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Las “ÓMICAs”: Herramientas modernas de diagnóstico y estudio de la microbiota; junto con el uso de productos bioseguros, para un mejor control y prevención de las enfermedades en el camarón Litopenaeus vannamei.
Motte Emmerik, Quimi J., Lopez J., Intriago J., Macias P., Chanta C., Bermudes ME, Jerusik R, Benzoni G, Weissman D, Jegou F, Cedeño V, Mialhe E.
.
EXPORTACIONES DEL CAMARÓN EN ECUADOR
WSSV
EMS/AHPND
- WSSV - IHHNV - NHP - TSV - BP
510000 MT
Tasa de crecimiento promedio anual =12%
Retos de la producción mundial en acuicultura
La FAO: Para satisfacer las necesidades de la población humana, la producción debería ↗ a 196 mtm, con 178 mtm para consumo humano (2025). Implica ↗ la Eficiencia en la Producción de las especies cultivadas. ↘el impacto de las enfermedades.
Para lograrlo Amplios esfuerzos en investigación para la acuicultura.
Vibrio spp.
Photobacterium spp.
γ-Proteobacteria
V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. penaecida,
V. vulnificus, V. sinaloensis, V. nigriulchritudo, V.
campbelli, etc., Photbacterium damselae
Pseudomonas spp.
γ-Proteobacteria
P. putida, P. putrefaciens,
P. fluorescens
Streptococcus spp.
Firmicutes
Streptococcus parauberis, S. penaeicida
Spiroplasma spp.
Firmicutes
Spiroplasma penaei
Mycobacterium spp.
Actinobacteria
M. peregrinum, M. fortuitum, M. marinum
PR
OC
AR
IOT
AS
BA
CT
ER
IAS
MYCOPLASMATACEAE
Ex
tra
-
celu
lare
s
Necrotizing Hepatopancreatitis bacterium
α- Proteobacteria
MYCOBACTERIACEAE
Intr
a-
celu
lare
s
VIBRIONACEAE
PSEUDOMONADACEAE
RICKTTESIACEAE
STREPTOCOCCACEAE
Parásito Intracelular formador de esporas
FUNGI = MICROSPORIDIA
EHP Hepatopancreatic
Microsporidiosis
Enterocytozoon hepatopenaei
EN VIGILANCIA
Quitinosis EMS / AHPND
Síndrome de bolitas o Zoea II
“NHP-B”
Retos de la producción mundial en acuicultura
BP
Baculovirus
Baculovirus penaei
WSSV
WhispovirusWhite Spot Syndrome Virus
Virus de la Mancha Blanca
SHIV
IridovirusShrimp Hemacyte Iridescent Virus
Virus Iridiscente de Hemocitos del Camaron
IHHNv
Brevidensovirus
Infectious Hypodermic and Hematopoietic Virus
Virus de la Necrosis hipodermica y hematopoyetica
Infecciosa
HPV
Pm-DensovirusHepatopancreactic parvo-like Virus
Virus Hepatopnacreatico
VIR
US
de
AD
N
BACULOVIRIDAE
NIMAVIRIDAE
IRIDOVIRIDAE
PARVOVIRIDAE
PARVOVIRIDAE
AD
Nd
cA
DN
sc
275 nm
120 nm
300 nm 70 nm
Retos de la producción mundial en acuicultura
TSV
AparavirusTaura Syndrome Virus
Virus del Síndorme de Taura
YHV-type1-8
OkavirusYellow Head Syndrome Virus
Virus del Síndrome de la Cabeza Amarilla
IMNV
¿Artivirus?Infectious Mionecrosis Virus
Virus de la Mionecrosis Infecciosa
CMNV
gamma NodavirusCovert Mortlity Nodavirus
Nodavirus de la Mortlidad encubierta
PvNV
NodavirusPenaeus vannamei Nodavirus
Necrosis Muscular
MrNV
NodavirusMacrobranchium rosenbergii nodavirus
Enfermedad de la cola blanca
RONIVIRIDAE
TOTIVIRIDAE
NODAVIRIDAE
NODAVIRIDAE
NODAVIRIDAE
VIR
US
de
AR
N
DICISTROVIRIDAE
AR
Nsc
+A
RN
dc
AR
N b
ipa
rtit
e
TODOS BAJO VIGILANCIA
PvNV
Retos de la producción mundial en acuicultura
Retos de la producción mundial en acuicultura
Las “Ómicas”; junto con el Estudio y manejo de la Microbiota, el uso de Probióticos y Productos BioSeguros
pueden acelerar la consecución de estos objetivos.
