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PRESERVAZIONE DELLA FERTILITA’ NEL
MASCHIO
• Presentazione del PDT
Mirco Castiglioni
U.O. di Urologia
A.O. San Paolo, Polo Universitario - Milano
INTRODUZIONE
Il 5% delle neoplasie colpisce individui sotto i 35 anni d’età.
Con il miglioramento della diagnostica e della terapia in campo oncologico la sopravvivenza dei giovani affetti da tumore è significativamente migliorata negli anni recenti e progressivamente aumenta, tanto che oggi circa l’85% dei tumori del bambino e del giovane può essere aggredito con successo.
Si stima che 1/250 soggetti tra 20 e 29 anni sia sopravvissuto ad un tumore. (Blatt, 1999)
1 adulto su 3 sopravvissuto a un tumore dell’infanzia incontrerà difficoltà a procreare (Holoch, 2011)
[SEER, NCI]
Age Specific Incidence rates for childhood cancer all races, both sexes
Age at Diagnosis
LLA
*
LMA
*
Lym
*
CNS
*
Il cancro del testicolo è la più comune neoplasia maligna nei maschi di età fra 20 e 34 anni.
Lifetime risk 0,3-1 % (in alcune nazioni x 3-4 negli ultimi 50 anni )
• Huyghe et al, 2003; van der Horst et al, 2006.
L’incidenza di tumori testicolari nei maschi infertili è più elevata che nella popolazione generale
infertili
•230/100.000 fertili
6.7-10.6/100.000
(Kliesh, 1997; Botchan, 1997; Logarakis, 1998; Raman, 2005; Doria-Rose, 2005)
RISCHIO DI INFERTILITA’ DURANTE IL TRATTAMENTO
Danno alla spermatogenesi
Età e/o sviluppo
puberale al momento della
terapia
Tipo di terapia Dose di terapia
Sede della terapia
(Jaffe, 1988; Humpl, 1999)
RELAZIONE TRA PRESENZA DI K
& INFERTILITA’ MASCHILE
qualità seminale ridotta in
soggetti con tumore vs “sani”
parametri seminali anomali
fino al 64% dei soggetti con
tumore
30-70% dei soggetti con K
testicolare sono oligospermici
50-70% dei soggetti con LH
sono oligospermici
La fertilità può già essere compromessa prima del trattamento
Bahadur et al., 2002
van Casteren et al., 2010
Chung et al., 2004; van Casteren et al., 2010
Crueffer et al., 2001; van Casteren et al., 2010
I NOSTRI DATI
608 pazienti oncologici di età
compresa tra 13-63 aa
(30.6±8.5) afferiti negli ultimi
7aa presso il nostro centro per la
crioconservazione del liquido
seminale prima di qualsiasi
trattamento
PARAMETRO Mediana (25-75 P)
Vol (mL) 3 (2-4)
Conc (106/mL) 22 (6-36)
Tot (106) 57 (16-118)
Mot (%) 34 (20-43)
Morfo (%) 8 (4-12)
* Cooper et al., Hum Reprod Update, 2010
*WHO 2010 10° percent.
*WHO 2010 50° percent.
2 3.7
22 73
69 255
32 55
5.5 15
VALORI INTORNO AL 10°PERCENTILE WHO 2010
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Con
ta t
otal
e (
106)
Altro Hodgkin LNH Testicolo
P<0.05
0
20
40
60
80
100
Altro Hodgkin LNH Testicolo
Con
c (
106/m
L)
P<0.05
Median
25%-75%
Non-Outlier Range
PRESERVAZIONE DELLA
FERTILITA
PRIMA DEL TRATTAMENTO
• EIACULAZIONE PRESENTE
• SI/NO
• SPERMATOZOI NELL’EIACULATO
• SI/NO
RECUPERO DELLA
FERTILITA’
DOPO IL TRATTAMENTO
• RESCUE TESE/MICROTESE
Prima della pubertà non si
sono ancora formati i gameti
Lo spermarca (produzione di
spermatozoi) è un evento della
prima e media pubertà (stadio
P3/P4) , precede la capacità di
eiaculare e si associa ad una
adeguata produzione di
gonadotropine.
