Detección y determinación de los genotipos del Virus de la Diarrea

Viral Bovina (DVB) en cuatro regiones de Colombia

Viviana Vanadia Villamil Reyes M.V, MSc (c)

Tutor: Jairo Jaime Correa M.V, MSc, PhD

Grupo de Microbiología y Epidemiología

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia - Laboratorio de Virología Animal

2015

Marco teórico

Historia Flaviviridae, Pestivirus1

Alto impacto económico2

Entidad descrita por Olafson3

Distribución mundial4

Endémico en poblaciones

bovinas donde alcanza un nivel

de seropositividad del 40-80%5

1.Peterhans E, et al, 2010. Vet. Research, 41, 1–10. Oguzoglu T, et al, 2010. Trop Anim Health Prod 42:1175–1180.

2.Citado por Häsler B, et al, 2012. Preventive Veterinary Medicine 106 (2012) 162– 173; Muñoz-Zanzi CA. et al. 2004. Theriogenology 61: 1085-1099.

3. Kohara J, et al. 2009. Veterinary Immunology and Immunopathology 128 : 211–347

4. Olafson P, et al. 1946. Cornell Vet, 36 :205–213

5. Moennig V, et al, 2005. Anim Health Res Rev 6:63-74; Citado por Vargas DS, et al ,2009. Rev. Colomb. Cienc. Pecu. 22: 677-688

Fuente: http://tvmdl.tamu.edu/2015/02/10/bvd-herd-drovers-cattle-network/

Agente etiológico

Virus Envuelto1

Simetría icosaédrica

Diámetro: 40-60 nm

ssRNA+

Genoma: 12.3 kb3

ORF que codifica para una poliproteína de 4000 aminoácidos

5’UTR (370 nucleótidos) que proporciona diferencias filogenéticas significativas4

Codifica para 4 proteínas estructurales: C, Erns , E1, E22

1. Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA. 2005. Eighth ICTV Report, Academic Press, San Diego, CA

2. Knipe DM, Howley PM. 2007. Field’s Virology. Lippncott Williams & Wilkins, USA. Volumen 1, Ed. 5. Flaviviridae: The viruses and their replication. P: 1126-1131.

3. Mahony T, McCarthy F, Gravel J, Corney B, Young P, Vilcek S. 2005. J. Vet Microbiology 106 (1-2-20): 1-6.

4. Vilcek S, Paton DJ, Duekovic B, Strojny L, Ibata G, Moussa A, Loitsch A, Rossmanith W, Vega S, Scicluna M T, Palfi V .2001. Arch. Virol. 146:99-115

Fuente: Editado de www.bode-science-center.com

Clasificación - Genotipos Característica DVB – 1 DVB - 2 DVB -3 ó HoBi like virus2

Distribución geográfica

Mundial; cerca de la erradicación en

algunas regiones de Europa

Mundial, aunque más prevalente en Norte América y Suramérica; cerca

de la erradicación en algunas regiones de Europa.

Suramérica y Sureste africano

Huésped Rumiantes domésticos y salvajes, cerdos

Rumiantes domésticos y salvajes, cerdos

Bovinos y búfalos

Diferencias1 Región 5’UTR Región 5’UTR Región 5’UTR

Cuadro clínico Sintomatología clásica de DVB

Síndrome hemorrágico1:congestión en conjuntiva y mucosas,

hemorragias petequiales y equimóticas; animales PI2

Retardo en el crecimiento, reducción en la producción

láctea, enfermedad de tipo respiratorio y deficiencias en el

rendimiento reproductivo5

Subgenotipos 18 subgenotipos3 (VDVB-1a – VDVB-1r)

2 subgenotipos4

Fuente: Editado de Ridpath J, 2010.

1. Ridpath, 1994. Virology 205(1) 66-74; Tajima E, et al, 2001. Virus Res 76:31–42; Couvreur et al, 2002. Virus Res 85:17–28 2. Bauermann, F.V., Ridpath, J.F., Weiblen, R., Flores, E.F. 2013. J. Vet. Diagn. Invest. 25, 6–15.

