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MINISTERODELL'ISTRUZIONEDELL'UNIVERSITÀE DELLA RICERCA

Programmi di ricerca cofinanziati –PRIN - ANNO 2003prot. 2003060301

1. Area ScientificoDisciplinare principale

06: Scienze mediche

2. Coordinatore Scientificodel programma di ricerca

ZIPARO Elio

- Università Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

- Facoltà Facolta' di MEDICINA e CHIRURGIA

- Dipartimento/Istituto Dip. ISTOLOGIA ED EMBRIOLOGIA MEDICA

3. Titolo del programma diricerca

MECCANISMI DI CONTROLLO DELLA FERTILITA' MECCANISMI DI CONTROLLO DELLA FERTILITA' MASCHILE NELL'EPIDIDIMO E NEL FLUIDO SEMINALE: MASCHILE NELL'EPIDIDIMO E NEL FLUIDO SEMINALE: MODELLI SPERIMENTALI ED ASPETTI CLINICIMODELLI SPERIMENTALI ED ASPETTI CLINICI

4. Settore principale del Programma di Ricerca:

MED/13

5. Costo originale del Programma:

266.300 €

6. Quota CofinanziamentoMIUR:

146.000 €

7. Quota CofinanziamentoAteneo:

65.100 €

8. Finanziamento totale: 211.100 211.100 €€

9. Durata: 24 24 mesimesi

79%

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Prof.Prof. SANDRO FRANCAVILLASANDRO FRANCAVILLAUniversitUniversitàà de Lde L’’AQUILAAQUILA

FacoltFacoltàà Medicina & ChirurgiaMedicina & ChirurgiaDipDip. Medicina Interna e Sanit. Medicina Interna e Sanitàà PubblicaPubblica

MED13MED13

MODIFICAZIONI MODIFICAZIONI POSTPOST--INFIAMMATORIEINFIAMMATORIE DELLA CELLULA DELLA CELLULA

CONTRATTILE NELLCONTRATTILE NELL’’EPIDIDMO UMANOEPIDIDMO UMANOFinanziamento Tot: 36.700 Finanziamento Tot: 36.700 €€

Prof.Prof. ELIO ZIPAROELIO ZIPAROUniversitUniversitàà di ROMA di ROMA ““La SapienzaLa Sapienza””

FacoltFacoltàà Medicina & ChirurgiaMedicina & ChirurgiaDipDip. Istologia ed Embriologia Medica. Istologia ed Embriologia Medica

MED13MED13

REGOLAZIONE DEL SISTEMA REGOLAZIONE DEL SISTEMA FAS/LIGANDO DI FAS NEL SEME FAS/LIGANDO DI FAS NEL SEME UMANO NEL TRATTO GENITALE UMANO NEL TRATTO GENITALE

MASCHILEMASCHILEFinanziamento Tot: 72.900 Finanziamento Tot: 72.900 €€

Prof.Prof. FRANCO DONDEROFRANCO DONDEROUniversitUniversitàà di ROMA di ROMA ““La SapienzaLa Sapienza””

FacoltFacoltàà Medicina & ChirurgiaMedicina & ChirurgiaDipDip. Istologia ed Embriologia Medica. Istologia ed Embriologia Medica

MED13MED13

FENOMENI APOPTOTICI DEL GAMETE FENOMENI APOPTOTICI DEL GAMETE MASCHILE NELLMASCHILE NELL’’AMBIENTE AMBIENTE

EPIDIDIMARIO E NEL LIQUIDO EPIDIDIMARIO E NEL LIQUIDO SEMINALESEMINALE

Finanziamento Tot: 47.200 Finanziamento Tot: 47.200 €€

Prof.Prof. MARIO MAGGIMARIO MAGGIUniversitUniversitàà di FIRENZEdi FIRENZE

FacoltFacoltàà Medicina & ChirurgiaMedicina & ChirurgiaDipDip. Fisiopatologia Clinica. Fisiopatologia Clinica