Producción Rentable de Animales Sanos con un Impacto Ambiental Limitado mejorar las tasas de crecimiento (selección genética, nutrición, probióticos), mejorar la eficacia de la alimentación (péptidos bioactivos, probióticos), innovar y mejorar los sistemas de producción (Bioflocs, RAS, probióticos, …), reducir las pérdidas por enfermedades, mejorando la respuesta inmune,
- Certificación de reproductores y postlarvas - Selección genética basada en la resistencia,
mejorar las técnicas de diagnóstico y las medidas de prevención - Diagnósticos moleculares rápidos, sensibles y específicos (PCR, LAMP) - Selección de microorganismos benéficos (Probióticos, Bioremediadores,… )
Del gen a la proteína: Tecnologías “Ómicas”
Moléculas de la vida:
Realtime-PCR, RNA-Seq
Diagnostico por PCR, Secuenciación,
Metagenómica…
MALDI TOF TOF Mass Imaging
“Herramientas biotecnológicas para el control y prevención de enfermedades en especies acuáticas”
1) Aplicación de las herramientas “Omicas” para la prevención,
diagnóstico y vigilancia de patógenos.
- Certificación de reproductores y postlarvas.
- Monitoreo de las enfermedades en:
Laboratorios (zoea-mysis-postlarvas-algas-artemia)
Raceways
Camaroneras
Amplificación isotérmica LAMP
útiles cuando los microorganismos son difíciles de cultivar, ya que permiten su identificación sin necesidad de aislarlos.
Aplicación para identificación de Bacterias, Rickettsias, Microsporidia, Mycobacterium, Hongos, Virus...
PCR, nested-PCR RT-nested-PCR
Espectrometría de masa
Ventajas: - Alta Sensibilidad, - Alta Especificidad, - Rapidez
Diagnóstico molecular: Genómica, Transcriptómica y Proteómica
DIAGNÓSTICOS MOLECULARES PARA PATÓGENOS DEL CAMARÓN
(larvas, juveniles, reproductores, vectores, alimentos y muestras ambientales)
Resultados altamente competitivos especificidad, sensibilidad y confiabilidad.
Virus ADN
WSSV (virus de la mancha blanca)
IHHNV (Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa)
BP (Baculovirus penaei)
HPV (Parvovirus Hepatopancreático)
SHIV (Shrimp Hemocyte Iridescent Virus)
Virus ARN
TSV (virus de síndrome de Taura)
IMNV (Virus de la mionecrosis infecciosa)
YHV/GAV (virus de la cabeza amarilla y virus asociado a branquias)
PvNV (Nodavirus de P. vannamei)
CMNV (Covert Mortality Nodavirus)
BACTERIAS Y HONGOS
NHP (Bacteria intracelular causante de la Hepatopancreatitis necrotizante)
EMS/AHPND (Gen PirA/B) Síndrome de la mortalidad temprana / Enf. de la necrosis hepatopancreática aguda.
Vibrio sp. no luminiscente altamente patógeno (síndrome de la cola blanca opaca)
SPIROPLASMA (Responsable de la muerte parrada)
ESTREPTOCOCCUS de L. vannamei
MICROSPORIDIA (EHP) (Enterocytozoon hepatopenaei)
La prevención de la transmisión de virus se basa principalmente en el análisis individual de los reproductores para eliminar los animales portadores de virus y subsecuentemente susceptibles de transmitirlos.
Certificación y eliminación de la transmisión vertical
Eliminación de la transmisión horizontal por individuos
portadores y vectores
DIAGNÓSTICOS MOLECULARES PARA PATÓGENOS DEL CAMARÓN
(larvas, juveniles, reproductores, vectores, alimentos y muestras ambientales)
Analísis puntuales, han detectado la presencia del virus del síndrome de Taura “TSV”
En reproductores y larvicultura = muestreo aleatorio (independiente de síntomas) En juveniles casos con problemas = muestreo no aleatorrio.
Monitoreo de las enfermedades
DIAGNÓSTICOS MOLECULARES PARA PATÓGENOS DEL CAMARÓN
(larvas, juveniles, reproductores, vectores, alimentos y muestras ambientales)
Diagnóstico por Proteómica: MALDI-TOF TOF
DIAGNÓSTICOS MOLECULARES PARA PATÓGENOS DEL CAMARÓN
El MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time-Of-Flight Mass) Poderosa técnica micro-analítica determinar con gran sensibilidad y precisión la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z).
