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Universidad Nacional de San Martín (UNSAM)
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB-INTECH)
Priorización y caracterización de moléculas
implicadas en la interacción de
Trypanosoma cruzi con el hospedador
Autor: Lic. Ignacio Miguel Durante
Tesis presentada para optar por el título de Doctor en Biología Molecular y
Biotecnología de la Universidad Nacional de San Martín
Director: Dr. Carlos Andrés Buscaglia
2016
A mis padres, por regalarme la vida.
A Mariela, por compartirla.
Agradecimientos
A mis padres, Vicente José Durante y Sara Melgar, por permitirme elegir libremente mi
camino, y educarme -con el ejemplo- en las máximas del amor al prójimo, la responsabilidad, el
estudio, el trabajo, el esfuerzo y la honestidad.
A mis hermanos, Santiago y María Cecilia Durante -en orden de aparición en el mundo-
por acompañarme siempre y compartir todo; por las sonrisas.
A Mariela Giberti, por el amor, la revisión del manuscrito y los cafecitos.
A mi “familia política”, Gustavo Giberti, Norma Fagnani, Karina Giberti, Darío
Valentino, Isabella y Stefano Valentino Giberti, por no portarse como tal.
A mis amigos, también en orden (aproximado) de aparición: Enzo De Bernardini,
Maximiliano Cetuné, Pedro Di Raimondo, Darío Dilernia, Natalia Ricardo, Facundo Schivo,
Valeria Bauni, Marisa Lía Taverna Porro, Silvina Rothacher, Leonardo y Cecilia Pronzolino
Yannino, Mariela Yannino, Soledad Aispuru, María Julia Scott, María Laura Laita, Cecilia
Forcato, María Carolina Mariani, Sergio Gómez, Mariela García, Gastón Ricchi, Mariela
Espinosa, Leandro Monsalve, Gloria Longinotti, Claudia Iranzo, Marcelo Aguayo, Daniela
Mónaco, Juan Burdisso, Yanina Ferreira, María Ana Meira, Federico Fuentes, Marc Laverrière,
Gastón Ortíz, Peter Döhmer, Fernando Merwaiss, Claudia Herrmann, Gastón Arocena, Anabel
Álvarez-Juliá, Cintia Sánchez, Valentina Salzman, Laura Basile, Marcia Acosta. Gracias por la
Ciencia, la Música, y por reír y llorar juntos.
A mis queridos compañeros, Fabiana Fulgenzi, Lucía Boiani-Santurio, Andrea Mesías,
Santiago Carmona, Raúl Cosentino, Leonardo Pannunzi, Daniel Musikant, Mariela del Giudice,
Diego Rey Serantes, Milagros Cámara, María Paula Magariños, Esteban Hernando, Ana
González, Diana Wehrendt, Karina Formoso, Andrés Lantos, Alejandra Frasch, Sol González,
Gabriela Cervini, Albertina Romaniuk, Luciano Melli, Virginia Balouz, Francisco Guaimas,
Mariela Nahmias, Gabriela Levy, Anabella Farinatti, Jimena Martínez, Florencia Pukacz, Lucía
Barcos, Danilo Legisa, por hacer que la vida sea más linda y que el trabajo no pese.
A quienes (fuera de la familia y amigos) me ayudaron espiritualmente en el desarrollo
de la presente Tesis, Horacio Donikián, Norberto “Pappo” Napolitano, Stevie Ray Vaughan,
Riley B. King, Roberto Arlt, Alessandro Baricco, José Saramago.
A quienes me ayudaron profesionalmente en el desarrollo de la presente Tesis: a los
Dres. Carlos Arregui, Javier de Gaudenzi, Vanina Alvarez, Gabriela Niemirowicz, Vanina
Campo, Alejandro Cassola, y Juan Mucci, por innumerables preguntas respondidas y asistencia
técnica. A los Dres. Fernán Agüero y Esteban Serra, por compartir TDR Targets y el programa
de predicción de ORFs, respectivamente. A la Dra. María Teresa Téllez-Iñón, por su apoyo,
asesoramiento técnico y facilitarme el anticuerpo FK-2. Al Dr. Pablo Nikel, por facilitarme la
cepa de E. coli DSM4509. A la Dra. María Isabel Colombo por facilitarme construcciones
fusionadas a GFP. A los Dres. Florencia Linero, Cecilia Czibener y Juan Ugalde por el apoyo y
la contribución con reactivos. Al Dr. Gaspar Cánepa, por facilitarme cepas controles TCSMUG
y TCSMUG. Al Dr. León Bouvier por facilitarme el vector pTREX-Omni. A la Lic.
Margarita López, por asistencia en la obtención de preparados y micrografías de TEM. Al Vet.
Fabio Fraga y al Dr. Marcelo Arguelles, por la inmunización de animales. A Susana Perini,
Susana Giambiagi, Leonardo Valerga, Pablo Briones, Mónica Romanello, Fernanda Peri,
Nicolás Bruni, Nélida Mendoza; por la asistencia y buena predisposición brindadas en todo
momento para facilitar las cosas. A la Téc. Liliana Sferco y la Dra. Berta Franke por todo lo
referido al trabajo con parásitos. A la Bioq. Agustina Chidichimo, por su gran apoyo y su
colaboración en la diferenciación de epimastigotes. A Pablo La Spina por su colaboración en la
caracterización antigénica de las MASPs. Al Dr. Gabriel Briones y a Raúl Takada por la
colaboración en la complementación de SicP.
