Présenté pour obtenir le diplôme de Magister en Chimie ... · Remerciements Ce travail a été réalisé au laboratoire de Phytochimie et Analyses Physico-Chimiques et Biologiques,

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE MENTOURI CONSTANTINE FACULTE DES SCIENCES EXACTES

DEPARTEMENT DE CHIMIE N°d’ordre :……………

Série :………………….

MEMOIRE

Présenté pour obtenir le diplôme de Magister en Chimie Organique

Option : Analyse Physico-Chimique et Substances Naturelles

Par : Sous la direction du Professeur :

HAMMOUD Leila BENAYACHE Fadila

Devant le jury : Mr BENAYACHE Samir Pr. Univ. Mentouri Constantine Président

Mme BENAYACHE Fadila Pr. Univ. Mentouri Constantine Rapporteur

Mme BOUMAZA Ouahiba M.C. Univ. Mentouri Constantine Examinatrice

Mr BOUHEROUM Mohamed M.C. Univ. Mentouri Constantine Examinateur

Mr ZAÏTER Lahcene M.C. Univ. Mentouri Constantine Examinateur

Juin 2009

Dédicace

A mes chères parents,

à mes grands parents,

à ma sœur,

à mes frères,

à toute ma famille,

à mes amis,

pour leur présence de tous les instants,

pour le soutien qu’ils m’ont apporté,

avec toute mon affection et ma reconnaissance .

Remerciements

Ce travail a été réalisé au laboratoire de Phytochimie et Analyses Physico-Chimiques et

Biologiques, Faculté des Sciences Exactes, Université Mentouri de Constantine, sous la direction

de madame le professeur Fadila BENAYACHE, à qui je tiens à exprimer toute ma

reconnaissance pour m’avoir accueillie au sein de ce laboratoire et particulièrement pour ses

conseils précieux, ses efforts, ses compétences scientifiques et pour le soutien qu’elle m’a

témoigné tout au long de cette étude.

J’exprime mes sincères remerciements à Monsieur Samir. BENAYACHE, professeur à

l’Université Mentouri de Constantine, d’avoir accepté de présider le jury de ce mémoire et pour

les conseils précieux qu’il m’a prodigués tout au long de ce travail .

Je suis très honorée de la présence en tant qu’examinateurs de Mr Mohamed

BOUHEROUM, Mme Ouhiba BOUMAZA et Mr Lahcene ZAÏTER, Maîtres de conférences à

l’Université Mentouri Constantine, je les en remercie sincérement.

Je remercie vivement monsieur la professeur P. MOSSET de l’Ecole Nationale de Chimie

de Rennes pour l’enregistrement des spectres de RMN et de SM du composé F16-1 et madame le

professeur A. LOBSTEIN et le docteur M. CHAABI de la Faculté de Pharmacie de Strasbourg

pour l’enregistrement des spectres de RMN du composé F9-3-1.

J’adresse mes plus vifs remerciements à Monsieur Ramdane SEGHIRI Maître de

conférences à l’Université Mentouri Constantine, pour son aide, ses conseils précieux et pour

tout ce qu’il m’a appris.

Je voudrais également remercier l’ensemble du personnel du laboratoire pour leur

disponibilité : Mlle Ratiba MEKKIOU, Mr Ali BENTAMENE, Mr Messaoud KERKATOU, Mlle

Sabrina BICHA, Mlle Ouahiba BENAISSA , Mlle Hanene ZAATER, Mme Samia MEZHOUD ,

Mme Hayet TOUAHER ainsi que mes amis et collègues, pour avoir simplement été eux-mêmes

et pour les moments inoubliables qu’ils m’ont permis de partager : Ouissaf, Souad, Amel,

Nacera, Fatima, Hanene, Kaouther, Lamia, Nassima, Linda, Samia, Ratiba, Saïda.

Je remercie toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à ce que la réalisation

de ce travail se soit déroulée dans les meilleures conditions.

Abréviations CHCl3 : Chloroforme

CDCl3 : Chloroforme deutérié

MeOH : Méthanol

MeOH-d4 : Méthanol deutérié

Me2CO : Acétone

CD3CO CD3 : Acétone deutériée

CH2Cl2 : Dichlorométhane

AcOEt : Acétate d’éthyle

isPrOH :Isopropanol

Et2O : Ether diéthylique

CCM : Chromatographie sur couche mince

Rf : Facteur de retardement (retardation factor)

RMN : Résonance Magnétique Nucléaire 13C : Carbone 13 1H : Proton

Me : Methyl (-CH3)

Glc: Glucose

Gluc : Glucuronide

Rut : Rutinose

Rham : Rhamnose

DEPT: Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer

HSQC :Heteronuclear Single Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear Multiple Bonding Connectivity

COSY : Correlated Spectroscopy

MHz : MegaHertz

ppm : Partie par million

δ : Déplacement chimique

J(Hz) : Constante de couplage exprimée en Hertz

s : Singulet

d : Doublet

dd : Doublet de doublets

Cq : Carbone quaternaire

m : Multiplet

SMIE : Spectrométrie de masse sous impact électronique

ESI : Ionisation electospray (Electro spray Ionisation)

m/z : Masse / Charge électrique

g : Gramme

˚C : Température en degrés Celsius

ml : Millilitre

HCl : Acide chlorhydrique

H3BO3 : Acide borique

NaOAc : Acétate de sodium

NaOH : Hydroxyle de sodium

AlCl3 :Chlorure d’alimunium

UV : Ultra violet

SOMMAIRE

Introduction générale ………………………………………………...………..............1

Chapitre I :Les flavonoїdes

І-1-Introduction.……………………………………………………………………………….4

І-2-Structure chimique et classification des flavonoїdes.………………………………….......4

I-2-1-Flavones………………………………………………………………………………….6

I-2-2-Flavonols……………………………………………………………………………........9

I-2-3- -Flavanones et dihydroflavonols …………….………………………………………..12

I-2-4- Flavan-3-ols, flavan-3,4-diols et anthocyanidols ……………………………………...12

I-2-5-Chalcones et aurones…………………………………………………….……...............13

І-3-Distribution et localisation ………………………………………………………………..13

I-4- Proprietés des flavonoїdes …………………………………………………….................17

І-5- Activités biologiques des flavonoїdes …………………………………………………...17

I-6- La biosynthèse des flavonoїdes…………………………………………………………...18

І-7-Les principales substitutions du squelette flavoniques …………………………………...19

I-7-1-L’hydroxylation ……………………………………………………………..…….........19

I-7-2- La méthoxylation ou méthylation ……………………………………………………...19

I-7-3- La O-glycosylation .........................................................................................................20

I-7-4- La C-glycosylation…...……………………………………………………….…...…...20

І-8- Méthodes de séparation et d’analyse des flavonoϊdes……………..……………………..20

І-8-1- Méthodes de séparation …………………………………………………………..........20

І-8-1-a-La chromatographie liquide sur colonne (CC)…………………………………..........21

І-8-1-b- La chromatographie préparative sur papier (CP)…………………………………….21

І-8-1-c- La chromatographie préparative sur couche mince (CCM)…………………………21

I-8-2- Méthodes d’analyse…………………………………………………………………….21

I-8-2-a- La fluorescence sous lumière de Wood ……………………………………………..22

I-8-2-b- Facteur de retardement et comportement chromatographique……………………….22

I-8-2 -c-La spectrophotométrie UV-Visible…………………………………………………..23

I-8-2 -c-1- Addition de réactifs……………………………………………………………….24

• l’addition de AlCl3 et AlCl3 + HCl…………………………………………………...25

• l’addition de NaOAc + H3BO3……………………………………………………….25

• l’addition de NaOH et de NaOAc…………………………………………………….25

I-8-2-d-La Spectrométrie de masse ……………………………………………………....…..27

I-8-2-e- La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) ………………...…….27

I-8-3 - L’hydrolyse acide des hétérosides………………………………………………..........28

Chapitre II :Les lactones sesquiterpéniques

II-1-Introduction ...……………………………………………………………………………30

II-2-Structure chimique des lactones sesquiterpéniques ...………………………….………...30

II-3-Classification des lactones sesquiterpéniques ..………………………….…...………….31

II-3-1-Les germacranolides …………………………………………………………………..31

II-3-2-Les élémanolides …………………………………………………………………........32

II-3-3-Les eudesmanolides …………………………………………………………………...33

II-3-4-Les guaianolides ………………………………………………………………….........34

II-3-5-Les héliangolides ………………………………………………………………………34

II-4-Biosynthèse des lactones sesquiterpéniques ………………………………………..........35

II-5-Activités biologiques des lactones sesquiterpéniques …………………………………...36

II-6- Les méthodes de séparation et d’analyse des lactones sesquiterpéniques ………............37

II-6-1- Les méthode de séparation ……………………………………………………………37

II-6-1- a- La chromatographie sur colonne ……………………………………………….…..38

II-6-1- b- Chromatographie sur couche mince ……………………………………………….39

II-6- 2- Les méthodes d’analyse ……………………………………………………………...40

Chapitre III : Partie expérimentale

III-1 - Etude phytochimique de Centaurea nicaeensis ………………………………………42

III-1.1 - Place dans la systématique …………………………………………………………..42

III-1.2 - Description de l’espèce Centaurea nicaeensis ……………………………………...42

III-1.3 - Travaux antérieurs…………………………………………………………………...44

III-2- Travaux personnels …………………………………………………………………….46

III-2-1-Extraction de Centaurea nicaeensis ….……………………………………………..46

III-2-2-Séparation chromatographique de l’extrait acétate d ’éthyle………………………..48

III-2-2-1-Séparation chromatographique sur colonne ………………………………………..48

III-2-2-2-Séparation et purification des fractions……………………………………………..51

III-3-Conclusion…………………………………………………………………………...….52

Chapitre VI : Résultats et Discussion

VI-1-Identification du produit F9-3-1…………………………………………………………..55

VI-2-Identification du produit F10-1…………………………………………………………...66

VI-3-Identification du produit F16-1 …………………………………………………………...72

VI-4-Identification du produit F16-4……………………….…………………………………..94

VI-5-Identification du produit F17-2…………………….………..…………………………..103

Références bibliographiques…………………….…………………………………..111

Conclusion générale…………………………………………….………………...……119

Introduction générale

1

Introduction générale :

Le 21ème siècle s’ouvre e t de nombreuses maladies à fort taux de mortalité restent encore sans

traitement. Dans certains cas, on devrait plutôt dire sans traitement adapté, car les malades du

paludisme ou du SIDA meurent souvent faute de ne pas avoir accès à des traitements trop

coûteux. Des résistances aux médicaments les plus utilisés ( e t les moins chers) se répandent.

La recherche de nouvelles molécules, plus actives, bon marché, sans e f f e t s secondaires trop

marqués, est aujourd’hui une urgence pour l’homme.

Les plantes sont depuis toujours une source essentielle de médicaments. Aujourd’hui encore

une majorité de la population mondiale, plus particulièrement dans les pays en voie de

développement, se soigne uniquement avec des remèdes traditionnels à base de plantes. De

l’aspirine au Taxol, l’industrie pharmaceutique moderne elle-même s’appuie encore largement

sur la diversité des métabolites secondaires végétaux pour trouver de nouvelles molécules aux

propriétés biologiques inédites. Cette source semble inépuisable puisque seule une petite partie

des 400 000 espèces végétales connues ont été étudiées sur les plans phytochimique et

pharmacologique, et que chaque espèce peut contenir jusqu’à plusieurs milliers de constituants

différents [1]. En Algérie il en existe 3000 espèces appartenant à plusieurs familles botaniques

dont 15% sont endémiques [2] .

La diversité des espèces utilisées e t des métabolites secondaires déjà isolés l a i sse présager

de l'ampleur de ce qui reste à découvrir. On considère effectivement que, jusqu’à ce jour,

moins de 10 % des espèces de végétaux supérieurs qui peuplent actuellement la planète ont été

explorées pour leurs propriétés chimiques e t biologiques.

On peut classer les métabolites secondaires en plusieurs grands groupes : parmi ceux ci, les

composés phénoliques, les terpènes e t stéroïdes e t les composés azotés dont les

alcaloïdes. Chacune de ces classes renferme une très grande diversité de composés qu i

possèdent une très large gamme d'activités biologiques [3-5].

Parmi les milliers de plantes médicinales recensées à ce jour, ceux de la famille des astéracées

(composées) l'une des plus grandes familles des angiospermes, avec environ 1100 genres et

25 000 espèces sont présentes dans pratiquement toutes les régions du globe.

Introduction générale

2

Le genre Centaurea de la famille des composées , comptant environ 700 espèces et 600 sous-

espèces, est très repandu en Algérie où il est représenté par 45 espèces dont 7 au sud [6,7].

Les espèces de ce genre sont utilisées dans la médecine traditionnelle pour leurs activités

stimulante, tonique [8,9], antidiabétique [10,11], diurétique [12] et antirhumatismale [13].

Le genre Centaurea a fait l’objet d’un grand nombre d’études phytochimiques qui ont révélé la

présence de sesquiterpènes [14-19], de triterpènes [20], de stéroïdes [21], d’alcaloïdes [22], de

lactones sesquiterpéniques [23,24] et de composés phénoliques notamment les flavonoïdes [25-

27].

Vu l’importance de ces plantes médicinales, plusieurs centaurées ont été étudiées dans notre

laboratoire de recherche. Dans le but de continuer ces investigations, nous avons choisi de

poursuivre l’étude de Centaurea nicaeensis All. variété walliana Maire.

Les principales parties de ce travail constituant quatre chapitres, sont traitées comme suit :

Le premier chapitre, consacré à l’étude bibliographique des flavonoїdes, renferme une

présentation de leurs différentes structures chimiques , leur biosynthèse ainsi que leur intérêt

thérapeutique. Il reporte également toutes les démarches et les méthodes nécessaires à la

séparation, la purification et l’établissement de structures de cette famille de substances

naturelles.

Dans le deuxième chapitre nous reportons sur un autre type des métabolites secondaires ;

les lactones sesquiterpéniques. Cette étude inclut : leur difinition et leur classification, leur

biosynthèse, leurs activités biologiques ainsi qu’une présentation des méthodes nécessaires à leur

séparation, leur purification et l’établissement de leur structure.

Le troisième chapitre concerne la partie expérimentale relative à nos travaux ainsi qu’une

présentation des techniques d’isolement et d’analyse utilisées.

Le quatrième chapitre reporte les résultats obtenus suivis de discussions et d’une

conclusion générale.

Chapitre I Les flavonoїdes

4

І-1-Introduction :

Les flavonoïdes ont constitué un intérêt global croissant pendant la dernière décennie et, en

raison de cette croissance dans la recherche, le nombre de flavonoïdes connus a augmenté

considérablement. En effet, au début des années 90, le nombre de structures de flavonoïdes

repportées était d’environ 4000 (Harborne,1994) [28], durant cette dernière decennie, ce

nombre avoisine les 6500 structures différentes (Harborne et Baxter1999) [29].

І-2-Structure chimique et classification des flavonoϊdes :

Structuralement parlant, les flavonoïdes ont un squelette de base commun, constitué de 15

atomes de carbone répartis sur deux noyaux benzéniques (A et B) qui sont reliés par une

chaîne linéaire de 3 atomes de carbone (Schéma 1) [30] formant en général un hétérocycle

après condensation avec un OH phénolique du noyau A [31].

A

B

Schéma 1 : Squelette de base des flavonoïdes.

Tous les flavonoïdes peuvent être classés en plusieurs groupes selon le degré d’oxydation du

cycle pyranique central (la chaîne en C3) [32], le noyau B est relié à l’hétérocycle C dans les

positions 2, 3 ou 4 (Schéma 2) .


5

O1

2

345

6

78

A

2' 3'

4'

5'6'

BC

Schéma 2 : Différentes positions du cycle B sur l’hétérocycle C.

Selon la structure du cycle intermédiaire (cycle C), les flavonoïdes se répartissent en plusieurs

classes de molécules dont les plus importantes sont : les flavones, les flavonols, les flavanones,

les dihydroflavonols, les flavan-3-ols et les flavan-3,4-diols (Schéma 3).

