Upload
others
View
15
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
PROTEINY ( = BÍLKOVINY)
DNA → RNA → protein → modifikovaný protein
- více než 50 % buněčné sušiny organismů
-chemicky se jedná o biopolymery složené z jednoho nebo více
lineárních polypeptidových řetězců, obsahujících obvykle 100 až 2 000
aminokyselinových zbytků (kódovaných AK)
- není obecná klasifikace; lze je rozdělovat např. podle:
-specifické funkce
-chemického složení
-tvaru a rozpustnosti molekul
-lokalizace v organismu
Funkce
(rozmanité)
-strukturní
-obranná (protilátky)
-transportní
-zásobní
-katalytickou
-regulační
-pohybová (myosin a aktin ve svalových vláknech)
Chemické složení
• Jednoduché
• Složené - polypeptidová + neproteinová část
Složené:
• metaloproteiny
• fosfoproteiny
• glykoproteiny
• lipoproteiny
• nukleoproteiny
DĚLENÍ PODLE TVARU MOLEKULY
-globulární - albuminy (rozp. ve vodě)
- globuliny (rozp. v roztocích solí)
-fibrilární
-membránové
DĚLENÍ PODLE LOKLAIZACE V ORGANISMU
-intracelulární (vnitrobuněčné) a extracelulární (mimobuněčné)
-bílkoviny krevní plasmy (též plasmové, plasmatické nebo sérové
proteiny)
Vznik peptidové vazby
Zjednodušené schema – níže uvedená reakce takto neprobíhá Proč?
CH CNH3
+
R1
OO- CH CNH3
+
R2
OO-OO-+ CHNH
3
+C
R1 O
NH CH
R2
C
Polypeptidový řetězec (peptidy, proteiny)
DNA → RNA → protein → modifikovaný protein
Syntéza proteinů animace: http://www.youtube.com/watch?v=PEDQoQuIhkg
Úrovně struktur
-primární struktura - pořadí zbytků aminokyselinových zbytků v lineárním
polypeptidovém řetězci
-sekundární struktura popisuje prostorové vztahy sousedních nebo blízkých
aminokyselinových zbytků
-terciární struktura - prostorové vztahy vzdálených částí řetězce a tím i celkový
tvar molekuly
-kvarterní struktura popisuje vzájemné uspořádání více polypeptidových
řetězců; řada bílkovin není tvořena jediným řetězcem,
složeným do definované terciární struktury; často jde o
oligomery tvořené jedním nebo několika typy tzv.
podjednotek
Struktury bílkovin
Primární struktura bílkovin
( + kovalentní)
pořadí aminokyselinových zbytků v peptidovém řetězci
(kódováno v DNA)
1. Propojení řetězců kovalentními vazbami
2. Odštěpení částí řetězců
3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin
4. Připojení mastných kyselin
5. Glykosylace
6. Fosforylace (dočasné či trvalé)
7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory
enzymů...)
8. Metaloproteiny (koordinační kovalentní vazby různé síly)
1 - 3: jednoduché bílkoviny
4 - 8: složené bílkoviny
Kovalentní struktura bílkovin
(primární struktura + posttranslační modifikace)
>gi|307229470|ref|ZP_07515881.1| putative Cerebroside-sulfatase [Escherichia coli TA143] MQKTLMASLIGLAVCTGNAFNPVVAAETKQPNLVIIMADDLGYGDLATYGHQIVKTPNIDRLAQEGVKFTDYYAPAPLSSPSRAGLLTGRMPFRTGIRSWIPTGKDVALGRNELTIANLLKAQGYDTAMMGKLHLNAGGDRTDQPQAKDMGFDYSLVNTAGFVTDATLDNAKERPRFGMVYPTGWLRNGQPTPRSDKMSGEYVSSEVVNWLDNKKDSKPFFLYVAFTEVHSPLASPKKYLDMYSQYMSDYQKQHPDLFYGDWADKPWRGTGEYYANISYLDAQVGKVLDKIKAMGEEDNTIVIFTSDNGPVTREARKVYELNLAGETDGLRGRKDNLWEGGIRVPAIIKYGKHLPKGMVSDTPVYGLDWMPTLANMMNFKLPTDRTFDGESLVPVLENKALKREKPLIFGIDMPFQDDPTDEWAIRDGDWKMIIDRNNKPKYLYNLKTDRFETINQIGKNPDIEKQMYGKFLKYKADIDNDSLMKARGDK PEAVTWG
Lze pohlížet jako na text
URČOVÁNÍ CELKOVÉHO
AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ
AK1-AK2-AK3 ....AKn kyselá nebo bazická hydrolysa AK1 + AK2 + AK3 +....+ AKn
(určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny -
