligosaharidi, probiotici, probiotičke starter kulture

Rad sadrži: 56 stranica, 13 slika, 13 tablica, 62 literaturnih navoda Jezik izvornika: hrvatskiRad je u tiskanom i elektroničkom (pdf format) obliku pohranjen u : Knjižnica Prehrambeno-

biotehnološkog fakulteta, Kačićeva 23, ZagrebMentor: Dr. sc. Blaženka Kos, izv. prof.Pomoć pri izradi: Dr. sc. Jagoda Šušković, red. prof. Ksenija Habjanič, dipl.ing

Stručno povjerenstvo za ocjenu i obranu: 1. Dr. sc. Jagoda Šušković, red. prof.2. Dr. sc. Blaženka Kos, izv. prof.3. Dr. sc. Tonči Rezić, doc.4. Dr. sc. Jadranka Frece, doc. (zamjena)

Datum obrane: 16. prosinac, 2011.

BASIC DOCUMENTATION CARDUniversity of Zagreb Graduate ThesisFaculty of Food Technology and BiotechnologyDepartment of Biochemical EngineeringLaboratory for Antibiotic, Enzyme, ProbioticAnd Starter Cultures TechnologyScientific areea: Biotechnical sciencisScientific field: Biotechnology

Selection of autochthonous lactic acid bacteria for preparation of probiotic starter culturesAnamarija Perković 90/BPI

Summary: Research was conducted in probiotic concept with the main goal of in vitro selection of the

potential probiotic cultures. Autochthonous lactic acid bacteria (LAB) isolates were identified by sequencing of 16S rRNA genes. Sensitivity of LAB isolates was tested to various groups of antibiotics to exclude the possibility of the spread of antibiotic resistance. LAB isolates showed sensitivity to all tested antibiotics, with exception of Lactobacillus species which were resistant to vankomycin due to their intrinsic resistance. The survival of LAB isolates in simulated gastrointestinal tract (GIT) was examined since it is the main requirement in the selection of probiotic strains. High rate of survival in simulated gastric juice at pH 2.0 and simulated small intestine juice was exhibited by the following bacterial strains: ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14, ZG1-54, BGGO5-3, BGLE1-6, BGAL1-1 and ZG5-9. To achieve the probiotic effect, it is necessary to ingest high numbers of live probiotic bacteria in concentrated, powdered form. LAB can be obtained in such form by lyophilization. LAB isolates (selected on the basis of in vitro test) was tested for survivability during lyophilization. LAB isolates survived the process of lyophilization in higher numbers with lyoprotectants such as skimmed milk, inulin and oligosaharides. Lactococcus lactis subsp. lactis BGLE1-6 survives in highest numbers with inulin present in the system, Lactobacillus pentosus/paraplantarum/plantarum BGGO5-3 survives in highest numbers with oligosaharides as lyoprotectonts while Lactococcus lactis BGAL1-1 and Lactobacillus pentosus ZG3-17 survives the process of lyophilization in highest numbers with skimmed milk. Lyophilization of selected LAB strains with different lyoprotectants contributes to increase in number of live bacterial cells in probiotic formulations thus contributing to the demonstration of the probiotic effect when used as biotherapeutics.

Key words: native lactic acid bacteria isolates, inulin, lyophilization, skimmed milk, oligosaharides, probiotics, probiotic starter cultures

Thesis conatians: 56 pages, 13 figures, 13 tables, 62 referencesOriginal in: CroatianGraduate Thesis is printed and electronic (pdf format) version is deposited in: Library of the

Faculty of Food Technology and Biotechnology, Kačićeva 23, ZagrebMentor: PhD Blaženka Kos, Associated professorTechnical support and assistance: PhD Jagoda Šušković, Full professor Ksenija Habjanič, BScReviewers: 1. PhD Jagoda Šušković, Full professor 2. PhD Blaženka Kos, Associated professor

3. PhD Tonči Rezić, Assistant professor 4. PhD Jadranka Frece, Assistant professor (substitute)

Paper defended: 16 December, 2011.

Sadržaj:

1. UVOD.............................................................................................................................1

2. TEORIJSKI DIO.............................................................................................................2

2.1. Bakterije mliječne kiseline kao probiotici.............................................................2

2.1.1. Izbor sojeva za probiotičku uporabu..............................................................4

2.1.2. Mehanizam djelovanja probiotika.................................................................8

2.2. Liofilizacija probiotičkih bakterija......................................................................12

2.3. Primjena različitih lioprotektora pri liofilizaciji bakterijskih kultura.................15

3. EKSPERIMENTALNI DIO.........................................................................................25

3.1. Materijal..............................................................................................................20

3.1.1. Mikroorganizmi...........................................................................................20

3.1.2. Hranjive podloge i kemikalije......................................................................20

3.1.2.1. Hranjive podloge......................................................................................20

3.1.2.2. Kemikalije................................................................................................21

3.1.3. Aparatura i pribor........................................................................................22

3.2. Metode rada.........................................................................................................22

3.2.1. Održavanje i čuvanje mikroorganizama......................................................22

3.2.2. KOH metoda................................................................................................23

3.2.3. Katalaza test.................................................................................................23

3.2.4. Određivanje pH vrijednosti u supernatantu kulture.....................................23

3.2.5. Izolacija DNA..............................................................................................23

3.2.6. Identifikacija bakterija sekvencioniranjem 16S rRNA gena.......................24

3.2.7. SDS-PAGE površinskih proteina................................................................24

3.2.8. Ispitivanje osjetljivosti autohtonih izolata bakterija mliječne kiseline na

različite antibiotike......................................................................................25

3.2.9. Ispitivanje preživljavanja bakterija u simuliranim uvjetima

gastrointestinalnog trakta............................................................................26

3.2.10. Preživljavanje probiotičkih sojeva tijekom liofilizacije..............................27

3.2.11. Određivanje broja živih mikroorganizama indirektnom metodom..............27

4. REZULTATI.................................................................................................................20

4.1. Osjetljivost na antibiotike i preživljavanje autohtonih bakterija mliječne kiseline

u simuliranim uvijetima gatrointestinalnog trakta..............................................28

4.2. Utjecaj različitih lioprotektora na preživljavanje probiotičkih sojeva i autohtonih

bakterija mliječne kiseline tijekom liofilizacije..................................................39

5. RASPRAVA.................................................................................................................44

5.1. Osjetljivost na antibiotike i preživljavanje autohtonih bakterija mliječne kiseline

u simuliranim uvijetima gatrointestinalnog trakta..............................................44

5.2. Utjecaj različitih lioprotektora na preživljavanje probiotičkih sojeva i autohtonih

bakterija mliječne kiseline tijekom liofilizacije..................................................47

6. ZAKLJUČCI.................................................................................................................47

7. LITERATURA.............................................................................................................61

1. UVOD

DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Uvod

Bakterije mliječne kiseline (BMK) tradicionalno se primjenjuju u proizvodnji

fermentirane hrane, dakle važne su starter kulture u proizvodnji fermentiranih, prvenstveno

mliječnih proizvoda te, zatim u proizvodnji kiselih tijesta, kobasica i, alkoholnih pića.

Pojedini sojevi BMK, osobito oni iz rodova Lactobacillus, su definirani su kao probiotici jer

imaju dokazane pozitivne učinke na zdravlje ljudi i životinja. Probiotik je jedna ili više

kultura živih stanica mikroorganizama koje primijenjene u životinja i ljudi, djeluju korisno na

domaćina poboljšavajući svojstva autohtone mikroflore probavnog sustava domaćina

(Šušković, 1996). Međutim, da bi iskazali svoje pozitivne učinke na zdravlje, probiotički

pripravci moraju sadržavati žive mikrobne stanice u koncentracijama višim od 106 po gramu

proizvoda (Shah, 2007). Zbog toga se istražuju različite metode koje mogu doprinijeti

povećanju preživljavanja probiotika tijekom biotehnološke proizvodnje, čuvanja ili primjene

u različitim proizvodima, te nakon oralne primjene u gastrointestinalnom traktu domaćina.

Mnogi znanstveni radovi opisuju liofilizaciju kao najpogodniju metodu priprave bakterijskih

stanica u praškastom obliku, a kojom se osigurava visoki broj živih bakterijskih stanica kroz

duži vremenski period (G-Alegria i sur., 2004; Capela i sur., 2006; Meng i sur., 2008).

Liofilizacija ili sušenje proizvoda u zamrznutom obliku je postupak sušenja kojim se tekući

dio materijala odvodi sublimacijom. Tijekom liofilizacije razlikuju se dvije faze. Prva je

fazase faza sastoji od zamrzavanja a materijala u tankom sloju pri na temperaturi od -15°C do

-70°C, i pri tome čemu se voda prisutna unutar bakterijskih stanica i u ekstracelularnom

mediju prevodi u led. Druga faza je faza sušenja zamrznutog materijala u vakuumu, pri čemu

se kristali leda sublimacijom prevode direktno u paru, , sublimacijom, što uzrokuje

dehidrataciju bakterijske stanice (Šušković, 2009).

Bakterijske kulture su prilikom zamrzavanja i sušenja u vakuumu izložene stresnim

uvjetima koji uzrokuju oštećenja stanica. Kako bi se ta oštećenja svela na minimum, tijekom

liofilizacije se primjenjuju različiti lioprotektori. Lioprotektori su tvari koje različitim

mehanizmima sprečavaju oštećenja stanica tijekom zamrzavanja, sušenja i skladištenja. U

literaturi su opisani brojni lioprotektori kao što su, primjerice obrano mlijeko, proteini sirutke,

glicerol, betain, adonitol, dekstran, polietilen glikol, šećerni alkoholi manitol i sorbitol, a

najčešće se spominju šećeri poput saharoze, laktoze, trehaloze i glukoze (Carvalho i sur.,

2004; Santivarangkna i sur., 2008; Siaterlis i sur., 2009).

Cilj ovoga rada je bio ispitati zaštitnu ulogu inulina, fruktooligosaharida i obranog

mlijeka u prahu, na preživljavanje autohtonih bakterija mliječne kiseline tijekom liofilizacije.

1


Autohtoni izolati BMLK identificirani su sekvencioniranjem pomoću 16S rRNA gena

te su provedena istraživanja u okviru probiotičkog koncepta s ciljem in vitro odabira

potencijalnih probiotičkih starter kultura.

2


2. TEORIJSKI DIO

3

DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Teorijski dio

2.1. Bakterije mliječne kiseline kao probiotici

Bakterije mliječne kiseline su gram-pozitivni, nesporogeni mikroorganizmi s niskim

sadržajem gvanina i citozina u molekuli DNA, kemoorganotrofi, mezofili i mikroaerofili. One

rRastu na kompleksnim hranjivim podlogama i imaju GRAS status (engl. Generally Regarded

as Safe), a mogu biti homofermentativne ili heterofermentativne. Homofermentativne vrste

proizvode više od 80% mliječne kiseline iz glukoze, dok heterofermentativne vrste proizvode

manje mliječne kiseline (50% ili više), a veće količine octene i mravlje kiseline, ugljičnog

dioksida i etanola. Bakterije mliječne kiseline proizvode i komponente arome poput diacetila,

acetoina i acetaldehida. Ove bakterije mogu rasti u najrazličitijim, katkada i ekstremnim

uvjetima, acidotolerantne su te sprječavaju rast ostalih mikroba proizvodeći mliječnu kiselinu

i zbog toga uspješno rastu i razmnožavaju se na različitim staništima. Bakterije mliječne

kiseline mogu biti svrstane u slijedeće rodove: Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus,

Pediococcus, Lactococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Vagococcus, Aerococcus,

Alloicoccus, Tetragenococcus, Atopobium, Bifidobacterium i Sporolactobacillus. Iako rodovi

Bifidobacterium i Sporolactobacillus filogenetički pripadaju drugim grupama bakterija, ovdje

su uključene zbog svojih fizioloških karakteristika, odnosno proizvodnje mliječne kiseline kao

finalnog proizvoda metabolizma (Šušković, 2009).

BMK su važni industrijski važni mikroorganizmi koji se primjenjuju kao funkcionalne

starter kulture u proizvodnji različitih fermentiranih proizvoda poput jogurta, sireva, maslina,

kiselog zelja, krastavaca, kobasica, gljiva, kruha i alkoholnih pića ameđu kojima se istuču ,

pivoa, brandy i, whisky. Vrlo brzo proizvode mliječnu kiselinu, i spuštaju pH vrijednost

prehrambenog proizvoda, ite utječu na aromu, proizvodnjom diacetila i acetaldehida, teksturu

, proizvodnjom različitih egzopolisaharida, te na nutritivnu vrijednost proizvoda. Pojedini

sojevi BMK proizvode antimikrobne supstancije bakteriocine, primjerice, soj Lactococcus

lactis spp. lactis proizvodi bakteriocin nisin koji se primjenjuje kao biokonzervans. Osim

proizvodnjom bakteriocina, BMK mogu djelovati antagonistički i zbog sniženjema pH

uslijed nakupljanja organskih kiselina kao što su mliječna kiselina i octena kiselina, te zbog

proizvodnjeproizvodnjom diacetila i vodikova peroksida u aerobnim uvjetima. Na taj

načinTim mehanizmima sprječava se kvarenje proizvoda tei mu se produžuje se vijek

trajanja. proizvoda. One se također nalaze u našem probavnom traktu gdje su kao dio prirodne

mikrobne populacije i uključene su u naš metabolizam. Metchnikoff je početkom prošlog

stoljeća uočio kako BMK unesene fermentiranim mliječnim proizvodima povoljno utječu na

2


regulaciju mikroflore crijevnog trakta. Međutim, tek se zadnjih tridesetak godina nastoji

razviti Metchnikoffova teorija i pronaći prirodan način poboljšanja zdravlja ljudi i životinja

korištenjem fermentiranih proizvoda i čistih kultura BMK.

Izraz probiotik se odnosi na proizvode koji sadrže žive mikroorganizme, kao što su

liofilizirane stanice ili u fermentiranim proizvodimaa, poboljšavaju zdravlje ljudi i životinja

što može uključivati i poticanje rasta životinja. D, djeluju u ustima ili i u probavnom traktu

preko hrane ili u obliku kapsula, te u gornjem respiratornom traktu (aerosol) ili u

urogenitalnom traktu području (lokalna primjena) (Šušković, 2009).