MED13MED13

REGOLAZIONE DEL TRANSITO REGOLAZIONE DEL TRANSITO EPIDIDIMALE DEGLI SPERMATOZOIEPIDIDIMALE DEGLI SPERMATOZOI

Finanziamento Tot: 54.300 Finanziamento Tot: 54.300 €€

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RIPARTIZIONE SPESE SOSTENUTERIPARTIZIONE SPESE SOSTENUTEDONDERO

63%17%

0%

11%0%

9% 0%

FRANCAVILLA

51%36%

0% 2%1% 10% 0%

MAGGI5%

36%

52%

2%2% 3% 0%

ZIPARO0%

58%34%

0%0% 0%

8%

Materiale InventariabileMateriale ConsumoPersonale a contratto/DottoratiMissioni

PubblicazioniConvegniAltro

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DONDERO

FRANCAVILLA

MAGGI

ZIPARO

TOTALI

Convegni naz

ionaliConvegni inte

rnazionali

Articoli su riv

iste internaz

ionali con re

fereeArticoli

su riviste na

zionali

Comunicazioni a

Convegni inte

rnazionali

Comunicazioni a

Convegni naz

ionaliBrevetti dep

ositati

0

5

10

15

20

0

13

76 5

21

13

PRODUZIONE SCIENTIFICAPRODUZIONE SCIENTIFICA

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D ON D ER O

F R A N C A VILLA

M A GGI

Z IP A R O

T OT A LE

020406080

100

120

140

160

180

200

220

DISTRIBUZIONE DEL PERSONALE: MESI UOMODISTRIBUZIONE DEL PERSONALE: MESI UOMO

DONDERO

FRANCAVILLA

MAGGI

ZIPARO

TOTALE

88

2612

4842

216

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OBIETTIVIOBIETTIVI

Sistema Fas/FasL:nella regolazione della sopravvivenza degli sperm

lungo apparato riproduttivo (epi e liquido seminale) in soggetti normozoospermici e non

ruolo metalloproteasi in soggetti sani e ostruiti

Meccanismi che controllano il trasporto degli sperm in epididimo:

fisiopatologia della contrazione epicontrollo ormonale (OT e ES)

Modelli umano e animale

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UNITAUNITA’’ 1: DONDERO1: DONDEROModificazioni sistema immunitario indotte da patologie Modificazioni sistema immunitario indotte da patologie andrologicheandrologiche in microambiente in microambiente testicolotesticolo--epididimarioepididimariopossono alterare parametri cinetici, morfologici e struttura possono alterare parametri cinetici, morfologici e struttura cromatinicacromatinica dello spermatozoo? dello spermatozoo?

3. Frammentazione DNA (TUNEL), esposizione fosfatidilserina in eiaculato dei pz ed epididimo, stadi precoci danno mediante studio ubiquitinazione(FACS e MF)

1. Selezione casistica:A. n. 41 normali fertili no patologie sistemiche/ormonali B. n. 14 teratospermici con patologie andrologiche (varicocele,

criptorchidismo, flogosi) (7T e 7OT)C. n.13 pz con azospermia secretoria/escretoria D. n.3 pz criptospermici da disfunzione vescicole seminali

Campioni liquido seminale cellulefrazione plasmatica

2. Parametri seminali

Correlazione Fas/FasL in sperm e parametri seminali

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UNITAUNITA’’ 2: ZIPARO2: ZIPARO

Ruolo sistema Ruolo sistema FasFas//FasLFasL e sua regolazione in apparato e sua regolazione in apparato riproduttivo maschile e in semeriproduttivo maschile e in seme

1. Analisi Fas/FasL e sFasL e matrilisina in a. sperm e plasma seminale in normo e pz parametri seminali alteratib. plasma seminale 13 pz azospermici e 3 cripto con disf. Vesc.

• organi riproduttivi• epididimo da pz ostruzione post-infiammatoria/congenita

2. Analisi secrezione matrilisina (MMP-7) e TIMPs in testis, epi, prostata

3. Funzionalità in vitro sistema Fas/FasL FLIP in popolazioni spermatiche arricchite

4. Analisi Fas/mFasL e sFasL MMP-7 e TIMPs in seme e organi riproduttivi in modelli animali (ratto e coniglio)

MMP7

m

sFASLmFasL

TIMPs

caspasi caspasi FLIP

Modello animale:Fas poco espresso in tratto riproduttivo mFasL molto elevato in germinali e sperm

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RISULTATIRISULTATI

normo terato

22%

0%

mFasL Normospermici: 22% spermTeratospermici: assente

sFasL e MMP7 in plasma seminale di tutti i soggettino differenze fra normo e terato in relazione a sperm

Livelli sFasL e attività enzimatica MMP7 azo > normo

sFasL e MMP7 non derivano da sperm (ci sono in azo)prodotti in testis e prostata (in azo con disfunzione vescicole)

normo terato azo

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RISULTATIRISULTATI

Sistema Sistema FasFas//FasLFasL: : controllo qualitcontrollo qualitàà spermatica (induzione spermatica (induzione apoptosiapoptosi gameti anomali)gameti anomali)

escapeescape da da immunosorveglianzaimmunosorveglianza in riproduttivo (in riproduttivo (apoptosiapoptosi T T cellscells))

mFasLmFasL solo in solo in spermsperm soggetti soggetti normonormo: corretta eliminazione gameti anomali: corretta eliminazione gameti anomali