chromatografické dělení)
Určení N-koncové a C-koncové aminokyseliny
N-koncové:
– Sangerova metoda; reakce s DNF (viz reakce AK)
C-koncové:
-specifické enzymové štěpení (karboxypeptidasy)
-redukce -COOH LiBH4 na -OH, identifikace aminoalkoholu
Určování sekvence – Edmanovo odbourávání
- zbylý polypeptidový řetězec zůstane neporušen (rozdíl proti využití totální hydrolýzy
při Sangerově metodě – jen N-koncová AK); lze tedy opakovat a přímo „číst“ pořadí AK;
princip automatických sekvenátorů – až několik desítek AK
• Určení počtu polypeptidových řetězců v proteinu;
• Rozštěpení disulfidových vazeb mezi řetězci a uvnitř polypeptidových
řetězců;
• Izolace jednotlivých řetězců;
• Vícenásobné specifické štěpení polypeptidových řetězců na kratší
fragmenty;
• Určení pořadí aminokyselin v těchto fragmentech;
• Sestavení primární struktury polypeptidů;
• Určení původního propojení polypeptidových řetězců.
Pozn.
Možnost sekvenování peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie
Určování primární struktury
Určování primární stuktury
1. Nativní struktuře odpovídá minimum Gibbsovy energie, dané
výhodností nekovalentních interakcí.
2. Nativní struktura je zakódována v kovalentní struktuře.
3. Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích
s okolím.
4. Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické.
5. Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformační
dynamické systémy).
6. Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).
Prostorové uspořádání biopolymerů
(obecné znaky)
Stabilizace struktury bílkovin – nekovalentní interakce
Typ interakce
Příklad
*Vazebná energie
(kJ/mol)
vodíkové vazby: voda (led) -O-H...O= 17
„peptidové vazby“ (můstky H…O) =N-H...O=C 15
neutrální a nabitá skupina -COO-...HO-CH2- 15
elektrostatické interakce ion-ion -COO-...+H3N- 20-30
permanentní dipól - permanentní dipól | |
Cd+=Od-...Cd+=Od-
| |
2
Londonovy dispersní interakce mezi dvěma alifatickými
atomy C
0,11
patrové interakce mezi dvěma aromatickými
kruhy Phe
6
hydrofobní interakce
mezi dvěma methylovými
skupinami
1,2
mezi dvěma postranními
řetězci valinu
6
Hydrofobní interakce
- popisuje prostorové uspořádání sousedních nebo blízkých částí polypeptidového řetězce
Sekundární struktura
• konformace polypeptidového řetězce je definována torzními úhly vazby
Cα-N (φ) a vazby Cα- C (ψ) - hodnota těchto úhlů je definována jako 180° v případě, že je řetězec v rovinné, plně rozvinuté konformaci a klesá až k hodnotě –180° (přetočení „na druhou stranu“). Volná rotace je omezena sterickými zábranami mezi atomy vlastní kostry polypeptidového řetězce a sterickou náročností postranních řetězců aminokyselin; rotační úhly mohou tedy nabývat jen určitých hodnot
stereotypní opakování struktury –NH-CHR-CO-
=> tendence k tvorbě periodických prostorových struktur
Základní typy: α-šroubovice
β-struktury
α-šroubovice charakterizovány parametry: výškou závitu,
směrem otáčení (levotočivé a pravotočivé) a počtem
aminokyselinových zbytků nebo počtem atomů na jednu
otáčku šroubovice.
Sekundární struktury bílkovin
V proteinech časo - pravotočivá
šroubovice označovaná jako α-
helix, která je charakterizována
výškou závitu 0,54 nm a 3,6
aminokyselinového zbytku (resp.
11 atomy) na jeden závit
- stabilizován vnitrořetězcovými
vodíkovými můstky, které se
vytvářejí podél osy šroubovice
mezi nad sebou ležícími CO a
NH skupinami.