A todos aquellos que por error omito, pero han contribuido con su acompañamiento al
desarrollo de esta Tesis.
A la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica y al Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas, por aportar financiamiento que permitió el desarrollo de
este trabajo.
A Carlos Buscaglia, por ofrecerme esta oportunidad, por respetar el espacio para el
disenso, que me dio libertad para buscar mi propio rumbo; y por todo su aporte para finalizar
exitosamente esta ardua tarea.
A mis profesores: a la Prof. Ana María Marín-Salta y al Prof. Jorge Renard, que
abrazaron mi vocación temprana por la Biología; a los Profesores Alberto Kornblihtt, Adrián
Paenza, Haydeé Pizarro, Ernesto Massouh, Elsa Damonte, Lidia Poggio, Emilio Ulibarri,
Joaquín Cannata, Hernán Javier Aldana Marcos, y Juan Donati, por confirmarla; y a la Prof.
Maestra Encarnación Rosa Guaglianone por ejemplificarla.
A la educación pública, laica, obligatoria, gratuita e irrestricta de la República
Argentina, con el compromiso de honrarla y defenderla siempre. En particular a la Escuela Nro.
4 “Francisco Márquez”, a la Escuela de Educación Media Nro. 6 “Dr. Carlos Saavedra Lamas”,
a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires, al Instituto de
Investigaciones Biotecnológicas de la Universidad de Nacional de San Martín, a la Universidad
Nacional de La Matanza; todas ellas fueron o son los lugares que permitieron y permiten el
desarrollo de mi vida y de tantas otras.
Abreviaturas
AID: Activation Induced Deaminase BF: Bolsillo Flagelar bp: pares de bases CesT: proteína Chaperone for E.Coli Secretion of Tir CEST: dominio tipo CesT CL: clon CM: medio condicionado (sobrenadante de secreción) ConA: concanavalina A CRAM: Cysteine-rich acidic trans-membrane protein CV: vacuola contráctil CZP: cruzipaína drel: distancia relativa ER: retículo endoplásmico GFP: Green Fluorescent Protein GO: Gene Ontology GPI: Glicosil-phosphatidyl-inositol GST: glutatión-S-transferasa HASPs: Hydrophilic Acylated Surface Proteins IR: Intergenic Region ISGs: Invariable Surface Glycoproteins K: kinetoplasto KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KLH: Keyhole Limpet Hemocyanine LMB: Leptomicina B LPG: lipo-phospho-glycan MASPs: Mucin-Associated Surface Proteins mAb FLAG: anticuerpo monoclonal anti FLAG ME: mini-exón Mic: microsomas MVT: Multi Vesicular Tubules N: núcleo NC: medio no condicionado NE: Nuclear Envelope NER: nucleotide excisión repair NES: nuclear exportation signal NLS: nuclear localization signal ORF: open reading frame P: pellet PDZ: PSD95/Dlg1/zo-1 (dominio) RT: Reverse Transcriptase SFB: suero fetal bovino SL: spliced leader SN: sobrenadante SP: signal peptide tER: transitional ER TIIISS: Type III Secretion System TLTF: T-lymphocite triggering factor TriTryps: T. cruzi, Leishmania mayor, T. brucei TSSA: Trypomastigote Small Surface Antigen ULD: Ubiquitin Like Domain UTR: Un-Translated Region VSGs: Variable Surface Glycoproteins WT: wild type
1
Indice de secciones
Introducción general ......................................................................................................5 El orden Kinetoplastida y trypanosomátidos................................................................5 Ciclo de vida de T. cruzi...............................................................................................6 Estructura y organización celular de T. cruzi ...............................................................8
La superficie celular .................................................................................................8 El flagelo y el citoesqueleto....................................................................................11 La mitocondria y kinetoplasto ................................................................................12 El núcleo.................................................................................................................13
Vías de secreción y endocitosis en T. cruzi y trypanosomátidos................................15 Vía secretoria temprana ..........................................................................................15 Vía secretoria tardía................................................................................................16 Vía endocítica .........................................................................................................17 Transporte de GPI-proteínas...................................................................................19 Mecanismos de secreción no clásica......................................................................19
Objetivos y organización de la Tesis..........................................................................20 Capítulo I. Búsqueda bioinformática y priorización de moléculas efectoras .........21
Introducción................................................................................................................21 Resultados...................................................................................................................23
I.1 Búsqueda in silico de efectores .........................................................................23 I.2 La Selección 1 comprende proteínas putativas de membrana asociadas al
metabolismo de ácidos nucleicos y la ubiquitinación de proteínas .................27 I.3 El análisis de anotación del ATG inicial muestra casos posibles de mala
anotación del genoma o trans-splicing alternativo..........................................29 I.4 Validación bioquímica de las señales de tráfico citoplasma-núcleo................34 I.5 TcCLB.510181.60 (CAF1-B) posee NLS funcional y es secretado en
forma independiente de SP..............................................................................36 I.6 TcCLB.511277.250 muestra evidencias de trans-splicing alternativo y
secreción estadio-específica ............................................................................39 Discusión ....................................................................................................................43
Capítulo II. Caracterización de TCLP1 .....................................................................46 Introducción................................................................................................................46 Resultados...................................................................................................................47
II.1 TCLP1 pertenece a una nueva familia de proteínas quiméricas conservadasen trypanosomátidos ........................................................................................47
II.2 El motivo CEST de TCLP1 presenta similitud estructural con chaperonasdel TIIISS de Salmonella sp ............................................................................51
II.3 El motivo CEST de TCLP1 complementa funcionalmente a SicP deSalmonella typhimurium..................................................................................53