Correlazione tra frammentazione e qualità parametri seminali in casistica selezionata

Messa a punto di metodiche per valutazione danno al DNA in stadiprecoci/tardivi

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PUBBLICAZIONI UNITAPUBBLICAZIONI UNITA’’ DONDERO e ZIPARODONDERO e ZIPARO1. RICCIOLI A; SECCO VD; DE CESARIS P; STARACE D; GANDINI L; LENZI A; DONDERO F.; PADULA F; FILIPPINI

A; ZIPARO E. (2005). Presence of membrane and soluble forms of Fas ligand and of matrilysin (MMP-7) activity in normal and abnormal human semen. HUMAN REPRODUCTION vol. 20 pp. 2814-2820

2. LOMBARDO F; SGRO P; SALACONE P; GILIO B; GANDINI L; DONDERO F.; JANNINI EA; LENZI A. (2005). Androgens and fertility. JOURNAL OF ENDOCRINOLOGICAL INVESTIGATION vol. 28 pp. 51-55

3. LOMBARDO F; GANDINI L; LENZI A; DONDERO F. (2004). Antisperm immunity in assisted reproduction. JOURNAL OF REPRODUCTIVE IMMUNOLOGY vol. 62 pp. 101-109

4. GANDINI L; LOMBARDO F; PAOLI D; CARUSO F; ELEUTERI P; LETER G; CIRIMINNA R; CULASSO F; DONDERO F.; LENZI A; SPANO M. (2004). Full-term pregnancies achieved with ICSI despite high levels of sperm chromatindamage. HUMAN REPRODUCTION vol. 19 pp. 1409-1417

5. GANDINI L; LOMBARDO F; SALACONE P; PAOLI D; ANSELMO AP; CULASSO F; DONDERO F.; LENZI A (2003). Testicular cancer and Hodgking's disease: evaluation of semen quality HUMAN REPRODUCTION vol. 18 pp. 796-801

6. GIAMPIETRI C; PETRUNGARO S; KLINGER FG; COLUCCIA P; PAONE A; VIVARELLI E; FILIPPINI A; DE CESARIS P; DE FELICI M; ZIPARO E. (2006). c-Flip expression and function in fetal mouse gonocytes FASEB JOURNAL Jan;20(1):124-6.

7. ROMANO F; CHIARENZA C; PALOMBI F; FILIPPINI A; PADULA F; ZIPARO E.; DE CESARIS P (2005). Platelet-derived growth factor-BB-induced hypertrophy of peritubular smooth muscle cells is mediated by activation of p38 MAP-kinase and Rho-kinase. JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY J Cell Physiol Apr;207(1):123-31.

8. STARACE D; RICCIOLI A; D'ALESSIO A; GIAMPIETRI C; PETRUNGARO S; GALLI R; FILIPPINI A; ZIPARO E.; DE CESARIS P. (2004). Characterization of signaling pathways leading to Fas expression induced by TNF-alpha: pivotalrole of NF-kappaB. FASEB JOURNAL vol. 19 pp. 473-475

9. GIAMPIETRI C.; PETRUNGARO S.; COLUCCIA P.; D'ALESSIO A.; STARACE D.; RICCIOLI A.; PADULA F.; ALNEMRI E.; PALOMBI F.; FILIPPINI A.; ZIPARO E.; DE CESARIS P. (2003). FLIP is expressed in mouse testis and protectsgerm cells from apoptosis. CELL DEATH AND DIFFERENTIATION vol. 10 pp. 175-184

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UNITAUNITA’’ 3: FRANCAVILLA3: FRANCAVILLA

Modificazioni istologiche e ultrastrutturali parete contrattile Modificazioni istologiche e ultrastrutturali parete contrattile e cellula contrattile caput epididimo umano in condizioni e cellula contrattile caput epididimo umano in condizioni normali e in ostruzione postnormali e in ostruzione post--infiammatoria/congenita infiammatoria/congenita

10 pz azo: 5 CBAVD 5 ostruz. post-infiammatoria

controlli normali da orchiectomia per K testis

Associazione fenotipo ultrastrutturale e funzionale: transizione da cellsmioide (MYO) a cell muscolare liscia ad attività contrattile, proliferativa e secretiva (SMC)

Valutazione IH markers SMC differenziata e proliferante (SM2 e SMemb) e SMC attivata da danno (Collageno IV e Fibronectina)

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RISULTATIRISULTATI

MO: parete contrattile tubuli in sede ostruzione fortemente ispessitano differenza fra tipo di ostruzione

Cells mioidi piatte della parete contrattile sostituite da cells muscolari liscie poligonali proliferanti e con fx contrattile e secretoria