2) Irradiación láser pulsado. 3) Desorción de los iones de
fase sólida fase gaseosa. Separación de iones: relación masa/carga.
4) Resultado = Espectro
¿Cómo funciona? 1) Las macromoléculas mezcladas a
una matriz sólida
Identificación de toxinas en cepas causantes de EMS/AHPND
Diagnóstico por Proteómica: MALDI-TOF TOF
DIAGNÓSTICOS MOLECULARES PARA PATÓGENOS DEL CAMARÓN
Detección e Identificación de toxinas
VIBRIO BACILLUS Bacillomycin Bacilysin Iturin Surfactin Subtilin Micosubtilin Gramicidin Bacitracin
Evaluación de Probióticos: Análisis de los antagonismos
Proteómica funcional: Mass Imaging
Metabolómica: Exo-metabolomas
“Herramientas biotecnológicas para el control y prevención de enfermedades en especies acuáticas”
2) Estudio de la microbiota para una mejor prevención de las
infecciones bacterianas en el camarón Litopenaeus vannamei.
- Análisis de la microbiota de animales sanos y enfermos,
mediante secuenciación y metagenómica.
- Estudio de la diversidad microbiana y prevención de
enfermedades con la aplicación de microorganismos
probióticos específicos.
Metagenómica: Secuenciación de nueva generación “NGS”
La metagenómica nueva herramienta para analizar la diversidad de la microbiota del camarón y otros ambientes, sin necesidad de aislar los microorganismos.
Identificación molecular de cepas cultivables y co-cultivables
Taxonomía molecular (secuenciación gen 16S y metagenómica)
Identificación molecular de cepas no cultivables
Resultados: Identificación molecular de bacterias cultivables de camarones enfermos.
HEPATOPANCREAS Pseudomonas putida
Acinetobacter johnsonii Vibrio parahaemolyticus
Bacillus firmus
INTESTINO Vibrio alginolyticus Vibrio brasiliensis Vibrio campbellii
Vibrio harvey Vibrio hepatarius Photobacterium
damselae Providencia rettgeri Bacillus megaterium
HEMOLINFA Vibrio harvey
Vibrio hispanicus Vibrio nigripulchritudo
Vibrio sinaloensis Pseudomonas hibiscicola
Staphylococcus epidermidis Staphylococcus warneri Staphylococcus hominis
Staphylococcus haemolyticus Aerococcus viridans Acinetobacter pittii
Chryseobacterium gambrini Bacillus cereus
Resultados: análisis metagenómico de bacterias del intestino.
Disbiosis
Resultados: análisis metagenómico de bacterias del hepatopáncreas.
GENEROS PREDOMINANTES EN HEPATOPANCREAS DE
CAMARONES ENFERMOS
GENEROS PREDOMINANTES EN HEPATOPANCREAS DE CAMARONES SANOS
LOS GUARDIANES (Sentinelas) Roseobacter / Ruegeria / Paeobacter rol en ciclo global del carbono y sulfuro y produce compuestos bioactivos.
Simbióticos con fitoplancton, macroalgas, invertebrados…
Probióticos en larvicultura de peces.
Análisis metagenómico de bacterias del en cultivo de larvas (Agua y Larva)
QQ = Quorum Quenching
Abundancia relativa de los filos dominantes en la muestra de agua saludable (HWS), enfermedad (DWS), muestra de camarón saludable (HSS) y camarón enfermo (DSS).
Los seis géneros bacterianos más abundantes en agua de cultivo y larvas de camarón: muestra de agua saludable (HWS) y enfermedad (DWS); muestra de camarón sano (HSS) y camarón enfermo (DSS).
Avances, desafíos y direcciones en el control de la enfermedad del camarón: las directrices desde una perspectiva ecológica
“Herramientas biotecnológicas para el control y prevención de enfermedades en especies acuáticas”
2) Estudio de la microbiota para una mejor prevención de las
infecciones bacterianas en el camarón Litopenaeus vannamei.
- Análisis de la microbiota de animales sanos y enfermos,
mediante secuenciación y metagenómica.
- Estudio de la diversidad microbiana y prevención de
enfermedades con la aplicación de microorganismos
probióticos específicos.