O

O

O

O

OH

OO

OH

O

OH

O

A C

1

456

7

8O

O

CHO

O

O

OH

O

O

OHO

OH

OH

3

33

34

Chalcones

Flavanones

Flavones

DihydroflavonolsDihydrochalcones

FlavonoïdesIsoflavones

Flavonols

Aurones

Anthocyanidines

Flavan-3-ol Flavan-3,4-diol

O2

3

1'

2' 3'

4'

5'6'

B

OH

O

3

Schéma 3: Représentation des principaux groupes de flavonoïdes.


6

I-2-1-Flavones:

O

O

H

Schéma 4 : Structure chimique de base des flavones.

Tous les types des flavonoïdes dérivent de la 4,2’,4’,6’-tétrahydroxychalcone et par

conséquent, possèdent tous au moins trois hydroxyles phénoliques en C-5, C-7 et C-4’, cela

étant, l’un d’entre eux peut être absent.

Dans plus de 90% des cas, le cycle A des flavones est substitué par deux hydroxyles

phénoliques en C-5 et en C-7. Ces hydroxyles peuvent être libres ou éthérifiés. D’autres

substitutions sont possibles avec des fréquences variables: hydroxyles libres ou éthérifiés en

C-7 et/ou en C-8, méthylation en C-7 ou en C-8, implication du C-6 et/ou C-8 dans une liaison

carbone-carbone avec un sucre.

D’autre part, dans plus de 80% des cas, le cycle B est substitué en C-4’ ou disubstitué en C-3’

et C-4’, ou moins fréquemment trisubstitué en C-3’,C-4’et C-5’; ces substituants peuvent être

des groupes hydroxyles (OH) comme ils peuvent être des methoxyles (OCH3). Les autres

positions (C-2’ et C-6’) ne sont qu’exceptionnellement substituées.

Le tableau 1 rassemble quelques exemples de ce type de flavonoïdes isolés dans notre

laboratoire de quelques centaurées algériennes.


7

Les centaurées Flavones Structures Réf

C. incana

7,3’,4’,5’-tetramethoxy tricétine

7,3’,5’-trimethoxy tricétine

2’’-O-glucosyl-6-C-glucosyl apigénine

6-methoxy apigénine

6-methoxy lutéoline

7-O-methyl glucuronosyl apigénine

7-O-glucosyl hispiduline

Vicénine-2

01

02

17

03

04

05

06

18

[27]

C. pullata

Jacéosidine

Cirsilinéol

07

08

03

09

06

[33]

Hispiduline

Cirsimaritine

7-O-glucosyl hispiduline

[34]

C. parviflora

Eupatorine

Eupatiline

Cirsilinéol

5,7,4’-trihydroxy-6,3’-dimethoxyflavone

10

11

08

07

12

13

19

[35]

Genkwanine

5-hydroxy-6,7,3’,4-’tetramethoxyflavone

7,4’-dihydroxy-5-methoxyflavone

[36]

C. sphaerocephala

Apigénine

3’- methoxy apigénine

Lutéoline

6-methoxy lutéoline

14

15

16

04

[37]

Tableau 1 : Quelques exemples de flavones isolés des centaurées .


8

Les structures des flavones de 01 à 16 sont les suivantes :

O

H

O

R2O

R1

R3

OR4

R5

OH

Structures R1 R2 R3 R4 R5

01 H Me OMe Me OMe

02 H Me OMe H OMe

03 OMe H H H H

04 OMe H OH H H

05 H Megluc H H H

06 OMe Glc H H H

07 OMe H OMe H H

08 OMe Me OMe H H

09 OMe Me H H H

10 OMe Me OH Me H

11 OMe H OMe Me H

12 H Me H H H

13 OMe Me OMe Me H

14 H H H H H

15 H H OMe H H

16 H H OH H H


9

Les structures des flavones de 17 à 19 sont les suivantes:

O

O

OH

H

OH

H

H

H

H

OH

O

OHH

HO

H

H

HO

H

OH

OH O

OH

HO

O

O

HO

GlcC

OH

OH

CGlc

17 18

O

O

HO

OH

O CH3

19

I-2-2-Flavonols:

O

O

A C

B

OH

Schéma 5 : Structure chimique de base des flavonols.


10

Les flavonols se distinguent des flavones par la présence d’un groupement OH en position C-3.

Les variations structurales sont de même nature que celles décrites pour les flavones.

Le tableau 2 reporte quelques exemples de molécules de ce groupe et isolées dans notre

laboratoire à partir de centaurées algériennes.

Les centaurées Flavonols Structures Réf

C. incana

6-methoxy quercetine

6-methoxy 7-O-glucosyl quercetine

Rutine

6-methoxy kaempférol

7-O-glucosyl-3-methoxy myricétine

3,5’-dimethoxy-7-O-glucosyl myricétine

20

21

23

24

30

31

[27]

C. pullata

Kaempférol

7-O-glucosyl patulétine

3-O-glucosyl-6-methoxy kaempférol

25

21

26

[34]

C. calcitrapa L.

Kaempférol

6-methoxy kaempférol


3-O-rutinosyl kaempférol


3-O-glucosyl quercétine

3-O-glucosyl kaempférol

25

24

29

27

26

22

28

[38]

Tableau 2 : Quelques exemples de flavonols isolés des centaurées.


11

Les structures des flavonols de 20 à 23 sont les suivantes :



O

OOH

OH

OH

GlcO

H3CO

O

OOH

OCH3

OH

GlcO

OH

OH

29 30

O

OOH

OCH3

OH

GlcO

OH

OCH3

31

Structures R1 R2 R3

20 OMe H H

21 OMe Glc H

22 H H Glc

23 H H RhamGlc

Structures R1 R2

24 OMe H

25 H H

26 OMe Glc

27 H Rut

28 H Glc

O

OOH

OR3

OH

OH

R2O

R1

O

OOH

OR2

OH

HO

R1


12

I-2-3 -Flavanones et dihydroflavonols :

O

O

HO

OH

OH

O

O

HO

OH

OH

OH

Flavanone 32 dihydroflavonol 33

Schéma 6 : Structures chimiques de base des flavanones et dihydroflavonols.

Les flavanones et les dihydroflavonols sont caractérisés par l’absence de la double liaison C-2

- C-3 et par la présence de centres d’asymétrie. Les variations structurales sont de même

nature que celles décrites pour les flavones et les flavonols.

Les dihydroflavonols se distinguent des flavanones par l’ hydroxylation de la position C-3.

Cette classe de flavonoïdes semble un peu moins fréquente que son homologue insaturé

rassemblant les flavones et flavonols.

Les composés les plus distribués dans ces deux groupes de flavonoïdes sont la naringénine 32

et le dihydrokaempférol 33.

I-2-4- Flavan-3-ols, Flavan-3,4-diols et Anthocianidols :

O

OH

O

OH

OH

O+

Flavan-3-ol Flavan-3,4-diol Anthocyanidol

Schéma 7 : Structures chimiques de base des Flavan-3-ols, flavan-3,4-diols et anthocyanidols.

A la différence des flavonoïdes ci-dessus décrits, ces trois groupes de molécules sont toujours

hydroxylés en position C-3 et se caractérisent par l’absence du groupe carbonyle en C-4. Cette


13

position peut être libre (cas des flavan-3-ols et anthocyanidols) ou hydroxylée (cas des flavan-

3,4-diols).

Les flavan-3-ols et les flavan-3,4-diols sont à l’origine des polymères flavaniques appelés

proanthocyanidols ou tanins condensés.

I-2-5- Chalcones et Aurones:

O

O

CH2'

3'4'

5'6'

2 3

4

561' 4

5

67

O

2' 3'

4'

5'6'23

1

AuroneChalcone

β

α

Schéma 8 : Structures chimiques de base des chalcones et aurones.

Les chalcones sont différents des autres types de flavonoïdes cités au-dessus. De par l’ouverture

du noyau pyranique central, elles sont constituées par deux unités aromatiques reliées par une

chaîne tricarbonée, cétonique, α, β-insaturée (Schéma 8). Le noyau B est assez fréquemment non

substitué, alors que les substitutions sur le cycle A sont le plus souvent identiques à celles des

autres flavonoïdes.

Les aurones sont caractérisées par une structure de 2-benzylidène-coumarone.

Pour ces deux types de molécules, la numérotation des positions est différente de celle des autres

flavonoïdes décrits précédemment.

І-3-Distribution et localisation :

Les flavonoïdes sont largement abondants dans les légumes feuilles (salade, choux, épinards,

etc…, ainsi que dans les téguments externes des fruits. Ils sont également présents dans le vin

rouge et le thé.

Les céréales, les épices et les herbes aromatiques (persil, thym, céleri) sont considérés aussi

comme des sources importantes de flavonoïdes. De nombreux travaux ont montré que certains


14

fruits et légumes sont très riches en flavonols, flavones et flavanones [39-41]. Le tableau 3

regroupe la distribution des flavonoïdes dans des sources alimentaires.

Flavonoïdes Aliments

Flavanones

Naringénine 32

fruits du genre citrus

Flavones

Chrysine 34

apigénine 14

lutéoline 16

peau des fruits

persil, thym, romarin, céleri

persil, céleri

Flavonols

Kaempférol 25

Quercétine 35

Myricétine 36

radis, brocoli, thé noir

oignon, pomme, olive, vin rouge, tomate

canneberge, vin rouge

Flavan-3-ols

Epicatéchine 37

catéchine 38

épigallocatéchine 39

thé vert, thé noir

thé vert, thé noir

vin rouge

Anthocyanidols

Cyanidol 40

Malvidol 41

Apigénidol 42

cassis, myrtilles

raisins, fraises, cassis

framboises, fraises

Tableau 3 : Sources alimentaires des flavonoïdes .

Les flavones apigénine 14 et lutéoline 16 sont très spécifiquement détectées dans les herbes

aromatiques comme le persil, le thym, le romarin et le céleri. Pour ce dernier, les concentrations

de ces deux flavones sont largement supérieures à celles présentes dans les tiges. Dans les

tomates, il y a autant de naringénine 32 que de quercétine 35. Cette dernière se retrouve de façon

majoritaire dans la quasi-totalité des végétaux. Le kaempférol 25, autre flavonol, y est également

largement détecté.


15

Parmi les autres flavonoïdes souvent étudiés, les anthocyanes confèrent aux fruits et légumes

leurs teintes rouges ou bleutées. Ils se trouvent surtout dans les myrtilles, cassis, airelles,

groseilles, mais également, à un degré moindre, dans tous les autres fruits rouges comme les

raisins, les fraises et les framboises. On peut aussi les trouver dans certains légumes comme le

chou rouge et les radis.

Le monde animal est lui aussi concerné par les flavonoïdes. On trouve par exemple de la

chrysine 34, de la quercétine 35 et de la galangine 43 dans la propolis des abeilles. Ces insectes

les synthétisent à partir des sécrétions de bourgeons de nombreux arbres comme le bouleau,

l’aulne, le sapin, et les modifient grâce à leurs enzymes salivaires.

Les structures des flavonoïdes de 34 à 43 sont les suivantes :


16

OOH

HO O

34

OHOOH

HO O

OHOH

35

OHOOH

HO O

OHOH

OH

36

OHOH

HO O

OHOH

37

OHOH

HO O

OHOH

38

OHOOH

HO O

43

OHOH

HO O

OHOH

OH

39

OHOH

HO O

OHOH

40

OHOH

HO O

CH3

OH

CH3

41

OH

HO O

OH

42


17

I-4- Propriétés des flavonoïdes :

Une des propriétés majeures des flavonoïdes est de contribuer à la couleur des plantes et

notamment à celle des fleurs. Or, c’est par la couleur de ses fleurs que la plante exerce un effet

attracteur sur les insectes et les oiseaux pollinisateurs, ce qui assurent par ce biais, une étape

fondamentale de sa reproduction.

On peut également noter que les flavonoïdes, en repoussant certains insectes par leur goût

désagréable, peuvent jouer un rôle dans la protection des plantes.

Les flavonoïdes montrent d’autres propriétés intéressantes dans le contrôle de la croissance et du

développement des plantes en interagissaant d’une manière complexe avec les diverses

hormones végétales de croissance. Certains d’entre eux jouent également un rôle de

phytoalexines, c’est-à-dire de métabolites que la plante synthétise en grande quantité pour lutter

contre une infection causée par des champignons ou par des bactéries.

Par ailleurs, les flavonoïdes présentent un intérêt thérapeutique qui date de la découverte de la

vitamine C par Szent Gyorgyi (Prix Nobel, 1937), chercheur de l’Université de Szeged

(Hongrie), qui a constaté que les symptômes hémorragiques du scorbut, liés à la fragilité ou

l’hyperperméabilité des vaisseaux, étaient guéris par des extraits de paprika ou de jus de citron,

riches en vitamine C et flavonoïdes. Cette action a été appelée propriété vitaminique P (P étant

la première lettre du mot perméabilité).

Malgré ces premiers résultats prometteurs, les recherches ne permirent pas ensuite d’attribuer un

rôle essentiel aux divers polyphénols du monde végétal. A partir des années quatre-vingt, c’est

la découverte du rôle des radicaux libres dans les processus pathologiques qui a relancé l’intérêt

pour ces molécules dont les propriétés antioxydantes sont très marquées.

І-5- Activités biologiques des flavonoïdes :

Des études épidémiologiques ont montré qu’une consommation régulière de fruits frais et de

légumes diminue le risque de développement des maladies cardiovasculaires et d’apparition de

certains cancers [42]. Ces effets sont attribués, en partie, aux concentrations relativement

importantes des flavonoïdes présents dans les fruits et les légumes.


18

Les flavonoïdes sont également reconnus pour leurs nombreuses activités biologiques, citons

par exemple les activités : anti-allergiques et antivirales [43-45], anti-inflammatoires [46-48].

Ces activités sont en général attribuées à leur capacité à piéger les radicaux libres, chélater les

ions métalliques ou inhiber les enzymes responsables de la formation des radicaux.

І-6- La biosynthèse des flavonoϊdes:

L’enzyme clé pour la formation du squelette flavonoique est la chalcone synthase (CHS) qui

catalyse l’étape de condensation de trois unités acétate à partir de malonyl-CoA avec la 4-

coumaroyl-CoA pour donner l’intermédiaire en C15, la 4,2’,4’,6’-tétrahydroxychalcone [49].

Cette chalcone est l’intermédiaire caractéristique de la synthèse des différentes classes de

flavonoïdes (Schéma 9).

Les flavonoïdes peuvent ensuite être modifiés par des réactions d’hydroxylation, méthylation,

glycosylation et acylation [50].

OH

CoAS

O

COOHH2C

CO-S-CoA3

Malonyl-CoA

4-Coumaroyl-CoA

Chalcone Synthase

O

2',4',6',4-tetrahydroxychalcone

OHHO

OH

OH

Chalcone Isomérase

O

HO

OH

OH

OFlavone Synthase

Flavanone (naringénine )

OOH

HO O

OH

Flavone (apigénine )

Schéma 9 : Biosyntèse des flavonoïdes : exemple des flavones.


19

І-7- Principales substitutions du squelette flavonique :

Les composés flavoniques de chaque sous classe se distinguent par le nombre, la position et la

nature des substituants (groupes hydroxyles, méthoxyles et autres) sur les deux noyaux

aromatiques A et B et l’hétérocycle C.

I-7-1- L’hydroxylation :

D’une manière générale pour les flavones et les flavonols, et, d’après les réactions de

biogenèse les hydroxyles en positions 5 et 7 du noyau A et l’hydroxyle en position 4’ du

noyau B sont considérés comme originaux et existent avant la constitution du noyau chalcone

[51].

L’hydroxylation du noyau B dans la position 3’ se fera après la fermeture de l’hétérocycle C,

c'est-à-dire après la formation du squelette chalcone, tandis que la polyhydroxylation sur le

noyau B (les positions 3’, 5’) se fera par le biais des enzymes (hydroxylases) [52, 53].

Les positions 2’ et 6’ du cycle B sont rarement hydroxylées [52].