II.4 Ortólogos y parálogos de TCLP1 presentan evidencia de expresiónestadio-específica en los TriTryps...................................................................56
II.5 El transcripto maduro de TCLP1 se detecta en T. cruzi como unproducto desprovisto de SP .............................................................................57
II.6 TCLP1 se expresa en estadios replicativos de T. cruzi como una proteínacitoplasmática asociada a la región del bolsillo flagelar .................................62
2
II.7 TCLP1 co-localiza con marcadores moleculares y funcionales del bolsillo flagelar .............................................................................................................66
II.8 Los parásitos sobre-expresantes de TCLP1 muestran supervivencia disminuida durante la fase estacionaria tardía de crecimiento ........................70
II.9 Los parásitos sobre-expresantes de TCLP1 presentan actividad endocítica disminuida .......................................................................................................74
Discusión ....................................................................................................................77 Capítulo III. Caracterización antigénica, bioquímica y funcional de las MASPs ..81
Introducción................................................................................................................81 Resultados...................................................................................................................82
III.1 Priorización antigénica de las MASPs..........................................................82 III.2 Análisis posicional de péptidos antigénicos en las MASPs .........................85 III.3 El análisis de MASPs recombinantes sugiere la participación de estas
moléculas en los procesos de adhesión e infección de T. cruzi ....................90 III.4 Análisis de la expresión endógena de la familia de las MASPs...................92 III.5 La expresión endógena de las MASPs presenta variabilidad dentro de
una misma población y entre poblaciones....................................................95 III.6 Las múltiples bandas observadas en WB para MASP173 pertenecen a
distintas fracciones subcelulares...................................................................98 III.7 La expresión homóloga estable de una única MASP muestra aspectos
relacionados a su procesamiento ................................................................100 III.8 Las MASPs recombinantes en el estadio trypomastigote muestran
localización en membrana y son susceptibles al clivaje por PI-PLC .........104 III.9 Las MASPs recombinantes en el estadio trypomastigote afectan el
binding en cis/trans y exhiben un curioso fenotipo de secreción...............106 III.10 El fenotipo de secreción se asocia al estadio trypomastigote, que sufre
diferenciación a amastigote durante su adhesión al sustrato ......................110 Discusión ..................................................................................................................112
Conclusiones generales y perspectivas futuras ........................................................116 Materiales y Métodos .................................................................................................119
Análisis Bioinformático............................................................................................119 Materiales y técnicas de Laboratorio........................................................................120
Bacterias ...............................................................................................................120 Células ..................................................................................................................121 Parásitos................................................................................................................121 Técnicas de Biología Molecular y DNA recombinante........................................124 Expresión y análisis de proteínas recombinantes .................................................127 Inmunización de animales y obtención de anticuerpos ........................................128 Inmunoensayos. ....................................................................................................129 Fraccionamientos bioquímicos.............................................................................131
Anexo I – Oligonucleótidos, vectores y construcciones ...........................................134 Oligonucleótidos.......................................................................................................134 Vectores....................................................................................................................136 Construcciones..........................................................................................................138
Anexo II -Publicaciones..............................................................................................146 Pósters o Presentaciones Orales ...............................................................................146 Trabajos ....................................................................................................................147
Bibliografía..................................................................................................................148
3
Indice de figuras
Introducción Figura Introductoria 1. Formas de desarrollo en el ciclo de vida de T. cruzi ...................7 Figura Introductoria 2. Ciclo de vida de T. cruzi..............................................................8 Figura Introductoria 3. Moléculas de superficie de trypanosomátidos ..........................11 Figura Introductoria 4. Anatomía de T. cruzi .................................................................13 Figura Introductoria 5. Cis- y trans- splicing .................................................................15 Figura Introductoria 6. Endocitosis/secreción en T. cruzi ..............................................18 Capítulo I Figura I.1. Priorización del genoma de T. cruzi de acuerdo a los parámetros
puntuados en la búsqueda bioinformática .................................................26 Figura I.2. Análisis de señales de tránsito y términos de Gene Ontology (GO) de
los genes en la Selección 1 ........................................................................28 Figura I.3. Análisis de anotación y ATG inicial..........................................................33 Figura I.4. Identificación de posibles sitios de trans-splicing alternativo en
dos candidatos con valores altos de probabilidad en el extremo 5' ...........33 Figura I.5. Validación bioquímica de las señales de localización nuclear ..................35 Figura I.6. Caracterización bioquímica del candidato TcCLB.510181.60 (CAF1-B) 38 Figura I.7. Caracterización bioquímica del candidato hipotético TcCLB.511277.