β-struktura - další časté periodické uspořádání polypeptidového řetězce
-bývá stabilizována propojením s antiparalelně (častěji) či paralelně probíhajícím
polypeptidovým řetězcem stejné konformace, s nímž je spojen maximálním možným
počtem meziřetězcových vodíkových můstků. Tak vznikají struktury zvané β-skládaný list
(angl. β-pleated sheet). Jejich plocha bývá různým způsobem zakřivena (tzv. twisted
sheet) nebo může tvořit válec (tzv. β-barrel)
Antiparalelní β-struktura polypeptidového řetězce
Periodické sekundární struktury – zastoupeny v proteinech různou měrou, od několika
procent až po desítky procent z celkové struktury. Mezi těmito útvary se řetězec otáčí
zpět, někdy až o 180º. Tyto ostré změny směru, umožněné určitými sekvencemi
aminokyselin, bývají označovány jako β-ohyby, (angl. β-bend nebo β-turn), protože
často propojují β-struktury. Jsou tvořeny čtyřmi aminokyselinovými zbytky, často se v
nich vyskytuje prolin a glycin. Jsou charakteristické pro globulární bílkoviny, zajišťují
jejich sférický tvar.
Supersekundární struktury např.: Zn-prst, Leu Zip
Alfa helixy v hemoglobinu
Terciární struktura proteinů
-popisuje uspořádání celého polypeptidového řetězce a
tedy i celkový tvar molekuly.
Terciární struktura myoglobinu
Kvarterní struktura
Příklady bílkovin s kvarterní strukturou
Bílkovina Rel.mol.hm.
oligomeru
Počet podjednotek Charakter, funkce
hemoglobin (lidský) 64 500 4 2 + 2 podjednotky dvou typů (a2b2 tetramer),
přenos kyslíku
α-amylasa (lidská) 97 600 2 identické podjednotky, enzym (hydrolytické
štěpení škrobu)
alkoholdehydrogenasa
(kvasinky)
150 000 4 identické podj., enzym (katalysuje redukci
acetaldehydu na ethanol)
ferritin (lidský) 480 000 20 skladování železitých iontů (až 4300 Fe3+)
glutaminsynthetasa
(E.coli)
592 000 12 enzym (synthesa Gln z Glu), kulovité
identické podj. tvoří 2 šestiúhelníky umístěné
nad sebou
pyruvátdekarboxylasa
(E.coli)
4 400 000 72 enzymový komplex, podjednotky 3 typů,
každá katalysuje jednu dílčí reakci (odd. 9.2)
hemocyanin (plži) 8 000 000 160 metalloprotein obsahující Cu2+; přenos O2;
dutý válec 40x40 nm
virus tabákové mozaiky 39 300 000 2130 helikálně uspořádané identické podj. (Mr 17
500) tvořící komplex s RNA
Svinování proteinů (folding)
- neprobíhá náhodným způsobem
- probíhá postupně
- při skládání některých proteinů, zejména bílkovin s
kvarterní strukturou, asistují v buňkách bílkoviny
označované jako chaperony
a) malé dočasné periodické struktury
b) supersekundární struktury
c) strukturní domény a "roztavená" glubule
d) závěrečné úpravy za účasti enzymů
Vlastnosti proteinů
• Nábojové vlastnosti
• Rozpustnost - v závislosti na pH, iontové síle
• Denaturace - ztráta nativní konformace
• Kooperativita (denaturační přechod)
•Optické
Rozpustnost proteinů - v závislosti iontové síle
Kooperativita -důsledky pro vlastnosti biopolymerů
Molekula reaguje na podněty z vnějšího prostředí jako celek; to znamená, že
konformační impuls, vyvolaný v jedné části molekuly, může vyvolat celý řetězec
následků, jež končí konformační změnou v jiné, prostorově vzdálené části molekuly
Sigmoidní charakter - náhlý přechod mezi nativním a denaturovaným stavem je
důsledkem kooperativity nativní struktury
-př. fosforylace enzymů
Absorpce UV záření:
-peptidová vazba (200 – 220 nm)
-aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm ( pro srov. DNA cca 260 nm)
OPTICKÉ VLASTNOSTI
Abs. spektra lidského sérového albuminu (1), lidského imunoglobulinu G (2) a DNA (3) v
ultrafialové oblasti. Koncentrace obou bílkovin je 1 mg/ml, koncentrace DNA 0,1 mg/ml
Keratiny (ř. keras roh) - významná skupina fibrilárních bílkovin; podílejí se na
výstavbě intermediárních filament cytoskeletu vlasů, chlupů, nehtů, rohů a
peří; nerozpustné ve vodě a odolné vůči fyzikálním i chemickým vlivům.