I-7-2- La méthoxylation ou méthylation :

La méthylation par l’intermédiaire d’une jonction C-C se fait uniquement en C-6 et ou en C-8

par contre la fixation du groupement méthyle pour former un groupement methoxyle, se fait

après celle du groupement hydroxyle et nécessite la présence d’une enzyme (O-

methyltransferase) qui joue le rôle de transporteur à partir de la S-adenosyl-methionine (SAM)

qui représente le donneur du radical méthyle. Cette transformation se fera avant la formation

du noyau chalcone [54, 55].

Cette réaction de méthylation peut se faire sur le noyau A (carbones 5, 6, 7, 8), sur le noyau B

(carbones 2’, 3’, 4’, 5’) et l’hétérocycle C (carbone 3) après la formation du noyau chalcone

dans le cas de flavones et flavonols [54].


20

I-7-3- La O-glycosylation :

Elle s’effectue entre un hydroxyle du squelette flavonique et un hydroxyle alcoolique du sucre

(glucose, rhamnose, xylose, galactose et arabinose). La O-glycosylation se fait en présence de

l’enzyme Glycosyltransferase et un donneur de sucre comme UDP-Glu (Uridine diphosphate

glucose).

L’hydroxyle de la position 7 constitue le site préférentiel de la glycosylation dans le cas des

flavones alors que dans le cas des flavonols c’est l’hydroxyle de la position 3 [56].

I-7-4- La C-glycosylation :

Les flavonoïdes C-glycosylés ne sont pas rares, on y trouve plus de 350 hétérosides [57]. Dans

ce type de composés, le sucre est lié directement au cycle benzénique par une liaison carbone-

carbone. Cette liaison résiste à l’hydrolyse acide [58].

D’une manière générale, la liaison carbone-carbone est rencontrée souvent en position C-6 et

ou en position C-8 .

І-8-Méthodes de séparation et d’analyse des flavonoϊdes :

І-8-1- Méthodes de séparation :

La séparation des composés flavoniques commence d’abord par l’extraction d’une quantité

importante de plante macérée dans du méthanol ou de l’éthanol (solvant polaire) en présence

ou non d’eau. Après filtration et concentration, l’extrait obtenu additionné d’eau distillée subit

des affrontements successifs par des solvants de polarité croissante menant ainsi à une

séparation partielle en fonction de la polarité des constituants. En général, ce travail débute par

le chloroforme qui permet l’extraction des aglycones méthoxylés et hydroxylés, puis par

l’acétate d’éthyle qui permet l’extraction des aglycones polyhydroxylés et monoglycosylés, et

en dernier par le n-butanol qui accède aux hétérosides polyglycosylés. Les phases organiques

ainsi obtenues sont séchées, concentrées et soumises à la batterie chromatographique pour la

séparation. Les techniques usuelles utilisées pour la séparation des flavonoïdes sont en

général :


21

І-8-1- a-La chromatographie liquide sur colonne (CC) :

Elle est basée sur l’utilisation d’une phase stationnaire comme le gel de silice, la cellulose ou le

polyamide et une phase mobile constituée par divers systèmes de solvants comme éluant. Elle

est la plus utilisée pour la séparation des quantités de mélanges importantes et complexes [59].

І-8-1-b- La chromatographie préparative sur papier (CP) :

Basée sur l’utilisation d’une surface plane de cellulose considérée comme support maintenant

par imprégnation une phase stationnaire liquide, les systèmes de solvants les plus utilisés dans

cette technique sont [60] :

• L’acide acétique 15 et 30 % constituant des systèmes aqueux.

• Le n-butanol / Acide acétique/ Eau (BAW) 4 /1/ 5 constituant un système organique.

І-8-1-c- La chromatographie préparative sur couche mince (CCM) :

Cette méthode est très simple et très rapide, elle est utilisée aussi bien pour la séparation que

pour la purification. Elle se sert de diverses phases stationnaires et de systèmes d’élution

solvants appropriés.

La purification ultime des composés phénoliques isolés se fait généralement sur une colonne

de Sephadex LH20 en utilisant du méthanol pur comme éluant.

I-8-2- Méthodes d’analyse :

La fluorescence sous lumière UV, la valeur de Rf dans différents systèmes de solvants, les

résultats de la spectrométrie de masse (SM) avec différents modes d’ionisation : impact

éléctronique (IE), ionisation chimique (IC), electrospray (ESI) et bombardement par des

atomes accélérés (FAB), la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) avec

ses différentes expériences monodimensionnelles (1H, 13C, DEPT) et bidimensionnelles

(COSY, HSQC, HMBC, COLOC, NOESY…) et la spectrophotométrie UV-Visible qui donne

des indications importantes sur la nature du flavonoïde et son mode de substitution, sont les

techniques utilisées pour l’identification et la détermination des structures flavoniques .


22

I-8-2-a- La fluorescence sous lumière de Wood :

L’absorption des substances flavoniques sous lumière de Wood à la longueur d’onde de 365

nm donne des renseignements préliminaires sur la structure chimique. Le tableau 4 montre la

relation entre la fluorescence et la structure chimique [60].

La fluorescence Les structures possibles

Violette noire Flavones avec 5-OH

Flavonol avec 3-OR, 5-OH, 4’-OH

Chalcones.

Bleue Flavone ou flavonol sans OH libre en 5.

Flavanone avec OH en 3 ou flavanol.

Flavonol avec 3-OH et sans 5-OH.

Jaune ou jaune terne Flavonol avec 3-OH, et avec ou sans 5-OH

Orange fluorescente Isoflavones

Jaune-verte Aurones

Bleue-verte Flavanone sans 5-OH

Tableau 4 : Relation entre la fluorescence sous lumière de Wood et les stuctures flavoniques

I-8-2-b- Facteur de retardement et comportement chromatographique :

La valeur du Rf est définie comme suit :

Distance entre l’origine et la tache du produit après élution Rf = Distance entre l’origine etle front du solvant après élution

Cette valeur varie avec la nature du solvant utilisé (organique ou aqueux), le type de support

chromatographique (gel de silice, polyamide, cellulose), la nature du produit lui-même

(aglycone ou glycosyle), ainsi que de la disposition des différents substituants sur le squelette

flavonique [59-61]. Le tableau 5 montre l’influence de la substitution du squelette flavonique

sur la valeur du Rf.


23

Structure flavonique Rf Augmentation des groupes hydroxyles Rf diminue dans les systèmes de solvants

organiques et augmente dans les systèmes de solvants aqueux

Methylation des groupements hydroxyles Rf augmente dans les systèmes de solvants organiques et diminue dans les systèmes de solvants aqueux

Glycosylation Rf diminue dans les systèmes de solvants organiques et augmente dans les systèmes de solvants aqueux.

Tableau 5 : La relation entre le Rf et la structure flavonique.

I-8-2 -c-La spectrophotométrie UV-Visible :

C’est la méthode la plus importante pour l’identification des structures flavoniques. Elle est

basée essentiellement sur l’enregistrement d’un spectre dans un milieu alcoolique (méthanol ou

éthanol) qui sera caractérisé par deux bandes d’absorption principales, la bande I et la bande II

[62].

Ces deux bandes représentent les absorptions dans le proche UV, des chromophores composant

le squelette flavonique. Ainsi, la bande I présentant un maximum d’absorption entre 300 et 400

nm, est attribuée à l’absorption du système cinnamoyle qui résulte de la conjugaison du

groupement carbonyle avec la double liaison (C2-C3) et le noyau B, elle donne donc, des

renseignements sur les variations structuralesdu cycle B et l’hétérocycle C (Schéma 10). La

bande II, présentant un maximum d’absorption entre 240 et 280 nm, est attribuée à l’absorption

du système benzoyle qui dérive de la conjugaison du groupement carbonyle avec le noyau A et

donne des informations sur les variations structurales du cycle A [59] (Schéma 10).


24

O

O

A C

Absorption de la partie cinnamoyle bande I

Absorption de la partie benzoyle bande II

B

Schéma 10: Les bandes caractéristiques d’un squelette flavonique

Le tableau 6 donne l’intervalle du maximum d’absorption des deux bandes en milieu

méthanolique pour quelques types de flavonoïdes.

Type de compose flavonique Bande I Bande II

Flavones 320-350 250-270

Flavonols 352-385 250-280

Flavanones 300-330 245-275

Tableau 6 : Relation entre le maximum d’absorption en UV et le type de flavonoïdes.

Le maximum d’absorption d’une telle ou telle bande dépend du nombre et de la position des

groupements hydroxyles ou méthoxyles sur le squelette flavonique. L’augmentation du

nombre de groupements hydroxyles fait déplacé le maximum d’absorption vers des longueurs

d’onde plus élevées, par contre la substitution des groupements hydroxyles par des

groupements méthoxyles ou glycosyles fait déplacé ce maximum vers des longueurs d’onde

plus courtes [63].

I-8-2 -c-1-Addition de réactifs :

Le spectre méthanolique d’un composé flavonique sera modifié par addition d’un certain

nombre de réactifs tels que NaOH, AlCl3, AlCl3+HCl, NaOAc et NaOAc+H3BO3. Ces réactifs

réagissent avec les groupements hydroxyles par formation de sels et de complexes qui se


25

traduiront sur le spectre UV par des déplacements bathochromiques ou hypsochromiques des

bandes d’absorption, permettant la localisation des hydroxyles libres sur le squelette

flavonique.

• l’addition de AlCl3 et AlCl3 + HCl :

L’addition de AlCl3 à la solution du flavonoïde dans le méthanol mène à la formation de

complexes entre les hydroxyles ortho, l’hydroxyle en 3 et la fonction carbonyle et l’hydroxyle en

position 5 et la fonction carbonyle [64]. Ce qui entraîne un effet bathochrome de la bande I.

L’addition de HCl dans ce même échantillon provoque la disparition des complexes instables

(complexe formé entre deux hydroxyles) et le maintien des complexes stables (hydroxyle et

carbonyle). Ceci se manifeste par un déplacement hypsochrome de la bande I par rapport à celui

en présence de AlCl3 et bien évidement un effet bathochrome moins important par rapport au

spectre dans le méthanol pris comme référence.

• l’addition de NaOAc + H3BO3 :

Le H3BO3 est additionné à l’échantillon en présence de NaOAc et les informations apportées

indiquent l’existence ou l’absence de systèmes ortho dihydroxyle sur le cycle B ou sur le cycle

A (6, 7 ou 7, 8) à cause des complexes formés. l’effet qui observé est un déplacement

bathochrome de la bande I par rapport au spectre enregistré dans le méthanol [65].

• l’addition de NaOH et de NaOAc :

NaOH :

L’addition du NaOH indique le nombre et la position des hydroxyles libres sur le squelette

flavonique essentiellement les OH des positions 7, 4’et 3 par un effet bathochromique de la

bande I, accompagné ou non d’une augmentation d’intensité renseignant ainsi sur un 4’-OH libre

ou substitué. Dans ce spectre, la présence d’un 7-OH libre est déduite de l’apparition d’une

nouvelle bande entre 320 et 335 nm. Par contre la décomposition de l’échantillon après cinq

minutes indique la présence simultanée d’un 3-OH et d’un 4’-OH libres.


26

NaOAc :

Ce réactif sert à détecter les groupements hydroxyles essentiellement celui de la position 7 par un

léger effet bathochrome de la bande II, il ionise les OH les plus acides comme les hydroxyles des

positions 3, 7 et 4’ [65]. Le tableau 7 donne les informations obtenues des spectres en présence

de réactifs [59, 66, 67]

Tableau 7 : Informations obtenues des séries spectrales UV-Vis

Réactifs Déplacement en nm Bande I Bande II Interprétation

MeOH

304-350 250-280 352-385 250-280 350-380 250-280

Flavones Flavonols (3-OH) Flavonols (3-OR)

NaOH

+44 à 65 1)- avec stabilité ou augmentation d’intensité 2)-avec diminution d’intensité une nouvelle bande entre 320-335

4’-OH 3-OH et 4’-OR 7-OH

AlCl3/MeOH + 20 à 45 + 60

5- OH 3- OH

AlCl3+HCl/AlCl3

-20 à -40 -20 à -25

Ortho di OH (noyau B) Ortho di OH (noyau A) +ortho di OH (noyau B)

AlCl3 +HCl/MeOH

+ 17 à 20 + 35 à 55

+ 50 à 60

5- OH (avec 6- oxygénation) 5-OH flavone et 3-OMe flavone 3- OH avec ou sans 5- OH

NaOAc /MeOH

+ 5 à 20 Déplacement très faible Diminution d’intensité avec le temps Le spectre se décompose avec le temps

7- OH 7- OR 6, 7 ; 7, 8 ou 3’, 4’ di OH 5, 6, 7 ; 5, 7, 8 ou 3, 3’ ,4’ – tri OH

NaOAc + H3BO3 + 12 à 36 + 5 à 10

3’, 4’ di OH 6, 7, ou 7, 8 di OH


27

I-8-2-d-La Spectrométrie de masse :

Cette technique permet la détermination du pic moléculaire des aglycones qui donne

globalement le nombre et la nature des substituants hydroxyles ou méthoxyles [68, 69].

Les pics de fragmentation caractéristiques fournissent des renseignements utiles, notamment

sur les structures des substituants des noyaux A et B [70]. Cette technique connaît un véritable

succès dans ce domaine avec le développement de divers mode d’ionisation permettant

l’analyse des structures glycosylés à l’état natif tels que la FAB, et l’électro-spray.

De nos jours, la spectrométrie de masse trouve diverses applications grâce au couplage avec

les techniques chromatographiques. Ces techniques de couplage permettent des analyses très

rapides et très rigoureuses.

I-8-2-e- La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) :

Très précise et très efficace, elle est couramment utilisée et permet entre autre :

La localisation des protons de la molécule [70].

De déterminer le nombre, la nature et la position des sucres [71,72].

D'identifier les liaisons C-sucre et O-sucre.

D’identifier les substituants acylés et leur sites d’acylation.

L’identification des substituants oxygénés.

Les tableau 8 et 9 contiennent quelques déplacements chimiques et constantes de couplage des

protons du noyau A et du noyau B [73].

Protons du noyau A Nature du flavonoïde

(H-5) δ, ppm J, Hz

(H-6) δ, ppm J, Hz

(H-8) δ, ppm J, Hz

5, 7 – OH 6,0-6,2 d 2,5 6,3-6,5 d 2,5 5-OH, 7-OR (R=Gluc.) 6,2-6,4 d 2,5 6,5-6,9 d 2,5 7-OR (R=H, sucre) 8,0 d 9 6,7-7,1 dd (9,0 ; 2,5) 6,7-7,0 d 2,5 5, 6, 7-OR R=H, sucre 5, 7, 8-OR

6,3 s

6,3 s

Tableau 8 : Les déplacements chimiques et constantes de couplage des protons du noyau A.


28

Protons du noyau A

Nature du flavonoïde

(H-5)

δ, ppm J, Hz

(H-6)

δ, ppm J, Hz

5, 7 – OH 6,0-6,2 d 2,5

5-OH, 7-OR (R=Gluc.) 6,2-6,4 d 2,5

Tableau 9 : Les déplacements chimiques et constantes de couplage des protons du noyau B.

I-8-3 - L’hydrolyse acide des hétérosides :

Cette manipulation concerne dans un premier temps les flavonoïdes O-glycosylés, elle

renseigne sur la nature du sucre qui peut être étudié une fois détaché ainsi que celle de

l’aglycone. L’identification du sucre se fait par co-chromatographie avec des solutions

authentiques.

Les hétérosides C-glycosylés résistent à l’hydrolyse acide, cette propriétés permet de

différencier ce type de liaison dans les flavonoïdes glycosylés.

Chapitre II les lactones sesquiterpéniques

30

II-1-Introduction :

La famille des lactones sesquiterpéniques est très représentée dans la nature. Depuis les années

70, le nombre de structures élucidées n’a cessé d’augmenter pour dépasser, les 2500 molécules

[74]. Plus de 5000 structures sont connues [75,76].