3. Alpay G, Yesilbag K. 2015. J. Vet. Microbiology 175(1): 1-6.

4. Flores EF, Ridpath JF, Weiblen R, et al. 2002. Virus Res 87(1):51–60.

5. Decaro, N., Mari, V., et al,. 2012. J. Vet. Microbiol 155: 165–171.

Árbol filogenético

del género Pestivirus1

1. Liu L, Xia H, Wahlberg N, Belák S, Baule C. 2009. Virology, 385 (2): 351-357.

Siete grupos

monofiléticos

Dos ramas

divergentes

Fuente: Editado de Liu L, et al. 2009

Citopático No citopático2

Efecto citopático en cultivos celulares1,9

No hay efecto citopático en cultivos celulares1,9

Incapaz de generar PI5 Animales PI5,6

Expresión independiente de las proteínas NS2 y

NS31,3,8

Expresión proteína NS2-3 3

Induce apoptosis7 Las proteínas virales protegen las células de la apoptosis

(Inhibe producción IFN-I)4

Clasificación - Biotipos

1. Deregt, D, Loewen KG.1995. Can. Vet. J., 36: 371-377.

2. Bolin SR, Grooms DL 2004. Vet Clin Food Anim 20: 51-68

3. Brown CC, et al. 2007. Pathology of Domestic Animals, Fifth edition.p:140-147.

4. Schweizer 2001. J Virol 75(10):4692-8

5. Brownlie J et al. 1989. Res Vet Sci 46: 307-11.

6. Bolin SR 1990. Vet. Med. 85: 1124 -1132.

7. Citado por Yamane D et al 2005. Microbes and Infection 7: 1482–1491

8. Bauermann, F.V., Ridpath, J.F., Weiblen, R., Flores, E.F. 2013. J. Vet. Diagn. Invest. 25, 6–15.

9. Ridpath J. 2005. Preventive Veterinary medicine 72(1-2): 17-30.

CP

Fuente: Editado de www.viralzone.expasy.org. 2008

NCP

Presentación clínica

Persistentemente infectados

•Estado inmune del huésped

•Viremia crónica y eliminación continua del virus1

•Retraso en el crecimiento2

Enfermedad de las Mucosas3

•VDVB CP (PI): EM letal4

•Fiebre, descarga nasal serosa o mucosa, diarrea, hemorragias mucosas.5

Enfermedad Aguda

•I.Competentes6

•T, descarga nasal, anorexia, inmunosupresión.

•Complejo Respiratorio Bovino7

•6-24 meses

1. Smirnova N, et al 2008. Virus Res. 132 : 49-58

2. Houe 1995. Prev. Vet. Med. 15:275–283

3. Fritzemeier J et al. 1997. Arch Virol 142: 1335-350

4. Becher 2001. J. Virol 75 :14. p 6256-6264

5. Dabak M. 2007. J. Vet Intern Med 21(3) :514-8.

6. Wilhelmsen CL et al 1990 Vet Pathol 27(4):235-43

7. Ridpath 2010. Vet Clin Food Anim 26:335–348

1Peterhans E, Bachofen C, Stalder H, et al.. Vet Res. 2010;41(6):44. 2 Lanyon SR, Hill FI, Reichel MP,et al. J. Vet. 2014;199(2):201–9.

Fuente: Editado de http://www.bvdzero.com/infograph/infograph1.html. 2015

Métodos diagnósticos

Métodos directos

Aislamiento viral 1

Inmunofluorescencia directa 2

Inmunohistoquímica 3

Hibridación de ácidos nucléicos4

RT-PCR 5

qRT-PCR6

Métodos indirectos

Neutralización7

ELISA8

Inmunofluorescencia indirecta7

1. Saliki y Dubovi, 2004;. Vet Clin North Am Food Anim Pract.20(1):69-83.;Dubovi et al,. 2013. J Biologicals 41: 8-13. 2. Urcuqui y Ossa, 2008. Principios de Virología. Fundamentos de las técnicas diagnósticas para infecciones virales. Colombia. Cuarta Edición.

3. Shin y Acland, 2000 J. Vet. Sci. 2: 81-84.; Grooms y Keilen, 2002. Clin Diagn Lab Immunol 9:898-900.;Dubovi et al., 2013. J Biologicals 41: 8-13.