Mehanizam djelovanja probiotika je raznolik. Oni inhibiraju rast nepoželjnih

mikroorganizama u gastrointestinalnom traktu proizvodnjom antibakterijskih supstancija,

poput primarnih metabolita mliječne i octene kiseline, diacetila, acetaldehida, vodikova

peroksida i bakteriocina, zatim natjecanjem za hranjive tvari te, natjecanjem za mjesta vezanja

na crijevniom epitelu. Oni također modificiraju metaboličke procese u crijevima tako što

povećavaju aktivnost nekih enzima kao npr. β-galaktozidaze, a smanjuju aktivnost enzima

koji sudjeluju u kancerogenim procesima, kao što su β-glukuronidaza, nitroreduktaza,

azoreduktaza i steroid-7-α-dehidroksilaza. Također stimuliraju imunološki sustav domaćina

povećanjem razine antitijela i povećanjem aktivnosti makrofaga. Ciljno mjesto djelovanja

probiotika je narušen integritet crijevnae sluznicae čiji je integritet narušen, a koja je

predstavlja obrambenua barijerua nepoželjnog i nekontroliranog prolaska antigena, odnosno

patogenih mikroorganizama.

Probiotici se klasificiraju kao bioterapeutici, odnosno proizvodi za terapiju ili

prevenciju bolesti te kaoi probiotičke kulture, odnosno proizvodie koji promoviraju zdravlje i

koji služe kao dodaci hrani ili služe se koriste za proizvodnju funkcionalne hrane. Počeli su se

popularizirati uslijed nedostatka učinkovitih antibiotika te zbogi razvoja antibiotičke

rezistencije. Naime, velikom primjenom kemijskih dodataka i antibiotika u prehrani, dolazi do

kroničnog poremećaja crijevne mikroflore i nedjelotvornosti kemoterapeutika pri liječenju

različitih infektivnih bolesti. Zbog toga se u prehrani i terapiji primjenjuju probiotici zbog

zahvaljujućinjihova širokomg rasponu njihovoga korisnog djelovanja. Oni poboljšavaju

metabolizam laktoze, stimuliraju imunološki sustav, suzbijaju urogenitalne i crijevne

infekcije, reguliraju koncentraciju kolesterola, imaju antitumornu aktivnost, te suzbijaju

alergijske reakcije i modificiraju crijevnu mikrofloru.

3


2.1.1. Izbor sojeva za probiotičku uporabu

Bakterijski sojevi za probiotičku uporabu trebaju zadovoljiti tzv. opće, tehnološke i

funkcionalne izborne kriterije (Slika 1). Ako je probiotički soj namijenjen za specifičnu

zdravstvenu primjenu može se još dodatno postaviti “specifičan izborni kriterij” (Sanders i

Huis in’t Veld, 1999).

Probiotička svojstva koja iskazuje određeni bakterijski soj ne mogu se pripisati

drugom soju, bez obzira pripadaju li istoj ili različitim bakterijskim vrstama. Poželjno je da

probiotički soj bude humanog podrijetla, te da se suvremenim molekularnim metodama

odredi kojem rodu i vrsti pripada. Najbolji je dokaz o zdravstvenoj sigurnosti BMK je

duga tradicija njihove primjene bez štetnog utjecaja na zdravlje čovjeka, zbog čega su,

prema US FDA, dobile GRAS (“generally recognised as safe”) status.

Odabir potencijalnih probiotičkih sojeva temelji se na in vitro istraživanjima što

jesu dobar preduvjet za utvrđivanje probiotičkih svojstava u in vivo uvjetima. Pri tome

se koriste različiti statički i dinamički modeli koji simuliraju uvjete u humanom GIT

(Havennar i sur., 1992; Dunne i sur., 1999; Alander i sur., 1999).

4

OPĆI KRITERIJI Zdravstvena sigurnost

Otpornost prema niskom pH, želučanom soku, soku gušterače i žučnim solima

TEHNOLOŠKI KRITERIJ

Preživljavanje i zadržavanje aktivnosti tijekom priprave i čuvanja probiotičkog

proizvoda

Adhezija na crijevni epitel

Antimikrobno djelovanje, posebno prema patogenim mikroorganizmima

Poticanje imunološkog odgovora

i/ili

i/ili

Podrijetlo

i/ili

Promjene mikrobnog metabolizma u probavnom traktu

FUNKCIONALNI KRITERIJI


Slika 1. Opći, tehnološki i funkcionalni kriteriji za odabir probiotičkih sojeva (Sanders i Huis

in’t Veld, 1999, Kos, 2001, Šušković i sur., 2001).

Glavne prepreke za preživljavanje potencijalnih probiotičkih sojeva u GIT

predstavljaju niski pH želuca, žučne soli tei probavni enzimi, kao što su lizozim, pepsin i

enzimi gušterače. Bakterije roda Lactobacillus pokazale su uglavnom veću otpornost prema

niskim pH-vrijednostima u usporedbi sa sojevima Bifidobacterium vrsta (Dunne i sur., 1999).

Nadalje, jedan od važnih izbornih kriterija je preživljavanje i rast potencijalnih probiotičkih

sojeva na hranjivoj podlozi kojoj je dodano 0,15-0,3 % žučnih soli, što odgovara fiziološkoj

koncentraciji u ileumu čovjeka (Goldin i Gorbach, 1992). Visok stupanj preživljavanja

5


probiotičkih sojeva u GIT prijeko je potreban preduvjet za adheziju, tj. vezanje na crijevni

epitel, zatim za antimikrobno djelovanje i stimulaciju imunološkog sustava. Probiotičko

djelovanje koje nije uvjetovano aktivnošću stanica odnosi se na poboljšanje metabolizma

laktoze i neke imunološke modifikacije (Marteau i Rambaud, 1993; Fuller i Perdigon, 2000).

Utvrđivanje antagonističkog djelovanja potencijalnih probiotičkih sojeva prema patogenim i

drugim mikroorganizmima provodi se različitim in vitro metodama. Posebnu pozornost

privlači bakteriocinska aktivnost BMK (Kos, 2001; Cotter i sur., 2005; Šušković i sur., 2010).

Nadalje, važno je osigurati i optimalne uvjete tijekom priprave i čuvanja probiotika (sastav

hranjive podloge, temperatura rasta, trajanje fermentacije, miješanje, homogenizacija itd.) radi

mikrobiološke stabilnosti proizvoda. Dodatkom protektora, inkapsuliranjem i

mikroinkapsuliranjem probiotičkih sojeva tijekom zamrzavanja, sušenja ili čuvanja, može se

bitno povećati broj živih stanica po gramu pripravka (Laulund, 1994). Nakon provedenih in

vitro istraživanja za izbor probiotičkih sojeva, slijede istraživanja na animalnim modelima te

zatim i i klinička istraživanja (Havenaar i sur., 1992; Reid, 1999). Dnevno potrebna,

minimalna doza živih mikrobnih stanica, koja bi mogla polučiti korisni učinak na zdravlje, je

između 108 i- 1010 stanica/mL, ali je još uvijek predmet mnogih rasprava (Ouwehand i sur.,

2002, Swenson, 1999; Sanders i Huis in’t Veld, 1999). Popis svih očekivanih svojstava

potencijalnog probiotičkog soja prema općim (1-6), tehnološkim (7-10) i funkcionalnim

zahtjevima (11-17), prikazan je u Tablici 1. (Kullen i Klaenhammer, 1999; Kos, 2001;

Šušković i sur., 2001).

6


Tablica 1. Zahtjevi za izbor probiotičkih sojeva (Kullen i Klaenhammer, 1999; Kos,

2001;Šušković i sur., 2001).

1. točna taksonomska identifikacija

Opć

i zah

tjev

i

2. humano podrijetlo za humane probiotike3. netoksičnost i nepatogenost

4. genetička stabilnost (nema prijenosa plazmida)5. otpornost prema žučnim kiselinama6. otpornost prema niskim pH vrijednostima

7. stabilnost poželjnih karakteristika tijekom priprave kulture, skladištenja i isporuke

Teh

nolo

ški z

ahtj

evi

8. visoka razina broja živih bakterija u probiotičkom proizvodu (106-108 mL-1 ili g-1), npr. 100 g proizvoda osigurava 108-1010 živih stanica

9. brzo i lako razmnožavanje, izdvajanje, koncentriranje, smrzavanje i liofiliziranje tijekom procesa priprave probiotičkih kultura, te visok stupanj preživljavanja tijekom čuvanja i distribucije

10. dobivanje poželjenih organoleptičkih svojstava kad su uključeni u fermentacijske procese

11. sposobnost preživljavanja, razmnožavanja i metabolizamske aktivnosti u "ciljanom" području primjene u organizmu

Funk

cion

alni

zah

tjev

i12. sposobnost adhezije i kolonizacije crijevnog epitela13. sinteza antimikrobnih supstancija, uključujući bakteriocine, vodikov peroksid i organske

kiseline

14. antagonistička aktivnost prema patogenim i kariogenim bakterijama15. mogućnost kompeticije sa sudionicima normalne mikroflore, uključujući iste ili srodne vrste,

otpornost prema bakteriocinima, kiselinama ili drugim antimikrobnim supstancijama koje proizvodi autohtona mikroflora

16. imunostimulatorni učinak17. sposobnost iskazivanja jednog ili više klinički dokumentiranih korisnih učinaka na zdravlje

7


2.1.2. Mehanizam djelovanja probiotika

Mehanizam probiotičkog djelovanja nije još u potpunosti razjašnjen. Prema Fulleru

(1989, 1992),; Huis in’t Veld i Havenaaru (1993) te; Šušković i sur. (2001) probiotičko

djelovanje bakterija mliječne kiseline (BMK) izražava se pomoću tri glavna mehanizma:

A. Inhibicija rasta nepoželjnih mikroorganizama u intestinalnom traktu:

a) proizvodnjom antibakterijskih supstancija, što obuhvaća primarne metabolite: mliječnu

kiselinu, octenu kiselinu, diacetil, acetaldehid, vodikov peroksid i bakteriocine (proteinske

supstancije s antimikrobnim djelovanjem, u prvom redu prema srodnim bakterijskim

vrstama);

b) natjecanjem za hranjive tvari, u prvom redu za neprobavljive ugljikohidrate u debelom

crijevu;

c) natjecanjem za mjesta vezanja u intestinalnom traktu. Adhezija probiotičkih sojeva u

intestinalnom traktu može biti specifična i nespecifična. Specifična adhezija označava

vezanje adhezina na površini bakterijske stanice s receptorom na crijevnoj epitelnoj stanici.

Nespecifična adhezija obuhvaća hidrofobne i elektrostatske interakcije koje su često

inicijalna faza koja prethodi specifičnoj adheziji. Adhezija bakterija na sadržaj u lumenu

crijeva također je nespecifična.

B. Modifikacija metabolizamskih procesa u intestinalnom traktu:

a) povećanjem aktivnosti nekih enzima kao npr. β-galaktozidaze, što omogućava

podnošljivost laktoze pri deficijenciji tog enzima;

b) smanjenjem aktivnosti enzima koji sudjeluju u kancerogenim procesima kao što su: β-

glukuronidaza, nitroreduktaza, azoreduktaza i steroid-7α-dehidroksilaza.

C. Stimulacija imunološkog sustava domaćina:

a) povećanjem razine protutijela

b) povećanjem makrofagne aktivnosti

Prema posljednjim istraživanjima, oralno primijenjeni laktobacili poboljšavaju imunost

domaćina jer povećavaju broj cirkulirajućih i lokalnih protutijela, koncentraciju gama

interferona, aktivnost makrofaga i broj stanica ubojica. Nakon adhezije probiotičkih BMK na

crijevnu sluznicu (mukozu) slijedi njihova translokacija do limfoidnog tkiva crijeva (engl.

8


gut-associated lymphoid tissue, GALT), što je presudan korak u jačanju mukozalne i

sistemske imunosti (Fuller i Perdigon, 2000; Shu i Gill, 2002, Bakker-Zierikzee i sur., 2006).

Na temelju iznesenog mehanizma probiotičkog djelovanja, mogući su poželjni učinci

probiotičkih sojeva na zdravlje (Tablica 2.). Mehanizam probiotičkog djelovanja iznesen pod

točkom A sudjeluje u sprječavanju gastrointestinalnih infekcija, dok mehanizmi probiotičkog

djelovanja pod točkama B i C omogućavaju smanjenje učestalosti raka debelog crijeva te

općenito antikancerogeno djelovanje, smanjenje koncentracije kolesterola u krvi, poboljšanje

metabolizma laktoze, sprječavanje zatvora (konstipacije), suzbijanje alergija, stimulaciju

imunokompetentnih stanica (Limfocita B i T, stanica ubojica) i povećanje makrofagne

aktivnosti (Šušković i sur., 2001).

Nakon što je određeni autohtoni izolat ispunio opće i funkcionalne izborne kriterije za

probiotičke sojeve, te je okarakteriziran kao probiotik, potrebno je i ispitati da li zadovoljava

i tehnološke kriterije, te je tek nakon toga moguće proizvesti probiotički pripravak koji će se

primjeniti kao probiotička starter kultura ili kao bioterapeutik.

9


Tablica 2. Poželjna svojstva i mehanizam djelovanja probiotičkih bakterija (Sanders i Huis

in’t Veld, 1999; Kos, 2001).

Poželjna svojstva probiotika Mehanizam djelovanja probiotika

Sudjelovanje u metabolizmu laktoze β-galaktozidazna aktivnost probiotičkog soja u tankom crijevu.

Sprječavanje gastrointestinalnih i urogenitalnih infekcija

Antimikrobno djelovanje mliječne kiseline, kratkolančanih masnih kiselina, vodikovog peroksida, diacetila i bakteriocina.

Stimulacija imunološkog sustava (povećana proizvodnja protutijela).

Natjecanje za hranjive komponente i mjesta vezanja u GIT.

Antikancerogeno djelovanje

Sprječavanje rasta bakterija koje proizvode prokancerogene enzime: β-glikozidazu, β-glukuronidazu, nitroreduktazu, azoreduktazu i inhibicija djelovanja tih enzima.

Stimulacija imunološkog sustava (aktivacija makrofaga koji djeluju tumoricidno).

Utjecaj na koncentraciju sekundarnih žučnih soli.

Modulacija imunološkog sustava

Stimulacija nespecifičnog (fagociti) i specifičnog imunološkog odgovora: aktivacija humoralnog imunološkog odgovora (IgA i IgG) i staničnog imunološkog odgovora (T-limfociti).

Suzbijanje alergija Sprječavanje translokacije antigena u krv.Snižavanje razine masnoće u krvi, sprječavanje bolesti srca i krvnih žila

Asimilacija kolesterola.Aktivnost hidrolaze žučnih soli.

Suzbijanje hepatičke encefalopatije Inhibicija rasta mikroorganizama koji proizvode ureazu.

U Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura na

Prehrambeno-biotehnološkom fakultetu, na temelju istraživanja provedenih u sklopu

probiotičkog koncepta, probiotičke bakterije Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus

10


plantarum L4 i Enterococcus faecium L3 su ispunile vrlo stroge izborne probiotičke

kriterije (Šušković, 1996, Kos, 2001, Šušković i sur., 2001; Šušković, 2010), te je razvijen

proces biotehnološke proizvodnje probiotičkih bakterija u liofiliziranom obliku (Slika 2).