Les lactones sesquiterpéniques constituent un grand et divers groupe de métabolites secondaires,

qui se distinguent dans leurs propriétés et leurs structures, elles sont appelées aussi les principes

amers à cause de leur gout amer.

On les trouve dans plus de 15 familles de plantes et très majoritairement chez les Asteraceae

[77]. Les lactones sesquiterpéniques sont fréquement localisées dans des poils sécréteurs situés

au niveau des feuilles, des tiges et des bractées de l’inflorescence [78].

Les lactones sesquiterpéniques sont connues depuis 1830, date à laquelle le premier d’entre eux,

l’α-santonine a été isolée sous forme cristalline [79].

O

O

O

Schéma 11: α-santonine

II-2-Structure chimique des l actones sesquiterpéniques :

Les lactones sesquiterpéniques ont comme base un squelette de 15 atomes de carbone qui

contient généralement au moins le groupe γ-lactonique, sa formation vient de trois unités

isopronèques qui sont liées ensemble sous forme" tête-queue" en formant le composé 2,6,10-

triméthyldodécane (Schéma 12).


31

Schéma 12 : Squelette de base des lactones sesquiterpéniques.

II-3- Classification des lactones sesquiterpéniques :

Les lactones sesquiterpéniques majoritaires dans le genre Centaurea sont: les germacranolides,

les élémanolides, les eudesmanolides, les guaianolides et les héliangolides [80].

II-3-1-Les germacranolides :

Ce sont des composés monocycliques, leur squelette de base est un cycle à 10 atomes de

carbone, avec deux doubles liaisons l’une entre C-1 et C-10 et l’autre entre C-4 et C-5. Ce cycle

est attaché à un autre cyclique formé de 5 atomes caractérisant la fonction γ-lactone qui peut être

fermée en 6 ou en 8 .

Le schéma 13 montre un exemple de germacranolide isolé de Centaurea lippi et de plusieurs

autres centaurées dans notre laboratoire: la cnicine [81].

O

OOH

HOO

O OH

1

2

3 45

67

89

10

11

14

15 12

13

Schéma 13: La cnicine .

Des études réalisées sur les germacranolides ont montré que ce type de lactones

sesquiterpéniques est constitué essentiellement de trois classes différentes : 6α,12-olide; 8α,12-

olide et furanogermacrane [82].

Unité d’isoprène (x 3)

Combinaison linéaire « tête-queue »

2,6,10-triméthyldodécane


32

II-3-2-Les élémanolides :

Ce sont des lactones sesquiterpéniques qui ont comme squelette de base un monocycle à 6

atomes de carbone, comme le montre le schéma 14, ce squelette est caractérisé par la

stéréochimie α de la liaison C1-C10 et la stéréochimie β de la liaison C4-C5.

O

O

X

12

34

5

14

15

67

8

9

10

1113

12

Schéma 14: Squelette de base des élémanolides.

Ils dérivent par un réarrangement de Cope des germacra-1(10),4(5)-diènolides [83,84] (Schéma

15).

O

O

(CH3)2NH,MeOH

O

O

NMe2

205ºC, N2,5min

O

O

NMe2

1.CH3I2.NaHCO3

O

O

Schéma 15 :Réarrangement de Cope d’un germacranolide.


33

II-3-3-Les eudesmanolides :

Ils sont aussi appelés les sélinanolides, et ont comme squelette de base deux cycles hexagonaux,

comme le montre schéma 16. La fermeture de la fonction γ-lactone peut s’effectuer aussi bien en

6 qu’en 8 avec une jonction cis comme avec une jonction trans.

OH

O

X

12

34

56

7

910 8

11

13

12

14

15

Schéma 16 :Exemple de squelette de base des eudesmanolides.

Ils dérivent généralement de la cyclisation trans annulaire entre C-5 et C-10 du système

cyclodécadiène des germacra-1,5-diènes ou de leurs dérivés 1,10 et 4,5 époxydes [85], ces

réactions peuvent être catalysées par un acide de Lewis.

Le schéma 17 montre la cyclisation du germacra-1,5-diène [86,87], formant un mélange de deux

eudesmanolides via un cation intermédiaire.

Schéma 17: Formation d’élémanolide via le costunolide.

+

OH

O

OO

OH

O

OH

O

+

+H+

-H +

H +

β- cyclocostunolide α-cyclocostunolide

Cation intermédiaire


34

II-3-4-Les guaianolides :

Les guaianolides constituent un large groupe de lactones sesquiterpéniques, ils ont comme

squelette de base un cycle pentagonal et un autre heptagonal, comme le montre schéma 18 .

Ce type de lactones sesquiterpéniques se distingue par la stéréochimie α des protons des

positions 1 et 5.

OO

HO HOH

H

H

123

45

67

8910

11

12

13

14

15

Schéma 18 : Deacylcynaropicine.

II-3-5-Les héliangolides :

Ce sont des germacranolides avec des doubles liaisons de configuration E pour C-1, C-10 et Z

pour C-4, C-5. Le squelette de base de ce type de composés est représenté dans le schéma 19 .

O

O

1

2

3

4

15

109

8

7

12

5 11

6

13

14

Schéma 19 : Structure du squelette héliangolide


35

II-4- Biosynthèse des lactones sesquiterpéniques :

La biosynthèse des α-méthylène-γ-lactones sesquiterpéniques serait la suivante: ces composés

proviendraient de la cyclisation du trans,trans-farsényl-pyrophosphate. Une série de

fonctionnalisations du cyclodécadiène obtenu permettrait ensuite de former une grande diversité

de sesquiterpènes (Schéma 20).

OPP co2Me

O

O

O

O

O

O

HO HO

HO

O

O

O

O

HO OO

ou

Trans, trans-Farnésyl Pyrophosphate

germacranolides

guaianolides

eudesmanolides

Schéma 20 : biosynthèse de α-méthylène-γ-lactones sesquiterpéniques


36

II-5-Activités biologiques des lactones sesquiterpéniques :

Plusieurs études ont tenté d’identifier le lien entre l’activité biologique et la structure de ces

sesquiterpènes lactones[88-93].

Celles-ci ont démontré que les α-méthylène-γ-butyrolactones alkyleraient, par réaction de

Michael, des nucléophiles biologiques tels que la L-cystéine ou des enzymes contenant des thiols

(Schéma21).

OO

OO

S-Enz+ Enz-SH

Schéma 21: mode d’action supposé des α-méthylène-γ-lactones.

La réactivité des α-méthylène-γ-lactones insaturées avec les thiols et les amines, en particulier la

cystéine[94-96], est bien établie et peut suggérer que la cytotoxicité des lactones

sesquiterpéniques résulte de l’alkylation des centres nucléophiles de systèmes biologiques. Mais

les γ-lactones α,β-insaturées endocycliques réagissent lentement avec la cystéine et certains

adduits sont même inertes.

Un grand nombre de lactones sesquiterpéniques, dont la vernolépine, l’aromaticine, et

l’éléphantopine, peuvent inhiber la prolifération des tumeurs. Elles présentent toutes une lactone

α ,β-insaturée dont la double liaison conjuguée est exocyclique (Schéma 22).

OOH

OO

O

H

O

OO

OO

O

O

O

O

O

Schéma 22: de gauche à droite: la vernolépine, l’aromaticine et l’éléphantopine


37

En général, les lactones sesquiterpéniques possèdent des propriétés d’inhibition de la Farnésyl

Protéine Transférase (FPTase).

La protéine Ras joue un rôle important [97] puisqu’elle régule le cycle de vie des cellules. Une

altération de cette protéine entraîne une prolifération excessive de cellules, formant des tumeurs.

Ce phénomène a été identifié dans plus de 30% des cancers humains.

La FTPase permet la farnésylation des protéines Ras. Cette étape est indispensable avant leur

ancrage dans la membrane plasmatique. La FTPase est donc nécessaire à l’expression de la

protéine Ras: inhiber la FTPase des cellules cancéreuses revient à annihiler le développement de

tumeurs. Les agents inhibiteurs de FTPase, tels que les lactones sesquiterpéniques, sont donc des

agents thérapeutiques pour le traitement des cancers.

Parmi les autres activités biologiques des lactones sesquiterpéniques ,on peut citer : l’activité

inflammatoire [98-100], antimigraineuse [101], antioxydante [102], antifonqique [103-105],

cytoprotectrice gastrique [106] et antimicrobienne[107].

Malgré l’importance des lactones sesquiterpéniques ces substances peuvent aussi être

allergisante [108] et neurotoxique [109], car des allergies peuvent apparaître lors d'un contact

direct ou indirect avec la plante. Des études ont montré que leur présence dans des plantes est

responsable d’empoisonnement de mammifères.

II-6-Les méthodes de séparation et d’analyse des lactones

sesquiterpéniques :

II-6-1- Les Méthode de séparation :

Les travaux de la littérature montrent que plus de 90% des lactones sesquiterpéniques isolées et

déterminées l’ont été à partir d’espèces de la famille des composées. Cependant, bien que

certaines plantes soient de grandes accumulatrices de ces métabolites, le passage par des

techniques de séparations chromatographiques différentes est obligatoire pour les atteindre.

Chercher des lactones sesquiterpéniques et faire leur séparation commence d’abord par

l’extraction d’une quantité importante de plante macérée dans du méthanol ou de l’éthanol

(solvant polaire) en présence ou non d’eau. Après filtration et concentration, l’extrait obtenu


38

additionné d’eau distillée subit des affrontements successifs par des solvants de polarité

croissante menant ainsi à une séparation partielle en fonction de la polarité des constituants. En

général, ce travail débute par de l’hexane ou de l’éther de pétrole pour récupérer les cires et les

hydrocarbures suivi par au moins trois extractions au chloroforme pour avoir les lactones

sesquiterpéniques moyennement polaires. Ces deux étapes sont suivies par une extraction à

l’acétate d’éthyle dont l’extrait pourrait contenir des lactones sesquiterpéniques trop

fonctionnalisées et enfin par des affrontements au n-butanol pour rechercher les produits

beaucoup plus polaires tels les hétérosides souvent de type flavonoïde.

Les phases organiques ainsi obtenues sont séchées, concentrées et soumises à la batterie

chromatographique pour la séparation. Les techniques usuelles utilisées pour la séparation des

lactones sesquiterpéniques sont en général la chromatographie sur colonne et la chromatographie

sur couche mince.

II-6-1- a- La chromatographie sur colonne :

Les lactones sesquiterpéniques ont des polarités similaires. En effet, leur séparation en produits

purs est souvent complexe et consomme énormément de temps et de solvants.

L’étape initiale pour leur séparation est la chromatographie sur colonne utilisant le gel de silice

comme phase stationnaire éluée par des systèmes de solvants en mode gradient ou en mode

isocratique. Cette étape doit être précédée par une analyse par chromatographie sur couches

minces pour rechercher l’éluant donnant la meilleure séparation.

Le tableau 10 rapporte quelques systèmes de solvants utilisés pour séparer les lactones

sesquiterpéniques sur colonne.


39

Systèmes de solvant Proportions

CHCl3- Me2CO 9:1; 7:1; 5:1; 3:1, 3:2; 1:1; 2:3; 1:3

Hexane-AcOEt 9:1; 4:1; 2:1; 1:1; 2:3; 1:3

Haxane-CHCl3- AcOEt 1:1:1; 1:1:2; 2:2:1

CHCl3-MeOH 99.5:0.5; 99:1; 98:2; 95:5; 50:1; 10:1

CHCl3-AcOEt 1:1

Hexane-Et2O 1:3

CH2Cl2-Me2CO 1:1

CH2Cl2-isPrOH 99:1; 98:2; 97:3; 19:1; 9:1; 3:1

Et2O-Toluène-CH2Cl2 1:1:1

Tableau 10 : Systèmes de solvants utilisés pour séparer les lactones sesquiterpéniques sur

colonne.

II-6-1- b- Chromatographie sur couche mince :

Cette méthode utilisée de manière analytique donne une idée sur la composition de l’extrait à

étudier. De manière preparative, elle permet des séparations correctes suivies de purifications.

Dans notre cas pour les lactones sesquiterpéniques le support fréquemment utilisé reste le gel de

silice 60 avec indicateur fluorescent. La révélation des plaques preparatives se fait sous lumière

UV à 254 nm.

Les plaques analytiques, peuvent être révélées sous lumière UV à 254 nm ou par pulvérisation de

l’acide sulfurique suivie de chauffage à 100 °C pendant 3 minutes.

Cette dernière technique de révélation peut donner des informations sur la nature et la position de

certains substituants sur le squelette sesquiterpénique de type guaianolide de la lactone en

question en fonction de la couleur que prennent les spots après chauffage. Par exemple, une

couleur verte indique la présence d’un groupement chlorométhylène en C-4 et un groupement

hydroxyle en C-3 [110].


40

II-6- 2- Les Méthodes d’analyse :

Le développement des méthodes d’analyse de nos jours a facilité l’investigation structurale des

molécules complexes, notamment celles des lactones sesquiterpéniques.

a- La spectroscopie d’absorption infrarouge (IR) montre la présence de la fonction γ – lactoneα,

β-saturée ou α, β- insaturée par l’existence de bandes caractéristiques à 1780 ou 1755 cm-1

respectivement. Les bandes à 1740, 1735 et 1720 cm-1 respectivement confirment la présence

d’un groupement acétate [111,112], esters saturés et esters insaturés.

Cette étape est définie comme étape initiale de l’identification des lactones sesquiterpéniques.

b- La spectrométrie de masse avec ses divers modes d’ionisation permet en plus de la

visualisation d’un pic pseudo moléculaire (ionisation douce) permettant d’arriver à la masse

moléculaire [113], la détermination de la nature des substituants sur le squelette

sesquiterpénique.

c- La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire est la technique la plus performante dans

la recherche structurale des lactones sesquiterpéniques. En effet, les expériences

multiimpulsionnelles et bidimensionnelles homo et hétéronucléaires permettent non seulement

d’arriver à la structure mais peuvent donner d’excellentes informations sur la stéréochimie des

centre asymétriques.

d- La diffraction des rayons X est également très utilisée. Elle donne toutes les informations

nécessaires à l’établissement de la structure y compris la stéréochimie des centres chiraux mais

exige une bonne cristallisation de l’échantillon.

Chapitre III Partie expérimentale

42

III-1 - Etude phytochimique de Centaurea nicaeensis :

III-1.1 - Place dans la systématique :

III-1.2 - Description de l’espèce Centaurea nicaeensis :

Centaurea nicaeensis est une plante bisannuelle à fleurs nettement jaunes et des tiges bien

marquées (Schéma 23). Elle est très polymorphe à feuilles inférieures pétiolées et lyrées, les

supérieures sont sessiles et amplexicaules. Les capitules sont de 1-1,5 cm de large sur 2,5-3 cm

de long, les akènes sont pâles de 3 mm de long et à aigrettes deux fois plus courtes.

Cette plante est assez répandue sur tout le Tell, dans les forêts claires et les pâturages arides [2].

Elle possède deux sous-espèces :

• Les bractées à appendices dont l’épine médiane est très marquée jusqu’à 2 cm et de

couleur claire, elle est accompagnée de courtes épines en nombre variable (Schéma 24) ssp.

nicaeensis Q. et S.

Embranchement Angiospermes

Classe Dicotylédones

Ordre Astérales

Famille Compositae

Sous-famille Tubiflores

Tribu Cynarées

Genre Centaurea

Espèce Nicaeensis sous-espèce walliana M.


43

Schéma 24 : La fleur de Centaurea nicaeensis Q. et S.

• Les bractées à appendices dont l’épine médiane est très courte 3-4 mm et de couleur noire

(Schéma 25) ssp. nicaeensis walliana M.

Schéma 25 : La fleur de Centaurea nicaeensis var. walliana M.

Nous nous sommes intéressés dans ce travail à la sous espèce nicaeensis var. walliana M.

Schéma 23: Centaurea nicaeensis var. walliana M.