250 (11277)................................................................................................41 Capítulo II Figura II.1. Secuencia predicha y dominios putativos de TCLP1 ................................48 Figura II.2. Análisis filogenético de TCLP1 y sus ortólogos en Bacteria y
Trypanosomatidae .....................................................................................50 Figura II.3. Conservación estructural entre el motivo CEST de TCLP1 y
chaperonas del TIIISS de Salmonella spp .................................................52 Figura II.4. Complementación de la cepa mutante de deleción para SicP con
el motivo CEST de TCLP1........................................................................55 Figura II.5. Análisis de la metionina inicial/codón inicio en TCLP1 y ortólogos........59 Figura II.6. Validación experimental de la metionina inicial/codón inicio en
TCLP1 .......................................................................................................61 Figura II.7. Validación experimental del anticuerpo TCLP1.....................................64 Figura II.8. Análisis de la expresión de TCLP1 en T. cruzi .........................................65 Figura II.9. Análisis de localización subcelular fina de TCLP1...................................69 Figura II.10. TCLP1 co-localiza con marcadores de la vía endocítica no degradativa..70 Figura II.11. Análisis cuantitativo de la sobre-expresión de TCLP1 y efecto general
de la transfección sobre el crecimiento de la cepa Adriana.......................72 Figura II.12. Los parásitos transfectados con TCLP1 muestran una progresión
acelerada hacia la fase estacionaria tardía de crecimiento ........................73 Figura II.13. Los parásitos transfectados con TCLP1 muestran disminución en su
capacidad endocítica..................................................................................76
4
Capítulo III Figura III.1. Priorización antigénica de las MASPs ....................................................84 Figura III.2. Análisis posicional de péptidos antigénicos............................................87 Figura III.3. Validación de regiones C-terminales como regiones inmuno-
dominantes..............................................................................................89 Figura III.4. Ensayos de binding e infección de MASPs recombinantes ....................91 Figura III.5. Expresión endógena de las MASPs I (Análisis de WB) .........................94 Figura III.6. Expresión endógena de las MASPs II (Análisis de IFI) .........................97 Figura III.7. Expresión endógena de las MASPs III (Fraccionamientos subcelular
y análisis con el anticuerpo r MASPEP) ..............................................99 Figura III.8. Análisis de expresión de construcciones derivadas de la MASP
TcCLB.511173.360 en epimastigotes transgénicos de T. cruzi Adriana .................................................................................................103
Figura III.9. Análisis de expresión de construcciones derivadas de la MASP TcCLB.511173.360 en trypomastigotes transgénicos (SP::FLAG::GPI) de T. cruzi Adriana..................................................106
Figura III.10. Efectos sobre la infección, binding y fenotipo de secreción de la MASP 173.360 expresada en la cepa Ad SFG .....................................108
Figura III.11. El fenotipo de secreción requiere de la viabilidad de los parásitos.......109 Figura III.12. Análisis del fenotipo de secreción y diferenciación de
trypomastigotes en ensayos de migración sobre poli-lisina .................112 Anexo I Figura AI.1. Vectores utilizados para las construcciones mostradas en esta Tesis ...136 Figura AI.2. Construcciones de candidatos expresados como fusiones
traduccionales a EGFP (Validación funcional de NLS, NES) .............139 Figura AI.3. Generación de construcciones para la expresión de candidatos en
epimastigotes de T. cruzi en fase traduccional con el epitope 3xFLAG................................................................................................140
Figura AI.4. Construcciones para el ensayo de complementación funcional de Salmonella typhimurium LT2 con el motivo CesT de TCLP1.............142
Figura AI.5. Construcciones para la expresión de MASPs recombinantes en parásitos de T. cruzi .........................................................................145
Indice de tablas
Tabla I.1. Lista simplificada de los principales atributos priorizados y los correspondientes puntajes otorgados en la búsqueda bioinformática.....24
Tabla I. 2. Candidatos emergentes luego da la curación manual de la Selección 1 .29 Tabla II.1. Evidencia de expresión y fenotipos reportados para TCLP1 y
ortólogos relacionados............................................................................57 Tabla AI.1. Oligonucleótidos utilizados para generar las construcciones
mostradas en la presente Tesis..............................................................134
5
Introducción general
El orden Kinetoplastida y trypanosomátidos
El orden Kinetoplastida (Eukaryota, Excavata, Euglenozoa), comprende a
organismos protozoarios con la peculiaridad de poseer una organela particular, el
kinetoplasto, estructura basófila que forma parte de la mitocondria y donde se concentra
el DNA mitocondrial, descripta originalmente por Alexieff en 1917 y caracterizada por
Vickerman en 1976. Este grupo se subdivide en dos subórdenes: Bodonina y
Trypanosomatina (trypanosomátidos). El primero está formado por organismos
usualmente biflagelados con un kinetoplasto alargado y hábitos que van de la vida libre
al parasitismo. El suborden Trypanosomatina, de mayor importancia médica y
económica, se compone de protozoos uniflagelados con un kinetoplasto pequeño,
muchos de los cuales son parásitos obligados de plantas, insectos y animales (1).
En particular, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), Leishmania spp., y Trypanosoma
brucei spp., son trypanosomátidos de superlativa importancia sanitaria como agentes
etiológicos de la Enfermedad de Chagas (Trypanosomiasis Americana),
la Leishmaniasis, y la enfermedad del sueño (Trypanosomiasis Africana),
respectivamente. Estas patologías se encuentran categorizadas dentro de las más
relevantes enfermedades olvidadas, afectando a más de 27 millones de personas en el
mundo y causando unas 150.000 muertes anuales (2).
Además de su relevancia médica y económica, los trypanosomátidos presentan
características excepcionales respecto de la transcripción génica, bioquímica y
organización celular, entre las cuales pueden mencionarse: -i) la edición y arquitectura
única de su DNA mitocondrial (3); -ii) la transcripción policistrónica, la ausencia casi
total de intrones, y el trans-splicing de mensajeros maduros (4-7); -iii) la
compartimentalización de la glicólisis en glicosomas, y la posesión de otras organelas
altamente especializadas (8); -iv) la presencia de “bases J” modificadas mediante
glicosilación y asociadas a la represión de la expresión génica y/o recombinanción
homóloga (9) ; y -v) la posesión de numerosas copias de glicoproteínas de superficie en
su cubierta implicadas en mecanismos de variación antigénica y evasión de la respuesta
inmune (10), entre otras. Todos estos atributos hacen de los trypanosomátidos
6
organismos sumamente interesantes desde el punto de vista médico, ecológico y
evolutivo como representantes de linajes de eucariotas ancestrales (11). Resulta
imposible abarcar la totalidad de las peculiaridades de este grupo tan diverso, de manera
que a continuación se introducirán en forma general algunas de las características de los
trypanosomátidos (y más en particular de T. cruzi) mayormente relevantes respecto del
presente trabajo.