Grande variabilità nello stadio
di maturazione degli
spermatozoi tra 13 e 18 anni
Nielsen, 1986
Stadi puberali di
Tanner
PRESERVAZIONE DELLA FUNZIONE GONADICA PROCREATIVA NEL PREPUBERE
PRESERVAZIONE DELLA FUNZIONE GONADICA PROCREATIVA NEL PREPUBERE
Schermatura (radioterapia)
Manipolazione farmacologica o ormonale
Autotrapianto/xenotrapianto
Maturazione in vitro
Trapianto di cellule staminali
Crioconservazione di tessuto testicolare
PRESERVAZIONE DELLA FUNZIONE GONADICA PROCREATIVA NELL’ADULTO E NELLE ETA’
PIU’ AVANZATE
One out of five PCa
patients would bank
sperm before RP (Salonia et al, 2013)
Argomento di crescente
interesse
Congiuntura socio-
economica sfavorevole
ritardo ricerca primo
figlio
Instabilità coniugale
crescente ricerca di
prole con altre partners
Kidd et al., 2001; Kuhnert & Nieschlag, 2004; Lazarou et al.,,
2008; Parheentupa & Huhtaniemi, 2009; Stewart & Kim, 2011
PRESERVAZIONE DELLA FERTILITA’ PRIMA DEL TRATTAMENTO
Ad oggi l’unica reale possibilità di preservare la fertilità del paziente
oncologico è la CRIOCONSERVAZIONE DEI GAMETI: Liquido seminale da MSS
Spermazoi da urine post MSS o vibrostimolazione
Recupero chirurgico (TESE/MicroTESE)
La crioconservazione degli agoaspirati testicolari è problematica per cui sono
sconsigliati
CRIOCONSERVAZIONE
La crioconservazione deve essere effettuata solo prima del trattamento antineoplastico per evitare l’alto rischio di effetti mutageni sugli elementi germinali in ultimo stadio. (Meistrich, 1993)
Nell’uomo è stato evidenziata una frequenza 5 volte più elevata di aneuploidia spermatozoaria sotto l’effetto della chemioterapia. Tale risultanza patologica non è più presente dopo 100 giorni dal termine del trattamento. (Robbins, 1997)
Il rischio di aneuploidie nella prole di pazienti trattati per cancro testicolare o linfoma non è superiore a quello della popolazione generale. Tuttavia in questi casi è altamente consigliato lasciar passare un periodo di 2 anni dalla terapia prima di ricercare il concepimento. (Thomas, 2004)
Accesso
Documentazione richiesta
Indicazioni
Logistica
Costi della crioconservazione
Procedura operativa
Stoccaggio
Archiviazione dati
Utilizzo del materiale crioconservato
• Utilizzo in “loco”
• Utilizzo presso un altro Centro
Attivazione della procedura di trasferimento
Distruzione
Organizzazione del personale
Strumentazione
I pazienti che accedono ad un programma di crioconservazione
prenotano telefonicamente al N°diretto del Laboratorio di
seminologia e crioconservazione dei gameti maschili 0281844417
attivo dal lun al ven dalle ore 13.00 alle ore 15.00.
Per i casi urgenti di pazienti oncologici viene fornito anche il
numero diretto della segreteria 0281844535-4428 e, in ultima
istanza, anche il numero di telefono cellulare del biologo
referente.
Le istruzioni vengono date telefonicamente direttamente dal
biologo al paziente (o al medico se il paziente in questione risulta
ricoverato). Il paziente che accede deve avere necessariamente
una indicazione clinica alla crioconservazione, riportata
sull'impegnativa o su carta intestata dell'Ospedale inviante nel
caso di pazienti ricoverati.