Slika 2. Primjer proizvodnje liofiliziranih probiotičkih bakterija kao živih lijekova u

Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura na Prehrambeno-

biotehnološkom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu (Šušković, 2009).

2.2. Liofilizacija probiotičkih bakterija

Precjepljivanje

Inokulum

Mikrobiološka i genetička kontrola

Zbirka probiotičkih sojevaLaboratorija za tehnologiju antibiotika, enzima,

probiotika i starter kultura

Uzgoj

Odvajanje hranjive podloge

Vlažna biomasa probiotičkog soja

Duboko smrzavanje

LIOFILIZACIJA

Probiotička bakterija- živi lijek -

Čuvanje na +4 oC

Hranjiva podloga

Sterilizacija

Mikrobiološkai genetička kontrola

Kontrola procesa proizvodnje

Mikrobiološka i genetička kontrola

Dodatak krioprotektora i

lioprotektora

MIKROINKAPSULACIJA

MIKROINKAPSULACIJA

11


Probiotičke bakterije se učestalo primjenjuju kao pripravci u koncentriranom obliku s

ciljem direktne inokulacije u prehrambene proizvode. Preživljavanje i aktivnost koncentrirane

probiotičke kulture mora biti dovoljno visoka da bi proces fermentacije započeo nedugo

nakon inokulacije funkcionalne starter kulture. Koncentrirane probiotičke kulture su dostupne

u zamrznutom i suhom, praškastom obliku. Suhe, praškaste kulture se koriste zbog malih

troškova skladištenja i transporta, jer se ne moraju čuvati na niskim temperaturama. Danas se

primjenjuje nekoliko različitih metoda sušenja vlažne biomase BMK :

a) sušenje u vakuumu (manje od 1 mmHg) pri temperaturi od 40°C do 45°C

b) sušenje biomase raspršivanjem

c) kontrolirano sušenje u vakuumu pri niskim temperaturama (od -2°C do -3°C)

d) sušenja biomase iz zamrznutog stanja sublimacijom tzv. liofilizacija

Liofilizacijom se probiotici stabiliziraju kako bi bili upotrebljivi tijekom duljeg

perioda čuvanja te tijekom primjene kao bioterapeutika i u proizvodnji funkcionalne hrane.

Liofilizacija se provodi u uređaju nazvanom liofilizator (Slika 3.), a sastoji od dvije faze: faze

zamrzavanja i faze sušenja. Stanice se u prvoj fazi zamrzavaju pri temperaturi od -15°C do -

70°C, a u drugoj fazi se suše tako što se zamrznuta voda iz krutoga stanja, sublimacijom,

prevodi direktno u paru pod vakuumom i niskim temperaturama. Postizanje vakuuma je od

presudnog značaja za uspješnu liofilizaciju. Ukupan tlak unutar uređaja mora biti niži od tlaka

pare na površini pripravka koji se liofilizira, a tlak pare na površini kondenzatora mora biti

niži od tlaka pare u unutrašnjosti liofilizatora. Ova razlika tlakova upravlja brzinom sušenja.

Uobičajeni vakuum koji se primjenjuje tijekom liofilizacije iznosi između 50 i 100 mmHg.

Tijekom sušenja razlikuju se dvije faze: faza primarnog sušenja i faza sekundarnog sušenja.

Primarno je sušenje iz zamrznutog stanja (od -15°C do -70°C), tijekom kojeg se u pripravak

dovodi toplina. Primarno sušenje završava kada u pripravku preostane još samo 6-8% vode jer

tada u pripravku više nema leda pa zbog čegai završava i sublimacija tada završava.

Primarnim sušenjem se iz pripravka izdvaja tzv. slobodna voda. Sekundarno sušenje je

sušenje iz „tekućeg“ stanja i njime se nastoji ukloniti tzv. vezana voda. Ako vezana voda

ostane u pripravku, ona može spriječiti njegovo uspješno čuvanje, osobito pri sobnoj

temperaturi. Temperatura se u vakuum sušnici održava pomoću tople vode koja cirkulira kroz

police na kojima se nalaze bočice. Vodena para se kondenzira u kondenzatorima koji se hlade

rashladnim sredstvom. Tijekom cijeloga procesa se mora osigurati sterilnost. Pri opadanju

brzine sušenja materijala dolazi do izjednačavanja temperature preparata i okoliša. Proces

sušenja završava kada se ove temperature izjednače. Izbor konačne temperature sušenja ovisi

12


o samoj termostabilnosti mikroorganizama. Preostalih 2-3% vlage se teško uklanja, najčešće

pri 60-70°C, kroz 2-3 sata.

Slika 3. Liofilizator Christ Alpha 1-2 LD PLUS iz Laboratorija za tehnologiju

antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura na Prehrambeno-biotehnološkom

fakultetu Sveučilišta u Zagrebu.

Tijekom liofilizacije dolazi do inaktivacije pojedinih stanica i to najčešće tijekom faze

zamrzavanja. Prema literaturi, 60-70% stanica koje prežive u fazi smrzavanja opstaju također

i u fazi sušenja (Meng i sur. 2008). Tijekom zamrzavanja, oko stanice se formira led koji

uzrokuje povećanje osmotskog tlaka izvanstanične otopine te zbog toga dolazi do

dehidratacije stanice. Koncentracija otopina unutar i izvan stanice, a tako i osmotski tlak, će

se povećavati padom temperature. Dva su načina zamrzavanja -, sporo ili brzo zamrzavanje

(Slika 4.). Tijekom sporog zamrzavanja stanice su izložene temperaturama od 20°C, 4°C, -

4°C,-20°C te -80°C i to kroz 3h, dok se tijekom brzog zamrzavanja stanice naglo zamrzavaju

pri temperaturi od -80°C. Najveći broj stanica odumire tijekom sporog zamrzavanja pri

temperaturi između -4 i -20°C (Santivarangkna i sur., 2008). Tijekom sporog zamrzavanja

izvan stanice se postupno stvara led. To dovodi do dehidriranja stanice i njenog oštećenja, dok

se pri brzom zamrzavanju to može izbjeći, jer nastaju manji kristali koji imaju veću površinu

isparavanja leda. U tom slučaju Tada dolazi i do stvaranja viskoznije otopine koja okružuje

13


kristale leda nakon zamrzavanja. Viskoznija otopina pri sublimaciji zadržava porozniju formu

što olakšava sublimaciju.

Slika 4. Shematski prikaz „ponašanja“ stanice tijekom zamrzavanja (preuzeto od

Santivarangkna i sur., 2008): a) Tijekom postupnog zamrzavanja povećava se koncentracija

kristala vode izvan stanice. Voda difundira i zamrzava se van stanice. b) Tijekom optimalne

brzine zamrzavanja količina kristala leda je veća. Difuzija vode je usporena povećanjem

viskoziteta. Kada je brzina zamrzavanja dovoljno visoka, stanice dosegnu temperaturu

stabilizacije prije nego što previše vode difundira izvan stanice. c) Pri velikoj brzini

zamrzavanja naglo smanjenje temperature prekida difuziju vode van stanice usprkos velikom

koncentracijskom gradijentu. Kristali leda se stvaraju unutar stanice.

Veličina same bakterijske stanice također je značajna za preživljavanje tijekom

liofilizacije. Što je veća površina stanice, dolazi do većeg njihovog oštećenja stanice

stvaranjem leda izvan stanice. Male sferne stanice poput stanica onih kod enterokoka, su

otpornije su na smrzavanje i liofilizaciju nego dugački štapićasti lactobacili (Meng i sur.,

2008).

Prilikom sušenja također dolazi do oštećenja stanice jer uklanjanje vezane vode uzrokuje

oštećenje strukture proteina, stanične stjenke i citoplazmine membrane. Voda je pomoću

različitih nekovalentnih interakcija vezana na makromolekule prisutne u staničnoj stjenci i

citoplazminoj membrani, čime se stabilizira njihova struktura i omogućuje odvijanje važnih

bioloških funkcija unutar stanice. Stoga uklanjanjem vezane vode tijekom sušenja može doći

14


do narušavanja strukture makromolekula, što opet uzrokuje i gubitak bioloških funkcija.

Prema literaturi, tijekom sušenja se prvenstveno oštećuju lipidi unutar citoplazmine

membrane jer dolazi do njihove oksidacije. Također je posljedica i gubitak konformacije

molekula DNA i RNA, što ometa DNA replikaciju, transkripciju i translaciju proteina (Meng

i sur., 2008). Da bi oštećenja bakterijskih stanica tijekom sušenja i skladištenja bila

minimalna, potrebno je nadzirati brojne parametre, poput početne koncentracijea biomase

mikroorganizama, uvjeta tijekom bakterijskog rasta, sastava hranjive podloge i, medija

tijekom procesa sušenja tei uvjeta rehidratacije.

Liofilizacija, iako relativno skup proces, koji zahtjeva sterilnost i hermetičnost, ima i

brojne prednosti u usporedbi s drugim metodama čuvanja bakterijskih kultura. Prednost

liofilizacije pred drugim metodama je prvenstveno mogućnost postizanja veće stabilnosti

liofiliziranog pripravka i dobro otapanje liofilizirane suspenzije. Također je kod liofilizacije

smanjena mogućnost kontaminacije, minimalna su oštećenja bakterijskih stanica ii minimalni

gubici aktivnosti termolabilnih supstancija, rehidratacija je brza i cjelovita, a uzorkovanje

finalnog proizvoda je precizno i sterilno. U današnje vrijeme traže se alternativne metode koje

bi zamijenile skup postupak liofilizacije, a to su npr. vakuum sušenje, sušenje u struji toplog

zraka i sušenje u lebdećem sloju, ali se tim metodama još uvijek ne postiže dovoljno visok

postotak preživljavanja mikroorganizama (Santivarangkna i sur., 2007). Postupak liofilizacije

kojim se proizvode probiotičke bakterije u praškastom obliku u Laboratoriju za tehnologiju

antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta

prikazan je na slici 2.

2.3. Primjena različitih lioprotektora pri liofilizaciji bakterijskih kultura

Lioprotektori su tvari koje se dodaju u medij prije liofilizacije kako bi se stanice

zaštitile, te povećao postotak preživljavanja tijekom dehidratacije. Kao lioprotektori se često

primjenjuju različiti šećeri jer su ekonomski isplativi, kemijski su neškodljivi, te te jer se često

koriste u prehrambenoj industriji. Prema literaturi, šećeri poput trehaloze, sorbitola, manoze,

saharoze, manitola i laktoze se uspješno primjenjuju kao lioprotektori tijekom liofilizacije.

Uloga lioprotektora osobito je značajna u procesu sušenja, ali i tijekom kasnijeg skladištenja

bakterijskih kultura (Santivarangkna i sur., 2008). Pretpostavlja se da utjecaj lioprotektora

ovisi i o hranjivoj podlozi primijenjenoj za uzgoj mikroorganizma i medija u kojem se

provodi sušenje, odnosno liofilizacija bakterijske kulture. Primjerice, prema Santivarangkna i

15


sur. (2008), saharoza ima značajniji protektivni učinak tijekom liofilizacije ako su bakterijske

stanice prethodno rasle u MRS hranjivoj podlozi koja je sadržavala saharozu umjesto glukoze.

Lioprotektori se također mogu dodati u hranjivu podlogu prije fermentacije kako bi pospješili

prilagodbu bakterije na novi okoliš (Meng i sur., 2008). Osim šećera, kao lioprotektori mogu

se primijeniti i obrano mlijeko u prahu, proteini sirutke, glicerol, betain, adonitol i polimeri

poput dekstrana i polietilen glikola.

Preživljavanje BMK tijekom liofilizacije ovisi o količini šećera tijekom rasta jer su šećeri

primarni izvor ugljika, ali previsoka koncentracija šećera može uzrokovati smrt stanice uslijed

naglog povećanja osmotskog tlaka. Zbog toga se tijekom rasta stanica u hranjivu podlogu

dodaju odgovarajuće topljive tvari tj. osmoliti. To su male organske molekule koje ne utječu

na stanične funkcije i koriste se za prilagođavanje osmotskog tlaka kako stanice ne bi

doživjele osmotski stres. Štite citoplazminu membranu i proteine pri zamrzavanju, sušenju i

visokim temperaturama. To mogu biti različite aminokiseline poput glutamata ili prolina te

kvaterni amini poput betaina i karnitina. Makromolekule unutar stanice imaju veći afinitet

prema vodi nego prema topljivim tvarima te se voda prekomjerno nakuplja na površini

makromolekula (Slika 5.). Na taj način se stabilizira prirodna konformacija makromolekula.

Topljive tvari su veće molekule nego molekule vode te zbog svojega oblika ne pristaju na

površinu makromolekula. Češće dolazi do stvaranja veza topljiva tvar - voda nego veza voda -

voda ili topljiva tvar - topljiva tvar. Povećanjem veza voda - voda dolazi do stvaranja naslaga

topljivih tvari. Tijekom sušenja, tj. uklanjanja vode, može doći do oštećenja stanice ako je u

suspenziji prisutna visoka koncentracija topljivih tvari, soli ili proteina. Do pomanjkanja

količine citoplazmatske vode i oštećenja stanice može doći pri više od 0,3 g H2O/suhoj tvari

(Santivarangkna i sur., 2008). Tijekom osmotskoga šoka, u bakterijskoj stanici se nakupljaju

topljive tvari. Kako bi se topljive tvari akumulirale, potreban je utrošak energije, stoga je

njihovo nakupljanje potrebno inducirati tijekom bakterijskog rasta jer tada stanica raspolaže

izvorima energije. Bakterije nemaju sposobnost sinteze određenih tvari de novo poput prolina

ili betaina, pa je potrebno osigurati njihov izvor ili prekursore u hranjivoj podlozi (Le i sur.,

2007). Uz mliječnu kiselinu, BMK proizvode i neke druge metabolite koji povećavaju stupanj

preživljenja tijekom sušenja. Tako u prisutnosti saharoze ili fruktoze bakterija Leuconostoc

(pseudo)mesenteroides proizvodi veliku količinu manitola koji stabilizira stanice pri niskom

aktivitetu vode i štiti stanicu od oksidacije. U prisutnosti laktoze, fruktoze i galaktoze

Lactobacillus helveticus proizvodi veće količine egzopolisaharida koji zaštićuju stanice pri

isušivanju (Santivarangkna i sur., 2008).

16


Slika 5. Stabilizacija A) proteina i B) citoplazmine membrane dodatkom šećera pri čemu

nastaje hidratizirani sloj (sivo obojeno) oko proteina i membrane što održava njihovu nativnu

konformaciju (Santivarangkna i sur., 2008).

