Prevención y control de infecciones nosocomiales causadas por biofilms

microbianos

Dra. Beatriz Passerini de RossiCátedra de MicrobiologíaFFyB UBA

¿Qué son los biofilms?

Comunidades de microorganismos que crecenadheridos a una superficie abiótica o a un tejido,embebidos en una matriz de sustancias poliméricasextracelulares (EPS)

Nuevo “paradigma” de la microbiología:

Microorganismos sésiles, microorganismos que crecenadheridos a superficies, versus microorganismosplanctónicos, que crecen libres en medios líquidos

Etapas de la formación del biofilm

Adhesión reversible (características de lasuperficie: hidrofobicidad, carga, rugosidad )

Adhesión irreversible

Migración sobre la superficie y división celular paraformar pequeñas microcolonias dentro de unamatriz de EPS (exopolisacáridos, proteínas y ADN)

Maduración de las microcolonias. Arquitectura:canales que permiten el flujo de agua, oxígeno ynutrientes

Dispersión

Microscopía ópticaCristal violeta

Microscopía confocal (CLSM) SYTO9

OBSERVACION DE BIOFILMS

Imagen tridimensional

García C., Alcaraz E., Franco M., Passerini de Rossi B. 2015. “Iron is a signal forStenotrophomonas maltophilia biofilm formation, oxidative stress response, OMPsexpression, and virulence” Front. Microbiol. 6: 1-14.

Microscopía electrónica de barrido

Biofilm de S. epidermidis en la luz de un

catéter intravenoso

Biofilm formado en la luz de un catéter urinario

Biofilm en la superficie interna de un

endoscopio

Biofilms: factor de virulenciaInfecciones asociadas al uso

de productos médicosInfecciones crónicas

Biofilms: Infecciones asociadas a

productos médicos

Prótesis de cadera

Válvulas cardíacas

Catéteres vasculares centrales y

periféricos

Catéteres urinarios

INFECCION INTRAHOSPITALARIA

Instrumental y superficies

Máquinas de diálisis

Respiradores

Microorganismos de la misma especie

Comunicación intra-especie

Microorganismos de distintas especiesComunicación inter-especiesInclusive entre dominios Bacteria-Eukaria: Stenotrophomonas maltophilia-Candida albicans.

Passerini de Rossi B. et al. 2014. “Stenotrophomonas

maltophilia interferes via the DSF-mediated quorum

sensing system with Candida albicans filamentation and

with its planktonic and biofilm modes of growth”. Rev

Argent Microbiol 46: 288-297.

Quorum sensing

Quorum sensing

Mecanismo de comunicación célula-célulamediante el cual las bacterias regulan, en formaconcertada, la expresión de ciertos genes enrespuesta a la densidad celular.

El sistema de QS regula una amplia variedad de procesos:

formación de biofilmsproducción de otros factores de virulencia

QS: Se basa en la producción de moléculas señal difusibles o

autoinductores, cuya acumulación en el medio permite a las

bacterias censar la densidad poblacional y controlar

coordinadamente la expresión de ciertos genes

BIOFILMS: FACTOR DE VIRULENCIA

Estrategia de Resistencia frente a:

antimicrobianos de uso clínico y desinfectantes

mecanismos de defensa del hospedador

Los esquemas terapéuticos de control de las infeccionesagudas generalmente no son exitosos en las infeccionescausadas por biofilms ya que la sensibilidad aantimicrobianos de los mismos es hasta 1000 vecesmenor que la de su contraparte planctónica.

La resistencia a los antimicrobianos se asociageneralmente con cambios genéticos (adquisición degenes de resistencia o mutaciones). Sin embargo, laresistencia de los biofilms o recalcitrancia no depende decambios genotípicos, se trata de una resistencia fenotípicay por lo tanto, reversible al volver al modo planctónico.

Resistencia Fenotípica a Antimicrobianos

Resistencia Fenotípica: Fenómeno Multifactorial La matriz de EPS es una barrera física y química que previene la

penetración

Las bacterias presentes en las capas superficiales “absorben eldaño” y protegen a las situadas en el interior

La generación de gradientes de concentración de pH, oxígeno ynutrientes crea diferentes microambientes

La menor velocidad de crecimiento

La respuesta al estrés, aumento de actividad de bombas deeflujo

La mayor proporción de microorganismos persistentes, con muybaja actividad metabólica.