Tutti i pazienti che crioconservano devono fornire la documentazione
come da ultima revisione delle Normative in materia di PMA e crioconservazione di gameti ed
embrioni, con particolare attenzione al punto riguardante gli esami
infettivologici e la firma del consenso informato
1. Copia degli esami infettivologici:
• HbsAg, HbcAb, Anticorpi anti-HCV, Anticorpi anti-HIV, (data non anteriore a 3 mesi a quella
del congelamento)
2. Impegnativa rossa “spermiogramma per crioconservazione, eosin test,
citocentrifugato”
3. Attestazione della patologia in corso (diagnosi di infertilità, esame
istologico, dimissione, ecc.)
4. Documento d’identità del paziente (e dei genitori, entrambi presenti, nel
caso di pazienti minori)
5. Tessera sanitaria e/o di esenzione dal pagamento del Ticket
6. Nei casi in cui sia possibile, si richiede astinenza da rapporti sessuali o
comunque da eiaculazione di minimo 2 massimo 7 giorni
7. La procedura si attiva soltanto previa compilazione di un consenso
informato che il paziente firma al momento.
INDICAZIONE PER I PRELIEVI CHIRURGICI EFFETTUATI IN ALTRI CENTRI
• Si confermano i punti 1, 3, 4, 5, 7.
• Il chirurgo, inoltre, prende contatti con il Centro di Crioconservazione per pianificare: data dell’intervento
ritiro del terreno di coltura presso il Centro di Crioconservazione (che viene effettuato qualche giorno prima solitamente da un familiare del paziente)
ritiro dei moduli di Consenso e delega alla consegna (che viene consegnato dal Centro insieme al terreno)
modalità di trasporto del prelievo bioptico (sempre a carico di un familiare o comunque a carico dell’Ospedale inviante)
• Contatti telefonici: da lun a ven dalle 13.00 alle 15.00 al n°02.8184.4417 (Laboratorio)
fax: 02.8184.4149
• Costi della crioconservazione: 107 euro per i pazienti oncologici (esenzione 048)
Pazienti oncologici con spermatogenesi conservata in
nota per trattamenti, spesso imminenti, di chemio e/o
radioterapia, pertanto accedono in regime di urgenza,
a volte anche dall'oggi al domani, soprattutto i pazienti
con forme oncologiche ematologiche, spesso
minorenni.
Recupero chirurgico per pazienti azoospermici prima
del trattamento o resi azoospermici dal trattamento • Il biologo è presente in sala operatoria il giorno dell'intervento con
una postazione di microscopio mobile e fornisce in estemporanea ai
chirurghi informazioni circa il ritrovamento degli spermatozoi.
Terminato l'intervento il biologo torna in laboratorio per il trattamento
biologico e il congelamento del campione
Gli appuntamenti per crioconservazione vengono fissati in mattinata, in
coda agli appuntamenti per gli spermiogrammi, in modo da avere più
tempo a disposizione per l'espletamento delle pratiche burocratiche e per
far in modo che la raccolta del campione possa avvenire con maggiore
tranquillità.
Se il paziente oncologico accede da ricoverato presso altra Struttura, il
trasporto al nostro Centro è organizzato dall'inviante e avviene spesso in
ambulanza.
Verificata l'idoneità della documentazione il biologo procede
all'accettazione del paziente.
Ritirato il campione, si chiede al paziente di attendere circa 15' per
verificare l'idoneità biologica al congelamento. Se i parametri di quantità e
qualità del campione risultano nella norma, il paziente viene congedato
con una relazione di report definitivo per il Centro o medico inviante . Se il
paziente necessita di eseguire un altro deposito (compatibilmente con
l'urgenza di iniziare chemio e/o radioterapia) viene fissato un
appuntamento per altro deposito e il foglio di report viene consegnato a
procedura ultimata.
In fase di prenotazione e pianificazione di
accesso al programma di
crioconservazione dei gameti, il paziente
viene informato delle tariffe di pagamento
annuale per il mantenimento dei campioni
congelati . Il pagamento della prima
annualità viene effettuato in tutti i casi il
giorno della crioconservazione
direttamente alle casse dell'Ospedale; i
pagamenti degli anni successivi possono
essere effettuati di nuovo alle casse alla
scadenza dell'annualità oppure mediante
bonifico bancario. Il pagamento
dell'annualità costituisce in ogni caso un
tacito rinnovo del consenso alla
crioconservazione.