F meccaniche su parete a monte ostruzione attivano transizione dF meccaniche su parete a monte ostruzione attivano transizione da a fenotipo differenziato contrattile fenotipo differenziato contrattile mioidemioide a fenotipo a fenotipo contemporaneamente maturo/contrattile e indifferenziato contemporaneamente maturo/contrattile e indifferenziato proliferante/secernenteproliferante/secernenteRuolo della ETRuolo della ET--11

IH: Caput ostruito ha positività in tutto strato contrattile per markers SMC indifferenziate proliferanti (SMemb) e secernenti (collageno IV e fibronectina) e per SMC contrattili mature (SM2)

ET-1 in parete contrattile

Normale OstruitoNormale OstruitoAA BB

CC DD

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UNITAUNITA’’ 4: MAGGI4: MAGGI

Meccanismi implicati nel trasporto Meccanismi implicati nel trasporto epididimarioepididimario degli degli spermatozoi: ruolo degli estrogeni (ES) nel modulare spermatozoi: ruolo degli estrogeni (ES) nel modulare risposta contrattile a ETrisposta contrattile a ET--11Effetto replacement T e ES in modello coniglio ipogonadico con analoghi GnRH1. Emax risposta contrattile a ET-1 ridotta in ipogonadico

Controllo ES endogeni ed esogeni risposta contrattile da ET-1

2. Effetto ES diretto su ET-1? No alterazioni ET-1 e ETA/ETB

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LoopLoop sistema OT e ETsistema OT e ET--1 nella risposta contrattile?1 nella risposta contrattile?

Antagonisti OTR (atosiban e OTA) competono con ET-1 senza alterare il legame con il R e inibiscono contrattilità indotta da ET-1 e da OT in preparati epididimo animale e uomo

ET-1 stimola rilascio OT locale da epididimo umano/coniglio (IH e RT-PCR)

ET-1 lega recettori ETA e secrezione OT in cellule di epitelio epi coniglio 24h

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Effetto ormoni sessuali Effetto ormoni sessuali steroideisteroidei su sistema su sistema RhoARhoA/ROK/ROK

Sistema calcio sensibilizzanteAttiva contrazione cells muscolari lisce bloccando fosfatasi MLCRhoA/ROK in epi coniglio ipogonadico/trattato steroidiStudi funzionali contrazione con letrozolo e inibitori ROK

RhoA/ROK

MLC fosfatasi

Via calcio-sensibilizzanteOT/ET-1 (R)

PLC

[Ca]i

CAMK

MLCK

pMLC

ActinaActina//miosinamiosina contrazione SMCcontrazione SMC

CO4: Dr.ssa Filippi

ES attivano sistema RhoA/ROK

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CONCLUSIONICONCLUSIONI

ES upregolano contrattilità indotta da ET-1 in epididimonon attraverso effetto diretto sul sistema

OT media la risposta contrattile all’ET-1 dipendente dagli ES

ET-1 stimola liberazione di OT da epitelio epididimo

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PUBBLICAZIONI UNITAPUBBLICAZIONI UNITA’’ FRANCAVILLA e FRANCAVILLA e MAGGIMAGGI

1. PELLICCIONE F; CORDESCHI G; BOCCHIO M; SAGONE P; FRANCAVILLA F; FRANCAVILLA S. (2005). Immunophenotypical characterisation of contractile cells in caput epididymidis of men affected by congenital or postinflammatory obstructiveazoospermia. MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION vol. 11 pp. 289-294

2. F. PELLICCIONE; G. CORDESCHI; V. GIULIANI; P. DABRIZIO; S. NECOZIONE; L.NEGRI; M.; MANCINI; P. SAGONE; F. FRANCAVILLA; G.M. COLPI; FRANCAVILLA S.(2004). The contractile wall of the caput epididymis in men affected by congenital or postinflammatory obstructive azoospermia. JOURNAL OF ANDROLOGY vol. 25 pp. 417-425

3. FILIPPI S; MORELLI A; VIGNOZZI L; VANNELLI GB; MARINI M; FERRUZZI P; MANCINA R; CRESCIOLI C; MONDAINI N; FORTI G; LEDDA F; MAGGI M. (2005). Oxytocin mediates the estrogen-dependent contractile activity of endothelin-1 in humanand rabbit epididymis. ENDOCRINOLOGY vol. 146 pp. 3506-3517

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Elucidati meccanismi fisiopatologici contrattilitàepididimo in uomo e modello animale

Ruolo sistema Fas/FasL in fisiopatologia del gamete maschile e dell’apparato riproduttivo

Stretta collaborazione e interdigitazione fra le unità

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