Ciclo de vida de T. cruzi
Al igual que en el resto de los trypanosomátidos, T. cruzi posee un complejo
ciclo de vida digenético, alternando entre un hospedador invertebrado (Triatominae,
Reduviidae) y uno vertebrado (mamíferos, incluido el hombre). Durante su ciclo de
vida, T. cruzi constituye una población pleomórfica compuesta por diversos estadios
morfológicos (Fig. Int.1). Aunque existen varias formas de diferenciación intermedias,
típicamente se nombran cuatro estadios fundamentales, a saber: -el epimastigote, estadio
no infectivo y replicativo en el insecto; -el amastigote, estadio replicativo dentro de la
célula de mamífero; -el trypomastigote sanguíneo, infectivo y no replicativo en el
mamífero; y -el trypomastigote metacíclico, no replicativo y también infectivo en el
mamífero, pero diferenciado a partir de epimastigotes en la ampolla rectal del insecto.
En forma muy simplificada, el ciclo puede iniciarse con la ingesta de sangre infectada
con trypomastigotes sanguíneos de un hospedador mamífero por un triatomino. En el
intestino medio, los trypomastigotes se diferencian a epimastigotes, que se adhieren a la
mucosa intestinal y replican dentro del insecto. En la ampolla rectal, los epimastigotes
se diferencian a trypomastigotes metacíclicos y son eliminados durante la micción. El
contagio ocurre cuando estos trypomastigotes ingresan al hospedador mamífero a través
de las mucosas y/o un daño en algún epitelio. Dentro del organismo, los trypomastigotes
metacíclicos son capaces de infectar un amplio rango de tipos celulares. Durante la
infección, se produce una reorganización del citoesqueleto celular y se reclutan
lisosomas al sitio de contacto, el trypomastigote es internalizado pero escapa de la
vacuola parasitófora rápidamente y se diferencia a amastigote en el citosol. Los
amastigotes realizan varios ciclos de replicación, formando un pseudo-quiste y luego se
diferencian a trypomastigotes sanguíneos, que se liberan al exterior cuando se produce
7
la lisis celular, y bien pueden infectar otra célula o ser tomados por el insecto durante
una ingesta, cerrando así el ciclo (12). En la Fig. Int.2 se muestra un esquema
simplificado del ciclo de vida de T. cruzi.
Figura Introductoria 1. Formas de desarrollo en el ciclo de vida de T. cruzi
Se muestran los estadios observados en el hospedador invertebrado (Reduviidae) y mamífero.
Se indica si el estadio es infectivo o no infectivo (I,NI) y replicativo o no replicativo (R,NR).
Modificado de (12).
8
Figura Introductoria 2. Ciclo de vida de T. cruzi
Se muestra en forma simplificada el ciclo de vida de T. cruzi. Los estadios de insecto
(epimastigotes, I) se diferencian a trypomastigotes metacíclicos que infectan células de
mamífero (II). Amastigotes intracelulares replican (III) y reinfectan células (IV) o se diferencian
a trypomastigotes sanguíneos infectivos (V) que pueden infectar nuevas células (VI) o ser
tomados por el insecto durante su alimentación (VII). Modificado de (13).
Estructura y organización celular de T. cruzi
A continuación se detallarán los aspectos más relevantes de la biología celular y
estructural de los estadios morfológicos principales de T. cruzi. Aunque muchos de los
atributos de su organización subcelular están conservados en el resto de los
trypanosomátidos, T. cruzi presenta características únicas, y debido a la relevancia
respecto del presente trabajo, sólo se realizará la descripción anatómica de este último.
La superficie celular La superficie externa de los trypanosomátidos posee un abundante glicocálix
formado por glicoproteínas y glicolípidos que constituye la cubierta de estos parásitos.
En T. brucei, la cubierta se constituye principalmente por VSGs (Variable Surface
Glycoproteins), implicadas en el fenómeno de variación antigénica, e ISGs (Invariable
Surface Glycoproteins). En Leishmania, el principal componente de la cubierta es un
glicolípido, el LPG (lipophosphoglycan), que se encuentra aumentado en cepas
9
patógenas y es requerido para su viabilidad (10). En T. cruzi, las moléculas más
abundantes del glicocálix pertenecen a la familia de las GPI-mucinas, transialidasas y
MASPs (Mucin Associated Surface Proteins) (14), todas ellas implicadas de alguna
manera en la invasión y evasión de la respuesta inmune. Además, deben mencionarse
los glicosil-fosfolípidos libres que a pesar de no tener aún una clara función asignada,
son tan abundantes en membrana como las mucinas (15). Aunque de naturaleza diversa,
todas estas moléculas se encuentran vinculadas a la membrana plasmática por anclas de
glicosil-fosfatidil-inositol (GPI, por sus siglas en inglés, Fig. Int. 3A).