Le ISTRUZIONI PER LA RACCOLTA (Sherman,
1990) del liquido seminale da crioconservare sono le stesse che si osservano per un esame standard (2-7 gg di astinenza da eiaculazione). • Il paziente dovrà produrre in SEDE il liquido
seminale da crioconservare. • Il campione viene valutato in tutti i suoi parametri. • In aggiunta viene eseguito un TEST DI VITALITA’
(EOSIN TEST) • Il campione viene diluito 1:1 con un terreno
crioprotettore e lasciato a temperatura ambiente per almeno 10 minuti quindi avviato allo stoccaggio
SPERMATOZOI RECUPERATI DALLE URINE
• E’ una metodica che permette di recuperare spermatozoi dalla vescica in pazienti affetti da eiaculazione retrograda.
Il paziente deve assumere del bicarbonato o altro alcalinizzante le urine per i 3 gg precedenti l’esame mantenendo il pH urinario tra 7,4 e 7.8
deve attenersi alle stesse istruzioni previste per un esame standard del liquido seminale
deve urinare un’ora prima della masturbazione (per ridurre il volume di urina presente in vescica)
dopo la masturbazione deve urinare in un contenitore sterile
le urine emesse vengono valutate in termine di aspetto, volume, pH e vengono centrifugate il prima possibile a 1600 rpm per 10 minuti
il pellet viene risospeso in 1 ml di terreno e valutato in camera di Makler
viene eseguito l’eosin test e lo striscio per la valutazione della morfologia
Il campione viene diluito 1:1 con un terreno crioprotettore e lasciato a temperatura ambiente per almeno 10 minuti quindi avviato allo stoccaggio
La metodologia di crioconservazione degli
spermatozoi è identica indipendentemente dal
loro “distretto di provenienza”.
Per raggiungere le bassissime temperature
necessarie a bloccare ogni attività biologica,
viene oggi largamente impiegato l’AZOTO
LIQUIDO ottenuto per distillazione frazionata
dell’aria liquida; si tratta di un liquido atossico,
chimicamente inerte e facilmente reperibile
anche a costi ragionevoli (Sherman, 1990).
Il possibile danno da squilibrio osmotico è ovviato dall’uso
del CRIOPROTETTORE (Stanic et al, 2000). Il principale
componente del crioprotettore è il GLICEROLO (Mortimer,
2004).
Il terreno crioprotettore rappresenta, quindi, per la cellula un
ambiente ipertonico. Essendo la membrana cellulare un filtro
attivo, essa impedisce la fuoriuscita dei soluti, ma non
dell’acqua che fuoriesce passivamente mentre il glicerolo
entra nella cellula.
Esso si sostituisce quasi completamente all’acqua
intracellulare evitando così: la disidratazione cellulare la
formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari con
conseguente rottura della membrana cellulare
L'organizzazione dello stoccaggio nel nostro Centro avviene in due fasi:
• - una sistemazione provvisoria in una Banca di piccole dimensioni dedicata al congelamento giornaliero
• - un trasferimento successivo (che avviene ogni 4-6 mesi circa) nella Banca grande di stoccaggio definitivo.
ANNO 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013
N°
pazienti
30 23 42 73 83 92 87 71 91 119 120 143 154 128
Età
media
26,9 29,7 29,7 29,1 31,3 30,4 30,5 32
31,7 31
28,9 32,1 31,1 31,6
LH 5 0 4 5 9 9 8 6 22 18 24 18 22 27
LNH 0 0 5 2 3 1 4 9 7 7 2 1 8 0
K testis 8 17 12 40 34 39 50 42 39 60 58 77 83 71
Leucemie 1 2 1 4 4 1 3 0 3 0 3 0 1 0
altro 16 4 20 22 33 42 22 14 20 34 33 17 40 30
LABORATORIO DI SEMINOLOGIA E CRIOCONSERVAZIONE DEI GAMETI MASCHILI
OSPEDALE SAN PAOLO MILANO
UTILIZZO IN LOCO UTILIZZO PRESSO ALTRO
CENTRO
Valutato il caso, l’Embriologo
decide il numero di paillettes da
utilizzare.