4. Citado por Vera V et al., 2003. Biología molecular, epidemiología y control de IBR y BVDV. Ed. Universidad Nacional de Colombia, Bogotá

5. Kennedy el at., 2006 J Vet Diagn Invest.;18(1):89-93; Ridpath J, 2006. Proc Am Assoc Bov Pract Conf 39:269-270.

6. Zhang et al., 2014. J. Virological methods 207: 204-209.

7. Dubovi et al, 2013. J Biologicals 41: 8-13.

8. Urcuqui S, Ossa J. 2008. Principios de Virología. Fundamentos de las técnicas diagnósticas para infecciones virales. Colombia. Cuarta Edición.

Métodos diagnósticos

Detección de virus

Detección de virus

Fuente: Editado de http://www.bvdzero.com/infograph/infograph2.html

Métodos diagnósticos

Detecta Ag

Fácil de obtener,

económica

Muestra viable : -20 a 25°C

Múltiples métodos

diagnósticos

No se ve afectada por

Ac maternales

Muescas de oreja

Ridpath JF, Hessman BE, Neill JD, et al 2006. Parameters of Ear Notch Samples for BVDV Testing: Stability, Size Requirements and Viral Load. Proc Am Assoc Bov Pract Conf 39:269-270.

Fuente: ksuccw.wordpress.com

Estudios realizados en

Colombia

1975 2015 Hoy

1975 1981 1987 1993 1999

2005

2011

Parra, et al.

1994

Jaime J, et al.

1996

Burbano, et al.

2004

Villamil V, et al.

2015

Borda, A.

1975

Mendigaña, et al.

1994

Vera V, et al.

1999 Vargas DS, et al.

2010

1994

Novillas Holstein importadas de Holanda 1975

Actividad serológica (vacas >novillas y terneros) Tasas de seroconversión (50-88%), incidencia (70-94%.)

1994

1996

Diferencias entre proteínas virales (CP y NCP: 31-35 kDa) a través de técnicas de SDS-PAGE e inmunoperoxidasa

1999

Métodos para la detección de animales PI mediante cultivos de células polimorfonucleares

2004

Identificaron el biotipo NCP en suero fetal bovino utilizado en diferentes laboratorios del país

Normalizaron la técnica RT-PCR (primers ubicados en el extremo 5’UTR del genoma del virus)

2010 Adenovirus recombinante que expresa la proteína E2 (como vacuna recombinante)

2015 Detección de los genotipos del VDVB (Genotipo 2)

2005

Impacto del VDVB

Objetivo General

Detectar y determinar los genotipos del virus de la Diarrea Viral Bovina

(DVB) en Colombia

Objetivos Específicos

1. Determinar los genotipos del Virus de Diarrea Viral Bovina

presentes en bovinos de 4 regiones ganaderas de Colombia

2. Detectar animales positivos al virus a través de la técnica

molecular de RT-PCR a partir de muesca de cartílago de oreja

“ear notch” y suero sanguíneo

Materiales y Métodos

FINCAS

(1) Fincas de Cundinamarca con ganadería de leche, (2) Antioquia:

ganadería de leche, (3) Santander: ganadería de leche y carne, (4)

Valle del Cauca: ganadería de leche y carne

16 fincas distribuidas en:

Cundinamarca (2), Antioquia (3),

Santander (1) y Valle del Cauca

(9).

Seleccionadas al azar de acuerdo

a la disponibilidad de los

propietarios para participar en la

investigación.

Muestreo desarrollado entre Abril a

Agosto del año 2013

1

2

4

3

1

4

3 2

Región

Laboratorio

Vacuna

empleada

Componentes

Frecuencia

de

aplicación

Tipo de vacuna

para VDVB

Cundinamarca Novartis Viral Shield 4 IBR, DVB cp y ncp; PI -3,BRSV Anual Inactivado*

Antioquia Novartis Viral Shield 4 IBR, DVB cp y ncp; PI -3,BRSV. 11 meses Inactivado*

Santander Novartis Viral Shield 4 IBR, DVB cp y ncp; PI -3,BRSV. Anual Inactivado*

Valle de Cauca Pfizer Cattle Master 4 IBR, DVB, PI -3,BRSV Anual Inactivado**

FINCAS

Esquema de vacunación establecido en las fincas

Distribución y número de animales muestreados por región

Fuente: Tomado de: *http://www.vecol.com **www.tecnovet.com

Región

Hembras bovinas

Terneros

Total de animales

Cundinamarca 13 3 16

Santander 101 121 222

Antioquia 74 67 141

Valle del Cauca 191 164 355

TOTAL 379 355 734

Toma de muestras

SUERO

Suero de Madres : Preparto “PP” (1mes antes) y

Posparto “POP”

