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JUAN GUILLERMO CUBILLOS HINOJOSAMicrobiólogo AgroindustrialCENTRO BIOTECNOLOGICO DEL CARIBE
EVALUACION BAJO CONDICIONES DE INVERNADERO DE
Rhizobium sp NATIVOS COMO FIJADOR DE NITRÓGENO EN
PLANTAS LEGUMINOSAS UTILIZADAS COMO FORRAJE EN EL
CENTRO BIOTECNOLOGICO DEL CARIBE
Ciudad de Panamá, 27 de septiembre de 2010
INTRODUCCIÓN
Se estima un aporte del
38% de la producción
nacional de carne y el 43%
de leche (Rey et al., 2005)
Leguminosas forrajeras
Características
físicas y biológicas
del suelo
Fijación
Biológica N2
Sustitución de
fertilizantes Químicos
Agropecuario
Agroforestería
Leguminosa-gramineas
Proteína cruda,
energía y
digestibilidad
Productividad
Aislar cepas de
Rhizobium sp nativas
Se estima que la simbiosis Rhizobium-
leguminosa puede fijar de 24 hasta más de
584 kg de nitrógeno por hectárea y
abastecer en algunos casos hasta 90% de
las necesidades de las plantas.
Opción seguraSíntesis de
fitohormonas
Solubilización de
fosforo
Reacción antagónica
Evaluar bajo condiciones
de invernadero
Leucaena y Matarratón
Germinación, inefectividad y efectividad
en la fijación de nitrógeno
METODOLOGÍA
PURIFICACIÓN
Procesamiento de los nódulos
Lavado y Desinfección - Hipoclorito de sodio 2,5 %, alcohol 70%
Caracterización fenotípica y fisiológica
Sección de nódulos
Agar YMA
Incubar a 25 – 28 ºC / 3 – 5 días.
CONSERVACIÓN
Tubos con LMA
en plano
Inclinado. 4 °C.
LMA+RC (-)
Tinción Gram
(Martínez, 2005; Matos et al., 1998, Bècquer et al., 2000, Mouraud et al., 2009; Küçük & Kıvanç, 2008).
LLA
HektoenXLD
Rx.
Benedict
No. Lotes No. Puntos No. Plantas
por puntos
3 5 3
Matarratón (G. sepium)
No. Puntos No. Plantas
por puntos
5 8
Leucaena (L. leucocephala)
Evaluación de las cepas aisladas en semillas de Leucaena y Matarratón
bajo condiciones de invernadero
Suelo estéril
Suspensión liquida de células
106 y 108. células/ml (Mora,
1995)
Diseño bloques al azar
7x2
METODOLOGÍA
Triple desinfección
alcohol 70%, yodo
70% e hipoclorito 1%
Siembra 3 semillas por maceta e
Inoculación de 2mL de la
suspensiónA B
Porcentaje de
Germinación (PG)
(Cubillos et al, 2009)
7 días Matarratón
14 días Leucaena
Evaluación de las cepas aisladas en plántulas de Leucaena y Matarratón
bajo condiciones de invernadero
Suspensión liquida de células
106 y 108. células/ml
METODOLOGÍA
Plántulas 30 días de edad
Variables evaluadas
tanto en semillas
como en plántulas
•Longitud del Tallo (LT)
•Grosor del Tallo (GT)
•Peso Seco Total (PST)
•Numero de Hojas
Verdaderas (NHV)
•Numero de Nódulos por
Planta (NNP)
•Porcentaje de Nitrógeno
(PN)
A B
Aislamiento de cepas nativas de Rhizobium sp a partir de nódulos
Leucaena
Aislamiento primario
RESULTADOS
Leguminosa Lote/punto
Nódulos
aislados
o
sembrados
Nódulos con
crecimiento
Porcentaje
de
recuperación
G. sepium
Matarratón
Lote 1 25 19 76
Lote 2 56 42 75
Lote 3 153 140 91
Total 234 201 85*
L.