Tijekom sušenja se smanjuje količina vode u stanicama kako bi se usporili metabolički

procesi i sačuvala stanična struktura i stanične funkcije tijekom skladištenja. Stanica bi trebala

sadržavati 0,1 g H2O/suhoj tvari, a nikako više od 0,3 g H2O/suhoj tvari (Santivarangkna i

sur., 2008). Pri niskim koncentracijama vode stanične makromolekule poput DNA, RNA i

proteina, a i lipidi unutar citoplazmine membrane mogu se oštetiti. Oštećenje citoplazmine

membrane tijekom sušenja se temelji na činjenici da se stabilnost lipida održava ravnotežom

između Van der Waalsovih sila i sila odbijanja molekula poput odbijanja hidrofilnih

molekula. Zbog toga su lipidi termodinamički nestabilni i lako dolazi do njihova oštećenja.

Oštećenje membrane se očituje povećanjem osjetljivosti stanica na NaCl ili povećanjem

koncentracije intracelularnih enzima poput laktat dehidrogenaze u mediju u kojima se provodi

ponovna rehidratacija sušene kulture. U citoplazminoj membrani fosfolipidi su hidratizirani.

Uklanjanjem vode povećavaju se Van der Waalsove sile između lanaca ugljikovodika.

Citoplazmina membrana sadrži oko 0,25 g H2O/g suhe tvari i tijekom uklanjanja vode dolazi

do stresa unutar membrane i fosfolipidi moraju podnijeti prelazak iz tekuće faze u gel fazu.

Iako se u staničnoj membrani nalaze najčešće otopljeni i u tekućoj fazi, oni također često

prelaze u gel fazu. Također dolazi i do povećavanja temperature unutar membrane. Povećanje

temperature se najčešće očituje kada je količina vode u stanici manja od 0,2 g H2O/g suhe

tvari. Primjerice, kod funkcionalne starter kulture Lactobacillus plantarum uočena je

promjena temperature od 4°C u stanici bogatoj vodom pa sve do 20°C u suhim stanicama

(Santivarangkna, i sur., 2008). Šećeri mogu utjecati na snižavanje temperature pri kojoj

17


stanica prelazi iz tekućeg stanja u gel stanje (u daljnjem tekstu Tm). Upravo je to razlog što se

mnogi šećeri primjenjuju kao lioprotektori.

Postoje dvije hipoteze o ulozi šećera u snižavaju Tm (Slika 6.). Prema prvoj hipotezi za

taj učinak su zaslužne vodikove veze između fosfatne grupe fosfolipida i hidroksilne grupe

šećera. Voda unutar membrane opkoljuje hidrofilnu glavu fosfolipida i malo zadire do

hidrofobnog djela koji se sastoji od estera glicerola i viših masnih kiselina. Tako je

ustanovljeno da trehaloza može tvoriti vodikove veze s karbonilnom grupom fosfolipida. Pri

usporedbi sa saharozom ustanovljeno je da, za manje nego 18 molekula po molekuli lipida, tri

ili četiri molekule vode su zamijenjene saharozom ili trehalozom, sedam molekula vode su

čvrsto vezane na karbonilnu skupinu i mogu biti zamijenjene jedino trehazolom i sedam

molekula vode su čvrstim vezama vezane za fosfat i mogu biti zamijenjene saharozom ili

trehalozom ako je dehidratacija brza. Polisaharidi se usprkos svojoj veličini također mogu

umetnuti u fosfolipidnu membranu i sniziti Tm. Međutim, interakcija između polisaharida i

fosfolipida ovisi o savitljivosti strukture šećera. Ako polisaharidi imaju krutu strukturu

interakcije između njih i fosfolipida ovise o njihovoj veličini. Tako npr. inulin koji ima

nasumičnu strukturu tzv. „slučajno klupko“ (engl. „random coil“) stvara čvršću vezu sa

membranom nego, primjerice, polisaharid levan koji ima strukturu uzvojnice.

Prema drugoj hipotezi, sile odbijanja između hidrofilnih molekula razdvajaju membranu

fosfolipida u prisutnosti prekomjerne količine vode. Tijekom sušenja, pada koncentracija

vode i sile odbijanja su sve manje tei dolazi do stresa porastom kompresije uzrokovane

približavanjem fosfolipida u membrani. Šećeri limitiraju prekomjerno približavanje molekula

fosfolipida osmotskim i volumetrijskim karakteristikama i uzrokuju pojavu kristalizacije.

Naime, povećane koncentracije šećera uzrokuju povećavanje osmotskog tlaka u otopini i

granična voda se uklanja s površine membrane. Nadalje, sam volumen umjereno velike

molekule šećera držat će fosfolipide odvojenima. Šećer također može tijekom sušenja postati

krut i stvarati mehanički otpor u međumembranskom prostoru te na taj način također može

spriječiti približavanje molekula fosfolipida. Sniziti Tm mogu samo šećeri kojima je

molekulska masa manja od 1000. Šećeri koji imaju molekulsku masu između 1000 i 5000 ne

snižavaju Tm kao ni polimeri velikih molekulskih masa jer ne ulaze unutar membrane (Slika

6.).

18


Slika 6. Prikaz uloge šećera u snižavanju Tm prema A) prvoj odnosno B) drugoj hipotezi.

(Preuzeto iz C.Santivarangkna i sur., 2008).

Tijekom liofilizacije bakterije mliječne kiseline se zamrzavaju pri vrlo niskim

temperaturama. Stanice se zamrzavaju i pri -196°C, pomoću tekućeg dušika, što može

uzrokovati inaktivaciju i oštećenja stanica. Kristali leda unutar stanice mehanički oštećuju

stanicu, te zamrzavanjem stanice otopina postaje hipertonična što ima toksični učinak na

stanicu. Tako primjerice početna 0,15 M izotonična otopina soli poveća svoju koncentraciju

na 3 M pri -10°C (Santivarangkna i sur., 2008). Za zaštitu stanica tijekom zamrzavanja

najčešće se primjenjuju šećeri poput saharoze i laktoze. Tijekom liofilizacije led se sublimira i

struktura osušene stanice jako ovisi o strukturi koja se formira tijekom zamrzavanja. Kada je

sušenje pravilno vođeno, poroznost i cjelokupna površina sušenih stanica nalikovat će onima

u otopini za zamrzavanje, sa velikim rupama koje su prije bile popunjene kristalima leda.

Nakon stvaranja kristala leda nezamrznuta faza tvori amorfnu strukturu poput stakla. Ovakvu

strukturu potrebno je očuvati tijekom uklanjanja kristala leda i skladištenja da ne bi došlo do

oštećenja stanica tijekom liofilizacije. Temperatura oštećenja (Tc) je maksimalna dozvoljena

temperatura tijekom liofilizacije a pri kojoj još uvijek nema oštećenja stanice. Ova

temperatura je različita ovisno o bakterijskoj stanici i koncentraciji bakterija. Disaharidi i

oligosaharidi se često dodaju u otopinu tijekom procesa liofilizacije zato što povećavaju Tc

tijekom zamrzavanja.

ŠMolekule šećeria imaju zaštitnu ulogu i kada su stanice izložene visokim temperaturama

(tijekom zagrijavanja i tijekom skladištenja) i to najčešće šećeri glukoza, fruktoza, laktoza,

manoza, saharoza, trehaloza te šećerni alkoholi sorbitol i inozitol (Carvalho i sur., 2004).19


3. EKSPERIMENTALNI DIO

20

DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Eksperimentalni dio

3.1. Materijal

3.1.1. Mikroorganizmi

Probiotički sojevi Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4 i

Enterococcus faecium L3 su selekcionirani u Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima,

probiotika i starter kultura na Prehrambeno-biotehnološkom fakultetu, na temelju istraživanja

provedenih u sklopu probiotičkog koncepta. Autohtoni izolati bakterija mliječne kiseline su

izoliranih iz svježih sireva ili sireva u salamuri proizvedenih na tradicionalan način u

različitim regijama.

3.1.2. Hranjive podloge i kemikalije

Tijekom rada korištene su sljedeće podloge:

Hranjive podloge za održavanje, čuvanje i uzgoj bakterija mliječne kiseline:

MRS (De Man, Rogosa i Sharpe) agar sljedećeg sastava (g/L destilirane vode):

pepton 10 g/L; mesni ekstrakt 10 g/L; kvaščev ekstrakt 5 g/L; glukoza 20 g/L;

Tween 80 1g/L; MgSO4 · 7 H2O 0,1 g/L; MnSO4 · 7 H20 0,05 g/L; natrijev acetat 5

g/L; agar 20 g/L. pH vrijednost podloge iznosi 6,5, a sterilizacija se provodi pri 121ºC

tijekom 15 min.

MRS bujon je istog sastava kao podloga MRS agar, ali bez dodatka agara.

GM17 agar sljedećeg sastava (g/L destilirane vode): kazein nakon razgradnje

tripsinom 2,50 g/L; pepton 2,50 g/L; pepton iz soje 5,00 g/L; kvaščev ekstrakt 2,50

g/L; goveđi ekstrakt 5,00 g/L; laktoza 5,00 g/L; natrijev glicerofosfat 19,00 g/L;

magnezijev sulfat 0,25 g/L; askorbinska kiselina 0,50 g/L; agar 13 g/L i glukoza 0,5

g/L.

GM17 tekuća hranjiva podloga je istog sastava kao podloga GM17 agar, ali bez

dodatka agara.

Sterilizacija svih hranjivih podloga se provodi pri 121ºC tijekom 15 min.

3.1.2.1. Hranjive

podloge

20


saharoza, „Kemika“, Hrvatska

laktoza, „Kemika“, Hrvatska

sorbitol, „Kemika“, Hrvatska

inulin, „Difco“, SAD

raftilose P95, Orafti, Tienen, Belbium

obrano mlijeko u prahu, „Dukat“, Hrvatska

fosfatni pufer (PBS), „Kemika“, Hrvatska

agaroza, „Appligane“, Strasbourg

natrijev acetat, „Kemika“, Hrvatska

natrijev dodecilsulfat, „Sigma“, SAD

etanol, „Kemika“, Hrvatska

glukoza, „Kemika“, Hrvatska

pepsin (P-700), „Sigma“, SAD

kloridna kiselina, „Kemika“, Hrvatska

pankreatin (165 U/mg) iz svinjske gušterače, „BioChemika“, Fluka, Švicarska

goveđa žuč (oxgall), „Difco“, SAD

glicin, „Gram-mol“, Hrvatska

akrilamid, „Sigma“, SAD

TEMED (N, N, N', N'-tetrametiletilen), „Sigma“, SAD

Β-merkaptoetanol, „Sigma“, SAD

metilensko modrilo R-250, „Sigma“, SAD

izopropanol, „Kemika“, Hrvatska

metanol, „Kemika“, Hrvatska

etanol, „Kemika“, Hrvatska

ledena octena kiselina, „Kemika“, Hrvatska

standard proteina poznatih relativnih molekulskih masa, „Pharmacia“, SAD

3.1.2.2. Kemi

kalije

21


raftilose P95, Orafti, Tienen, Belbium

3.1.3. Aparatura i pribor

termostat, „Instrumentarija“, Hrvatska

vibro- mješač EV-100, „Kartell“, Italija

vaga, „Tehtnica“, Slovenija

centrifuga CENTAUR 2, „Sanyo“, Engleska

centrifuga Centric, „Tehtnica“, Slovenija

liofilizator, model Christ Alpha 1-2 LD plus, „Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen

GmbH“, Njemačka

elektroforetske kadice Cleaver, Scientific Itd

DNA- termoblok, Mastercycler personal „Eppendorf“

Anaerocult A. Merck, Njemačka

filter diskovi natopljeni određenim koncentracijama antibiotika, „Oxoid“, Velika

Britanija)

elektroforetske kadice Cleaver, Scientific Itd

3.2. Metode rada

3.2.1. Održavanje i čuvanje mikroorganizama

Ispitivani sojevi bakterija mliječne kiseline Lactobacillus helveticus M92,

Lactobacillus plantarum L4 i Enterococcus faecium L3 čuvani su pri -80°C u MRS tekućoj

hranjivoj podlozi uz dodatak 15 % (v/v) glicerola. Navedeni Pprobiotički sojevi L. helveticus

M92, L. plantarum L4 i E. faecium L3 su dio su Zbirke mikroorganizama Laboratorija za

tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura Prehrambeno-biotehnološkog

fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Autohtoni izolati čuvani su pri -80°C u MRS, odnosno GM17

tekućoj hranjivoj podlozi uz dodatak 15 % (v/v) glicerola. Dan prije eksperimenta, probiotički

sojevi, odnosno autohtoni izolati bakterija mliječne kiseline su inokulirani u svježu optimalnu

hranjivu podlogu, te inkubirani pri optimalnoj temperaturi rasta, prema uvjetima navedenim u

tablici 3.

22


3.2.2. KOH metoda

KOH metoda se koristi za određivanje gram-pozitivnih odnosno gram-negativnih

bakterija. Na predmetno stakalce dodano je 10 μL 3% kalijeva hidroksida (KOH) te se

vidljiva količina bakterijskih stanica sterilno prenijela, pomoću mikrobiološke ušice, u

kapljicu KOH. Bakterijske stanice i otopina 3% KOH su se promiješale, proširivanjem mjesta

do promjera od 1,5 cm. Ako je suspenzija bila viskozna ili gelasta unutar 50-60 s, ispitivana

bakterija je definirana kao gram-negativna, a u protivnom kao gram-pozitivna (Buch, 1982).

3.2.3. Katalaza test

Katalaza test služi kako bi se ispitalo da li istraživani mikroorganizam proizvodi enzim

katalazu. Mikrobiološkom ušicom se dio ispitivane bakterijske kulture prenio na predmetno

stakalce, a zatim se dodaloa 1-2 kapi svježeg 3% vodikovog peroksida. U slučaju prisutnosti

katalaze, vidljiva je pojava mjehurića uslijed oslobađanja kisika (Duraković, 1996.,Kos,

2001).

3.2.4. Određivanje pH vrijednosti u supernatantu kulture

pH vrijednost supernatanta prekonoćne kulture autohtonih izolata bakterija mliječne

kiseline određena je pomoću pH metra, „Metrohm“, Švicarska.

3.2.5. Izolacija DNA

MRS podloga inokulirana je s 5% prekonoćne kulture i inkubirana 18 h pri 37°C.