44

III-1.3- Travaux antérieurs:

Trois études sur Centaurea nicaeensis All. ont été effectuées au sein de notre laboratoire. La

première concerne C. nicaeensis var.Q. et S. Cette étude a permis d’isoler 12 flavonoïdes, parmi

lesquels 8 de type flavone et 4 de type flavonol [114]. Il s’agit de:

• 6-methoxy lutéoline (Népétine) 04

• 7-O-glucosyl hispiduline 06

• 6-O-methoxy chrysoeriol (Jacéosidine) 07

• 6, 7-dimethoxy chrysoeriol ( cirsilinéol) 08

• 3'-methoxy salvigenine 13

• 6, 8-di-glucosyl apigénine (Vicénine-2) 18

• 6-methoxy quercetine 20

• 7-O-glucosyl patulétine 21

• 6-methoxy kaempférol 24

• 7-O-glucosyl isoorientine 44

• 6-O-glucosyl isoorientine 45

• 7-O-glucosyl- 6 –methoxy isorhamnétine 46

O

OOH

OH

OH

R3O

R2 R1

La deuxième étude également effectuée sur Centaurea nicaeensis var. Q. et S. reporte

l’isolement de quatre lactones sesquiterpéniques [115] , il s’agit de:

Structures R1 R2 R3

44 H CGlc Glc

45 H CGlcOGlc H

46 OH OMe Glc


45

• 11β-H, 13-dihydrocnicine :

O

OOH

HOO

O OH

1

2

34

56

7

89

10

11

14

15 12

13H

1617

18

1920

• 11β-H, 13-dihydrosalonitenolide :

O

HO

H

OH1

2

3 4

15

5

109

8

76 11 13

12

O

14

• La mélitensine :

O

O

OH2

1

34

56

7

89

10

14

111215

H

H

CH3

HO

13

• 5α,6β,7α,8β,11β-15-hydroxy-8-(1’, 2’-dihydroxyethyl)-acryloelema-1,3-dien-6,12-olide :

O

O

21

3

4

56

7

89

10

14

111215

H

H

CH3

HO

OOH

O OH

13

16

18

1719

20


46

La troisième a été effectuée sur Centaurea nicaeensis var. walliana M., soit la variété qui a fait

l’objet de ce travail. Cette étude concernant l’investigation de la phase chloroforme de l’extrait

hydro alcoolique a mené à la séparation de 2 composés flavoniques de type flavone [116]. Il

s’agit de :

• 5,7,4’-triihydroxy 6, ,3’-dimethoxyflavone (Jacéosidine) 07

• 5,4’-dihydroxy 6,7,3’-trimethoxyflavone ( cirsilinéol) 08

III-2- Travaux personnels :

III-2-1- Extraction de Centaurea nicaeensis :

La plante a été récoltée au mois de juin 1998, des montagnes de Souk-Ahras. Après séchage dans

un endroit sec et aéré à l’abri de la lumière directe du soleil, les parties aériennes broyées

(feuilles et fleurs) sont pesées (m=1,95 kg).

Le matériel végétal a subit une macération dans un mélange hydroalcoolique (Ethanol/Eau) dans

les proportions (70/30; v/v) pendant 24 heures. Cette macération est répétée 3 fois avec

renouvellement du solvant. Les 3 extraits hydroéthanoliques sont réunis, concentrés à une

température n’excédant pas environ 35 ºC.

La solution obtenue diluée avec de l’eau distillée à raison de 400 ml pour 1kg de matière sèche,

est additionnée d’acétate de plomb [(CH3COO)4Pb] pour éliminer la chlorophylle par

précipitation. Après filtration, la solution devenue rouge-brune, subit des extractions successives

de type liquide-liquide en utilisant des solvants de polarité croissante en commençant par le

chloroforme, puis l’acétate d’éthyle et en dernier le n-butanol.

Les trois phases organiques ainsi obtenues (chloroforme, acétate d’éthyle et n-butanol) sont

séchées par du sulfate de sodium anhydre (Na2SO4), puis filtrées et concentrées à sec sous

pression réduite.

Le protocole d’extraction est résumé dans le schéma 26 :


47

Schéma 26 : Protocole d’extraction de Centaurea nicaeensis.

Extrait chloroforme m = 35 g

Extrait AcOEt m =23 gPhase

organique

• Séchage par Na2SO4 anhydre • Filtration • Concentration à t = 35°C

• Extraction par Le n-butanol (x3)

• Décantation

• Séchage par Na2SO4 anhydre • Filtration • Concentration à 60°C

• Extraction par de l’AcOEt (x1) • Décantation

Phase aqueuse

Phase organique

• Concentration non à sec (t = 35°C) • Dilution avec 760 ml de H2O

distillée. • Précipitation de la chlorophylle par

le (CH3COO)4Pb. • Filtration

• Extraction par du CHCl3 (x3) • Décantation

• Macération à froid dans un mélange EtOH/H2O (70 : 30 ; v/v) 3 fois 24h

• Filtration

Extrait éthanolique

Filtrat

• Séchage par Na2SO4 anhydre • Filtration • Concentration à t = 35°C

Extrait n-butanol m = 68 g

Matière végétale m = 1950 g.

Phase organique

Phase aqueuse

Phase aqueuse


48

L’investigation de l’extrait acétate d’éthyle a débuté par l’enregistrement d’un spectre de RMN

de proton (spectre 1). Ce spectre montre la présence de signaux dans la zone attribuée aux

terpenoïdes et également dans celle attribuée aux flavonoïdes.

Spectre 1 : Spectre de RMN du proton de l’extrait acétate d’éthyle.

III-2-2-Séparation chromatographique de l’extrait acétate d’éthyle :

III-2-2-1- Séparation chromatographique sur colonne :

La séparation sur colonne a débuté par une recherche sur plaques analytiques de gel de silice 60,

du meilleur système d’élution. Les tests effectués ont montré que la meilleure séparation est

obtenue avec le système (CHCl3/MeOH) dans les proportions (9/1) comme le montre le

chromatogramme suivant (schéma 27).


49

Schéma 27 : Chromatogramme de l’extrait acétate d’éthyle dans le système CHCl3/MeOH

(9: 1). Révélateur : L’acide sulfurique.

Ainsi, cette étude a débuté sur une colonne de gel de silice préparée dans le chloroforme où

environ 14 g de l’extrait acétate d’éthyle y ont été déposés.

L’élution a été faite par du chloroforme avec un gradient de méthanol et un fractionnement tous

les 25 ml. Le suivi de la composition des fractions a été effectué par chromatographie sur couche

mince de gel de silice 60 sur support aluminium.

Les plaques sont visualisées sous lumière UV (λ=254 et 365nm) puis révélées par l’acide

sulfurique et chauffées à 100 °C pendant 3 min. Les pots de même composition sont rassemblés,

on obtient ainsi 28 fractions, le tableau 11 rassemble les résultats de cette colonne.


50

Fractions Tubes (25 ml)

Eluant Observations CHCl3

%MeOH

% F1 1-27 100 0 /

F2 28-76 99.5 0.5 Des traces 77-79

99 1

F3 80 Mélange séparable avec une quantité faible



F6 83-84 Mélange séparable avec une quantité faible

F7 85-115 Mélange séparable 116-147

98 2 F8 148-184 Mélange séparable

F9 185-202

Mélange séparable 203-210

96 4 F10 211-232 Mélange séparable F11 233-265 Mélange séparable

F12 266-271

Mélange séparable 272-298 94 6

F13 299-308 Mélange séparable F14 309-336

90 10

Mélange séparable F15 337-344 Mélange séparable F16 345-359 Mélange séparable F17 360-368 Des cristaux

F18 369-378 Des cristaux 379-384

85 15

F19 385-396 Mélange séparable F20 397-403 Mélange séparable F21 404-419 Mélange séparable F22 420-431 Mélange séparable

F23 432-436

Mélange séparable 437-440

80 20 F24 441-451 Mélange complexe F25 452-464 Mélange complexe

F26 465-478 Mélange complexe 479-488

50 50 F27 489-496 Mélange complexe F28 497-510 0 100 Mélange complexe

Tableau 11: Le fractionnement de la colonne.


51

Parmi les fractions obtenues, on a procédé à la séparation des fractions: F9, F10, F16, F17.

III-2-2-2- Séparation et purification des fractions:

• La fraction F9 :

Cette fraction a subit une séparation sur plaques préparatives de gel de silice normale en

utilisant comme système éluant: Ether diéthylique/Hexane dans les proportions respectives (4:1).

Cette étude a mené à 5 sous fractions. Vu les quantités faibles obtenues, nous n’avons pu nous

intéresser qu’à la purification de la sous fraction F9-3.

Cette sous fraction F9-3, testée sur plaque analytique de gel de silice 60 révélée par de l’acide

sulfurique a montré deux taches dont une très minoritaire.

Ainsi, cette sous fraction jugée intéressante a subi une purification par chromatographie sur

plaques préparatives de gel de silice normale éluées par le système CHCl3/AcOEt/MeOH dans

les proportions respectives (3:1:0,5). Pour donner le produit F9-3-1 à l’état pur et natif sous forme

des cristaux blancs.


Cette fraction a été chromatographiée sur plaques préparatives de gel de silice normale éluées 2

fois par le système éther diéthylique/Hexane (4:1) pour donner le produit F10-1 à l’état pur et

natif.


Intéressante du point de vue quantitatif, la fraction F16 a retenu notre intérêt. Ainsi, le test

chromatographique sur couche mince de gel de silice normale de cette fraction, a montré 4 spots

dont deux très intenses. La couleur de leur fluorescence sous lumière UV à λ=366nm nous a

orientés vers des structures flavoniques.

Après cette analyse, cette fraction chromatographiée sur plaques préparatives de gel de silice

éluées par le système CHCl3/MeOH (9:1), a donné les produits flavoniques F16-1 et F16-4.


52


Cette fraction se présente sous forme cristallisée contenant un produit majoritaire mêlé à d’autres

produits en faible quantité. Pour cette raison, cette fraction a été chromatographiée sur une

colonne de gel de silice normale éluée par le système CH2Cl2/MeOH en gradient de polarité. Le

tableau 12 montre les résultats de cette colonne après regroupement des pots selon les tests

chromatographiques sur couche mince de gel de silice 60.

F17 Tubes

(25 ml)

Eluant Observations

CH2Cl2 % MeOH %

F17-1 1-29 100 0 Mélange de plusieurs produits

F17-2 30-74 90 10

Monotache (produit pur) 75-95 85 15

F17-3 96-112 70 30

Couleur marron (traînée) 113-130 50 50

Cette fraction a ainsi mené au composé F17-2 à l’état pur et natif.

III-3- Conclusion :

Ce travail, réalisé en complément d’une étude effectuée sur la phase chloroforme de cet extrait

hydroéthanolique, dans notre laboratoire [116] a ainsi mené à la séparation et la purification de 5

composés purs que nous avons soumis à l’analyse physico-chimique en vue de l’établissement de

structures. Il s’agit des composés: F9-3-1, F10-1, F16-1, F16-4 et F17-2.

Le schéma 28 résume les travaux chromatographiques effectués sur colonnes et plaques

préparatives sur couches minces de gel de silice.


53

Schéma 28: Résumé des travaux chromatographique effectués.

F9

F9-3-1

F17F16

F16-4

CCM

CCM

F17-2

Une colonne de gel de silice

Extrait acétate d’éthyle de Centaurea nicaeensis

F10

CCM

F9-3

CCM

F10-1 F16-1

Chapitre IV Résultats et discussion

55

IV-1- Identification du produit F9-3-1 :

Le composé F9-3-1 est caractérisé par une couleur noire sous lumière UV 254 nm et une couleur

rose après révélation par l’acide sulfurique.

L’étude simultanée des spectres de RMN 13C (Spectre 2), DEPT 135 (Spectre 3) et DEPT 90

(Spectre 4) du composé F9-3-1 montre la présence de 15 atomes de carbone que nous pouvons

répartir comme suit:

- 3 carbones quaternaires dont:

• 1 à δ =179,0 ppm caractéristique d’un carbonyle d’une γ-lactone sesquiterpénique

α,β-saturée

• 1 à δ =143,9 ppm attribuable à un carbone éthylénique

• 1 à δ = 40,2 ppm attribuable à un carbone hybridé sp3 et non oxygéné

- 6 groupements CH dont:

• 1 éthylénique à δ =146,2 ppm

• 1 à δ =77,7 ppm (oxygéné) caractéristique d’un CH de fermeture d’une γ-lactone

• 1 oxygéné à δ = 66,6 ppm

• 3 non oxygénés à δ =57,2; 49,4 et 39,9 ppm

- 4 groupements CH2 dont :

• 2 éthyléniques à δ =110,2 et 109,8 ppm

• 1 oxygéné à δ = 64,3 ppm

• 1 non oxygéné à δ = 47,8 ppm

- 2 groupements CH3 à δ = 16,8 et 12,2 ppm


56

Spectre 2: RMN 13C (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1.

Spectre 2-1: RMN 13C (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1 (Etalement).

C-9 C-7


57



C-14

C-10

C-12

C-1 C-6

C-8

C-15

C-4

C-2C-3 C-5

C-11 C-13


58

Spectre3-1 : DEPT 135 (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1.

Spectre 3-2: DEPT 135 (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1 (Etalement).

C-1 C-13

C-14 C-11

C-7 C-5 C-8

C-6

C-15 C-9 C-2C-3

C-3 C-2


59

Spectre 4: DEPT 90 (MeOH-d4, 75 MHz) du composé F9-3-1.

Un décompte de l’ensemble des noyaux formant ces groupements mène à une formule brute

partielle de C15H20O4. Comme cette molécule ne comporte que 15 atomes de carbone, cela

suppose qu’ils sont tous engagés dans le squelette sesquiterpénique, par conséquent, les deux

groupements CH2 et CH oxygénés précedemment signalés, sont porteurs de groupements

hydroxyles. Cette observation mène à une molécule de formule brute totale C15H22O4

comportant 5 insaturations. Comme elle comporte une fonction lactone et deux doubles

liaisons, il en résulte que cette lactone sesquiterpénique admet un squelette monocyclique.

L’éxamen du spectre RMN 1H (Spectre 5) montre un singulet d’intégration 3H à δ =1,05

ppm, cette donnée ajoutée à la présence du carbone quaternaire à δ = 40,2 ppm, oriente vers

une structure portant un méthyle angulaire. Comme il s’agit d’un squelette sesquiterpénique

monocyclique, il ne peut être que de type élémanolide. Cette hypothèse est confortée par la

présence d’un CH éthylénique résonant sous forme d’un doublet de doublets (J = 18,0, 9,0

Hz) à δ = 5,76 ppm (δC = 146,2 ppm) attribuable à H-1, la presence d’un CH2 (δC =109,8

ppm) éthylénique résonant sous forme de deux doublets larges, le premier à δ = 4,91 ppm (J

= 9,0 Hz); le second à δ = 4,87 ppm (J = 18,0 Hz). Ces deux noyaux montrant un couplage

cis et un couplage trans avec le CH éthylénique précédent sont attribuable à H-2 et H-2’

C-6C-8

C-5

C-7

C-11 C-1


60

respectivement. Le squellette élémane est également apuyé par la présence du groupement

CH2 (δC =110,2 ppm) résonant sous forme de deux singulets larges à δ = 5,29 ppm et

δ = 4,72 ppm attribuables à H-3 et H-3’. Ce spectre montre également un triplet à δ = 4,30

ppm (J = 12,0 Hz) attribuable au CH de fermeture de la γ-lactone (δC = 77,7 ppm). La

multiplicité de ce signal permet son attribution à H-6 et mène par conséquent à une lactone

sesquiterpénique de type élémanolide fermée en C-6. Par ailleurs ce spectre montre un

système AB à δ = 3,96 et 3,92 ppm (J = 15,0 Hz) attribuable, vu la multiplicité, à H-15 et

H-15’ respectivement, la valeur des déplacements chimiques de ces noyaux confirment bien

la présence d’un groupement hydroxyle en C-15. Le fait que cette lactone soit de type

élémanolide permet l’attribution du doublet à δ = 2,21 ppm (J = 12,0 Hz) à H-5, le doublet à

δ =1,24 ppm (J = 6,0 Hz) à H-13, le doublet de quadruplets à δ = 2,63 ppm (J = 15,0; 6,0 Hz)

à H-11, le multiplet à δ =1,64 ppm à H-7. A ce stade de notre étude structurale, il ne reste

plus qu’à placer le 2ème groupement hydroxyle, lequel ne peut être qu’en position C-8 ou en

position C-9.