Las glicoproteínas de la cubierta de T. cruzi son principalmente GPI-mucinas,
gp85/transialidasas (16) y MASPs (14). Todas ellas comparten atributos estructurales
como la presencia de péptidos señales N-terminales (SP) de exportación al ER
(Endoplasmic Reticulum), regiones internas variables y anclas de GPI C-terminales.
Estas moléculas son fundamentales en procesos de invasión y evasión/modulación de la
respuesta inmune, y son importantes desde el punto de vista diagnóstico (13).
Las transialidasas transfieren ácido siálico proveniente del glicocálix o bien de
glicoconjugados solubles presentes en el hospedador vertebrado a las mucinas de
T. cruzi (17, 18). Esto es de suma relevancia dado que el parásito es incapaz de
sintetizar ácido siálico, necesario para la invasión de la célula hospedadora (Fig. Int.
3B). Estas moléculas, junto a otras estructuralmente relacionadas aunque sin actividad
enzimática, definen una gran familia génica con múltiples roles en la biología del
parásito (19). Por otra parte, la presencia de epitopes inmunodominantes en estas
moléculas constituye un mecanismo de evasión de la respuesta inmune (20).
La familia de las GPI-mucinas de T. cruzi se subdivide en TcSMUG, asociadas
al estadio de insecto (epimastigote) (21), y TcMUC, asociadas a estadios de mamífero
(amastigotes, trypomastigotes) (22). En particular, TSSA (Trypomastigote Small
Surface Antigen), una GPI-mucina relacionada con la familia TcMUC, está vinculada
con la adhesión e invasión del trypomastigote a la célula hospedadora y posee a su vez
valor diagnóstico (23, 24).
Por último, las MASPs son una familia multigénica de glicoproteínas de T. cruzi
que emergió recientemente con la secuenciación del genoma (14). Constituyen las GPI-
moléculas de superficie menos caracterizadas hasta el momento y se las ha asociado
principalmente al estadio trypomastigote donde participan en la invasión (25). También
10
se ha sugerido que podrían estar involucradas en la posible variación antigénica de
T. cruzi (26). Sobre estas moléculas se profundizará en el Cap. III.
En resumen, en forma similar a otros trypanosomátidos, la superficie de T. cruzi
está formada principalmente por glicoproteínas ancladas con GPI de expresión
diferencial en todos los estadios de T. cruzi, y de relevancia funcional en la invasión,
adhesión y modulación de la respuesta inmune.
11
Figura Introductoria 3. Moléculas de superficie de trypanosomátidos
A) Esquema de las principales moléculas de superficie de trypanosomátidos. Modificado de
(10). B) Mecanismo de acción de la transialidasa de T. cruzi. Modificado de (13).
El flagelo y el citoesqueleto T. cruzi posee un único flagelo en todos sus estadios de desarrollo, aunque en el
amastigote se encuentra muy reducido (Fig. Int. 4D,E) Esta estructura posee la
conformación típicamente eucariota de nueve dobletes de microtúbulos periféricos y un
par central (9+2), además de un cuerpo basal (27). El flagelo es responsable
principalmente de la motilidad de los trypanosomátidos, pero también está asociado con
la morfogénesis y citocinesis (28), y la viabilidad de formas sanguíneas de
trypanosomas africanos (29). Recientemente se ha descripto en detalle el movimiento
flagelar para epimastigotes de T. cruzi y se han observado movimientos rítmicos
ondulantes direccionales y de tipo ciliar durante trayectorias aleatorias (30). Sin
embargo, el movimiento del flagelo está poco estudiado en trypanosomátidos.
Existen dos particularidades respecto del citoesqueleto de los trypanosomátidos
que merecen especial atención. La primera es la presencia de una red intrincada de
microtúbulos justo por debajo de la membrana plasmática o película, denominados
microtúbulos subpeliculares, responsables del mantenimiento de la forma celular (Fig.
Int. 4A). Esta red rodea la totalidad del cuerpo del parásito, salvo en el bolsillo flagelar
(BF) y en el citostoma, manteniendo la forma característica de cada estadio de
desarrollo (27). La segunda la constituye la ausencia general de microfilamentos de
actina. Aunque se han identificado genes para actina y miosina y se ha caracterizado la
presencia de “parches” citoplasmáticos de estas proteínas, no se han observado hasta el
momento filamentos, y la función de la actina/miosina estaría asociada a la endocitosis
dependiente de clatrina (27, 31).
12
La mitocondria y kinetoplasto Los trypanosomátidos poseen una única mitocondria alargada y altamente
ramificada que incluye al anteriormente mencionado kinetoplasto, organela distintiva
del orden Kinetoplastida y que contiene un tipo especial de DNA mitocondrial (kDNA)
circular de dos tamaños (mini- y maxi-círculos) que codifican para RNA guías y genes
mitocondriales, respectivamente. Los transcriptos originados de los maxi-círculos son
editados en el proceso denominado edición de RNA. El kinetoplasto está asociado al
cuerpo basal en todos los estadios de T. cruzi, y su posición indica el punto de
emergencia del flagelo (8). Su posición relativa respecto del núcleo y el cuerpo basal
varía de acuerdo al estadio en T. cruzi: es anterior en epimastigotes y amastigotes,
posterior en trypomastigotes y medio en trypomastigotes metacíclicos (Fig. Int. 4A).