Volumen od 1,5 mL kulture je centrifugiran i ispran u GTE puferu (25 mM TRIS + 10 mM

EDTA + 50 mM glukoze). Stanice su resuspendirane u 500 μL GTE pufera, uz dodatak

lizozima (8 mg/500 μL) i RNA-ze (50 μL/mL), i inkubirane 30 min pri 37°C. Zatim je

dodano 250 μL 2% SDS-a i vorteksirano 1 min. Slijedio je dodatak 100 μL neutralnog

fenol-kloroforma,, te miješanje tijekom 30 sekundi tei centrifugiranje na 13 000 okr/5

23


min. Supernatant, bez interfaze, je pomiješan s 1/10 volumena 3M natrijeva acetata

(pH=4,8), i 1 volumenom izopropanola. Nakon inkubacije (5 minuta pri sobnoj

temperaturi) slijedilo je centrifugiranje na 13 000 okr/10 min. Talog je resuspendiran u

300 μL 0,3 M NaAc i 10 mM MgCl2 i vorteksiran. Nakon dodatka 700 μL apsolutnog

etanola (ohlađenog na -20°C), uzorak je inkubiran preko noći pri -20°C. Nakon toga je

slijedilo centrifugiranje pri 14000 okr/20 min. Talog je suspendiran u 75%-tnom etanolu

(ohlađenom na -20°C) i ponovno centrifugiran na 13 000 okr/5 min. Talog DNA je

resuspendiran u 50 μL TE pufera (Gardiner i sur., 2002).

3.2.6. Identifikacija bakterija sekvencioniranjem 16S rRNA gena

Odabrani autohtoni izolati su čuvani u MRS (DeMan i drugi, 1960 ; Difco) bujonu ili

agaru (1-7 % w/v) pri 30°C, u aerobnim ili anaerobnim uvjetima – uvjetima optimalnim za

rast , u optimalnim uvjetima rasta pojedinog soja, nakon čega je provedena izolacija DNA

prema postupku opisanom u 3.2.5. Za amplifikaciju željene sekvence DNA upotrebljena je

KAPA Taq DNA polimeraza s odgovarajućim oligonukleotidnim početnicama , primerima,

specifičnim za konzervirane regije 16S rRNA gena pomoću PCR-a; 16S FW universal Tm =

52 °C I 16S REW universal Tm = 57 °C.

Amplifikacija DNA provedena je pomoću PCR reakcije programirane započete

ninicijalnom denaturacijom na 5 min pri 94 °C, nakon čega je slijedilo (inicijalna

denaturacija), te 30 ciklusa od 30 s pri 94 °C (denaturacija), 30 s pri 50 °C (prijanjanje), 30 s

pri 72 °C (produljivanje), dok je završno produljivanje vođeno i 77 min pri 72 °C. (završno

produljivanje). Produkti PCR reakcije su detektirani elektroforezom u 1,5 % (w/v) agaroznom

gelu i bojanjem gela etidijevim bromidom. Dobiveni PCR produkti pročišćeni su pomoću

QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Njemačka) prema uputama proizvođača i zatim

sekvencionirani.

3.2.7. SDS-PAGE površinskih proteina

Stanice autohtonih izolata BMK, koncentrirane centrifugiranjem 10 000 okr./min

tijekom 5 min i dva puta isprane sterilnom destiliranom vodom, resuspendirane su u 50 µL

1%-tne otopine SDS-a. Tako resuspendirane stanice kuhale su se , kuhaju se 10 min. Nakon

toga je slijedilo ponovno centrifugiranje suspenzije stanica pri 9000 okr./min kroz 5 min. i

24


supernatant je podvrgnut SDS-poliakrilamidnoj gel-elektroforezi (SDS-PAGE). U svrhu

uklanjanja površinskog sloja proteina (engl. “S-layer” proteins) bakterijske stanice su tretirane

s 5 M litijevim kloridom 30 min pri 37 oC.

U 15µL uzorka dobivenog supernatanta dodano je 5 µL reducirajućeg reagensa i

prokuhano 2-3 min. Nakon kuhanja, ukupni volumen uzorka je nanešen na 10 %-tni

poliakrilamidni gel. U svrhu uklanjanja površinskog sloja proteina (engl. “S-layer” proteins)

bakterijske stanice su tretirane s 5 M litijevim kloridom 30 min pri 37 o C.

SDS-poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE) je provedena postupkom prema

Laemmli-ju (1970) u komori za elektroforezu (Sigma), pri konstantnom naponu od 200 V

kroz 45 min. Bojanje gela na proteine provedeno je u 0,1 %-tnom metilenskom modrilu R-

250 s 50 % metanola i 7 % octene kiseline kroz najmanje 3 sata. Nakon bojenja, gel je

inkubiran u 7 %-tnoj octenoj kiselini do obezbojenja pozadine. Kao pozitivna kontrola

poslužio je S-layer protein izoliran s površine stanica probiotičkog soja L. helvecitus M92.

Nakon provedene SDS-PAGE elektroforeze proteinski profili različitih autohtonih izolta

BMK su međusobno uspoređeni pomoću programskog paketa Gel-Compar II, Applied Maths.

3.2.8. Ispitivanje osjetljivosti autohtonih izolata bakterija mliječne kiseline na različite antibiotike

Osjetljivost autohtonih izolata na antibiotike ispitana je metodom difuzije iz filter

diska u agar, pomoću komercijalno dostupnih diskova Oxoid (Basingstoke, Velika Britanija),

natopljenih određenom koncentracijom antibiotika. Osjetljivost svakog pojedinog autohtonog

izolata ispitana je na 12 različitih antibiotika tako da su obuhvaćene sve poznate skupine

antibiotika: ampicilin, bacitracin i, vankomicin kao inhibitori sinteze stanične stijenke;,

eritromicin, gentamicin, klindamicin, kloramfenikol, streptomicin i, tetraciklin kao inhibitori

sinteze proteina;; novobiocin i, rifampicin, kao inhibitori sinteze nukleinskih kiselina tei

azitromicin. Kolonije pojedinog izolata porasle na krutoj hranjivoj podlozi, (na MRS ili

GM17 hranjivomi agaru), inokulirane su prekonoćno uu tekuću hranjivu podlogu te

inkubirane preko noći pri temperaturi optimalnoj za određeni soj. Gustoća stanica u

prekonoćnoj kulturi određena je očitavanjem stupnja McFarland pomoću densitometra te je

podešena na istu vrijednost. 100µL. 100 ul dobivene suspenzije stanica je inokulirano u

otopljenu krutu hranjivu podlogu koja je potom razlivena u Petrijeve zdjelice. Na svaku sve

nacjepljene ploču podloges određenim autohtonim izolatom postavljeno je po šest filter

25

Amp

B

C

Da

Cn

E

N

NV

P

VA

S

TE


diskova, a zatim su podloge koje su zatim stavljenei na inkubaciju pri optimalnoj temperaturi

rasta. određenog autohtonog izolata. Nakon 24 sata inkubacije pri optimalnim uvjetima rasta

za pojedini autohtoni izolat, slijediloi je mjerenje promjera zona inhibicije, uključujući i

promjer diska. Rezultati (prosjek od 3 čitanja) su izraženi u milimetrima (Zhou i sur. 2005).

Slika 7. Raspored nanošenja filter-diskova s antibioticima na hranjivu podlogu nacjepljenu

test-mikroorganizmom.

(Oznake antibiotika: Amp – ampicilin; B – bacitracin; C – kloramfenikol; Da – klindamicin;

Cn – gentamicin; E – eritromicin; N – neomicin; NV – novobiocin; P – penicilin G; VA –

vankomicin; S – streptomicin i TE – tetraciklin.

3.2.9. Ispitivanje preživljavanja bakterija u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog trakta

26


Simulirani želučani sok pripravljen je suspendiranjem pepsina (3 g/L) u 0,5%

sterilnoj otopini natrijevog klorida, kojoj je pH podešen na 2 koncentriranom

kloridnom kiselinom.

Simulirani sok tankoga crijeva pripravljen je suspendiranjem pankreatina (1 g/L),

samog ili sa i žučnihm solima (3,0 mg/mL goveđe žuči) u 0,5% sterilnoj otopini natrijeva

klorida, kojoj je pH podešen na 8,0 s natrijevom lužinom.

Prekonoćna kultura pojedinog autohtonog izolata BMK centrifugirana je pri 3300

g/10 min i dva puta isprana sa sterilnom fiziološkom otopinom. Priređena suspenzija

bakterijskih stanica (1 mL) dodana je u simulirani sok želuca ili tankoga crijeva (4 mL)

(sa ili bez dodatka žučnih soli). Broj živih stanica određivan je u simuliranom soku

želuca tijekom 2 sata, a u simuliranom soku tankoga crijeva tijekom 43 sata,

indirektnom metodom.

3.2.10. Preživljavanje probiotičkih sojeva tijekom liofilizacije

Bakterijske kulture uzgojene su u MRS hranjivoj podlozi. Nakon toga smo ihu

centrifugiraline na 3300 okretaja/10 min. Nakon centrifugiranja hranjiva podloga je

odbačena, smo te smo biomasu stanica resuspendirali u 500 μL fiziološke otopine (0,9%

NaCl). Biomasi stanica smo zatim dodali 5%-tnu otopinu inulina odnosnoi obranog

mlijeka u prahu kao lioprotektore tei fosfatni pufer pH 6 koji je služio kao kontrola.

Tako priređene suspenzije stanica zamrznuli smo pri na – 820°C preko noći, a zatim

liofilizirali u liofilizatoru. Broj živih stanica (CFU/mL) smo određivali prije i nakon

liofilizacije indirektnom metodom kako je opisano u točci 3.2.11. (Određivanje broja živih

mikroorganizama indirektnom metodom).

U eksperimentima ispitivanja preživljavanja mikroinkapsuliranih i liofiliziranih

mikroinkapsuliranih stanica bakterija u različitim nosačima (alginat, karagenan i kazein),

preživljavanje imobiliziranih kultura u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog trakta,

uspoređeno je s preživljavanjem biomase kultura probiotičkih sojeva koje nisu

mikroinkapsulirane odnosno liofilizirane.

27


3.2.11. Određivanje broja živih mikroorganizama indirektnom metodom

Iz uzorka koji sadrži bakterijske stanice pripremljena su decimalna razrjeđenja u

sterilnoj destiliranoj vodi. MRS hranjiva podloga u Petrijevoj zdjelici nacijepljena je sa 100

μL petog, šestog, i sedmog i osmog decimalnog razrjeđenja. Nakon 48 h inkubacije pri 37°C

izbrojane su izrasle kolonije i proračunat je broj živih stanica po mililitru uzorka.

28

4. REZULTATI

DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Rezultati

[4.1.] Osjetljivost na antibiotike i preživljavanje autohtonih bakterija mliječne kiseline u simuliranim uvijetima gatrointestinalnog trakta

Da bi se neki mikroorganizam mogao definirati kao probiotik mora ispuniti opće,

funkcionalne i tehnološke zahtjeve. Iako BMK karakterizira GRAS (engl. Generally

Recognisedegarded As Safe) status, pri odabiru sojeva za daljnja ispitivanja njihovih

funkcionalnih svojstava, neophodno je provesti ispravnu taksonomsku identifikaciju soja, te

ispitati osjetljivost na pojedine antibiotike, kako bi se spriječila mogućnost širenja antibiotičke

rezistencije. Povećana primjena antibiotika u terapijske svrhe, te za poticanje rasta životinja

na farmama, utjecala je na širenje antibiotičke rezistencije. Odabrani autohtoni izolati su

identificirani kao predstavnici rodova BMK, a da bi se potvrdila sigurnost odabranih

autohtonih izolata s aspekta antibiotičke rezistencije, u ovom radu je ispitana i osjetljivost na

određene antibiotike metodom difuzije u agaru s filter diskovima. Rezultati su prikazani u

tablici 6 ite za autohtoni izolat BGAL1-1 na slici 9. U tablici 7 je radi usporedbe prikazana

osjetljivost probiotičkih starter kultura okarakteriziranih u Laboratoriju za tehnologiju

antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura, Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta.

Odabrane autohtone BMK su osjetljive na većinu ispitivanih antibiotika, no uočen je

izostanak zone inhibicije kod rasta pojedinih sojeva prilikom inkubacije u prisutnosti, na

vankomicina, neomicina i streptomicina.

Iz uzoraka tradicionalno proizvedenihog sirevaa, izolirane su, s visokog razrjeđenja, na

MRS ili GM17 hranjivoj podlozi, autohtono prisutne BMK. Ispitan je rast odabranih bakterija

u aerobnim i anaerobnim uvjetima, te su definirane njihove optimalne temperature rasta

(Tablica 3.). Učinkovito spuštanje pH vrijednosti, kao rezultatuslijed sinteze mliječne kiseline

kao primarnog metabolita BMK, nakon prekonoćnog uzgoja u optimalnoj hranjivoj podlozi za

uzgoj, također je karakteristika koja doprinosi fiziološkoj karakterizaciji BMK, a koja je

važnao s aspekta antimikrobnog djelovanja ovih bakterija. U tablici 3 su navedene pH

vrijednosti određene u supernatantu kulture pojedinog autohtonog izolata nakon prekonoćnog

uzgoja u tekućoj hranjivoj podlozi pri optimalnim uvjetima uzgoja.

Autohtone BMK koje su uspješno izrasle na MRS hranjivimoj podlogamazi, bojane su po

Gramu. Prisutnost enzima katalaze kod pojedinog bakterijskog izolata ispitana je katalaza

testom, te je provedena KOH metoda, kako bi se potvrdilo da su izolirani sojevi gram-

pozitivni, zatim je napravljen test sporogenosti i određivanje homofermentativnosti odnosno

heterofermentativnosti (Tablica 4.).

28


Smatra se da su i svojstva površine stanica izoliranih sojeva bakterija mliječnih kiselina

važna za njihovu probiotičku aktivnost. Poznato je da proteini prisutni s vanjske strane

stanične stijenke bakterija, poput S-layer proteina, imaju funkcionalnu ulogu kod nekih

probiotičkih sojeva kao što je L. helveticus M92 otprije definiran kao probiotik (Beganović i

sur., 2011). Biološka uloga površinskih proteina bakterija mliječnih kiselina iz roda

Lactobacillus nije u potpunosti razjašnjena, ali su istraživanja ukazala na važnost ovih

proteina za preživljavanje nepovoljnih uvjeta u GIT. Nadalje, S-layer proteini mogu biti

uključeni u ekskluziju patogena i imunomodulaciju domaćina, kojišto su sve važna

funkcionalna svojstva probiotičkih sojeva. Stoga je u ovom radu provedena i SDS-PAGE

elektroforeza površinskih proteina izoliranih bakterijskih sojeva gdje je kao pozitivna kontrola

upotrebljen proteinski profil probiotičkog soja L. helveticus M92, za koji se zna da posjeduje

S-layer protein (Kos i sur.; 2003, Frece i sur., 2005, Beganović i sur., 2011), te su dobiveni

proteinski profili međusobno uspoređeni pomoću Gel-Compar II programskog paketa,

Applied Maths, St-Materns-Latem, Belgija (Slika 8.).

Da bi neki probiotički soj mogao kolonizirati GIT, te iskazati pozitivne učinke na zdravlje

domaćina, mora preživjeti nepovoljne uvjete u GIT-u i adhezirati se na epitelne stanice GIT-a.

