Efecto neuroprotector combinado de aminoguanidina y dapsona en

modelo in vitro de infarto cerebral y diabetes mellitus.

Trimestre de Investigación II.Efecto de la Aminoguanidina y Dapsona

Q.F.B. Juventino III Colado Velázquez

Actividades Realizadas

Prueba de diferentes concentraciones de aminoguanidina, 250, 500 y 1000mM.

Efecto de Aminoguanidina en animales normales y diabéticos.

Efecto de Dapsona en animales normales y diabéticos.

Material y Métodos

Ratas Wistar Macho (n=6) 200-250 gramos con ciclos de luz-oscuridad invertidos a las que se permitió acceso ad libitum a agua y alimento.

Inducción de diabetes a animales con STZ 66.0 mg/kg intraperitoneal. 90 días de diabetes.

Se midió la glucosa con un glucómetro Bayer Contour TS Se consideraron diabéticos los animales con

concentraciones de glucosa mayores a 25 mmol/L de glucosa.

Los animales se sacrificaron por decapitación, se extrajo el cerebro de los animales haciendo un corte longitudinal dejando descubierto el corpus striatum, el cual fue cuidadosamente removido y posteriormente rebanado utilizando el método descrito por McIlwain.

Material y Métodos

Las rebanadas de corpus striatum fueron incubadas en tubos de ensayo (4 rebanadas por tubo) conteniendo solución Krebs-Ringer conteniendo NaCl 118 mM, KH2PO4 1.2 mM, KCl 4.7 mM, CaCl2 2.5 mM, MgSO4 1.17 mM, Glucosa 5.6 mM y Tris 25 mM. En un baño a temperatura de 37ºC, burbujeando 95% O2 y 5% de CO2.

Todos los procesos experimentales y manejo de los animales se realizaron de acuerdo a los protocolos establecidos por el Comité de Ética de Animales del Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía de México.

Material y Métodos

Las rebanadas de corpus striatum obtenidas de los animales, se sometieron a los siguientes tratamientos:Control Aminoguanidina

500uMIsquemia Isquemia + Aminoguanidina

500uM

Dapsona 1.2 uM Isquemia + Dapsona 1.2uM

O2/CO2

n=6

O2/CO2

n=6

O2/CO2

N2 20min

O2/CO2 30 min

n=6

O2/CO2

N2 20min

O2/CO2 30 min

n=6

Material y Métodos

Una vez terminados los tratamientos. Dependiendo de la determinación se tomaron las muestras.

Para Espectrofotometría, se tomaron 2mL del buffer Krebs en el que se incubaron las rebanadas, y se pusieron en viales eppendorf, de los cuales se tomaron las alícuotas para la reacción de Griess.

Material y Métodos

Para cuantificar los nitritos se realizó una determinación espectrofotométrica (540 nM).

Modificación de la reacción de Griess. Permite cuantificar nitritos

Reducción de los nitratos a nitritos utilizando solución saturada de VCl3.

Reactivos Griess: Sulfanilamida 2% en 5% HCl, NEDD 0.1% en agua.

Curva de Calibración con NaNO2 - 200 M, 100 M, 50 M, 25 M, 12.5 M, 6.25 M, 3.125 M.

Material y Métodos

200 L Muestra/Estándar + 100 L SULF + 100 L NEDD + 200 L VCl3 .

Se incubaron las muestras por 30 min a 37ºC.Se procedió a leer en espectrofotómetro a 540

nm.Como Blanco se utilizó el medio de disolución.