13
Figura Introductoria 4. Anatomía de T. cruzi
A) Dibujo derivado de micrografías electrónicas (modificado de (32)) mostrando las principales
organelas presentes en el epimastigote. B) Micrografía electrónica de un corte transversal a
nivel del BF. FP: Bolsillo Flagelar; F: Flagelo; N: Núcleo; K: Kinetoplasto; G: Golgi; A:
Axonema; M: Mitocondrión. C) Micrografía electrónica (criofractura) del BF mostrando
numerosas vesículas asociadas. D) Micrografía electrónica comparando el flagelo y forma
celular de promastigotes (izq.) y amastigotes (der.) de Leishmania amazonensis. E) Micrografía
electrónica de barrido de un trypomastigote de T. cruzi. Paneles B a E, modificados de (33).
El núcleo Como muchos otros eucariotas inferiores, T. cruzi y los trypanosomátidos en
general poseen peculiaridades respecto de su estructura nuclear con implicancias en la
transcripción, splicing, replicación y reparación del DNA entre otros procesos claves en
su adaptación a los ambientes altamente cambiantes a los que están sometidos durante
su ciclo de vida (34). Entre dichas peculiaridades pueden mencionarse: -i) la presencia
de una cromatina laxa, incapaz de condensarse a fibras de 30 nm, formando fibras de 10
nm con nucleosomas dispuestos en forma irregular (35), -ii) que no se observan
cromosomas durante la mitosis y la envoltura nuclear no se disgrega (36), -iii) la
ausencia de regulación de la transcripción a nivel de inicio y la generación de unidades
transcripcionales policistrónicas precursoras que sufren capping y poli-adenilación de
manera concertada en un proceso denominado trans-splicing (37). Este último proceso
(Fig. Int. 5) es de importancia general respecto de la regulación de la expresión génica
en trypanosomátidos y de especial relevancia particular en el presente trabajo, de
manera que se explicará con mayor detalle.
Durante el trans-splicing, se agrega a los extremos 5’ de todos los mRNA
maduros una secuencia corta de RNA conocida como mini-exón (ME) o Spliced-Leader
(SL) (4, 38). Así, dos moléculas transcriptas en forma independiente (el pre-mRNA y el
SL) son unidas en dos pasos. En el primer paso, se genera un intermediario en “forma
de Y” generado por el corte del extremo 5’ donor del SL y la formación de un enlace
fosfo-diéster 2’-5’ entre el primer residuo 5’ del SL y un residuo de adenosina río arriba
del sitio 3’ aceptor en el pre-mRNA. En el segundo paso, el intermediario en forma de
14
Y es removido y el SL es ligado al mRNA en su sitio 3’ aceptor. Debido a que éste es
un proceso rápido probablemente co-transcripcional, no es posible aislar el
intermediario y directamente se obtiene el producto final del capping, es decir mRNAs
maduros con SL en sus extremos 5’ (7, 39, 40). Estas reacciones ocurren en sitios de
splicing específicos situados en regiones intergénicas, de manera de evitar la deleción
de secuencias pertenecientes al marco de lectura abierto (Open Reading Frame, ORF).
Así, y de manera similar a lo que ocurre en el cis-splicing, el sitio 3’ aceptor siempre
consiste en un dinucleótido de adenosina-guanosina (sitio AG-aceptor) (4). Además, en
las regiones intergénicas son de particular importancia los tractos de poli-pirimidinas
(T, C, Py-Tracts), dado que su clivado puede descubrir y de este modo activar sitios
“crípticos” de trans-splicing (5).
Por otro lado, se han reportado varios casos de trans-splicing alternativo en
trypanosomátidos afectando la función y localización subcelular de las proteínas
resultantes (6, 41-44). En particular, se reportaron tres variantes de trans-splicing para
la proteína LYT1 (lytic) de T. cruzi, además de encontrarse que la expresión de estas
variantes a nivel transcripcional es estadio-dependiente. Dos de las variantes de trans-
splicing mostraron diferente función y localización subcelular: mLYT1, la variante con
SP se distribuye en la membrana plasmática, mientras que kLYT1, la más corta y sin
SP, es direccionada a la zona “mitocondrial/kineto-flagelar” (43, 44). En T. brucei,
también se reportaron cambios en la distribución subcelular de la iso-leucil- tRNA
sintasa relacionadas a variaciones en el trans-splicing. En este caso, la forma larga con
SP se ubica en la mitocondria mientras que la forma carente de SP en el citosol (41).
15
Figura Introductoria 5. Cis- y trans- splicing
Esquemas comparativos entre los procesos de cis- (izq.) y trans-splicing (común en
trypanosomátidos, der.). Se muestran en cada caso las dos reacciones de trans-esterificación
para remover intrones (cis-splicing) o regiones intergénicas (IR) de pre-mRNAs policistrónicos
(trans-splicing). SS: Splice Site; SL: Spliced Leader; PPT: Poly-Pirimidine Tract. Modificado
de (6).
Vías de secreción y endocitosis en T. cruzi y trypanosomátidos
Vía secretoria temprana Como se mencionó anteriormente, los trypanosomátidos han desarrollado
cubiertas de glicoproteínas, proteoglicanos, glicolípidos y demás moléculas de
superficie que recubren la totalidad del cuerpo celular, incluyendo el flagelo y el BF
(10). La síntesis de todas estas moléculas de superficie comienza en el ER, y el
plegamiento en su lumen es asistido por chaperonas como calreticulina y BiP. Esta
16
última, además, constituye un marcador de todas las regiones del ER (45).