Suero de terneros: Precalostral “PC” y 25 días post

nacimiento “25 DD”

Muestra de sangre (hembras 7-10 ml; terneros 5 ml) ; Tubos Vacutainer

Refrigeradas a 4°C y procesadas dentro de las siguientes 18 horas

Centrifugación suero (1300g – 2000g por 10 min)

Almacenado -70°C

Mahlum C, et al, 2002. J Vet Diagn Invest 14(2):120-5.

Biopsia de cartílago de oreja

(1cm2)1

Pinza ProSampler

200 μL PBS2 Colección del

sobrenadante

24 horas para procesar la

muestra

1. Cornish T et al, 2005. J Vet Diagn Invest 17:110–117. 2. Kennedy J, et al, 2006, J Vet Diagn Invest 18:89-93

Toma de muestras

EAR NOTCHES

Terneros : 2 biopsias

Distribución de muestras

Región HEMBRAS TERNEROS

PP POP PC 25 DD MO

Cundinamarca 13 13 0 0 3

Santander 101 101 121 90 87

Antioquia 74 74 67 13 35

Valle del Cauca 191 191 86 42 56

TOTAL 379 379 274 145 181

Procesamiento de muestras

El RNA viral fue extraído de las muestras (suero, cartílago auricular)1

Análisis mediante RT-PCR empleando primers que amplifican una región de 288 pb para establecer la presencia del VDVB2

Aquellas muestras que resultaron positivas, fueron sometidas a una nueva RT-PCR empleando primers que amplifican una secuencia de

221 pb en la región 5’UTR (VDVB-2)3

1.Zhang X et al, 2012. Research in Veterinary Science, Volume 92, Issue 3, June 2012, Pages 512–518.

2. Burbano. 2004. Estandarización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico del Virus de la Diarrea Viral Bovina. Tesis de pregrado. Facultad de Medicina

Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia.

3. Letellier C., Kerkhofs P., Wellwmans G. & Vanopdenbosch E. 1999. Detection and genotyping of bovine diarrhea virus by reverse transcription-polymerase chain

amplification of the 5'untranslated region. Vet. Microbiol. 64:155-167.

Primer Secuencia Tm %GC

Primer F 324 5' ATG CCC WTA GTA GGA CTA GCA 3' 49 52,9

Primer R 326 5' TCA ACT CCA TGT GCC ATG TAC 3' 50.5 52,9

Diferenciación Genotipos

Dos métodos

ADNc fue reamplificado para determinar si

correspondían al genotipo 2 del VDVB

Primers específicos VDVB-2

Primer Secuencia Posición del

genoma

Tamaño de

secuencia

5’UTR F 5′ ACT AGC GGT AGC AGT GAG 3′ 139-145

221 pb 5’UTR R 5′ CTA GCG GAA TAG CAG GTC 3′ 360-343

Fuente: Letellier, 1999.

Amplificación región 5’UTR para

diferenciación de genotipos 1

Digestión enzimática para diferenciación

de genotipos 1 y 2 2

Nueva PCR1

296 pb

Digestión enzimática

BstNI

Incubación 60°C x 1 h

VDVB - 1 VDVB - 2

Primer Secuencia

Forward OPES 13A 5' GCT AGC GAT GCC CTT AGT AGG A 3'

Reverse OPES 14A 5' ATC AAC TCC ATG TGC CAT TTA CAG C 3'

Fuente: Stahl et al., 2005

REGIÓN 5’UTR

Resultados

Amplificación región 5’UTR

VDVB VDVB - 2

VDVB (288pb)

(1) Control negativo, (2) VDVB Cepa NADL, (3) Marcador

de peso molecular (pb),

(1) Muestra positiva de muesca de oreja al VDVB-2, (2) Muestra negativa de muesca de

oreja al VDVB-2, (3) Control positivo VDVB-2 Cepa VS-260, (4) Marcador de peso

molecular (pb), (5) Control negativo

VDVB-2 (221pb)

Animales positivos por RT-PCR al VDVB y

VDVB-2 en finca de Cundinamarca

El estudio determinó que de 13 muestras de suero PP obtenidas de las hembras bovinas, 1 (7,69%) resultó positiva al VDVB, correspondiendo al VDVB-2.