Susceptibilidad de los biofilms

Calgary Biofilm Device: CBD (pegs)

MBIC: Minimal Biofilm Inhibitory Concentration

MBEC: Minimal Biofilm EradicationConcentration

MRC: Minimal Regrowth Concentration

Ausencia de métodos estandarizados

de uso rutinario

SUSCEPTIBILIDAD A FLUOROQUINOLONAS DE BIOFILMS DE Stenotrophomonas maltophilia

Passerini de Rossi B., García C., Calenda M., Vay C., Franco M.2009. “Activity of levofloxacin and ciprofloxacin on biofilmsand planktonic cells of Stenotrophomonas maltophiliaisolates from patients with device-associated infections”.Int. J. Antimicrob. Agents 34: 260-264. ISSN 0924-8579.

TSA

TSBCultivo ON

TSB-108 UFC/ml

Incubar 24h

35ºC

Aspirar cultivos

Lavar:

eliminar células

planctónicas

Agregar MH-ATB

Incubar ON 35º

Aspirar y lavar

Agregar TSB Incubar

24h

MRC

MBIC

Minimal Regrowth Concentration: MRC

MRC: Minimal Regrowth Concentration

Aislamientos

de Sm

CIM CBM MBIC MRC

K279a 2 S 8 8 2048

g/ml g/ml g/ml g/ml

Sm9 16 R 32 ND ND

Sm10 0.25 S 0.5 1 256

Sm11 1 S 4 4 512

Sm13 1 S 4 4 1024

Sm14 0.5 S 2 2 512

Sm15 1 S 2 4 1024

Sm16 0.25 S 0.5 2 512

Sm17 1 S 2 4 256

Sm18 0.25 S 0.5 2 128

Sm19 1 S 4 2 1024

Sm20 1 S 2 2 1024

Sm26 1 S 4 2 256

Sm27 0.5 S 2 2 1024

Sm28 1 S 2 4 2048

Sm29 0.5 S 1 1 512

Sm30 8 R 16 ND ND

Sm31 1 S 2 4 1024

Sm32 4 I 16 ND ND

Sm33 0.5 S 1 4 1024

Sm34 0.5 S 2 2 1024

Sm35 0.5 S 1 2 1024

Sm36 0.5 S 2 2 512

Sm37 1 S 4 2 1024

Sm38 0.5 S 2 1 1024

Sm39 4 I 8 ND ND

Sm40 0.5 S 2 1 512

CONCLUSIONES

La sensibilidad de los biofilms fue de 100 a más de 1000veces menor que la de sus contrapartes planctónicas.Por lo tanto, los resultados de ensayos de sensibilidad a losantimicrobianos diseñados para bacterias planctónicas nodeben extrapolarse a biofilms.

Concentraciones de 128 – 1024 μg / ml de levofloxacina,correspondientes a la MRC de Biofilms de Sm, sólo puedenutilizarse en técnicas de sellado antibiótico (lock solutions).

Qué hacer frente al Desafío de la Resistencia de los Biofilms

Sellado antibiótico: lock solutions

Instilar en el interior del catéter una solución deanticoagulante (heparina o EDTA) y ATB en una concentraciónentre 100 y 1000 veces mayor a la CIM, durante al menos 8 hdiarias a lo largo de 10-14 días.

ATB más usados: Gentamicina, levofloxacina, cotrimoxazol, minociclina, teicoplanina y vancomicina.

Passerini de Rossi B, Feldman L, Saliba Pineda M, Vay C, Franco M. 2012.“Comparative in vitro efficacies of ethanol-, EDTA- and levofloxacin-based catheter lock solutions on eradication of Stenotrophomonasmaltophilia biofilms”. J Med Microbiol 61:1248-1253. ISSN 0022-2615.