Glavnu prepreku njihovom preživljavanju čine niske pH vrijednosti u želucu, probavni enzimi

i žučne soli. U ovom radu je glavni selekcijski kriterij pri odabiru autohtonih izolata BMK za

daljnja ispitivanja potencijalnih probiotičkih sojeva bilo preživljavanje sojeva tijekom

direktnog prijelaza iz simuliranog želučanog soka pH-vrijednosti 2 u simulirani sok tankog

crijeva gdje se izlučuje sok gušterače i žuč (Tablica 8; Slika 10.). Većina odabranih sojeva je

osjetljiva na nepovoljne uvjete GIT-a in vitro, no pojedini bakterijski sojevi koji rastu na MRS

hranjivoj podlozi, koja je optimalna podloga za laktobacile, su pokazali visok stupanj

preživljavanja: ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14, ZG1-54, BGGO5-3 (Tablica 8.) Uočeno

je da preživljavanje kolonija koje rastu na GM17 hranjivoj podlozi, koja je optimalna podloga

za rast laktokoka, bilo slabije, jer je smrtnost stanica izražena kao log CFU/mL bila puno

veća (Tablica 8.).

29


Tablica 3. Autohtone bakterije mliječne kiseline (BMK), optimalni uvjeti uzgoja te pH

vrijednosti postignute nakon prekonoćnog uzgoja pri navedenim uvjetima.

Autohtoni izolatiBMK

Hranjivapodloga Uvjeti uzgoja pH

BGGO7-28 GM17 30°C, anaerobno 4,92

BGAL1-1 GM17 30°C 4,81

BGLE1-6 GM17 30°C, anaerobno 4,88

BGGO5-3 MRS 30 °C, anaerobno 4,24

BGGO5-7 MRS 30 °C, anaerobno 4,6

BGGO5-47 MRS 30°C, anaerobno 4,36

ZG1-54 MRS 37°C 5,01

ZG2-25 MRS 30°C 4,01

ZG3-17 MRS 30°C, anaerobno 4,72



ZG5-9 GM17 30°C 4,8

30


Tablica 4. Karakterizacija Lactobacillus i Enterococcus vrsta autohtono prisutnih u siru

pomoću klasičnih mikrobioloških metoda.


KOH metoda

Bojanje po Gramu Katalaza test Test

sporogenosti

BGGO7-28 G + G + Katalaza-negativna Nesporogena

BGAL1-1 G + G + Katalaza-negativna Nesporogena

BGLE1-6 G + G + Katalaza-negativna Nesporogena




ZG1-54 G + G + Katalaza-negativna Nesporogena






G +, Gram-pozitivna bakterija

31


Tablica 5. Identifikacija autohtonih izolata bakterija mliječne kiseline sekvencioniranjem 16S

rRNA gena.

32

Autohtoni izolatiBMK 16S identifikacija (UNIR, UNIF)

BGGO7-28 Lactobacillus sucicola/uvarum/capillatus

BGAL1-1 Lactococcus lactis

BGLE1-6 Lactococcus lactis subsp. lactis

BGGO5-3 Lactobacillus pentosus/paraplantarum/plantarum

BGGO5-7 Lactobacillus casei

BGGO5-47 Lactobacillus rhamnosus

ZG1-54 Enterococcus faecium

ZG2-25 Lactobacillus pentosus/paraplantarum/plantarum

ZG3-17 Lactobacillus pentosus/paraplantarum/plantarum

ZG3-18 Lactobacillus plantarum/pentosus

ZG4-14 Leuconostoc mesenteroides/pseudomesenteroides

ZG5-9 Lactococcus lactis


Slika 8. SDS-PAGE površinskih proteina autohtonih BMK izoliranih iz tradicionalno

proizvedenih sireva.

33


Tablica 6. Određivanje osjetljivosti ispitivanih autohtonih izolata bakterija mliječne kiseline na predstavnike različitih skupina

antibiotika.


Ampicilin (Amp)

Bacitracin(B)

Kloramfenikol(C)

Klindamicin (DA)

Eritromicin (E)

Gentamicin (CN)

Neomicin(N)

Novobiocin (NV)

Penicilin G(P)

Vankomicin(VA)

Streptomicin(S)

Tetraciklin (TE)

10 μg 10 units 30 μg 2 μg 15 μg 120 μg 10 μg 5 μg 10 units 30μg 10 μg 30 μgPromjer zona inhibicije (mm)

BGGO7-28 26,5 23,5 28 27,5 29 21 7 18,5 29,5 0 0 34,5BGAL1-1 27 27 29 27,5 29 24 13,5 22,5 33 22 13,5 33BGLE1-6 27 24 29 26,7 26 21,3 13 23,3 24,7 17,7 11,7 31,7BGGO5-3 35 8 24 12 22 13 0 13 28 0 0 15BGGO5-7 18 13 24 26 30 14 0 17 25 0 0 31

BGGO5-47 22 6 23 18 21 14 0 15 29 0 0 29ZG1-54 26 11 16 12 11 10 0 20 25 21 0 27ZG2-25 22 9 22 13 13 11 0 13 14 0 0 14ZG3-17 35 11 30 12 29 18 0 11 29 22 0 30ZG3-18 20 9 22 13 19 12 0 12 13 0 0 13ZG4-14 25 13 23 27 24 18 9 10 32 0 0 27ZG5-9 30 24 29 29 29 23 14 25 33 21 9 36

34


Tablica 7. Određivanje osjetljivosti probiotičkih i starter kultura na pojedine predstavnike različitih skupina antibiotika.

Bakterije mliječnekiseline

Ampicilin (Amp)

Bacitracin(B)

Kloramfenikol (C)

Klindamicin (DA)

Eritromicin(E)

Gentamicin (CN)

Neomicin (N)

Novobiocin (NV)

Penicilin G (P)

Rifampicin(RD)

Streptomicin(S)

Tetraciklin(TE)

10 μg 10 units 30 μg 2 μg 15 μg 120 μg 10 μg 5 μg 10 units 5 μg 10 μg 30 μgPromjer zona inhibicije (mm)

L. acidophilusATCC 4365 18 17 22 26 23 14 0 11 14 19 0 15

L. helveticusM92 30 24 28 20 27 15 0 14 28 19 12 30

L. plantarumL4 23 7 21 17 23 8 0 14 27 16 0 14

E. faeciumL3 23 14 0 0 0 13 0 14 20 11 0 35

L. mesenteroidesLMG 7954 18 0 16 16 15 0 0 12 22 17 0 13

L. rahmnosusGG 20 10 23 19 26 13 0 16 20 22 0 26

35


Slika 9. Osjetljivost autohtonog izolata Lactococcus lactis BGAL1-1 na antibiotike:

neomicin, novabiocin, penicilin, rifamipicn, streptomicin i tetraciklin.

36


Tablica 8. Preživljavanje kolonija poraslih na MRS i GM17 hranjivoj podlozi u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog trakta (GIT) (direktan

prijelaz iz simuliranog želučanog soka u simulirani sok tankog crijeva).

Prijelaz iz želučanog soka

(pH 2, t = 2 h) u soktankog crijeva (t = 4h,

6h)

Autohtoni izolati BMK / (CFU/mL)

BGGO7 - 28

BGAL1 - 1

BGLE1 - 6

BGGO5 - 3

BGGO5 - 7

BGGO5 - 47

ZG1 - 54

ZG2 - 25

ZG3 - 17

ZG3 - 18

ZG4 - 14

ZG5 - 9

Želučani sok (0 h) 1,11·107 5,60·107 5,96·107 1,87·109 4,86·108 6,37·108 5,5·107 4,32·108 1,4·108 1,14·108 2,15·108 1,13·1010

Želučani sok (2h) 0 2,83·107 4,67·106 3,5·107 9,66·105 7,75·106 3,55·105 8,45·107 7,21·105 2,33·107 2,59·106 4,56·105

Sok tankog crijeva (4h) 0 2,29·107 3,62·106 1,54·105 6,5·104 3,11·104 2,72·105 1,53·107 5,6·105 7,71·106 3,6·105 8,36·104

Sok tankog crijeva (6 h) 0 1,00·106 2,53·106 1,2·105 0 0 1,94·105 5,05·106 5,41·105 1,51·106 1,36·105 4,56·104

Smrtnost stanicalogCFU/ml (0h – 6h) 7,05 2,75 1.38 4,19 8,69 8,80 2,45 1,94 2,42 1,88 3,2 5,39

37


Slika 10. Preživljavanje autohtonih izolata BMK tijekom direktnog prolaska iz simuliranog

želučanog soka (pH=2) u simulirani sok tankog crijeva.

38


4.1.[4.2.] Utjecaj različitih lioprotektora na preživljavanje probiotičkih sojeva i autohtonih bakterija mliječne kiseline tijekom liofilizacije

U prvom redu provedena je liofilizacija probiotičkih sojeva L. helveticus M92, L.

plantarum L4 i E. faecium L3 (Slika 11.-13.). Ti Bbakterijski sojevi L. helveticus M92, L.

plantarum L4 i E. faecium L3 definirani su kao probiotički sojevi prema strogim izbornim

probiotičkim kriterijima u Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter

kultura Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Osim njihove primjene,

kao funkcionalnih starter kultura u različitim fermentiranim proizvodima, istražuje se i njihov

bioterapijski učinak kao živih lijekova.

Stoga je biomasa bakterijskih stanica resuspendirana u fosfatnom puferu (PBS) i u

5%-tnim otopinama različitih lioprotektora. Kao lioprotektori korišteni su obrano

mlijeko u prahu, inulin i raftilozaoligosaharidi. Postotak preživljavanja probiotičkih

sojeva tijekom liofilizacije određen je uz nakon primjeneu obranog mlijeka, inulina i

raftiloze oligosaharida kao lioprotektora, te u slučaju kada je umjesto lioprotektora dodan

korišten fosfatni pufer pH 6. Kao najučinkovitiji lioprotektori za probiotički soj L.

helveticus M92 tijekom liofilizacije, a na temelju rezultata preživljavanja, pokazali su se

obrano mlijeko i inulin (Slika 11.). Sličnio rezultati su dobiveni i za probiotički soj L.

plantarum L4 (Slika 12.), dok je za soj E. faecium L3 preživljavanje nakon liofilizacije

bilo najuspješnije kada je liofilizacija provedena uz dodatak obranog mlijeka (Slika 13.).

Ispitan je i protektivni učinak obranog mlijeka nakon godinu dana čuvanja

liofiliziranih kultura L. helveticus M92, L. plantarum L4 i E. faecium L3. Broj poraslih

kolonija određen na MRS hranjivom agaru iznosio je iznad 107 CFU/mL, što je iznad

broja stanicavrijednosti kojai je definirana za probiotičke sojeve kao minimalnaan za

iskazivanje pozitivnih učinaka na zdravlje domaćina (Tablica 9.).

Nadalje, su odabrani su autohtoni izolati BMK, koji pokazuju najbolje karakteristike

s probiotičkog aspekta -, BGGO7-28, BGAL1-1, BGAL1-1, BGG05-3, BGGO5-7, ZG1-54,

ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14, ZG5-9, a zatim te je provedena liofilizacija svježe

biomase njihovih stanica uuz korištenje lioprotektora lioprotektorima,, obranom mlijeku,

inulinu i raftilozi, koji su se pokazali kao najučinkovitiji za probiotičke sojeve L. helveticus

M92, L. plantarum L4 i E. faecium L3, - obranog mlijeka, inulina i oligosaharida, te uz

fosfatnom fosfatni puferu pH 6 koji je služio, kao kontrola (Tablice 10.-13.) Preživljavanje

39


je bilo za svih dvanaest autohtonih BMK uspješnije kada su odabrani sojevi liofilizirani

u obranom mlijeku, inulinu ili u oligosaharidu u usporedbi s rezultatima dobivenim

nakon liofilizacije u fosfatnom puferu. No uočeno je da je preživljavanje autohtonog izolata

BGLE1-6 osobito bilo osobito poboljšano uz dodatak prebiotika inulina.

Slika 11. Preživljavanje (%) probiotičkog soja L. helveticus M92 nakon liofilizacije s

različitim lioprotektorima.

40


Slika 12. Preživljavanje (%) probiotičkog soja L. plantarum L4 nakon liofilizacije s


41


Slika 13. Preživljavanje (%) probiotičkog soja E. faecium L3 nakon liofilizacije s


Tablica 9. Preživljavanje probiotičkih sojeva nakon liofilizacije u obranom mlijeku tijekom

12 mjeseci čuvanja pri 4 C.

Probiotički soj Vrijeme pohrane (mjeseci )/ CFU/g0 3 6 9 12

L. helveticus M92 2.51·1010 9.41·109 8.84·108 5.06·108 1.06·108

L. plantarum L4 1.87·1010 3.55·109 2.96·108 1.14·108 7.36·107

E. faecium L3 9.98·1010 3.24·109 1.84·108 4.35·108 3.84·107

42


Tablica 10. Preživljavanje izoliranih bakterijskih sojeva nakon procesa liofilizacije s

dodatkom obranog mlijeka u prahu kao lioprotektora.


Prije liofilizacije(CFU/mL)

Poslije liofilizacije(CFU/mL)

BGGO7-28 1,1·1011 1,6·1010

BGAL1-1 3,73·109 3,8·109

BGLE1-6 2,6·1010 6,1·109

BGG05-3 2,8·1010 1,2·108

BGGO5-7 5,5·1010 1,2·109

BGGO5-47 4,14·1010 4,1·108

ZG1-54 5,3·109 1,9·109

ZG2-25 1,121010 1,23·1010

ZG3-17 2,7·109 3,7·109

ZG3-18 1,02·1010 4,6·109

ZG4-14 1,9·1010 1,5·108

ZG5-9 2,6·1010 6,4·109


dodatkom inulina kao lioprotektora.




BGGO7-28 1,3·1011 1,7·109

BGAL1-1 1,37·1010 5,7·109

BGLE1-6 7,2·109 5,5·109

BGG05-3 8·1010 7,7·108

BGGO5-7 3,9·1010 1·108

43


BGGO5-47 1,64·1010 1,9·108

ZG1-54 3,32·109 1,02·109

ZG2-25 8,84·109 8,87·109

ZG3-17 2,9·109 2,98·109

ZG3-18 1,02·1010 4,6·109

ZG4-14 1·1010 7·109

ZG5-9 6,03·1010 7·109


dodatkom oligosaharida (Raftilose P95) kao lioprotektora.




BGGO7-28 3,66·1011 5,75·108

BGAL1-1 5,63·109 3,80·108

BGLE1-6 9,10·109 6,11·108

BGG05-3 3,78·1011 1,52·109

BGGO5-7 1,38·1010 2,26·109

BGGO5-47 3,65·1010 9,80·108

ZG1-54 8,60·109 2,83·108

ZG2-25 2,71·1011 3,55·1010

ZG3-17 1,62·109 3,77·108

ZG3-18 7,20·109 8,54·108

ZG4-14 1,35·1010 9,60·108

ZG5-9 2,60·1010 2,71·109

Tablica 13. Preživljavanje izoliranih bakterijskih sojeva nakon procesa liofilizacije u

fosfatnom puferu pH 6.