Queste vengono individuate,
assieme al Seminologo,
all'interno della Banca di
Stoccaggio e vengono recuperate
per l'utilizzo. Entrambi i biologi
firmano la Scheda di
Congelamento in cui viene
riportato il N° di paillettes
recuperate e la data del recupero.
Contestualmente viene
aggiornato il file con la
variazione del numero di
paillettes residue.
Si procede allora al trasferimento totale o parziale delle paillettes, previa richiesta diretta del paziente.
• Il problema della movimentazione del materiale crioconservato in un Centro di PMA, viene menzionato dalla Legge 40/2004 "Norme in materia di Procreazione Medicalmente Assistita" e di seguito riportate nelle "Linee guida contenenti le indicazioni delle procedure e delle tecniche PMA (Art. 7 Legge 40/2004), trasferimento di gameti ed embrioni tra Centri (Art.14, comma 3). Il trasporto del materiale biologico stoccato viene affrontato dal D.L. N. 191/2007 ed, in seguito, dal D.L. N. 16/2010. Essi recepiscono le Direttive Europee (23/2004) e stabiliscono i criteri di qualità, trasparenza, tracciabilità e sicurezza per il trattamento di cellule e tessuti.
Il paziente effettua domanda di
ritiro (via fax o via mail) al Centro
in cui ha crioconservato il
materiale (INVIANTE) e domanda
di accettazione al Centro in cui
sposterà le paillettes
(RICEVENTE). In seguito a tale
richiesta, il Centro ricevente invia
(via fax o via mail) al Centro
inviante un documento di
"richiesta preliminare di
accettazione del campione" in cui
richiede una serie di informazioni
relative al paziente e al campione
biologico
Il Centro inviante risponde con un documento di "risposta alla
richiesta preliminare di accettazione del campione" in cui
risponde alle richieste del ricevente.
Quest'ultimo esegue il controllo del materiale in oggetto e
verifica la completezza e conformità della documentazione; se
tutto risulta conforme alle procedure e alle direttive vigenti,
esprime parere favorevole all'accettazione del materiale e, quindi,
al trasferimento.
Il ritiro del campione può essere effettuato soltanto dal diretto
interessato pertanto, quest'ultimo, concorda la data del
ritiro/consegna con i Centri inviante/ricevente.
Il trasporto avviene a totale carico del paziente (noleggio o
acquisto della banchetta di trasporto) e sotto la responsabilità
dello stesso .
Il giorno del ritiro il biologo procede a: • identificare il paziente mediante verifica e fotocopia del documento d'identità;
• verificare la documentazione di idoneità della banchetta di trasporto e verificare l'avvenuta refrigerazione della stessa (livello di riempimento, eventuale rabbocco di azoto, ecc.);
• trasferire le paillettes dalla Banca di stoccaggio alla banchetta di trasporto
• consegnare e far firmare al paziente il “documento di ritiro”
• compilare il modulo di "l‘etichetta di viaggio”
• far leggere, spiegare e far firmare al paziente il documento di "Informativa al trasportatore”
Congedato il paziente, si rimane in attesa di ricevere dal Centro ricevente (via fax o via mail) il documento di avvenuta consegna del materiale (o di presa in carico).
Tale procedura si attiva esattamente al contrario nel caso in cui un paziente decide di effettuare una procedura di PMA presso il nostro Centro utilizzando materiale crioconservato presso altro Centro
Si procede alla distruzione del campione crioconservato soltanto su richiesta scritta del paziente previa esibizione del documento d'identità.
In caso di morte del paziente, il parente più prossimo, munito di documento d'identità, comunica l'avvenuto decesso mediante consegna del certificato di morte e del documento d'identità del paziente deceduto. Il campione viene così distrutto.