Actividad de diferentes lock solutions sobre biofilms

de Sm13 formados en catéteres de silicona

Biofilms de

24hs

Control : Solución fisiológica

Etanol 25%

Etanol 25% + EDTA (30mg/ml)

Levofloxacina (2.5mg/ml)

EDTA (30 mg/l)

Levofloxacina + EDTA

1h, 3h y 24hLavar

Sonicar

Recuento de viables

Control (SF)

EDTA

Levo

Levo-EDTA

ETOH 25% o ETOH 25%-EDTA

Viabilidad de biofilms de Sm formados en catéteres de silicona

CONCLUSIONES

Etanol 25% y la combinación Etanol 25%-EDTA fueron las“lock solutions” más efectivas en la rápida erradicaciónde biofilms de Sm (1 h).

El EDTA es un quelante con actividad anticoagulanteequivalente a la de la heparina y tiene la ventaja deposeer actividad antimicrobiana. El uso de etanol en vezde antibióticos excluye la potencial selección debacterias altamente resistentes.

La combinación Etanol 25%-EDTA sería una alternativaútil para la prevención y tratamiento de infecciones porSm asociadas a catéteres intravasculares.

Estrategias preventivas para catéteres

Colocación del catéter: técnica aséptica

Manipulación hidrofobicidad del biomaterial (materiales

superhidrofóbicos)

Biomateriales con mejor perfil de biocompatibilidad,

flexibilidad y resistencia

Recubrimiento con biocidas y/o antimicrobianos (sales

de plata, nitrofurazona, minociclina, rifampicina, etc.)

PrevenciónLavado de manosUso de guantesDesinfectantes de un solo uso (monodosis)

Biofilms en catéteres vasculares

Estrategias preventivas para prótesis

Recubrimiento prótesis con materiales

biodegradables que incluyen antibióticos

(gentamicina)

Recubrimiento de prótesis con hidroxiapatita

(biomimético) con antibióticos (tetraciclina,

tobramicina, vancomicina)

Inclusión de antibióticos en el cemento.

Recubrimiento de prótesis vancomicina

Estrategias preventivas generales

Técnica aséptica, lavado de manos, guantes

Capacitación del personal

Remoción temprana de catéteres, evitar eluso innecesario

Política “racional” de uso de antibióticos

Correcta esterilización o desinfección deequipos

Pneumonia asociada a ventilación mecánica (VAP)

Biofilm en endoscopios

Prevención asociada a un correcto reprocesamiento “The sooner the better” Evitar el secado de la suciedad y

formación de biofilms. Prelavado en el lugar de uso (mantenerlohúmedo y comenzar a degradar la biocarga)

El correcto lavado con detergentes multienzimáticos (proteasas,lipasas , amilasas) determina la eficiencia del proceso dedescontaminación

- eliminar proteínas que serían fijadas por agentes químicos enlos canales

- eliminar microorganismos y biofilms

Biofilm en superficie interna de un endoscopio

https://www.slideshare.net/OneLifeBF/belgian-interdisciplinary-biofilm-

research-sept-2016

El correcto lavado determina la eficiencia del proceso de descontaminación

https://www.slideshare.net/OneLifeBF/belgian-interdisciplinary-biofilm-research-

sept-2016

Etapas críticas

Control de biofilms: una perspectiva compleja en desarrollo

Un nuevo concepto

Visión tradicional Drogas antipatogénicas

Blanco: Sistemas de QS

• Inhibidores de QS (QSI)

o quorum quenching (QQ)

Inactivación de autoinductores (AI):

lactonasas (Bacillus spp., Acinetobacter spp.) y acilasas

Análogos del AI que bloquean el receptor

Naturales

furanonas halogenadas (macroalga Delisea pulchra)

Patulina: Penicillium radicicola

Son productos tóxicos

Sintéticos

Inhibidores aislados del ajo, chile habanero, te verde, etc.

Inhibidores de Quorum Sensing

Análogos de Autoinductores

Análogo del AI

Agentes que promueven la dispersión

Enzimas que degradan la matriz:ProteasasDnasasGlicósido hidrolasas (alginato liasa, Dispersina B)

D aminoácidos (D-Leu, D-Met, D-Trp, D-Tyr)

Ciertos AI de QS (ácido Cis-2-decenoico)

Front Microbiol. 2016; 7: 825.

Uso de fagos o de sus proteínas (endolisina)

Fagos modificados por ingeniería genética que codifican dispersina B

Dispositivos médicos con nanopartículasmagnéticas. Desactivación térmica de biofilms

Muchas gracias