De las 4 muescas de oreja obtenidas de los terneros, no se evidenció ningún animal positivo al VDVB.

Animales positivos por RT-PCR al VDVB

y VDVB-2 en finca de Santander

Hembras Terneros PC Terneros 25 DD Terneros MO

VDVB 1 2,97 1,65 2,22 3,45

VDVB 2 4,95 0 0 1,15

Total de muestras positivas 7,92 1,65 2,22 4,6

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

% A

NIM

ALE

S P

OSIT

IVO

S

(8)

(3)

(5)

(2) (2)

(4)

(1)

(3)

101 121 90 87

Animales positivos por RT-PCR al VDVB

en fincas de Antioquia

Hembras Terneros PC Terneros 25 dd Terneros MO

VDVB-1 4,05 1,49 0 2,85

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

% A

NIM

ALE

S P

OSIT

IVO

S

(1) (1) (3)

74 67 13 35

Animales positivos por RT-PCR para el VDVB-1

y VDVB-2 en Valle del Cauca

Hembras Terneros PC Terneros MO

VDVB-1 2,6 3,2 0

VDVB 2 0 0 23,2

0

5

10

15

20

25

% A

NIM

ALE

S P

OSIT

IVO

S

(13)

(3) (5)

Hembras?

191 86 56

Evaluación del VDVB en sueros de hembras PP

muestreadas en fincas de 4 regiones del país

Cundinamarca Santander Antioquia Valle del Cauca

VDVB-2 0,26 1,31 0 0

VDVB-1 0 0,79 0,79 1,32

0

0,5

1

1,5

2

2,5%

AN

IMA

LES P

OSIT

IVO

S

Evaluación del VDVB en sueros PC, 25 DD y MO en

terneros de fincas muestreadas en 4 regiones de

Colombia

PC

VDVB-1

25 DD

VDVB-1

MO

VDVB-1

MO

VDVB-2

Cundinamarca 0 0 0 0

Santander 0,71 1,38 1,1 0,55

Antioquia 0,35 0 0,55 0

Valle del Cauca 1,06 0 0 7,73

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

% A

nim

ale

s p

osi

tivo

s

Digestión enzimática

Controles positivos para VDVB-1 y VDVB-2

Digestión realizada empleando la enzima BstNI: 1A) Clivaje del producto del control de la cepa de referencia NADL para el VDVB-1

correspondiente a 186 pb y 110 pb; 1B) Producto del control obtenido de la cepa de referencia VS-260 correspondiente a 296 pb.

Muestras de cartílago auricular y sueros de

Cundinamarca, Santander y Valle del Cauca.

296 pb 186 pb

110 pb

296 pb

186 pb

110 pb

Digestión realizada empleando la enzima BstNI en muestras de cartílago auricular: 1A: 1) Control

negativo, 2) Biopsia F1H04PP Cundinamarca, 3) Suero F2HO7PP Santander, 4) Suero F2H15PP

Santander, 5) Suero F2H25PP Santander 6) Suero F2H27PP Santander, 7) Biopsia F2T02MO Santander,

8) Suero F2H69PP Santander 9) Biopsia F4T1321MO Valle, 10) Biopsia F4T2419MO Valle, 11) Biopsia

F4T1298MO Valle, 12) Biopsia F4T4300MO Valle, 13) Control DVB1 Cepa NADL 14) Control DVB2 Cepa

VS-260 15) 100 MP 100 pb)

1B): 1) Control Negativo, 2) Biopsia F4T429MO Valle, 3) Biopsia F4T2711MO Valle 4) Biopsia

F4T4256MO Valle 5) Biopsia F4T2754MO Valle 6) Biopsia F4T2161MO Valle 7) Biopsia

F4T2837MO Valle 8) Biopsia F4T6092MO Valle 9) Biopsia F4T6887 Valle 10) Biopsia F4T6099

Valle 11) Control DVB1 Cepa NADL 12) Control DVB2 Cepa VS-260, 13) MP 100 pb).

Muestra de

hembra PP Santander

Secuenciación

15μl de amplicon

purificado a partir de gel

La secuencia se comparó con el genoma de la cepa VS-260 (AF410788.1).