leucocephala
Leucaena
Punto 2 18 18 100
Punto 3 25 22 88
Punto 4 5 5 100
Total 48 45 93,8*
Matarratón
Característica macroscópicas de cepas de Rhizobium sp, aisladas en YMA a partir de Matarratón y Leucaena
Gliri
cid
ia s
ep
ium
NºCódigo
cepaColor
TamañoForma Superficie Levantamiento Consistencia
PrecipitadosTransparencia
Grand. Med. Si No
1 G-21 Beige x Circular Lisa Convexo Mucoide x Opacas
2 G-22 Beige x Circular Lisa Convexo Gelatinosa x Opacas
3 G-24 Beige x Circular Lisa Convexo Gelatinosa x Traslucidas
4 G-26 Beige x Circular Lisa Convexo Gelatinosa x Traslucidas
5 G-32 Beige x Circular Lisa Convexo Gelatinosa x Traslucidas
6 G-34 Beige x Circular Lisa Convexo Gelatinosa x Traslucidas
7 G-35 Beige x Circular Lisa Convexo Gelatinosa x Traslucidas
8 G-36 Beige x Circular Lisa Convexo Gelatinosa x Traslucidas
9 G-38 Beige x Circular Lisa Convexo Gelatinosa x Traslucidas
10 G-39 Beige x Circular Lisa Convexo Gelatinosa x Opacas
11 G-310 Beige x Circular Lisa Convexo Gelatinosa x Traslucidas
Le
uca
en
ale
uco
ce
ph
ala
Nº Código ColorTamaño
Forma Superficie Levantamiento Consistencia Precipitados
Transparencia Grand. Med. Si No
1 L-01 Beige x Circular Lisas Convexo Gelatinosa x Opacas
2 L-24 Beige x Circular Lisas Convexo Gelatinosa x Opacas
3 L-27 (1) Beige x Circular Lisas Convexo Gelatinosa x Opacas
4 L-27 (2) Beige x Circular Lisas Convexo Gelatinosa x Opacas
5 L-32 Beige x Circular Lisas Convexo Gelatinosa x Opacas
6 L-34 Beige x Circular Lisas Convexo Gelatinosa x Opacas
7 L-35 Beige x Circular Lisas Convexo Gelatinosa x Opacas
8 L-36 Beige x Circular Lisas Convexo Gelatinosa x Opacas
9 L-38 (2) Beige x Circular Lisas Convexo Gelatinosa x Opacas
10 L-38 (3) Beige x Circular Lisas Convexo Gelatinosa x Opacas
11 L-47 Beige x Circular Lisas Convexo Gelatinosa x Opacas
Cepas
comerciales1 CC Beige x Circular Lisas Convexo Mucoide x Traslucidas
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
Referencias
Küçük & Kıvanç, 2008
Bécquer et al., 2000
Martínez, 2005
Matos et al., 1998;
Kuykendall et al., 2005
Pérez et al., 2008
RESULTADOS
A
B
Evaluación del efecto de cepas de Rhizobium sp. sobre el
Porcentaje de germinación en Semillas de Matarratón
(A) 106 células/ml (B) 108 células/ml.
RESULTADOS
A
B
(A) 106 células/ml (B) 108 células/ml.
Evaluación del efecto de cepas de Rhizobium sp. sobre el
Porcentaje de germinación en Semillas de Leucaena
RESULTADOSEvaluación Semillas de Matarratón
LGT en Gliricidia sepium. Ensayo
con semilla a los 42 días.
Peso seco de la parte aérea (PST)
y porcentaje de nitrógeno (%N) .
RESULTADOSEvaluación en plántulas en Matarratón
LGT Ensayo en plántulas
de G. sepium, a los 52
días y después de la
aplicación en plántula a
los 35 días de edad.
Peso seco de la parte aérea
(PST) y porcentaje de
nitrógeno (%N) .
RESULTADOSEvaluación en semillas de Leucaena
LGT y NHV L. leucocephala,
a los 38 días. Ensayo con
semillas.
Peso seco de la parte
aérea PST.
RESULTADOSEvaluación en semillas de Leucaena
Número de nódulos/planta (NNP) y porcentaje de nitrógeno (%N)
en L. leucocephala a los 38 días.
RESULTADOSEvaluación en plántulas de Leucaena
LGT en L. leucocephala
a los 48 días, después
de la aplicación en
plántula a los 30 días de
edad.
PST L. leucocephala a los
48 días y después de la
aplicación en plántula a los
30 días de edad.
RESULTADOSEvaluación en plántulas de Leucaena
Número de nódulos/planta (NNP) y porcentaje de nitrógeno
(%N) en plántulas de L. leucocephala, a los 48 días y después
de la aplicación en plántula a los 30 días de edad.
RESULTADOS
A B
C
Leghemoglobina
Nodulación en plántulas de Matarratón
A B
Nodulación en plántulas de Leucaena
RESULTADOS
G32-
108G34-
108Testigo Testigo
BA
Plántulas de Matarratón a los 52 días después
de inoculadas con la cepa Rhizobium sp nativa,
L38-106
L34-106
Testigo
40 cm_________
CC-106 CC-108Testigo
30 cm_________
B
A
Plántulas de Leucaena a los 48
días después de ser inoculadas
con Rhizobium sp, nativa
CONCLUSIONES
Se aislaron 22 cepas de Rhizobium sp, nativas: 11 fueron específicas
para G. sepium y 11 para L. leucocephala que generaron un efecto
positivo sobre la germinación, infectividad, efectividad en la FBN y
promoción de crecimiento en concentraciones de 108 cel/ml de
Rhizobium sp en Matarratón y 106 cel/ml en Leucaena, en
comparación con la cepa comercial (CC) y el testigo.
Las cepas nativas generaron un efecto positivo en la germinación de
G. sepium y L. leucocephala. Encontrándose niveles del 100% en la
mayoría de los tratamientos con respecto al testigo (80%) en
Matarratón. En Leucaena las cepas estimularon la germinación,
obteniéndose valores de 100% con respecto al testigo de 86,7%. Se
encontró los mejores resultados en los tratamientos con 108 cel/ml.
CONCLUSIONES
Las cepas nativas presentaron un efecto significativo en la
infectividad, efectividad y promoción de crecimiento en plantas de
Matarratón y Leucaena. Para el caso Matarratón las cepas G34, G38,
G21, G32 presentaron mejores resultados con respecto a la materia
seca acumulada, porcentaje de nitrógeno; en las concentraciones 108
cel/ml. Encontrando resultados muy por encima de la cepa comercial
y el testigo.
En Leucaena los tratamientos L27, L36 y L38, presentaron mejores
resultados con respecto al testigo y la cepa comercial (CC) en la
concentración 106 cel/ml. Por su parte los tratamientos con la cepa
nativa en la concentración 106 cel/ml, presentaron mejores resultados
que en 108 cel/ml para; longitud y grosor del tallo, acumulación de
materia seca, desarrollo foliar y acumulación de nitrógeno.