Prevención de enfermedades: Domesticación de microorganismos probióticos
Cepas bacterianas benéficas
seleccionadas por sus propiedades
genéticas asociadas con:
- Actividades enzimáticas digestivas,
o de biorremediación,
- Inhibición del quorum-sensing de
los vibrios,
- Producción de agentes
antimicrobianos y antiviral.
Análisis metagenómico de la microbiota de postlarvas y juveniles de Litopenaeus vannamei inoculados con bacterias probióticas y patógenas
Bioensayos realizados con probióticos portadores de genes: - Lactonase (anti- quorum-sensing) - Bacilysin (antibacteriano y antifúngico) - Subtilin (lantibiótico = péptido antimicrobiano) - Surfactin (surfactante con actividades antibacteriana, antiviral, antifúngico, antimycoplasma y antihemolítico.
Probioticos = consorcio de cepas CA1 = 6 cepas CA2 = 8 cepas
Bacterias patógenas Vibrio harveyi V. nigripulchritudo Photobacterium damselae Pseudomonas aeruginosa
- 30 días con alimento balanceado (control = CSP) (inicio PL de 30mg) + mezcla de cepas probióticas (CA1 o CA2 ) - No desafiados (CSP, CA1, CA2) - Desafiados (día 30) con varias cepas bacterianas patógenas (104 UFC/ml) - Análisis metagenómicos a 3-4g
Porcentaje de supervivencia
Control sin Probióticos CSP: color gris CA1: color amarillo CA2: color naranja
Tratamientos donde ocurieron mayores mortalidades
Composición de las microbiotas a nivel de Filos
Metagenómica en intestino de juveniles de 3-4g
2do filo Bacteroidetes: CA2Vh,CA2Pd = 18-19% . Costertonia . Maribacter Saccharicrinis
Firmicutes: . Bacillus (no en CSP)
Fusobacteria (solo en CSP)
Actinobacteria
Tanque Población
Inicial
Población
Final
Supervivencia
Probióticos 4200000 336000 80%
Control 4200000 252000 60%
Inoculaciones siguientes: - Zoea 3 a Mysis 1 - Mysis 3 a Pl1 - Dos días antes de la cosecha
1era inoculación de probiótico CA2: Tanque de eclosión y baldes de nauplius
Ensayo en tanques de producción Perú
Thiovirga sp. = chemolithoautotrophic
sulfur-oxidizing bacterium in biofilm
Futura generación de probióticos
Empresas Multinacionales Especializadas en las Tecnologías Moleculares, en el Desarrollo y Producción de Probióticos y Productos Alternativos Seguros, se juntaron para: Nuevos Consorcios para la Prevención de las Enfermedades y Mejora de la Productividad.
Bacterias con características - antimicrobianas, - antivirales y - bioremediadoras , mostraron su sinergia en relación con la supervivencia en casos de doble infección (bacteria “portadora de PirAB” y virus “WSSV”.
“Herramientas biotecnológicas para el control y prevención de enfermedades en especies acuáticas”
3) uso de productos bio-seguros para una mejor prevención de las enfermedades en el camarón Litopenaeus vannamei.
Reducir riesgos por contaminación de dietas vivas como son Artemia y
Microalgas.
Reducir riesgos por contaminación de dietas frescas.
Dietas microencapsuladas Certificadas Orgánicas Bioseguras.
Uso de productos Bio-Seguros
BIOSEGURIDAD
A) Ensayo con reemplazo de Artemia Perfil nutricional que permite reemplazo al 100%
DAY 17: PL11
DEVELOPMENT OF THE TEST:
• 2 test tanks of 20 MT (TQ5 5 of module 1 & 2).
• 1 control tank 20MYT (TQ6 of module 1)
• 1.9 million NV en TQ prueba / 1.5 million NV Control
• Seed of Nauplii on September 30th 2018,
• AR Test started on October 4th 2018, in mysis 1.
(100% artemia replacement daily
at 10 am and 10 pm).
Laboratorio Ecuador, Sept- Oct 2018
Uso de productos Bio-Seguros
BIOSEGURIDAD
Tanques con 1000000 Nauplios (100 N/L) Tq 1 y 2 control protocolo normal Tq3 = Z1 hasta PL10 (reemplazo) Tq4 = Z2 hasta PL9 (remplazo)
A) Ensayo con reemplazo de Artemia Perfil nutricional que permite reemplazo al 100%
Laboratorio Ecuador, Abril 2017
Ensayo Maduración Honduras, 2004. Control = Balanceado + Poliqueto/Moluscos + Artemia + Calamar Prueba = Reemplazo de dieta fresca por 2% de dieta seca + Calamar en 11%.