En effet, toujours sur le spectre de RMN 1H, on relève un signal sous forme de triplet à

δ = 1,55 ppm (J = 12,0 Hz) partiellement recouvert par un autre signal sous forme de doublet

large à δ = 1,49 ppm (J = 12,0 Hz). Les multiplicités et les valeurs des constantes de

couplage dans ces signaux supposent une interaction de couplage géminal et une interaction

de couplage vicinal de type axial-axial dans le premier signal et une interaction de couplage

géminal et une interaction de couplage vicinal de type équatorial-axial dans le second signal.

Ces conditions ne peuvent être satisfaites que si le groupement OH est en position C-8 .Par

conséquent le premier signal est attribué à H-9 axial ou H-9α et le second signal est attribué à

H-9 équatorial ou Η−9β.


61

Spectre 5: RMN 1H (MeOH-d4, 300 MHz) du composé F9-3-1.

Spectre 5-1: RMN 1H (MeOH-d4, 300 MHz) du composé F9-3-1 (Etalement).

H-1

H-3

H-14

H-13

H-5 H-7 H-9α

H-9β


62



H-3’

H-6

H-11

H-15 H-15’

H-8 H-5

H-2 H-2’


63

La combinaison de l’ensemble de ces données mène à la formule partiellement plane reportée

dans le schéma 29.

O

O

OH2

1

34

56 7

89

10

14

1113

12CH2OH15

Schéma 29: Structure partiellemnt plane du composé F9-3-1.

Cette molécule renferme 6 centres asymétriques qui sont: C-10, C-5, C-6, C-7, C-8, et C-11.

- La stéréochimie de C-10 est déduite de la valeur du déplacement chimique du CH3-14 qui lui

confère une orientation β.

− La stéréochimie de C-5, C-6 et C-7 est déduite des valeurs des constantes de couplage relevées

dans les signaux de H-5, H-6 qui montrent des interactions trans diaxiales entre H-5, H-6 et H-6,

H-7. Ceci confère des orientations α pour H-5, β pour H-6 et α pour H-7.

− La stéréochimie de C-8 est déduite de la valeur de la constante de couplage relevée dans le

signal de H-9 axial (orientation α) qui montre une interaction de couplage vicinal de type axial-

axial, orientant ainsi vers une stéréochimie β−H-8.

- La stéréochimie de C-11 est déduite du signal de H-11 (dq, J = 15,0; 6,0 Hz), où il apparait

clairement que H-11 et H-7 admettent une disposition trans, orientant ainsi vers une stéréochimie

β-H-11.

Ces dernières informations mènent à la structure finale du composé F9-3-1 reportée dans le

schéma 30 , elle est connue sous le non de melitensine et a été isolée et décrite de Centaurea

melitensis [117 ] et de Centaurea nicaeensis All [115].


64

L’ensemble des données spectroscopiques de ce composé est reporté dans les tableaux 13 et 14.

O

O

OH2

1

34

56 7

89

10

14

1112CH2OH15

H

H

CH3

Schéma 30: Structure finale du composé F9-3-1, La melitensine.

H Multiplicité J (Hz) δ(ppm)

1

2’

2

3’

3

5

6

7

8

9α

9β

11

13

14

15’

15

dd

d

d

s

s

d

t

m

m

t

dl

dq

d

s

d

d

18.0 ;9.0

18.0

9.0

/

/

12.0

12.0

/

/

12.0

12.0

15.0; 6.0

6.0

/

15.0

15.0

5.76

4.87

4.91

4.72

5.29

2.21

4.30

1.74

3.83

1.55

1.49

2.63

1.24

1.05

3.92

3.96

Tableau 13: Résultats RMN 1H (MeOH-d4, 300 MHz) du composé F9-3-1.


65

C δ(ppm)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

146.2

109.8

110.2

143.9

57.2

77.7

49.4

66.6

47.8

40.2

39.9

179.0

12.2

16.8

64.3

Tableau 14: Résultats RMN 13 C (MeOH-d4, 300 MHz) du composé F9-3-1.


66

IV-2-Identification du produit F10-1:

La fluorescence noir-violette de ce produit sous la lumière ultra-violette (365nm) est

caractéristique d’une flavone ou d’un flavonol substitué en position 3.

Le comportement chromatographique indiqué par les valeurs du Rf dans les deux systèmes SI et

SII indique que le composé est un aglycone

SI : Toluène / Méthanol / Méthyléthylcétone (4:3:3)

SII : H2O / MeOH / Méthyléthylcétone / Acétylacétone (13:3:3:1)

La fluorescence noir-violette et la valeur de la longueur d’onde d’absorption maximale de la

bande I dans le méthanol (λ = 365 nm), sur le spectre UV (Spectre 6) sont caractéristiques d’une

flavone.

L’effet bathochrome de la bande I (+55 nm) après addition de NaOH par rapport au spectre

méthanolique avec une augmentation de l’intensité d’absorbtion, oriente vers la présence d’un

OH libre en position 4’. L’apparition d’une nouvelle bande à λmax = 327 nm indique la présence

d’un OH libre en position 7. Ceci est confirmé par l’effet bathochrome de la bande II (∆λ = +6

nm) par rapport au spectre pris dans le MeOH observé sur le spectre après addition de NaOAc.

La comparaison du spectre enregistré en présence de HCl +AlCl3 par rapport au spectre dans le

MeOH montre un effet bathochrome de la bande I (∆λ = +38 nm) indiquant la présence d’un OH

libre en position 5.

Aucun effet bathochrome de la bande I n’est observé après addition de H3BO3 en présence de

NaOAc par rapport au spectre dans le méthanol, ce qui indique l’absence de systèmes ortho di-

OH sur le noyau A et le noyau B. Cette hypothèse est confirmée par l’étude du spectre en

présence de AlCl3 dont les longueurs d’onde d’absorption maximale restent inchangées après

addition de HCl.

Systèmes SI SII

Rf 0,55 0,03


67

Ces résultats rassemblés dans le tableau 15 mènent à la structure partielle reportée dans le

schéma 31 avec R1, R2, R3, R4, R5 et R6 différents de OH.

O

OH

R4

R6

R5

R3

R1

R2

HO

OH O

H

2

34

5

6

7

8

2'3'

4'

5'

6'

Schéma 31: Structure partielle du composé F10-1

.

250 300 350 400 450 500 5500,0

0,2

0,4

0,6

0,8

F10+ MeOH

Abso

rban

ce

Longueur d'onde (nm)

250 300 350 400 4500,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

F10+MeOHF10+MeOH+NaOHF10+MeOH+NaOH+5mn

Abs

orba

nce


250 300 350 400 4500,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

F10+MeOHF10+MeOH+AlCl3F10+MeOH+AlCl3+HCl

Abso

rban

ce

Longueur d'onde (nm)250 300 350 400 450

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

F10+MeOHF10+MeOH+NaOAcF10+MeOH+NaOAc+H3BO3

Abs

orba

nce


Spectre 6 : Série spectrale UV du composé F10-1.


68

Réactifs Bande I Autres bandes Bande II

MeOH 338 / 269

NaOH 393 327 275

AlCl 3 380 350 302 275

AlCl 3+ HCl 376 342 300 277

NaOAc 366 300 275

NaOAc+H3BO3 341 / 270

Spectre stable avec NaOH après 5min

Tableau 15: Données de la série spectrale UV(λmax nm) du composé F10-1.

L’examen du spectre proton (Spectre 7) montre la présence de deux doublets (J = 6,9 Hz)

d’intégration 2H chacun, caractéristiques d’un noyau B oxygéné en position 4'. Le premier à

δ=7,96 ppm est attribué aux noyaux H2' et H6'; le second à δ = 7,04 ppm est attribué aux noyaux

H3' et H5' [118].

Ce spectre renferme également un signal sous forme de singulet à δ = 6,64 ppm, attribuable au

proton en position C-3 et deux autres doublets formant un système AM (J = 2,1 Hz) à δ = 6,55

ppm et δ= 6,26 ppm, attribuables à H8 et H6 respectivement.

Ces données consignées dans le tableau 16 mènent à la structure finale reportée dans le schéma

32 soit la 4',5,7-trihydroxy flavone, connue sous le nom d’apigénine. Cette molécule est

commune pour le genre Centaurea (Compositae) [37,119].


69

O

OH

H

H

H

H

H

H

HO

OH O

H

2

34

5

6

7

8

2'3'

4'

5'

6'

Schéma 32: Structure finale du composé F10-1 (Apigénine).

δ(ppm) Intégration Multiplicité J (Hz) Attribution

7 ,96 2H d 6,9 H-2’ ; H-6’

7,04 2H d 6,9 H-3’ ; H-5’

6,64 1H s / H-3

6,55 1H d 2,1 H-8

6,26 1H d 2,1 H-6

Tableau 16: Données de la RMN (Acétone-d6, 250 MHz) du composé F10-1.


70

Spectre 7: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 250 MHz) du composé F10-1.


71

Spectre 7-1: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 250 MHz) du composé F10-1 (Etalement).

H-2’, H-6’ H-3’ , H-5’ H-3

H-8 H-6


72

IV-3- Identification du produit F16-1 :

Le spectre de masse en mode ESI positif à haute résolution de ce composé (Spectre 8), donne un

pic quasimoléculaire de masse exacte 483,0894 Da correspondant à la formule brute

C22H20O11Na (calculée 483.09033). Ce résultat mène à une molécule de formule brute

C22H20O11, de masse 460 Da, comportant 13 insaturations.

.

Spectre 8: Spectre SMHR ESI du composé F16-1.


73

La fluorescence sous la lumière UV (365 nm) de ce composé est noir-violette, indiquant une

structure de type flavone ou flavonol substitué en position 3.

L’examen du spectre de RMN 1H (Spectre 9) montre la présence de:

- Un singulet à δ = 13, 02 ppm, attribuable à un OH en C-5

- Deux doublets d'intégration 1H chacun, formant un système AM à δ = 6,82 ppm et δ = 6,46

ppm, (J = 2,2 Hz) caractéristiques des protons H-8 et H-6 respectivement, du noyau A d’un

flavonoïde.


ppm, (J = 8,9 Hz) attribuables à H-2’, H-6’ et à H-3’, H-5’ respectivement, indiquant ainsi une

oxygénation du noyau B en position 4’ d’un flavonoïde.

- un signal à δ = 6,70 ppm, d'intégration 1H sous forme d'un singulet attribuable au H-3, ce qui

oriente vers la structure d'une flavone.

- Un doublet à δ = 5,36 ppm (J = 7,4 Hz), attribuable au proton anomérique d’un sucre relié à

l’aglycone, d’après la valeur de son déplacement chimique, par un pont oxygène. D’après la

valeur de la constante de couplage de ce proton anomérique avec son voisin en C-2’’, cette entité

pourrait dériver soit d’un glucosyle soit d’un galactosyle avec une configuration β du carbone

anomérique.

L’ensemble de ces données mène à la structure partielle reportée dans le schéma 33 qui est un

hétéroside ayant comme génine l’apigénine.

O

O

H

H HH

H

HH O-sucre

OH

OH

(Sucre-O)

(OH)1

2

356

2'

6'

4'

Schéma 33: Structure partielle du composé F16-1.


74

Ce spectre montre également:

- Un singulet à δ = 3,73 ppm, attribuable à un groupement methoxyle.

- Trois doublets d’intégration 1H chacun à δ = 4,89 ppm (J = 4,0 Hz), δ = 4,65 ppm (J = 4,8 Hz)

et δ = 4,58 ppm (J = 4,0 Hz). Les valeurs des constantes de couplage de ces noyaux sont

caractéristiques de couplages vicinaux de protons de groupements hydroxyles avec des

groupements CH. Ces observations orientent vers la présence de trois groupements hydroxyles

dans l’entité sucre. Cette hypothèse est appuyée par la présence d’un triplet de doublets

d’intégration 1H à δ = 3,63 ppm (J = 8,9; 4,0 Hz) et de deux doublets de doublets dédoublés à δ

= 3,58 ppm (J = 8,9; 7,4; 4,0 Hz) et à δ = 3,72 ppm (J = 9,6; 8,9 ; 4,8 Hz), ce dernier signal se

trouve partiellement recouvert par celui du methoxyle précédemment signalé. D’après les valeurs

des constantes de couplage de ces noyaux, il apparait clairement que ces signaux sont

attribuables aux trois protons des trois groupements CH porteurs des trois hydroxyles.

- Un doublet à δ = 4,27 ppm, J = 9,6 Hz, d’intégration 1H. D’après les résultats précedents, ce

CH doit faire partie du cycle de l’entité sucre.

Spectre 9: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1.


75

H1 - CD3COCD3/TMS

H.L. F 16

produit d'extraction fourni parMme Fadila Benayachesolide blanc, ~0,9 mg

0.79

62

Inte

gral

13.0

199

13.0

155

(ppm)

13.00513.01013.01513.02013.02513.03013.035

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0


H1 - CD3COCD3/TMS

H.L. F16


2.00

40

Inte

gral

3210

.37

3194

.08

3191

.19

3189

.11

3184

.38

3182

.25

3179

.39

(ppm)

7.907.927.947.967.988.008.02

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Spectre 9-2: Spectre RMN1H (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1(Etalement).

H-2’ , H-6’

OH en C-5


76

H1 - CD3COCD3/TMS

H.L. F16


2.03

69

Inte

gral

2825

.63

2822

.72

2820

.63

2815

.88

2813

.80

2810

.87

(ppm)

7.007.027.047.067.087.10

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0


H1 - CD3COCD3/TMS

H.L. F 16


1.00

00

0.98

56

Inte

gral

2732

.34

2730

.42

2728

.21

2683

.45

2681

.88

(ppm)

6.686.706.726.746.766.786.806.826.846.86

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5


H-3’, H-5’

H-8

H-3


77

H1 - CD3COCD3/TMS

H.L. F16


0.97

00

Inte

gral

2587

.95

2586

.58

2584

.40

(ppm)

6.446.456.466.476.486.49-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6


H1 - CD3COCD3/TMS

H.L. F16


0.27

04

0.97

40

Inte

gral

2252

.89

2149

.71

2142

.36

2137

.16

(ppm)

5.305.355.405.455.505.555.605.655.70

0.0

0.5

1.0

1.5


H-6

H-1’’


78

H1 - CD3COCD3/TMS

H.L. F16


0.27

04

0.97

40

0.91

85

0.81

96

0.89

36

0.98

51

0.23

250.

1389

3.80

57

2.21

93

Inte

gral

5.63

04

5.37

255.

3542

5.34

12

4.89

034.

8801

4.65

274.

6407

4.58

714.

5772

4.28

294.

2589

3.81

273.

7756

3.72

80

3.63

613.

6258

3.61

453.

6049

3.59

703.

5884

3.57

83

(ppm)

3.54.04.55.05.5

0.0

0.5

1.0

1.5


H1 - CD3COCD3/TMS

H.L. F 16


0.91

85

0.81

96

0.08

97

0.89

36

Inte

gral

1956

.77

1952

.69

1861

.70

1856

.88

1851

.75

1846

.75

1835

.44

1831

.48

(ppm)

4.554.604.654.704.754.804.854.90

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


H-1’’ 3 groupements –OH du sucre

H-5’’

-OCH3

OH-4’’

OH-3’’

OH-2’’


79

H1 - CD3COCD3/TMS

H.L. F 16


0.98

51

0.04

53

0.05

95

0.05

57

Inte

gral

1713

.73

1704

.13

1699

.76

1690

.08

1680

.13

1679

.18

1673

.00

1672

.10

(ppm)

4.164.184.204.224.244.264.284.30

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4


H1 - CD3COCD3/TMS

H.L. F 16


0.23

25

0.13

89

3.80

57

Inte

gral

1525

.58

1510

.72

1502

.38

1497

.55

1497

.15

1491

.68

1490

.32

1489

.78

1489

.36

1488

.91

1488

.50

1488

.13

1484

.05

1483

.68

1479

.13

1478

.87

(ppm)

3.683.703.723.743.763.783.803.823.84

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


H-5’’

H-4’’


80

H1 - CD3COCD3/TMS

H.L. F16


3.80

57

2.21

93

1479

.13

1478

.87

1463

.83

1459

.74

1454

.91

1450

.79

1446

.26

1443

.33

1442

.89

1442

.45

1442

.07

1439

.25

1438

.77

1435

.84

1431

.80

1430

.26

1427

.12

1422

.96

1422

.63

1416

.89

(ppm)

3.543.563.583.603.623.643.663.683.70

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6


L’examen du spectre COSY (1H 1H) (Spectre 10) permet la localisation H-2’’du sucre (ddd) à

δ = 3,58 ppm (J = 8,9; 7,4 ; 4,0 Hz), grâce à sa corrélation avec le proton anomérique H-1’’.