BGGO7-28 1,1·1011 1,05·109

BGAL1-1 3,9·1010 3,1·108

BGLE1-6 6,1·109 7,2·108

BGG05-3 1,23·1010 4,7·108

BGGO5-7 4,52·1010 1,04·1010

BGGO5-47 2,2·1010 9,23·109

ZG1-54 9,3·109 1,2·109

44


ZG2-25 1,27·1010 8,5·109

ZG3-17 5,2·109 1,63·109

ZG3-18 9,8·109 2,95·109

ZG4-14 1,13·1010 5,6·109

ZG5-9 2,14·1010 9,8·109

45

5. RASPRAVA

DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Rasprava

5.1. Osjetljivost na antibiotike i preživljavanje autohtonih bakterija mliječne kiseline u simuliranim uvijetima gatrointestinalnog trakta

Crijevna mikroflora ljudskog gastrointestinalnog sustava sadrži preko 500 različitih

bakterijskih vrsta u ukupnoj masi od 1,2 kg. Sudionici crijevne mikroflore mogu imati

pozitivne, ali uslijed narušavanja ravnoteže ovog ekosustava i negativne učinke na ljudsko

zdravlje. Upravo primjenom probiotika može se ponovno uspostaviti njena narušena

ravnoteža. Probiotici su definirani kao jedna ili više živih stanica mikroorganizama koji

primijenjeni u ljudi i životinja djeluju korisno na domaćina poboljšavajući svojstva autohtone

crijevne mikroflore (Šušković, 2001). Većina probiotika potječu iz rodova bakterija mliječne

kiseline, a najčešće iz roda Lactobacillus. Današnja populacija svjesna je važnosti ispravne

prehrane, pa postoji veliki interes primjene probiotika kao funkcionalnih dodataka hrani,

osobito u fermentiranim mliječnim proizvodima (Capela i sur., 2006; Šušković, 2009). U

ovom je radu izolirano 12 sojeva BMK koji su ispitani u okviru probiotičkog koncepta.

Najprije je ispitana acidifikacija ispitana nakon prekonoćnog uzgoja u optimalnim hranjivim

podlogama te je ustanovljeno da autohtone BMK uspješno spuštaju pH vrijednost podloge što

upućuje na njihov rast i sintezu mliječne kiseline (Tablica 3.).

Primjena probiotika, bilo kao funkcionalnih dodataka hrani ili u svrhu njihove

primjene kao bioterapeutika, zahtjeva njihovu ispravnu fenotipsku i genotipsku

karakterizaciju (Kos i sur., 2008). Tradicionalne mikrobiološke metode poput bojanja po

Gramu ili rasta na selektivnim hranjivim podlogama mogu poslužiti kao temelj primarne

karakterizacije bakterija, stoga su provedeni eksperimenti koji obuhvaćaju osnovne

mikrobiološke metode, a koje su potvrdile da su svi korišteni sojevi gram-pozitivne, katalaza-

negativne i nesporogene bakterije (Tablica 4.). Provedena je i genotipska identifikacija

autohtonih sojeva BMK sekvencioniranjem 16S rRNA gena, a dobiveni rezultati prikazani su

u tablici 5. SDS – PAGE elektroforeza površinskih staničnih proteina je pokazala da su svi

sojevi međusobno različiti (Slika 8.).

Iako BMK karakterizira GRAS (engl. Generally Regarded As Safe) status, pri odabiru

sojeva za daljnja ispitivanja njihovih funkcionalnih svojstava, osim ispravne taksonomske

identifikacije soja, neophodno je ispitati osjetljivost na pojedine antibiotike, kako bi se

spriječila mogućnost širenja antibiotičke rezistencije. Povećana primjena antibiotika u

terapijske svrhe, te za poticanje rasta životinja na farmama, utjecala je na širenje antibiotičke

rezistencije. Odabrani autohtoni izolati su identificirani kao predstavnici rodova BMK, a da bi

44


se potvrdila sigurnost odabranih autohtonih izolata s aspekta antibiotičke rezistencije, u ovom

radu je ispitana i osjetljivost na određene antibiotike metodom difuzije u agaru s filter

diskovima.

Ako su definirani kao probiotici ili kao probiotičke starter kulture cCiljno mjesto

djelovanja sojeva koji su definirani kao probiotici ili kao probiotičke starter kulture je GIT

trakt, gdje odabrani sojevi stupaju u interakciju s mikrobnom populacijom GIT domaćina, a

gdje zbog prisutnosti velikog broja mikroorganizama lako dolazi do prijenosa gena

odgovornih za antibiotičku rezistenciju. Zbog toga je ispitivanje osjetljivosti potencijalnih

probiotičkih sojeva na antibiotike dio općih izbornih kriterija u okviru strogo definiranog

probiotičkog koncepta (Šušković i sur., 2001). U ovom radu je korištena metoda difuzije u

agaru s filter diskovima. Budući da je posljednjih nekoliko godina došlo do naglog širenja

antibiotičke rezistencije, nakon uspješne identifikacije prema kojoj su svi autohtoni izolati

dokazani kao predstavnici rodova BMK, ispitana je njihova i osjetljivost probiotičkih sojeva

iz Laboratorija za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura, Prehrambeno-

biotehnološkog fakulteta, kao i odabranih autohtonih sojeva na određene antibiotike, a istoj

su metodi podvrgnuti i probiotički sojevi iz Laboratorija za tehnologiju antibiotika, enzima,

probiotika i starter kultura Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta (Tablica 6.). Većina

autohtonih sojeva je osjetljiva na predstavnike različitih skupina antibiotika, no prema

rezultatima uočena je rezistencija sojeva iz roda Lactobacillus na vankomicin. Mnoge

bakterije iz roda Lactobacillus imaju urođenu rezistenciju na vankomicin pri čemu se, geni za

rezistenciju nalaze se na genomu. U tom slučaju se rezistencija, stoga se ne može prenijeti

prenosi na druge bakterijske sojeve, kao što to može biti slučajse to može dogoditi kod nekih

vankomicin - rezistentnih vrsta iz roda Enterococcus. Naime, smatra se da su

peptidoglikanske strukture kod laktobacila odgovorne za visoku rezistenciju na glikopeptidne

antibiotike (Flórez i sur., 2005). Također je uočen izostanak zone inhibicije rasta

odabranih sojeva na neomicin i streptomicin. To su aminoglikozidni antibiotici koji su

osjetljivi na kisele pH vrijednosti, stoga je sintetizirana mliječna kiselina koju proizvode

BMK vjerojatno utjecala na degradaciju ovih antibiotika. Slični rezultati su dobiveni

ispitivanjem osjetljivostiih probiotičkih sojeva dobivenih u Laboratoriju za tehnologiju

antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura, Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta

(Tablica7.). Iako Pošto je soj E. facium L3 pokazao rezistentnost na kloramfenikol,

klindamicin, eritrocin i neomicin, trebalo bi te bi trebalo PCR metodom dodatno provjeriti

PCR metodom da li su te rezistencije prenosive na druge bakterijske sojeve.

45


Da bi polučili željene pozitivne učinke na zdravlje, probiotički pripravci moraju

sadržavati žive mikrobne stanice u koncentracijama višim od 106 po gramu proizvoda (Shah,

2007). Stoga je potrebno ispitati preživljavanje odabranih sojeva u GIT. Glavnu prepreku pri

prolasku mikroorganizama kroz želudac čine niska pH-vrijednost i pepsin. pH-vrijednost

želučanog soka, kada se izluči, iznosi oko 2, a udio soli oko 0,5 % , dok je vrijeme

zadržavanja u želucu oko 90 min (Kos, 2001; Lebeer i sur., 2008). Dakle, da bi se neki

mikroorganizam mogao primijeniti kao probiotik i korisno djelovati na zdravlje domaćina,

glavni je izborni kriterij preživljavanje u GIT-u.

Ispitano je preživljavanje autohtonih BMK tijekom direktnog prelaska iz

simuliranog želučanog soka, pri pH-vrijednosti 2 u simulirani sok tankog crijeva

(simulirani sok gušterače uz dodatak goveđe žuči), tijekom šest sati. Većina odabranih

sojeva je osjetljiva na nepovoljne uvjete GIT in vitro, no pojedini bakterijski sojevi su

pokazali visok stupanj preživljavanja: ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14, ZG1-54,

BGGO5-3 , BGLE1-6, BGAL1-1 i ZG5-9 (Tablica 8.) Uočeno je da je preživljavanje

kolonija koje rastu na GM17 hranjivoj podlozi, koja je optimalna većinom za rast

laktokokae, bilo slabije, jer je smrtnost stanica izražena kao log CFU/mL bila puno veća

(Tablica 8.).

46


5.2. Utjecaj različitih lioprotektora na preživljavanje probiotičkih sojeva i autohtonih bakterija mliječne kiseline tijekom liofilizacije

Uspješnost primjene probiotika ovisi i o tehnologiji proizvodnje probiotičkog

pripravka. Liofilizacija se smatra jednom od najučinkovitijih tehnologija za

proizvodnju metabolički aktivnih probiotičkih kultura s aspekta postotka

preživljavanja i funkcionalnosti (Otero i sur., 2007, Pekhonen sur, 2008).

Stoga je, istraženo ispitano preživljavanje tri probiotička soja prethodno istražena u

okviru probiotičkog koncepta u u Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i

starter kultura tijekom liofilizacije uz primjenuom različitih lioprotektora. Rezultati

pokazuju kako preživljavanje probiotičkih stanica L. helveticus M92, L. plantarum L4 i

E. faecium L3 može biti poboljšano uz dodatakk odgovarajućeg tipa i koncentracije

ugljikohidrata, ali osobito uz dodatak obranog mlijeka. Naime, pPreživljavanje

probiotičkih stanica nakon liofilizacije znatno je poboljšano kada je biomasa probitičkih

stanica neposredno prije liofilizacije suspendirana u obranom mlijeku

(Slike 11.-13.). To je posljedica zaštitnog utjecaja obranog mlijeka koje sprječava lizu

bakterijskih stanica, stabiliziranjem sastojaka stanične membrane, stvarajući poroznu

strukturu liofiliziranog proizvoda, što olakšava rehidrataciju, te sadrži proteine koji

služe kao zaštitni sloj stanice (Kos i sur., 2000; Kos, 2001, Carvalho i sur, 2004). No,

liofilizacija stanica probiotičkih sojeva L. helveticus M92 i L. plantarum L4 uz dodatak

preobiotika inulina pokazala se najučinkovitijom (Slike 11. i 12). Šećeri laktoza i saharoza,

kao i sorbitol pozitivno utječu na preživljavanje stanica prilikom liofilizacije (Slika 11. i 13.).

Takvi krioprotektori akumuliraju se unutarstanično te doprinose smanjenju osmotskog tlaka

između bakterijske stanice i vanjskog mikrookoliša, čime se sprječava liza stanica ( Capela i

sur., 2006). Zaštitni učinak obranog mlijeka tijekom 1 godine čuvanja liofiliziranih stanica L.

helveticus M92, L. plantarum L4 i E. faecium L3 pri 4ºC je prikazan u tablici 9.

Preživljavanje Broj stanica u tomnakon tog periodau pri 4 ºC je 107 CFU/mL, čime je

ispunjen zahtjev za minimalnim potrebnim brojem metabolički aktivnih stanica u

probiotičkim pripravcima.

Ispitani probiotički sojevi preživjeli su u visokom broju tijekom perioda čuvanja, no

preživljavanje liofiliziranih kultura L. plantarum L4 i E. faecium L3 se pokazalo nešto

slabijim u odnosu na preživljavanje liofilizirane kulture L. helveticus M92. Ova razlika u

preživljavanju može se pripisati razlikama u strukturi stanične ovojnice, budući da probiotički

47


soj L. helveticus M92 sadrži površinski parakristalni S-sloj (Frece i sur., 2005) koji se smatra

odgovornim za selektivne prednosti tijekom preživljavanja ove bakterije u

gastrointestinalnom traktu, a koji ujedno sudjeluje i u procesu adhezije (Kos i sur., 2001.;

Frece 2003.; Frece i sur., 2005). U prethodnim istraživanjima ustanovljeno je slabije

preživljavanje stanica L. helveticus M92 tijekom liofilizacije nakon uklanjanja površinskog S-

sloja (Kos i sur., 2008). Mnogi autori istražuju učinak različitih lioprotektora, osobito izvora

ugljika, na preživljavanje bakterija mliječne kiseline tijekom procesa liofilizacije (Capela i

sur., 2006; Anal i Singh, 2007; Siaterlis i sur., 2009), pa će u skladu s tim daljnja istraživanja

biti usmjerena na ispitivanje učinka različitih ugljikohidrata, prvenstveno prebiotika, na

preživljavanje probiotičkih kultura tijekom liofilizacije.

Stoga su odabrani autohtoni izolati BMK, koji su pokazali nabolje preživljavanje u

stimuliranim uvjetima GIT-a: BGGO7-28, BGAL1-1, BGLE1-6, BGGO5-3, BGGO5-7,

BGGO5-47, ZG1-54, ZG2-25, ZG3-17, ZG3-18, ZG4-14 i, ZG5-9, te je provedena

liofilizacija svježe biomase njihovih stanica uz dodatak lioprotektora -: obranog mlijeka,

inulina i oligosaharida, dok je . A lliofilizacija stanica suspendiranih u fosfatnom puferu pH

6,je poslužila kao kontrola (Tablice 10.-13.). Preživljavanje je bilo za svih dvanaest

autohtonih BMK uspješnije kada su odabrani sojevi liofilizirani u obranom mlijeku ili u

inulinu, u usporedbi s rezultatima dobivenim nakon liofilizacije u fosfatnom puferu. No,

uočeno je da je preživljavanje autohtonog izolata BGLE1-6 osobito bilo poboljšano uz

dodatak prebiotika inulina, izolata BGGO5-3 uz dodatak prebiotika oligosaharida, a izolata

BGAL1-1 i ZG3-17 uz dodatak obranogm mlijekua.

48

6. ZAKLJUČCI

DIPLOMSKI RAD – Anamarija Perković Zaključci

[1.] Metodom difuzije s filtera u agar potvrđeno je da su svi autohtoni izolati BMK

osjetljivi na 12 ispitanih antibiotika te su, stoga sigurni s aspekta kontrole širenja

antibiotičke rezistencije. Kod pojedinih sojeva uočena je rezistentncija na vankomicin,

no radi se o urođenoj rezistenciji Lactobacillus vrsta, koja se nalazi na genomskoj

DNA, pa nema opasnosti od transfera gena odgovornih za tu rezistenciju.