Las muestras fueron ensambladas y

editadas usando el programa Bioedit 7.

Inferencia filogénetica1

MEGA 6; criterio Neighbor-joining.

Secuenciación

Weber MN, Silveira S, et al. 2014.. Virus Research 191: 117–124.

Ubicándose en el mismo clado de la

cepa de referencia VS-123.4

(AF410790.1) encontrada en Brasil1

Las cepas de referencia usadas

corresponden a la región 5’UTR del

genoma viral y fueron las empleadas

por Flores et al1.

Filogenia de muestra positiva a VDVB-2

Comparación de secuencias 5’UTR del VDVB-2 de Brasil, Argentina y Colombia.

Adicionalmente, se comparan secuencias de algunos Pestivirus y el VDVB-1 cepa NADL.

1. Flores EF, Ridpath JF, Weiblen R, et al. 2002. Virus Res 87(1):51–60.

Conclusiones y Discusión

Nuestro estudio representa la primera evidencia documentada del genotipo 2 del

VDVB en bovinos de Colombia.

En este estudio se detectó y determinó la presencia del VDVB-1 en todas las regiones

evaluadas

El origen y la fecha de introducción del VDVB-2 en Colombia son inciertos y no se

puede establecer mediante el presente estudio (importación de ganado y/o semen

de otros países. Vacunas contaminadas1)

Se detectaron los genotipos 1 y 2 en el país analizando la región 5’UTR del genoma

viral2, la cual constituye la zona más empleada para su caracterización3 debido a

que es altamente conservada4 y permite una óptima amplificación mediante la

técnica de RT-PCR5.

1. Falcone E., Cordioli P., Sala G., Tarantino M., Tollis M. 2001. Vet. Res. Commun., 25, 161-167.

2. Couvreur B, Letellier C, et al. 2002. Virus Res 2002;85:17–28. Yilmaza H, Altana E, et al. 2012. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 35:411–

416.

3. Flores EF, Ridpath JF, Weiblen R, et al. 2002. Virus Res 87(1):51–60.

4. Cortez, A., Heinemann, M.B., et al 2006. Pesquisa Veterinaria Brasileira 26, 211–216.

5. Ridpath JF, Bolin SR, Dubovi EJ. 1994. Virology 205:66–74; Ridpath J, Bolin S. 1995. Virology. Sep 10;212(1):39-46.

En 3 de 4 de las regiones estudiadas de Colombia se evidenció la presencia del

VDVB-2. En países en donde se han realizado estudios similares se han evaluado

regiones específicas, como en el caso de Túnez1, Brasil2, Inglaterra3 ,Alemania4 y

Argentina5. En la presente investigación pudimos evaluar la presentación de los

genotipos de forma simultánea en varias regiones de Colombia.

En el país son pocos los estudios enfocados a la detección del VDVB mediante

técnicas moleculares. El presente estudio es el primero que combina análisis de

detección molecular junto con la diferenciación de genotipos en muestras de suero

y cartílago de oreja.

Aunque la cantidad de muestras de suero de hembras obtenidas de la región de

Cundinamarca fue pequeña (13 muestras), éstas permitieron determinar la

presencia del VDVB-2, lo que lleva a pensar que existe una alta probabilidad de

que el genotipo 2 esté en otros bovinos de la zona

1. Thabti F, Bakkali Kassimi L, M’zah A, Ben Romdane S, Russo P, Ben Said M, Hammami S and Pepin M. 2005. Revue Méd. Vét., 156, 8-9, 419-422.

2. Weber MN, Silveira S, Machado G, Groff F, Mósena A, Budaszewski R, Dupont P, Corbellini L, Canal CW. 2014 Virus Research 191: 117–124.