MODULO PER DISTRUZIONE
COMUNICAZIONE DI
DECESSO
Quello criogenico è un locale ad accesso limitato al personale direttamente addetto al congelamento o alla movimentazione del materiale biologico, e quindi soltanto ai biologi dei Laboratori di Seminologia e di Embriologia. Entrambe le porte di accesso, sia quella dal laboratorio di seminologia che quella dal corridoio dell'embriologia, hanno l'apertura a badge; rimangono aperte ma sempre sorvegliate soltanto durante le fasi lavorative. Il personale addetto alle pulizie accede nel primo pomeriggio, quando sono ancora presenti i biologi, che supervisionano e provvedono alla chiusura non appena la pulizia è terminata.
Le Banche che ospitano gameti maschili
sistemate all'interno del locale criogenico
al momento sono le seguenti:
• - N° 1 Arpege 170 (denominato ARIEL) - 4 rach a 3
piani con arredi interni a cassetti
• - N° 2 Arpege 110 (denominati UGO e SID) - 6 rach a
4 piani con arredi interni a cassetti
• - N° 1 Bidone (Banca 9) - arredi interni a 6 canister
• - N° 1 Bidone (Banca 1) - arredi interni a 6 canister
• - N° 1 Bidone (Banca 7) - arredi interni a 6 canister
per il congelamento di campioni infetti HCV+
• - N° 1 Bidone (Banca 5) - arredi interni a 6 canister
per il congelamento di campioni infetti HbsAg+
• - N° 1 Bidone (Banca 8) - arredi interni a 6 canister
per il congelamento di materiale chirurgico in cui non
sono stati evidenziati spermatozoi. Tale congelamento
si effettua a scopo preventivo in attesa dell'esito
dell'esame istologico; qualora l'istologico confermasse
l'assenza di spermatozoi il paziente viene invitato a
recarsi in Laboratorio per firmare il documento di
distruzione (cap. 10 - Distruzione). Pertanto la Banca 8
viene utilizzata per il congelamento di materiale
destinato ad essere eliminato.
ONCOFERTILITA’ DI SALVATAGGIO
PAZIENTE AZOOSPERMICO
IN ESITI DI TRATTAMENTO PER CANCRO
MICROTESE
MicroTESE in azoospermici post CT o RT
Le possibilità di recupero di spermatozoi mobili sono riportate fino al 45% con delivery rate del 22% (relativo ai recuperi positivi)
Assenza di parametri clinici ed istologici predittivi
Non correlazione con il regime di CT o RT
Potenziale rischio genetico
Chan, 2001 ; Mesequer, 2003; Colpi, 2004
Instabilità genomica
dei tumori
dell’infanzia
• Rischio di trasmissione
alla progenie del
danno al DNA
spermatico
Questioni etiche
Romerius P et al. Clin Cancer Res 2010;16:3843-3850
Sperm DFI in CCS depending on the treatment given.
©2010 by American Association for Cancer Research
QUESTIONI ETICHE
Ricorso ad opzioni ad alta tecnologia per la preservazione della fertilità
Pazienti spesso giovani e non ancora in grado di decidere consapevolmente sulla propria salute riproduttiva o addirittura non ancora in grado di procreare.
La masturbazione Pazienti “vulnerabili” possono prendere decisioni “non
consapevoli” per compiacere i medici o i familiari Pazienti adolescenti con orientamento omosessuale non ancora
dichiarato ai familiari Genitori o tutori chiamati a decidere (a volte in poche ore) con
il rischio di interferire con le proprie convinzioni religiose e culturali strutturate con il vero interesse presente o futuro del minore.
Il destino del materiale biologico crioconservato (distruzione) in caso di morte.
Eiaculazione presente
Spermatozoi vitali
Crioconservazione
Criptozoospermia
Crioconservazione se idoneo
TESE se non idoneo
Eiaculazione
Retrograda
Recupero spermatozoi da
urine
Aneiaculazione
vibrostimolazione
Prima del trattamento- adulto
Ragazzi
Post-pubere
In grado di eiaculare
crioconservazione
non in grado di eiaculare
Vibrostimolazione
? TESE ?
Pre-pubere
TESE (spermatozoi immaturi o tessuto
testicolare ) ?
Prima del trattamento- ragazzo
Daniela Giacchetta (referente)
Sara Melis
Carla Pasquale