1.[2.] Autohtoni sojevi, identificirani kao Lactobacillus pentosus / paraplantarum /

plantarum BGGO5-3, ZG2-25 i ZG3-17 najbolje preživljavaju u simuliranim

uvjetima gastrointestinalnog sustava.

[3.] Autohtoni izolati BMK, odabrani na temelju in vitro testa simuliranih

gastrointestinalnih uvjeta,, preživljavaju proces liofilizacije u većem broju kad su

prisutni lioprotektori obrano mlijeko, inulin i oligosaharidi. Izolat Lactococcus lactis

subsp. lactis BGLE1-6 preživljava bolje u prisutnosti inulina, izolat Lactobacillus

pentosus/paraplantarum/plantarum BGGO5-3 uz dodatak oligosaharida dok izolati

Lactococcus lactis BGAL1-1 i Lactobacillus pentosus / paraplantarum / plantarum

ZG3-17 bolje preživljavaju proces liofilizacije uz obranom mlijekou u prahu.

2.[4.] Liofilizacija odabranih sojeva BMK s različitim lioprotektorima doprinosi

povećanju broja živih bakterijskih stanica u probiotičkim pripravcima što doprinosi

iskazivanju njihovog probiotičkog učinka kad se primjene kao bioterapeutici.

49

7. LITERATURA

Alander, M., De Smet, I., Nollet, L., Verstraete, W., von Wright, A., Mattila-Sandholm, T.

(1999) The effect of probiotic strains on the microbiota of the Simulator of the Human

Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME). Int. J. Food Microbiol. 46, 71-79.

Bakker-Zierikze, A. M., van Tol, E. A. F., Kroes, H., Alles, M. S., Kok, F. J., Bindels, J.

G. (2006) Faecal SIgA secretion in infants fed on pre- or probiotic infant formula.

Pediatric Allergy Immunol. 17(2), 134-140.

Beganović, J., Frece, J., Kos, B., Leboš Pavunc, A., Habjanič, K., Šušković, J. (2011)

Functionality of the S-layer protein from the probiotic strain Lactobacillus helveticus M92

Antonie van Leeuwenhoek DOI 10.1007/s10482-011-9563-4 (u tisku)

Beganović, J., Leboš Pavunc, A., Gjuračić, K., Špoljarec, M., Šušković, J., Kos, B. (2011)

Improved sauerkraut production with probiotic strain Lactobacillus plantarum L4

and Leuconostoc mesenteroides LMG 7954. J. Food Sci.: Food Microbiol. Safety, 76(2),

(u tisku)

Bernardeau, M., Vernoux, J.P., Henri-Dubernet, S., Guéguen, M. (2008). Safety

assessment of dairy microorganisms: The Lactobacillus genus. Int. J. Food Microbiol.

126, 278-285.

Bogovič Matijašević, B., Narat, M., Zoric, M. (2003) Adhesion of Two Lactobacillus

gasseri Probiotic Strains on Caco-2 Cells. Food Technol. Biotechnol. 41(1), 83-88.

Capela, P., Hay, T.K.C., Shah, N.P. (2006) Effect of cryoprotectants, prebiotics and

microencapsulation on survival of probiotic organisms in yoghurt and freeze-dried

yoghurt. Food Res. Int. 39, 203-211.

Casey, P.G., Casey, G.D., Gardiner, G.E., Tangney, M., Stanton, C., Ross, R.P., Hill,

C., Fitzgerald, G.F. (2004) Isolation and characterization of anti-Salmonella lactic

acid bacteria from the porcine gastrointestinal tract. Lett. Appl. Microbiol. 39, 431–

438.

50

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19021822

Casey, M.G., Häni, J.P., Gruskovnjak, J., Schaeren, W., Wechsler, D. (2006)

Characterisation of the non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) of Gruyère PDO cheese.

Lait. 86, (6), 407 – 414.

Cotter, P.D., Hill, C., Ross, R.P. (2005) Bacteriocins: developing innate immunity for

food. Nat. Rev. Microbiol. 3, 777-788.

Dunne, C., Murphy, L., Flynn, S., O’Mahony, L., O’Halloran, S., Feeney, M.,

Morrissey, D., Thornton, G., Fitzgerald, G., Daly, C., Kiely, B., Quigley, E.M.M.,

O’Sullivan, G.C., Shanahan, F., Collins, J.K. (1999) Probiotics: from myth to reality.

Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical

trials. U: Proceedings of the 6th Symposium on Lactic Acid Bacteria: Genetics,

metabolism and Applications, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands,

Antonie van Leeuwenhoek 76, str. 279-292.

Duraković, S. (1996) Primjenjena mikrobiologija. Prehrambeno tehnološki inženjering,

Zagreb, str.115 – 119.

Đidić, S., Šušković, J., Kos B. (2008) Antibiotic Resistance Mechanisms in Bacteria:

Biochemical and Genetic Aspects. Food Technol. Biotechnol. 46, 11-21.

Fernandez, M.F., Boris, S. and Barbes, C. (2003) Probiotic properties of human

lactobacilli strains to be used in the gastrointestinal tract. J. Appl. Microbiol. 94, 449–455.

Flórez, A.B., Delgado, S., Mayo, B. (2005) Antimicrobial susceptibility of lactic acid

bacteria isolated from a cheese environment. Can. J. Microbiol. 51(1), 51-8.

Forestier, C., De Champs, C., Vatoux, C. and Joly, B. (2001) Probiotic activities of

Lactobacillus casei rhamnosus: in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial

properties. Res. Microbiol. 152, 167–173.

Fox, P.F., Guinee, T.P., Cogan T.M., McSweeney P.L.H. (2000) Fundamentals of

Cheese science, Aspen Publishers Inc., Gaithersburg, Maryland.

51

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mayo%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Delgado%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fl%C3%B3rez%20AB%22%5BAuthor%5D

Frece, J., Kos, B., Beganović, J., Vuković, S., Šušković, J. (2005) In vivo testing of

functional properties of three selected probiotic strain, World J. Microbiol.

Biotechnol. 21, 1401-1408.

Fuller, R. (1989) Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66, 365-378.

Fuller, R. (1992) Problems and prospects. U: Probiotics – The Scientific Basis, R.

Fuller (ured.), Chapman and Hall, London, str. 377-396.

Fuller, R., Perdigon, G. (2000) Probiotics 3: Imunomodulation by the Gut Microflora and

Probiotics, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.

Goh, Y.J., Azcarate-Peril, M.A., O´Flaherty S., Durmaz, E., Valence, F., Jardin, J.,

Lortal, S., Klaenhammer, T.R. (2009) Development and Application of a upp-Based

Counterselective Gene Replacement System for the Study of the S-Layer Protein

SlpX of Lactobacillus acidophilus NCFM. Appl. Environ. Microbiol. 75 (10), 3093-

3105.

Goldin, B. R., Gorbach, S. L. (1992) Probiotics for humans. U: Probiotics – The

Scientific Basis, R. Fuller (ured.), Chapman and Hall, London, str. 355-376.

Hammes, W.P. (1990) Bacterial starter cultures in food production. Food Biotechnol.

4, 383-397.

Havenaar, R., Ten Brink B., Huis in´t Veld J. H. (1992) Selection of strains for

probiotic use. U: Probiotics - The Scientific Basis, R. Fuller (ured.). Chapman and

Hall, London, str. 209-221.

Huis in't Veld, J. H., Havenaar, J. R., (1993) Selection criteria for microorganisms

for probiotic use. U: Probiotics and Pathogenicity, Flair No. 6, J. F. Jensen, M. H.

Hinton, R. W. A. W. Mulder (ured.), DLO Spelderholt Centrer for Poultry Research

and Information Services, str. 11-19.

52

Klein, G., Pack, A., Bonaparte, C. i Reuter, G. (1998) Taxonomy andy physiology of

probiotic lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol. 103-125.

Kos, B. (2001) Probiotički koncept: in vitro istraživanja s odabranim bakterijama mliječne

kiseline. Disertacija, Prehrambeno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu.

Kos, B., Šušković, J., Beganović, J., Gjuračić, K., Frece, J., Iannaccone, C.,

Canganella, F. (2008) Characterization of the three selected probiotic strains for the

application in food industry. World J .Microbiol. Biotechnol. 24, 699–707

Kos, B., Šušković, J., Vuković, S., Šimpraga, M., Frece, J., Matošić, S. (2003)

Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.

J. Appl. Microbiol. 94, 981–987.

Kršev, Lj., Eri, S., Borović, A., Tratnik, Lj. (1992) Svježi mekani sir proizveden

upotrebom koncentrirane kulture, Mljekarstvo, 42 (4), 281-289.

Kullen, M. J., Klaenhammer, T. R. (1999) Genetic modification of intestinal

lactobacilli and bifidobacteria. U: Probiotics. A Critical Review, G. W. Tannock

(ured.), Horizon scientific press, England, str. 65-84.

Laulund, S. (1994) Comercial Aspects of Formulation, Production and Marketing of

Probiotic Products. U: Human Health: The Contribution of Microorganisms, S. A. W.

Gibson (ured.), Springer Verlag, London, str. 159-174.

Lebeer S. Vanderleyden, J., De Keersmaecker, S. C. J. (2008) Genes and Molecules of

Lactobacilli Supporting Probiotic Action. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 72 (4), 728-764.

Leclercq, R., Courvalin, P. (1996) Resistance to Macrolides and Related Antibiotics in

Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 46 (9), 2727-2734.

Marshall, V. M. E., Henry, C. J. K. (1990) Nutritional benefits of food biotechnology-

the microorganisms' contribution. U: Processing and Quality of food. 2., P. Zeuthen,

53

J.C. Cheftel, C. Ericsson, T.R. Gormley, P. Linko, Paulus, K. (ured.), Food

Biotechnology: Avenues to Healthy and Nutritious Products, Elsevier Applied Science,

London i New York

Marteau, P., Rambaud, J. C. (1993) Potential of using lactic acid bacteria for

therapy and immunomodulation in man. FEMS Microbiol. Rev. 12, 207-220.

Moineau, S., Y. Boutin and J. Goulet (1989). Effect of fermented milks on the immune

response in mice. J. Dairy Sci. 72 (Suppl.), 174.

Neefs, J. M., Van de Peer, Y., De Rijk, P., Chappele, S., De Watcher, R. (1993)

Compilation of small ribosomal subunit RNA structures. Nucleic Acids Res. 21 (13),

3025-3049.

Ouwehand, A.C., Salminen, S., Isolauri, E., (2002) Probiotics: an overview of

beneficial effects. Antonie Van Leeuwenhoek 82, 279–289.

Radošević, V. (2005) Proizvodnja svježeg probiotičkog sira uz dodatak

transglutaminaze, Diplomski rad, Prehrambeno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u

Zagrebu.

Reid, G. (1999) Testing the Efficency of Probiotics. U: Probiotics. A Critical Review

(Tannock, G. W., ured.), Horizon scientific press, England, str. 129-140.

Sanders, M. E. i Huis in't Veld, J. (1999) Bringing a probiotic-containing functional

food to the market: microbiological, product, regulatory and labeling issued. U:

Proceedings of the 6th Symposium on Lactic Acid Bacteria: Genetics, Metabolism and

Applications. Kluwer Academic Publichers, The Netherlands, str. 293-316.

Schleifer, K. H., Amann, R. I., Ludwig, W. (1995) Phylogenetic identification and in

situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59,

143-169.

54

Shu, Q., Gill, H. (2002) Immune protection mediated by the probiotic Lactobacillus

rhamnosus HN001 (DR20) against Escherichia coli O157: H7 infection in mice.

Immunol. Med. Microbiol. 34-59.

Smit, G., Smit, B.A., Engels, W.J.M. (2005) Flavour formation by lactic acid bacteria and

biochemical flavour profiling of cheese products. FEMS Microbiol. Rev. 29 (3), 591–610.

Stackebrandt, E., Goebel, B. M., (1994) A place for DNA-DNA reassociation and 16S

rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst.

Bacteriol. 44, 846-849.

Swenson, U. (1999.) Industrial perspectives. U: Probiotics. A. Critical Review, G. W.

Tannock (ured.), Horizon Scientific Press, London, str. 57-64.

Szabo, I., Wieler H.L., Tedin, K., Scharek-Tedin, L., Taras, D., Hensel, A., Appel, B.,

Nockler, K. (2009) Influence of a Probiotic Strain of Enterococcus faecium on

Salmonella enterica Serovar Typhimurium DT104 Infection in a Porcine Animal

Infection Model. Appl. Enviro. Microbiol. 75 (9), 2621-2628.

Šušković J., Kos, B., Beganović, J., Leboš Pavunc, A., Habjanič, K., Matošić, S.

(2010) Antimicrobial Activity - The Most Important Property of Probiotic and

Starter Lactic Acid Bacteria. Food Technol. Biotechnol. 48 (3), 296-307.

Šušković, J. (1996) Rast i probiotičko djelovanje odabranih bakterija mliječne

kiseline. Disertacija. Prehrambeno-biotehnološki fakultet u Zagrebu.

Šušković, J. (2009) Probiotici kao živi lijekovi, predavanje iz kolegija "Probiotici i

starter kulture", Prehrambeno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu.

Šušković, J., Brkić, B., Matošić, S. (1997) Mehanizam probiotičkog djelovanja

bakterija mliječne kiseline. Mljekarstvo, 47, 107-112.

Šušković, J., Kos, B., Goreta, J., Matošić, S. (2001) Role of lactic acid bacteria and

bifidobacteria in synbiotic effect. Food Technol. Biotechnol. 39, 227-235.

55

Šušković, J., Krobot, M., Mehak, M., Matošić, S. (1993) Antimikrobna aktivnost

Lactobacillus acidophilus. Mljekarstvo, 43, 95-106.

Tannock, G.W. (1999) A fresh look at the intestinal microflora. In: Probiotics: A

Critical Review. GW Tannock ed. Horizon Scientific Press, Wymondham, pp. 1–15.

Todoriki, K., Mukai, T., Sato, S., Toba, T. (2001) Inhibition of adhesion of food-

borne pathogens to Caco-2 cells by Lactobacillus strains. J. Appl. Microbiol. 91, 154–

159.

Vandamme, P., Pot, B., Gillis, M., De Vos, P., Kersters, K., Swings, J. (1996).

Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol Rev.

60, 407–438.

Zhou, J.S., Pillidge, C.J., Gopal, P.K., Gill, H.S. (2005) Antibiotic susceptibility

profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. Int. J. Food

Microbiol. 98, 211–217.

56

57

Documents

Predložak za diplomski/seminarski/konstrukcijski radbib.irb.hr/.../746840.Anamarija_Perkovic_diplomski_rad.docx · Web viewSDS-poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE) je provedena