3. Wakeley P, Turner J, Ibata G, King D, Sandvik T, Howard P, Drewa T. 2004. Veterinary Microbiology 102: 19–24.

4. Tajima M, Frey H.R, Yamato O, Maede Y, Moennig V, Scholz H, Greiser-Wilke I. 2001 Virus Research 76: 31–42.

5. Jones LR, Zandomeni R, Weber EL: 2001. J.Vet Microbiol 81:367–375

Los resultados positivos al VDVB-2 fueron confirmados mediante digestión enzimática,

dado que las endonucleasas de restricción son ampliamente empleadas para

diferenciar los genogrupos pertenecientes al género de los Pestivirus1

En nuestro estudio se empleó la enzima BstNI con la que se confirmaron las muestras

positivas al genotipo 2 del VDVB, lo que coincide con la literatura reportada por Pizarro-

Lucero y colaboradores (2006). A partir de ésta investigación, se confirmó que es posible

realizar la genotipificación del virus mediante digestión enzimática, al clasificar 16

aislamientos como VDVB-1 y 17 aislamientos como VDVB-2.

La secuenciación realizada mostró una alta similitud con la cepa de referencia VS-123.4

que corresponde a un aislamiento del VDVB-2 de Brasil, lo que podría ser atribuido a la

cercanía geográfica con ese país o por la introducción de ganado y/o semen

contaminado.

1. Vilcek S, Herring A, Nettleton P, Lowings J, Paton J. 1994. Archieves of virology 136: 309-323. 2. Pizarro-Lucero J, Celedón M, Aguilera M, de Calisto M. 2006. Vet Microbiol. Jun 15;115(1-3):208-17.

En la finca de la región de Santander pudo evidenciarse el mayor porcentaje de

hembras positivas al VDVB-2 (4,95%). En contraste, en las fincas muestreadas en la

región del Valle del Cauca se encontró la mayor tasa de presentación del VDVB-2 en terneros, al encontrarse un 7,73% de biopsias auriculares positivas (? importación

de animales y/o semen contaminado, en donde se ha establecido que el virus

puede persistir por varios meses1).

La muestra de elección para detectar el genotipo 2, tanto por su manejo como por

la probabilidad de encontrar el virus, es la muesca de oreja que puede ser

evaluada mediante RT-PCR o por AgELISA, demostrando niveles de confiabilidad

del 95% al ser comparada con otras muestras como suero sanguíneo, saliva e

hisopados nasales2

1. Givens, M, Heath A, Brock K, Brodersen B, Carson R, Stringfellow D. 2003. Am. J. Vet. Res. 64(4): 428-434.

2. Renee S, Kims S, Cockcroft P, Reichel M. 2014. J. Vet diagnostic investigation: official publication of the American Association of

Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. (Impact Factor: 1.23).

En cuanto a la presencia de animales PI en el estudio, se podría sugerir una

aproximación mediante la técnica de RT-PCR en las fincas evaluadas de 3

regiones del país identificando terneros infectados con el VDVB biotipo NCP

en suero PC (Santander: 0,71%; Antioquia: 0,35% y Valle del Cauca: 1,06%).

Recomendación!!!

Se debe valorar el suero de una hembra antes y después del parto y estudiar

el suero precalostral de la cría. En "Valle del Cauca y Santander”, se podría

sugerir que 3 y 2 hembras respectivamente se infectaron durante el 1/3,

mientras que las otras hembras (17) (2-3/3) sin traer como consecuencia la

aparición de animales PI.

1. Zhang S, Tan B, Li P, Wang F, Guo L, Yang Y, Sun N, Zhu H, Wen, Cheng S. 2014. J. Virological methods 207: 204-209.

2. Renee S, Kims S, Cockcroft P, Reichel M. 2014. J. Vet diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary

Laboratory Diagnosticians, Inc. (Impact Factor: 1.23).

Recomendaciones

Aquellas muestras que resultaron positivas al VDVB-1 podrían corresponder

eventualmente al VDVB-3, por lo que se sugiere un estudio que determine la posible

presencia de los HoBi-like virus en el país.

Realizar estudios que correlacionen variables tales como el número de parto,

alimentación, manejo, condiciones climáticas, región del país, con la presentación del

VDVB-2

Seguimiento de la sintomatología clínica de las hembras y terneros dentro de las

explotaciones, como método para detectar los animales PI. Se recomienda realizar un

estudio en el cual se implementen técnicas IHC para el diagnóstico de bovinos PI.

Agradecimientos

A Dios

A mis familiares, amigos y colegas

A mi Director de Trabajo de Grado: Dr. Jairo Jaime

Al Dr. Víctor Vera y Dra. Gloria Ramírez

Al Dr. Humberto Guaqueta

A los ganaderos que participaron en el proyecto

A Colciencias, Universidad Nacional de Colombia