Sistema de alimentación Bio-Seguro en Maduración:
Uso de productos Bio-Seguros
BIOSEGURIDAD
# Huevos/ Hembra control # Huevos / Hembra dieta seca # Nauplios/ Hembra control # Nauplios / Hembra dieta seca
% Eclosión control % Eclosión dieta seca
% Copulas control % Copulas dieta seca
Uso de productos Bio-Seguros
BIOSEGURIDAD
Ensayo Honduras. Tratamiento A = Dieta seca 2% + Poliqueto 2% + Biomasa Artemia 2% + Calamar 11% Tratamiento B = Dieta seca 4% + Calamar 11%
Sistema de alimentación Bio-Seguro en Maduración:
Uso de productos Bio-Seguros
BIOSEGURIDAD
Sistema de alimentación Bio-Seguro en Maduración:
Ensayo Ecuador, 2016. Reemplazo de dieta fresca por 1% de dieta seca + Calamar en 11%.
Uso de productos Bio-Seguros
BIOSEGURIDAD
Objeto: Prueba de alimentación con Microencapsulado de alto nivel nutricional con CERTIFICACION ORGANICA (estadio desde Zoea1 hasta Pl9).
6 tanques de 2TM con 200000 N/Tq Dieta prueba: Micro0-50, 50-100, 100-200, 200-300um Dieta control : ≠ mezclas de productos (Z, M y PL) Microalgas y Artemia a aprtir de mysis 2
CONCLUSIÓN
La comunidad bacteriana asociada con el camarón es altamente dinámica en diferentes estados de salud y etapas de crecimiento.
Los estudios de metagenómica de la microbiota de L. vannamei abre la vía a una mejor comprensión de las relaciones camarón-bacterias patógenas / probióticas para la selección de consorcios de probióticos y el uso de prebióticos.
Prevención y Bioseguridad: - Diagnóstico = Certificación - Uso de productos Bioseguros
Seguir los estudio de la microbiota en los sistemas de cultivo (≠ estados salud y estadios) Trabajar en conjunto con el productor
Aplicación de Protocolos con Probióticos muy específicos y Productos Alternativos Seguros
(menor diversidad que en las mezclas actualmente usadas).
Monitoreo patológico y metagenómico - Mejorar el balance microbiano en los cultivos y en los animales
- Mejorar la supervivencia y productividad - Mayor éxito en la transferencia hacia la finca
Futuras investigaciones y acciones
MEDIDAS DE CONTROL Y PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES
MEDIDAS DE MANEJO - Aplicar las medidas de bioseguridad en las
instalaciones - Desinfección del agua de cultivo (larvicultura), y
suelos… - Ajustar parámetros del agua (T°C, pH, balance iónico) - Inoculación de PROBIÓTICO en agua , microalgas y
artemia. - Inoculación temprana de PROBIOTICO (nauplios) - Re-inoculación diaria o según recomendaciones - Minimizar el estrés (manejo, densidad, tóxicos, …) - Eliminar el exceso de materia orgánica ó Uso de
PROBIOTICOS BIOREMEDIADORES. - Monitorear la carga bacteriana (tanto bacterias
probióticas como de vibrios patógenos oportunistas - Comprobar actividad antimicrobiana de probióticos - Usar Productos Alternativos Seguros ej. reemplazo de microalgas y artemias
MEDIDAS DE CONTROL MEDIANTE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
- Certificación de reproductores
(orígen de los nauplios)
- Certificacion de PLs (Virus y Bacterias)
antes del traslado a la finca.
- Monitoreo de la presencia de
bacterias patógenas y portadoras
genes de toxinas (en larvas de
diferentes estadios, en microalgas, en
artemia).
GRACIAS POR SU ATENCION
EL FUTURO DE LA ACUICULTURA ESTA EN LA BIOTECNOLOGÍA La Revolución “Ómica”
con la colaboración y aportes: Universidad Nacional de Tumbes “Maestría en biotecnología molecular” Gobierno de Perú “CONCYTEC” , Empresas Peruanas y Ecuatorianas.
Emmerik Motte, PhD. Director Investigación y Laboratorio Conceptazul SA Ecuador / IncaBiotec SAC (Perú) Epicore Ecuador / Epicore Bionetworks [email protected]