Curva de Calibración

0 50 100 150 200 2502.1

2.3

2.5

2.7

2.9

3.1

3.3

3.5

f(x) = 0.00600739107611549 x + 2.18921666666667R² = 0.99950958370665

Concentración de NaNO2 mM

Ab

so

rba

ncia

x1

0-1

Resultados Aminoguanidina

Tukey's Multiple Comparison Test P value

Control vs Control + Isq P < 0.001

Control vs 250 uM P < 0.001

Control vs 500 uM P > 0.05

Control vs 1000 uM P < 0.05

Control + Isq vs 250 uM P < 0.001

Control + Isq vs 500 uM P < 0.001

Control + Isq vs 1000 uM P < 0.001

250 uM vs 500 uM P < 0.001

250 uM vs 1000 uM P < 0.001

500 uM vs 1000 uM P < 0.01

Resultados Aminoguanidina

Tukey's Multiple Comparison Test P value

Control vs Amino P > 0.05

Control vs Isq P < 0.001

Control vs Isq + Amino P > 0.05

Amino vs Isq P < 0.001

Amino vs Isq + Amino P > 0.05

Isq vs Isq + Amino P < 0.001

Resultados Aminoguanidina

Tukey's Multiple Comparison Test P value

Control vs. Amino P < 0.05

Control vs. Isq P < 0.001

Control vs. Isq+Amino P < 0.05

Amino vs. Isq P < 0.001

Amino vs. Isq+Amino P < 0.001

Isq vs. Isq+Amino P < 0.001

Resultados Aminoguanidina

Source of Variation

% of total variation P value

Interaction 3.43 P<0.0001

Tipo de Rata 16.57 P<0.0001

Tratamiento 72.46 P<0.0001

Resultados Dapsona

Tukey's Multiple Comparison Test P value

Control vs. Dapsona P > 0.05

Control vs. Isq P < 0.001

Control vs. Isq + Dap P < 0.001

Dapsona vs. Isq P < 0.001

Dapsona vs. Isq + Dap P < 0.001

Isq vs. Isq + Dap P < 0.001

Resultados Dapsona

Tukey's Multiple Comparison Test P value

Control vs. Dapsona P > 0.05

Control vs. Isq P < 0.001

Control vs. Isq + Dap P < 0.001

Dapsona vs. Isq P < 0.001

Dapsona vs. Isq + Dap P < 0.001

Isq vs. Isq + Dap P > 0.05

Resultados DapsonaSource of Variation

% of total variation P value

Interaction 0.87 P=0.0581

Tipo de Rata 17.31 P<0.0001

Tratamiento 71.99 P<0.0001

Discusión

La disminución de la dosis de aminoguanidina, da como resultado una reducción significativa en la cantidad de nitritos cuantificados.

El incremento de la dosis, reduce la cantidad de nitritos cuantificados a niveles menores que el control.

La dosis de 500 mM de Aminoguanidina se compara con el control.

Discusión

Los experimentos con aminoguanidina en animales no diabéticos dieron resultados muy semejantes a los obtenidos en experimentos previos.

La aminoguanidina en animales diabéticos disminuye la cantidad de nitritos producidos aún en muestras no sometidas a isquemia.

En ambos casos, la aminoguanidina reduce la cantidad de nitritos producidos por muestras sometidas a isquemia a niveles semejantes a los controles.

Discusión

La adición de dapsona 1.2mM no muestra ninguna influencia en muestras no sometidas a proceso de isquemia, tanto en muestras de animales diabéticos como no diabéticos.

La dapsona presenta un pequeño efecto en tejidos sometidos a isquemia, tanto en muestras de animales diabéticos como no diabéticos.

La razón para esta pequeña actividad de la dapsona puede encontrarse en el mecanismo de acción que se ha postulado, que es el de antioxidante.

Discusión

IsquemiaHipoxia -> Alteraciones de la homeostasis -> iNOSLiberación de citocinas.

ReperfusiónEntrada de O2 -> Especies reactivas de oxígeno (O2

-)

Interacción de O2- con NO -> ONOO-

Peroxidación lipídica -> Muerte celularLa aminoguanidina actua directamente sobre

la iNOS.Dapsona tiene efecto antioxidante previniendo

la formacion de especies reactivas de oxígeno.

Discusión

Referencias Gatti G, Hossein J, Malena M, et al. Penetration of Dapsone into cerebrospinal fluid of patients with AIDS. Journal of

Antimicrobial Chemotherapy. 1997; 40: 113-115. McIlwain, H. Preparing neural tissues for metabolic study in isolation. Practical Neurochemistry. Churchill Livingtone, London,

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