Cette attribution de H-2’’ permet la localisation de OH-2’’ (d) à δ = 4,89 ppm (J = 4,0 Hz) et

H-3’’ (td) à δ = 3,63 ppm (J =8,9 ; 4,0 Hz). L’attribution de ce dernier noyau permet celle de

OH-3’’ (d) à δ = 4,58 ppm (J = 4,0 Hz) et celle H-4’’ (ddd) à δ = 3,72 ppm (J =9,6; 8,9 ; 4,8 Hz).

Toujours sur le même spectre, H-4’’ permet de localiser OH-4’’(d) à δ = 4,65 ppm (J = 4,8 Hz)

et montre une corrélation avec le noyau relatif au signal sous forme de doublet à δ = 4,27 ppm,

J = 9,6 Hz, d’intégration 1H. Ce noyau ne peut être que H-5’’ de l’entité sucre comme

précedemment signalé. La multiplicité de ce dernier signal suppose l’absence de protons en

position C-6’’ du sucre; la valeur de sa constante de couplage (9,6 Hz) indique une interaction de

type axiale-axiale entre ce noyau et son voisin H-4’’. Cette observation oriente vers une entité

sucre dérivée du glucose. Ceci est apuyé par les valeurs des constantes de couplage relevées dans

les signaux de H-3’’ et H-4’’.

H-3’’ H-2’’


81

Spectre 10: Spectre COSY (1H 1H) (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1.

Spectre 10-1 : Spectre COSY (1H 1H) (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).

H-1’’

OH-2’’

OH-4’’ OH-3’’ H-5’’

H-3’’ H-4’’ H-2’’

H-5’’,H-4’’

OH-3’’,H-3’’

OH-4’’,H-4’’

OH-2’’,H-2’’

H-1’’,H-2’’


82

Le spectre RMN 13C (Spectre 11) confirme la présence de ces éléménts et montre également un

carbone quaternaire à δ = 169,7 ppm. La valeur de son déplacement oriente vers un carbonyle

d’ester.

C13 - DÚc. total H1

CD3COCD3/TMS

H.L. F 16


206.

1769

206.

1683

206.

1598

206.

1512

206.

1426

206.

1340

206.

1250

183.

2986

169.

6854

165.

6055

163.

9160

163.

0607

162.

0925

158.

3751

129.

4051

123.

1799

116.

9330

106.

9407

104.

3692

101.

0616

100.

4049

95.6

051

76.9

538

76.4

821

74.2

424

72.5

697

55.4

990

52.4

559

30.4

216

30.2

293

30.0

366

29.8

443

29.6

520

29.4

598

29.2

670

0.00

01

(ppm)

0 50 100 150 200

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Spectre 11 : Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1 .


CD3COCD3/TMS

H.L. F 16


183.

2986

(ppm)

183.20183.30183.40

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

169.

6854

169.

1257

165.

6055

165.

0332

163.

9160

163.

0607

162.

0925

158.

3751

(ppm)

158160162164166168170-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Spectre 11-1: Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1(Etalement).

C-9

C-5

C-4’ C-7

C-2

C-6’’

C-4


83


CD3COCD3/TMS

H.L. F 16


129.

4051

123.

1799

120.

8301

116.

9330

(ppm)

116118120122124126128130

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Spectre 11-2 : Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1 (Etalement).


CD3COCD3/TMS

H.L. F16


76.9

538

76.4

821

74.2

424

72.5

697

(ppm)

72737475767778

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Spectre 11-3 : Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1(Etalement).

C-3’’ ,C-5’’

C-1’

C-2’ ;C-5’

C-4’’C-2’’

C-5’’

C-3’’


84


CD3COCD3/TMS

H.L. F 16


55.4

990

52.4

559

(ppm)

52.052.553.053.554.054.555.055.556.0

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

Spectre 11-4 : Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1(Etalement).

C13 - DEPT 135

CD3COCD3/TMS

H.L. F 16


104.

3689

101.

0560

100.

4025

95.6

021

78.2

174

76.9

514

76.4

807

74.2

414

72.5

707

(ppm)

70 75 80 85 90 95100105 -5

0

5

10

15

Spectre 11-5 : Spectre RMN 13C (Acétone-d6, 100 MHz) du composé F16-1 (Etalement).

OMe

C-4’’

C-2’’

C-5’’

C-3’’

C-8

C-6

C-1’’C-3


85

La présence du carbonyle d’ester est vérifiée par la présence d’une tache de corrélation sur le

spectre relatif à l’expérience HMBC (Spectre 12), entre le carbone de ce carbonyle et les protons

du groupement methoxyle précedemment signalé. Ce spectre (HMBC) montre également une

tache de corrélation entre le carbone de ce carbonyle et le proton H-5’’. Cette donnée permet

d’attribuer le carbone de ce carbonyle au C-6’’ de l’entité sucre qui est par conséquent est un

groupement 6-methyl glucuronyle. Toujours sur le spectre de l’expérience HMBC, le proton du

OH-5 permet la localisation de C-5 à δ = 162,1 ppm et le C-10 à δ = 106,9 ppm grâce aux trois

taches de corrélation observées entre ce noyau et les protons H-8, H-6 et H-3.

Les protons H-6 et H-8 montrent des taches de corrélation avec le carbone quaternaire oxygéné à

δ = 163,9 ppm, ce qui permet l'attribution de ce dernier au C-7. Par ailleurs et toujours sur le

même spectre, le proton H-8 montre une autre tache de corrélation avec le carbone à δ = 158,4

ppm qui ne peut être que C-9 et le proton H-3 mène à la localisation de C-1’ à δ = 123,2 ppm.

Cette attribution est confirmée par la corrélation observée entre ce noyau et les protons H-3’ et

H-5’, de même H-3, H-2’ et H-6’ permettent l’attribution de C-2 à δ = 165,6 ppm. Les protons

H-3’, H-5’, H-2’ et H-6’ mènent à la localisation de C-4’ à δ = 163,1 ppm.

Spectre 12: Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1.


86

Spectre 12-1: Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).

Spectre 12- 2 : Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).

C-5,H(OH en 5)

C-6’’,H(OMe) C-6’’, H-5’’

C-10, H-5

C-6, H-5


87

Spectre 12-3 : Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).

Spectre 12-4 : Spectre HMBC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).

C-1’ ,H-3C-1’ ,(H-3’,H-5’)

(C-3’, C- 5’),(H-3’,H-5’)

C-10,H-8

C-6,H-8

C-4’ ,(H-2’,H-6’)

C-2 ,(H-2’,H-6’)

C-4’ ,(H-3’,H-5’) C-9 , H-8

C-7, H-8C-2 ,H-3

C-4 ,H-3

C-7 ,H-6

C-8 ,H-6

C-5 ,H-6

C-10 ,H-3 C-10 ,H-6


88


Toujours sur le spectre de l’expérience HMBC, le proton anomérique du glucuronate de methyle

montre une tache de corrélation nette avec le carbone C-7 (δ = 163,9 ppm).


C-7, H-1’’

C-4’, (H-2’, H-6’)

C-2, ,(H-2’,H-6’)

(C-2’, C- 6’),(H-2’,H-6’)


89

La présence de cette corrélation entre le C-7 et le proton anomérique, indique de l’entité sucre est

placée en C-7, ce qui mène à la 7-(6’’-methylglucuronyl) apigénine reportée dans le schéma 34 .

Cette molécule est commune pour le genre Centaurea (Compositae) [27, 120].

O

O

OH

O

OH

O

OHOHOH

OO

CH3

Schéma 34: Structure du composé F16-1, 7-(6’’-methylglucuronyl) apigénine

L'examen du spectre HSQC (Spectre 13 ) permet de localiser C-2’ et C-6' à δ = 129,4 ppm, C-

3’et C-5' à δ = 116,9 ppm, C-3 à δ = 104,4 ppm, C-6 à δ = 100,4 ppm, C-8 à δ = 95,6 ppm, C-1"

à δ = 101,1 ppm, C-2’’ à δ = 74,2 ppm, C-3’’ à δ = 77,0 ppm, C-4’’ à δ = 72,6 ppm, C-5’’ à δ =

76,5 ppm et le carbone du groupement méthoxyle à δ = 52,5 ppm.

Spectre 13: Spectre HSQC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).

H-6’,H-2’ H-5’,H-3’


90

Spectre 13-1: Spectre HSQC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).

C-6

’,C-2

’ C

-5’,C

-3’

C-3

C-1

’’

C-8

C

-6

H-8H-3 H-6 H-1’’

H-3’ , H-5’ H-2’ , H-6’


91

Spectre 13-2: Spectre HSQC (Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1 (Etalement).

C-3

’’

C-5

’’C

-2’’

O

Me

C-4

’’

C-4’’- H-4’’

C-2’’- H-2’’

C-3’’- H-3’’

H-3’’ H-4’’ H-2’’

H-5’’

OMe


92

L’ensemble des données spectroscopiques de ce composé est reporté dans les tableaux 17 et 18.

δ( ppm) Multiplicité Intégration J (Hz) Attribution

13 ,02 s 1H / OH en C-5

7,96 d 2H 6 ,9 H-2’ ; H-6’

7,04 d 2H 6,9 H-3’ ; H-5’

6,82 d 1H 2,2 H-8

6,70 s 1H / H-3

6,46 d 1H 2,2 H-6

5,36 d 1H 7,4 H-1’’

4,27 d 1H 9,6 H-5’’

3,73 s 3H / -OCH3

4,89 d 1H 4,0 -OH2’’

4,65 d 1H 4,8 -OH4’’

4,58 d 1H 4,0 -OH3’’

3,63 td 1H 8,9 ; 4,0 H-3’’

3,58 ddd 1H 8,9 ; 7,4 ; 4,0 H-2’’

3,72 ddd 1H 9,6 ; 8,9 ; 4,8 H-4’’

Tableau 17 : Résultats RMN 1H (δ ppm, Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1.


93

C δ (ppm) 2 165,6

3 104,4

4 183,3

5 162,1

6 100,4 7 163,9 8 95,6 9 158,4 10 106,9 1’ 123,2

2’, 6’ 129,4 3’, 5’ 116,9

4’ 163,1 1’’ 101,1 2’’ 74,2 3’’ 77,0 4’’ 72,6 5’’ 76,5 6’’ 169,7

-OCH 3 52,5

Tableau 18 : Résultats RMN 13 C(δ ppm, Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1.


94

IV-4-Identification du produit F16-4 :

La fluorescence sous la lumière UV (365 nm) de ce composé est noir-violette, indiquant une

structure de type flavone ou flavonol substitué en position 3.

La comparaison du spectre de RMN 1H (500 MHz) enregistré dans l’acétone –d6 de ce produit

(Spectre 14) avec celui du produit F16-1 révèle qu’ils sont très similaires notament la présence des

signaux:

- Un singulet à δ = 13, 01 ppm, attribuable à un OH en C-5.


ppm, (J = 2,2 Hz) caractéristiques des protons H-8 et H-6 respectivement, du noyau A d’un

flavonoïde.


ppm, (J = 8,8 Hz) attribuables à H-2’, H-6’ et à H-3’, H-5’ respectivement, indiquant ainsi une

substitution para du noyau B oxygéné en position 4’ d’un flavonoïde.

- un signal à δ = 6,70 ppm, d'intégration 1H sous forme d'un singulet attribuable au H-3 , ce qui

oriente vers la structure d'une flavone.

L’ensemble de ces données relatives au noyau flavonique oriente vers une génine à squelette

apigénine.

La portion du spectre RMN 1H relative au sucre de F16-4 est également très similaire à celle de

F16-1. On y observe en effet:

- Un doublet à δ = 5,36 ppm (J = 7,4 Hz) d’intégration 1H, attribuable au proton

anomérique du sucre.

- Un doublet à δ = 4,26 ppm (J = 9,6 Hz) d’intégration 1H, attribuable au proton H-5’’.

- Un singulet d’intégration 3H à δ = 3,74 ppm supperposé avec le signal central d’un dd

d’intégration 1H (J = 9,6 ; 9,1 Hz). Ce singulet est attribuable au groupement methoxyle

du glucuronyle de methyle, le dd centré sur ce signal (δ = 3,74 ppm) est attribuable au

proton H-4’’ du sucre..


95

- Un triplet (J = 9,1 Hz) et un doublet de doublets (J = 9,1; 7,4 Hz) présentant un effet de

toit, à δ = 3,64 et δ = 3,59 ppm respectivement, attribuables d’après l’ensemble de ces

observations aux protons H-3’’ et H-2’’respectivement.

Ces données et surtout les valeurs des constantes de couplage sont un faveur d’une entité sucre

de type 6’’-methylglucuronyle.

Spectre 14 : Spectre RMN1H (CD3CO CD3 , 500 MHz) du composé F16-4.

OH

en 5


96

Spectre 14-1: Spectre RMN1H (CD3COCD3, 500 MHz) du composé F16-4 (Etalement).

L’examen simultané des spectres de RMN 13C (Spectre 15) et HSQC (Spectre 16) permet de

localiser aisemment les atomes de carbone du noyau flavonique à:

- δ = 182,4 ppm C-4

- δ = 128,5 ppm C-2’ et C-6’

- δ = 122,3 ppm C-3’ et C-5’

- δ = 103,5 ppm C-3

- δ = 99,6 ppm C-6

- δ = 94,7 ppm C-8

De même, ce spectre permet de localiser aisemment les atomes de carbone du groupement 6’’-

methylglucuronyle notamment:

- à δ = 100,2 ppm C-1’’

- à δ = 76,1ppm C-3’’

- à δ = 75,6 ppm C-5’’

H-2’ ,H-6’ H-3’ ,H-5’

H-1’’H-6

H-3

H-8 H-5’’

OMe


97

- à δ = 73, 4 ppm C-2’’

- à δ = 71,7 =ppm C-4’’

- à δ = 168,8 =ppm C-6’’

- à δ = 51,5 =ppm OCH3 en C-6’’

Spectre 15: Spectre RMN13C (CD3CO CD3 , 125 MHz) du composé F16-4.

Spectre15-1: Spectre RMN13C (CD3CO CD3 , 125 MHz) du composé F16-4 (Etalement).


98

Spectre 15-2: Spectre RMN13C (CD3CO CD3 , 125 MHz) du composé F16-4 (Etalement).

Spectre 16 : : Spectre HSQC (CD3CO CD3 , 400 MHz) du composé F16-4


99

L’ensemble de ces données oriente vers une structure de type apigénine portant un OH libre en

position C-5 et un groupement 6’’-methylglucuronyle en position C-7 ou en position C-4’.

Le chromatogramme (schéma 35) de la fraction F16 réalisé sur plaque analytique de gel de silice

éluée par le système CHCl3/MeOH (9:1), montre clairement la présence des deux produits F16-1

F16-4 à coté de deux autre produits minoritaires

Schéma 35: La fraction F16 éluée par le système CHCl3/MeOH (9:1)

Le fait que les Rf de ces deux produits soient différents indique que ces deux produits sont

différents. Comme il s’agit d’une apigénine comportant un OH libre en position C-5 dans les

deux cas et comme il a été montré sans aucune ambiguité que le composé F16-1 porte le

substituant 6’’-methylglucuronyle en C-7, le composé F16-4 est par conséquent la 4’-(6’’-

methylglucuronyl) apigénine.