Hlavní skupina - α-keratiny - struktura je tvořena α -helixem; dvě tyto
šroubovice se pak stáčejí do levotočivého „kabelu“ (tzv. coiled-coil), jejichž
dvojice vytváří protofilamentum a osmice intermediární filamentum cytoskeletu
Vztah struktury a funkce vybraných proteinů
Imunoglobuliny (Ig) - globulární glykoproteiny krevního séra. Molekula
připomíná tvarem písmeno Y; na jeho horních ramenech jsou lokalizovány
oblasti, které nekovalentně váží antigeny; pro svojí velkou strukturní různorodost
se označují jako variabilní.
Svalové kontrakce - aktin, myosin a tropomyosin
Membránové proteiny
Hemoglobin
Kovalentní modifikace proteinů
aneb translací to nekončí
DNA → RNA → protein → modifikovaný protein
Mají modifikace podstatný význam pro funkci proteinů?
Ano. Nejedná se jen o „kosmetické“ změny
Známo více než 200 typů kovalentních modifikací (in vivo)
translací to nekončí
Čím jsou determinovány možné kovalentní
modifikace?
typem, pořadím a prostorovou lokalizací
aminokyselinových zbytků
aparátem enzymů realizujících modifikace
KOVALENTNÍ
MODIFIKACE (enzymové i neenzymové)
IN VIVO
IN VITRO
NEVRATNÉ
VRATNÉ
PŘIROZENÉ
UMĚLÉ
IN VITRO
VRATNÉ
1. Posttranslační modifikace
role v řadě různých buněčných procesů
svinování proteinů
stabilizace prostorové struktury proteinů
lokalizace proteinů v buňce
přenos signálu
exprese genů
regulace aktivity enzymů
mezibuněčné interakce
Příklady posttranslačních modifikací
Fosforylace vratná modifikace (kinasy / fosfatasy)
obvykle na –OH skupinách zbytků serinu,
threoninu, tyrosinu
významný regulační prvek:
aktivita řady enzymů aktivita glykogen fosforylasy je regulována
fosforylací na zbytku serinu v pozici 14
regulace transkripce
role při přenosu signálu
Regulace transkripce fosforylací
CREB (cAMP - responsive element binding protein) –
transkripční faktor
fosforylace na serin 133 → asociace s CBP; (CREB binding protein)
→ CREB –CBP komplex aktivuje CREB
dependentní transkripci mj. i remodelací
chromatinu acetylací histonů
Glykosylace
připojení sacharidů na proteiny - typické pro extracelulární a membránové proteiny
role glykosylace:
často nutná pro správné svinutí proteinu
stabilizace proteinu
regulace
rozpoznávání
molekulové
mezibuněčné
obrovská variabilita – řada míst glykosylace a každé z nich může být glykosylováno mnoha způsoby
Místa připojení sacharidů na protein
(N) přes asparagin; endoplasmatické retikulum (kotranslační); proteiny krevní plasmy, imunoglobuliny, řada enzymů
(O) přes serin /threonin; Golgi aparát; muciny, kolageny
(C) (přes tryptofan)
(P) (fosfothreonin, fosfoserin)
Mechanismus glykosylace na asparagin
dolichol
Regulace transkripce glykosylací
glykosylace CREBu „brzda“ transkripce - působí opačně než
fosforylace
modifikován serin a threonin
N- acetylglukosaminem
Lipidace - usnadňuje připojení proteinů na membrány, vzájemné
interakce proteinů
Prenylace - připojení farnesyl, dolichol nebo
geranylgeranyl zbytků; farnesylace u některých G proteinů
Acylace – připojení mastných kyselin (myristová, palmitová) přes ester, thioester nebo amid; rhodopsin palmitoylovaný na zbytku cysteinu
farnesylace
Modifikace proteinu jiným proteinem
- proteiny mohou být navázány (např. přes svůj C-konec) ke zbytkům
lysinu jiného proteinu
Ubiquitinylace - nejznámější modifikací tohoto typu
signál pro degradaci proteinu (např. chybně svinutý protein)
SUMOylace (SUMO: Small Ubiquitin-like Modifier) - role v
řadě buněčných procesů: transport mezi jádrem a cytosolem,