La structure de ce composé et notamment la position de l’entité sucre sur le squelette flavonique

a été confirmée par l’analyse du spectre de l’expérience HMBC (Spectre 17) qui montre en effet,

une correlation entre les protons H-3’, H-5’ et H-2’, H-6’ et un carbone quaternaire à

δ = 161,2 ppm qui ne peut être que le C-4’. Par ailleurs ce spectre montre clairement une

corrélation nette entre ce carbone (C-4’) et le proton anomérique (δH = 4,26 :δC = 100,2). Ces

données confortent la structure de la 4’-(6’’-methylglucuronyl)apigénine reportée dans le schéma

36. Cette molécule est nouvelle et n’a par conséquent jamais été décrite dans la littérature.

Le spectre de l’expérience HMBC de ce prduit a également permis l’attribution des autres

carbones quaternaires notamment :


100

*C-2 à δC = 164,7 ppm grâce à sa corrélation avec H-2’, H-6’ et H-3.

*C-5 à δC = 162,2 ppm grâce à sa corrélation avec H-6.

* C-7 à δC = 163,0 ppm grâce à sa corrélation avec H-8.

* C-9 à δC = 157,5 ppm grâce à sa corrélation avec H-8.

*C-1’ à δC =122,3 grâce à sa corrélation avec H-3’, H-5’ et H-3.

*C-10 à δC = 106,1 grâce à sa corrélation avec H-6, H-8 et H-3.

O

OOH

OH

O OOHOH

O

OH O CH3

27

3

4'

1'

5

1''6''

Schéma 36: Structure finale du composé F16-4, la 4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine .

Spectre 17 : : Spectre HMBC (CD3CO CD3 , 400 MHz) du composé F16-4


101

Les données de RMN 1H et 13C sont reportées dans les tableaux 19 et 20.

δ( ppm) Multiplicité Intégration J (Hz) Attribution

13 ,01 s 1H / OH en C-5

7,96 d 2H 8 ,8 H-2’ ; H-6’

7,05 d 2H 8,8 H-3’ ; H-5’

6,82 d 1H 2,2 H-8

6,70 s 1H / H-3

6,47 d 1H 2,2 H-6

5,36 d 1H 7,4 H-1’’

4,26 d 1H 9,6 H-5’’

3,73 s 3H / -OCH3

3,64 t 1H 9.1 H-3’’

3,59 dd 1H 9,1 ; 7,4 H-2’’

3,74 dd 1H 9,6 ; 9,1 H-4’’

Tableau 19: Résultats RMN 1H (δ ppm, Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-4.


102

C δ (ppm) 2 164,7 3 103,5 4 182,4 5 162,2 6 99,6 7 163,0 8 94,7 9 157,5 10 106,1 1’ 122,3

2’ , 6’ 128,5 3’, 5’ 122,3

4’ 161,2 1’’ 100,2 2’’ 73,4 3’’ 76,1 4’’ 71,7 5’’ 75,6 6’’ 168,8

-OCH 3 51,5

Tableau 20 : Résultats RMN 13 C(δ ppm, Acétone-d6, 400 MHz) du composé F16-1


103

IV-5-Identification du produit F17-2:

L’examen du spectre RMN 1H (Spectre 18 ) montre la présence de signaux caractéristiques d’un

noyau aromatique monosubstitué dont : un signal d’integration 3H sous forme d’un multiplet à

δ = 7,45 ppm et un autre d’integration 2H sous forme également, d’un multiplet à δ = 7,60 ppm.

Le même spectre montre un ensemble de signaux caractéristiques d’un hexose notamment le

signal à δ = 4,27 ppm sous forme d’un doublet (J = 7,5 Hz) attribuable au proton anomérique

(H-1’) de l’hexose.

Deux signaux d’integration 1H chacun attribuables respectivement à H-6’a, H-6’b à δ = 3,92

ppm (dd, J = 12,0; 1,8 Hz) et δ = 3,72 ppm (dd, J = 11,7; 6,0 Hz).

-Un signal d’intégration 1H sous forme d’un singulet à δ =5,92 ppm, porté d’après le spectre

HSQC (spectre 19) par le carbone à δC = 67,5 ppm.

Un ensemble de multiplets dans l’intervalle 3,30 – 3,36 ppm attribuable aux protons 2’, 3’, 4’,5’

du substituant sucre.

Spectre 18 : Spectre RMN1H (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 .

H-2


104

Spectre 18-1: Spectre RMN1H (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 (étalement).

Spectre 18-2 : Spectre RMN1H (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 (étalement).

2H du noyau aromatique

3H du noyau aromatique

H-1’H-6’a H-6’b

Protons du sucre


105

L’examen du spectre de l’expérience HSQC (Spectre 19) relatif à ce composé permet de

localiser le carbone anomérique de ce sucre grâce à sa corrélation avec H-1’à δC = 101,0 ppm. La

valeur de ce déplacement chimique indique que cet hexose est relié à l’aglycone par une jonction

oxygène.

Spectre 19 : Spectre HSQC (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2.

La combinaison des analyses des spectres RMN 13C (Spectre 20) et DEPT 135 (Spectre 21)

montre la présence dans cette molécule de:

-5 groupements méthynes (CH) dont quatre d’entre eux à: δC =77,3; 76,8; 73,8;70,5 ppm, le 5ème

étant le carbone anomérique à δC =101,0 ppm.

-Un groupement méthylène (CH2) oxygéné à δC =61,8 ppm

Ces données notamment les valeurs des déplacements chimiques des carbones comparées à

celles de la littérature orientent vers un substituant de type glucosyle [72].

H-1’

C-1’


106

Les mêmes spectres montrent également la présence de:

- 1 atome de carbone quaternaire à δC = 133,8 ppm attribué à un carbone du noyau

aromatique.

- 3 groupements CH, correspondant aux autres carbones du noyau aromatique

monosubstitué notamment les C-4 et C-8 à δ = 128,0 ppm, les C-5 et C-7 à

δ = 129,2 ppm et le C-6 à δ =130,1 ppm.

Ce spectre montre également un signal correspondant à un carbone quaternaire à

δ =118,5 ppm. Le déplacement chimique de ce carbone est caractéristique du carbone d’un

groupement nitrile. La présence de ce groupement justifie l’abaissement du déplacement

chimique du groupement CH oxygéné à δ= 67,5 ppm explicable par la proximité de ce noyau

de la zone positivante de la triple liaison.de ce groupement nitrile.

L’ensemble de ces données reporté dans les tableaux 21 et 22 mène à la structure plane

reportée dans le schéma 37.

CH

CN

O-Glu

Schéma 37: Structure plane du composé F17-2


107

Spectre 20 : Spectre RMM 13C (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2.

Spectre 21-1 : Spectre DEPT 135 (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 (étalement).

C-1’

C-6’

C-1

C-3 C-2


108

Spectre 21-2: Spectre RMN 13C, DEPT 135 (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 (étalement).

Spectre 21-3 : DEPT 135 (CDCl 3, 300MHz) du composé F17-2 (étalement).

C-2 C-4’ C-2’

C-3’ C-5’

C-4 ,C-8 C-5 ,C-7

C-6

C-6’


109

La comparaison de nos données à celles de la littérature à permis d’établir la stéréochimie (R) du

centre asymétrique de cette molécule. En effet nos résultats sont en parfait accord avec ceux

d’une molécule naturelle isolée de Centaurea Aspera var. Subinermis [121], de Perilla

Frutescens var. Acuta [122] et d’Eucalyptus L’Hérit [123] connue sous le nom de prunasine et

reportée dans le schéma 38.

N

O

OHOHOH

HOCH2

HO

Schéma 38: Structure finale du composé F17-2 , la prunasine

1H δ (ppm) Multiplicite Integration Ј (Hz)

H-1’ 4 ,27 d 1H 7,5

H-6’a 3,92 dd 1H 12,0 ; 1,8

H-6’b 3 ;72 dd 1H 11,7 ; 6,0

H-2’, H-3’ ,H- 4’, H-5’ 3,30-3,36 m 4H /

H-4 , H-8 7,60 m 2H /

H-5, H-6, H-7 7.45 m 3H /

H-2 5.92 s 1H /

Tableau 21:Les résultats RMN1H du composé F17-2


110

13C δ(ppm)

1

2

3

4, 8

5 ,7

6

1’

2’

3’

4’

5’

6’

118,5

67,5

133,8

128,0

129,2

130,1

101.0

73, 8

76,8

70,5

77,3

61,8

Tableau 22:Les résultats RMN 13C du composé F17-2

IV-6-Conclusion :

Ainsi cette étude phytochimique, que nous avons menée sur l’isolement et la détermination des

métabolites secondaires de la phase acétate d’éthyle de l’extrait hydroéthanolique des parties

aériennes de Centaurea nicaeensis sous espèce walliana M a permis l’obtention et la

détermination structurale de cinq composés natifs qui sont:

Une flavone aglycone, l’apigénine

Deux flavones glycosylées: la 7-(6’’-methylglucuronyl) apigénine et la 4’-

(6’’-methylglucuronyl) apigénine

Une lactone sesquiterpénique de type élémanolide: la melitensine

Un composé cyanogénique: la prunasine

Il est important de signaler que la 4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine est nouvelle et que nous

la décrivons pour la première fois dans la littérature. Une publication internationale reportant ces

résultats est en cours de soumission.

111

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Conclusion générale

Le but principal de notre travail est d’isoler et d’identifier les métabolites secondaires de la

phase acétate d’éthyle l’extrait hydroéthanolique de Centaurea nicaeensis variété walliana M

(Compositae). L’attention que nous avons donnée à cette plante est justifiée par le fait qu’elle

appartient au genre Centaurea, genre connu pour sa richesse en composés phénoliques

notamment les flavonoïdes, et les lactones sesquiterpéniques dont les activités biologiques

sont reconnues.

Cette étude complète les résultats préalables réalisés sur la phase chloroforme de cette

espèce.

Après extraction du matériel végétal suivi d’affrontements par des solvants de polarité

croissante (chloroforme, acétate d’éthyle, n-butanol), nos travaux de séparation et de

purification par des méthodes chromatographiques ont permis, l’isolement en l’état natif de 5

produits. Il s’agit de :

- Une flavone aglycone, l’apigénine

- Deux flavones glycosylées : la 7-(6’’-methylglucuronyl) apigénine et la

4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine

- Une lactone sesquiterpénique de type élémanolide : la melitensine

- Un composé cyanogénique : la prunasine

Les structures ont été établies par la combinaison des résultats des analyses physico-

chimiques notamment ceux de la RMN mono et bidimensionnelle et de la spectrométrie

de masse à haute résolution en mode ESI.

Il est important de signaler que la 4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine est nouvelle et que

nous la décrivons pour la première fois dans la littérature.

Résumé

Ce travail fait partie de notre programme de recherche qui porte sur l’étude phytochimique des

plantes du genre Centaurea (Compositae). Ces espèces réputées pour leur richesse en

métabolites secondaires bioactifs.

L’étude que nous avons entreprise constitue une contribution dans ce domaine et concerne la

détermination des lactones sesquiterpéniques et des flavonoïdes de la phase acétate d’éthyle de

l’extrait hydro alcoolique des parties aériennes de Centaurea nicaeensis var. walliana M et

complète les résultats obtenus au sein de notre laboratoire concernant l’investigation de la phase

chloroforme d’où deux composés flavoniques ont été déterminés.

Après extraction des feuilles et fleurs de cette espèce, concentration et affrontements successifs

au chloroforme, à l'acétate d'éthyle et au n-butanol, l’extrait acétate d’éthyle a été soumis à la

séparation et à la purification par chromatographie sur colonne et sur couches minces de gel de

silice. Ce travail a mené à l’obtention de 5 composés en l’état pur et natif. Il s’agit de :

- Une flavone aglycone, l’apigénine

- Deux flavones glycosylées : la 7-(6’’-methylglucuronyl) apigénine et la

4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine

- Une lactone sesquiterpénique de type élémanolide : la melitensine

- Un composé cyanogénique : la prunasine

Les structures ont été établies par la combinaison des données de RMN1H, RMN 13C, des

expériences de la RMN bidimensionnelle, de la spectrométrie de masse et de la

spectrophotométrie UV-Vis.

Il est important de signaler que la 4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine est une molécule nouvelle

et n’a par conséquent, jamais été décrite auparavant.

Summary This work belongs to our research program on the phytochemical study of Centaurea genus

(Compositae). The species of this genus, showed their wealth of bioactive secondary metabolites.

Our study, which concerns the isolation and the structural determination of sesquiterpene

lactones and flavonoids from the ethyl acetate soluble part of the aqueous-EtOH extract of the

aerial parts of Centaurea nicaeensis var. walliana M, constitute a contribution in this field and

supplement the results obtained in our laboratory from the chloroform soluble part which led to

the isolation and the structural establishment of two flavonoids.

After maceration of flowers and leaves of this plant, filtration, concentration and successive

extractions with chloroform, ethyl acetate and n-butanol, the ethyl acetate extract was submitted

to separation and purification by column and thin layer chromatography on silica gel 60.

This work led to the isolation in the native state of 5 compounds which were:

• A flavone : apigenin

• Two flavone glycosides : apigenin 7-(6’’-methylglucuronide) and

apigenin 4’-(6’’-methylglucuronide)

• A sesquiterpene lactone of elemanolide type-skeleton : melitensin

• A cyanogenic compound : prunasin

The structures were established by the combination of 1H NMR, 13C NMR, 2D NMR

experiments, mass spectrometry and UV-Vis spectroscopy data.

It is important to note, that apigenin 4’-(6’’-methylglucuronide) is new and then, was not

described elsewhere.

:ملخص

جنس سانتوريا من العائلة لنباتات ةيندرج هذا العمل ضمن برنامج بحث حول الدراسة الفيتوكيميائي .ذو الفعالية البيولوجية األيض الثانويب الغنيةالمركبة كويتربينية سالسي تهتم بتحديد المركبات الالكتونية التيالتي قمنا بها مساهمة في هذا المجال و اسةتعد الدر

Centaurea nicaeensis للمستخلص الكحولي لألجزاء الهوائية لـ اإليثيل خالت لطورو الفالفونيدية و المنجزة س النوع بالمستخلص الكلوروفورمي لنف الخاصةتكملة لنتائج سابقة و تعتبر هذه الدراسة

. ينيعلى مركبين فالفونيد من خاللها الحصولتم والتي بنفس المخبر متتالي بالكلوروفورم و الستخالص اإلالتركيز و ،ستخالص ألوراق و أزهار هذه النبتةبعد عملية اإل

و التنقية الفصل لعملياتاإليثيل خالتمستخلص أخضع. ثم بالبوتانول النظامييثيل اإل خالت .كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة التحضيريةبإستعمال العمود و الكروماتوغرافية

:نقية وهي مركباتخمسة سمحت هذه الدراسة الكروماتوغرافية بالحصول على apigénine: أجليكوني فالفونيد •

و apigénine (methylglucuronyl-’’6)-7: فالفونيدين جليكوزيديين • 4’-(6’’-methylglucuronyl) apigénine

melitensine: الكتون سيسكويتربيني من نوع إيليمانوليد •

prunasine: مركب سيانيدي •

التحليل البنيوي لهذه المركبات تم اعتمادا على تجميع معطيات أطياف الرنين النووي المغناطيسي لبروتون بالنسبة لمركبات .ثنائية البعد باإلضافة إلى مطيافية الكتلة النووي المغناطيسي و الكربون و أطياف الرنين

.المرئية -األشعة فوق البنفسجية ألطيافنا أيضا أالفالفونيدية لج

مركب جديد ولم يسبق التعرف عليه apigénine (methylglucuronyl-’’6)-’4من الجدير باإلشارة أن

.مسبقا

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Présenté pour obtenir le diplôme de Magister en Chimie ... · Remerciements Ce travail a été réalisé au laboratoire de Phytochimie et Analyses Physico-Chimiques et Biologiques,