regulace transkripce, apoptosa, stabilizace proteinu, odpověď
na stres
Acetylace - obvyklá na N – koncích některých proteinů nebo zbytcích lysinu; N-terminální serin histonu H4 acetylován
Hydroxylace - konverze prolinu na hydroxyprolin v kolagenu katalyzovaná prolyl-4-hydroxylasou
Jodace - thyroglobulin jodován (na Tyr) při syntéze thyroxinu
Karboxylace - karboxylace prothrombinu (srážení krve) na zbytek Glu (účast vitaminu K)
Methylace - methylací mohou být modifikovány například histony; lysine 20 histonu H4 může být mono- nebo di- methylován
methylace
acetylace
Nukleotidylace - připojení mononukleotidu reguluje aktivitu některých
enzymů; utilizace dusíku v E. coli: glutamin synthetasa specificky
adenylována (kovalentní připojení AMP) na zbytku tyrosinu; adenylovaná
forma je inaktivní; stupeň adenylace je řízen regulačním proteinem PII
schopnost proteinu PII regulovat adenylaci glutamin synthetasy je
řízena jeho uridinylací (kovalentní připojení UMP) na zbytku
Sulfatace – různé typy (O-, S-, N-); na Tyr (protein – protein interakce)
Připojení prostetických skupin - hem (globin a cytochrom), FAD, biotin
Vytvoření disulfidových vazeb - typické pro extracelulární proteiny; formace disulfidových můstků - po
svinutí proteinu do (téměř) finální podoby
Aktivace zymogenů - odštěpením sekvence, která kryje jejich aktivní centrum - proteasy
(chymotrypsin, trypsin, trombin)
2. Enzymová modifikace (in vitro)
Defosforylace kaseinů ve zrajících
sýrech (fosfatasa)
vliv na štěpení a následně chuťové
vlastnosti sýrů; vstřebávání
vápníku
možnost ovlivnění procesu
(přídavek fosfatasy)
3. Neenzymové modifikace (in vivo i in
vitro)
Oxidativní poškození
působením volných radikálů ROS (reactive oxygen species)
vodíku (H2O2), peroxid vodíku, hydroxyl etc.; mohou vznikat produkty buněčného metabolismu např. superoxid z mitochondrie 2 O2
−. oxid dusnatý (NO), peroxonitrát (NO3
− ; vznik: H2O2 + NO2− → ONOO− + H2O),
oxidace methioninu (in vivo i in vitro) možnost enzymové opravy neenzymové modifikace
enzymem methioninsulfoxidreductasou - konverze
oxidovaných zbytků zpět na methionin
chlorotyrosin, nitrotyrosin a bityrosin v lipoproteinech artherosklerotického plaku
oxidace methioninu
Glykace
navázání molekuly cukru (např. glukosy nebo
fruktosy) na molekulu proteinu (in vitro i in vivo) na rozdíl od glykosylace není katalyzována enzymově
Příklady: in vitro - při tepelné úpravě pokrmů (při vyšších teplotách)
obsahujících jak proteiny, tak sacharidy
in vivo - glykace hemoglobinu - valin na N-konci; diagnostická aplikace
Kvantifikace proteinů s využitím kovalentních značek
ICAT (Isotope Coded Afinity Tags), kvantifikace/studium Cys
iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification)
Kovalentní imobilizace enzymů
možnost opakovaného použití
stabilizace enzymu
vyloučení kontaminace enzymem příp. jeho
autokatalytickými produkty (proteasy)
4. Umělé modifikace proteinů
Eupergit C
kopolymer vážící proteiny
přes oxiranové skupiny
reakcí s -NH2 s volnými
skupinami zbytků lysinu
více bodové kovalentní
připojení → stabilizace
vysoká stabilita při pH 1 až
12
penicilin amidasa na
Eupergitu C - 60% původní
aktivity po 800 cyklech
Význam kovalentních modifikací proteinů
pro funkci živých organismů (setkání s medvědem)
v potravinářství (výroba sýrů)
biotechnologie (kovalentní imobilizace enzymů)
diagnostické metody v medicíně (glykace)
proteomika (kvantifikace proteinů)