Representando aproximadamente el 60% de las membranas de parásitos en división, el
ER se divide en un retículo perinuclear contiguo a la membrana nuclear (NE) y el
retículo cortical propiamente dicho (ER). En formas en división activa (epimastigotes)
se distingue además una región extra denominada retículo transicional (tER), opuesto a
la cara cis del aparato de Golgi (Golgi), a su vez próximo al bolsillo flagelar (Fig. Int.
6A,C). En esta región se acumularían en mayor medida proteínas y lípidos
transportados hacia el Golgi. El Golgi está presente en copia única y consiste en una
serie de 3-10 cisternas ubicadas en la proximidad del BF. Existen algunos pocos
marcadores de esta organela (46, 47), que a diferencia de lo que ocurre en células
eucariotas, no se disocia durante la mitosis, sino que se divide por fisión binaria de
manera similar al kinetoplasto, cuerpo basal, mitocondria, y flagelo. De manera similar
a lo que se verifica en eucariotas superiores, en el Golgi ocurren N- y O- glicosilaciones
de VSGs y prociclinas en T. brucei (48).
Vía secretoria tardía Existen numerosas líneas de evidencia que indican que las cisternas del trans
Golgi en trypanosomátidos actuarían como una región de organización del tránsito
intracelular en forma similar a lo que ocurre en eucariotas superiores (10). Esta zona del
Golgi se encuentra opuesta y posterior al BF que, como se mencionó anteriormente, es
la región privilegiada para los procesos de endo- y exocitosis por carecer de
microtúbulos subpeliculares (Figs. Int. 4,6). Se han caracterizado vesículas de transporte
cargadas con proteínas de superficie (VSGs, gp63) claramente diferentes de endosomas
entre el trans Golgi y el BF (49, 50). Además, la matriz del BF es similar a un gel y está
a su vez enriquecida en proteínas ancladas por GPI, probablemente retrasando su
difusión hacia otras regiones de la superficie celular (51).
A nivel del trans Golgi la vía secretoria tardía se intersecta con la vía endocítica/
degradativa (Fig. Int. 6A,C). En trypanosomátidos existen distintos compartimentos
degradativos: -i) reservosomas: organelas membranosas similares a lisosomas ubicadas
posteriormente y distintivas de epimastigotes de T. cruzi (52); y -ii) túbulos multi-
vesiculares (MVT, Multi-Vesicular Tubules), que se forman en el sistema endocítico por
17
invaginaciones de membranas de origen endosomal (53), (Fig. Int. 6A,B). Aunque no
constituyen compartimentos degradativos, los acidocalcisomas son otras importantes
organelas del sistema de endomembranas de trypanosomátidos que funcionan como
reserva de fósforo y cationes (Ca2+, Na+, Zn2+, Mg2+, etc.) y que están implicadas en la
osmoregulación (54), (Fig. Int. 6A,B).
Vía endocítica La internalización y degradación de complejos opsonizantes del hospedador es
un requerimiento esencial para la supervivencia de estos parásitos (55, 56). Como se
mencionó anteriormente, la endocitosis en trypanosomátidos está restringida al BF o en
forma alternativa y si está presente, al citostoma (Fig. Int. 6A,B). El BF constituye un
compartimiento de organización del tránsito importante en sí mismo, y destino de
proteínas residentes, como se ha determinado para algunas proteínas con señales de
retención en su lumen (57). Las proteínas de membrana o receptores del BF que son
internalizados por endosomas/MVTs pueden ser redirigidos al BF o bien derivados a
compartimentos degradativos. Por ejemplo, muchas GPI-proteínas en complejo con
anticuerpos opsonizantes (VSGs, etc.) son dirigidas a compartimentos lisosomales
donde dichos anticuerpos son degradados (55, 56).
18
Figura Introductoria 6. Endocitosis/secreción en T. cruzi
A) Esquema de las organelas involucradas en los procesos de endocitosis/secreción en T. cruzi
(epimastigote). fl.: flagelo; Cyt: citostoma; EE: (Early Endosome) endosoma temprano; fp:
(flagellar pocket) bolsillo flagelar; G: Golgi; ER: (Endoplasmic Reticulum), retículo
endoplásmico; tER: trans-ER; NE: (Nuclear Envelope) envoltura nuclear; LE-MVT: (Late
Endosomes-Multi Vesicular Tubules); AC: ácidocalcisoma; L: lisosoma (en epimastigote,
reservosoma). B) Micrografías de epifluorescencia con diversos marcadores de organelas de la
vía endo/exocítica. C) Diversas vías endo/exocíticas y sus conexiones. 1: síntesis y exocitosis de
19
GPI-proteínas o proteínas de membrana de tipo I. 2,3,6: formación de endosomas tardíos
(cuerpos multivesiculares), lisosomas y digestión (degradación). 4: endocitosis. 5: exocitosis
(secreción independiente de SP). 7: reciclado (receptor de tranferrina). Modificado de (10).
Transporte de GPI-proteínas Como se mencionó anteriormente, la mayor parte de las proteínas de membrana
de los trypanosomátidos se agrupan dentro de la familia de GPI-proteínas (VSGs,
transialidasas, mucinas, LPGs, gp63). Estas proteínas son sintetizadas inicialmente con
señales de direccionamiento al ER (SP) y consenso para la adición de anclas de GPI
(GPI) que son clivadas rápidamente en el lumen del ER (58-61). La adición del ancla de
GPI es necesaria para la rápida exportación del ER al tER, Golgi y su eventual
posicionamiento en la membrana. En presencia de GPI, el estado estacionario en el ER
es muy corto, y casi indetectable, pero para formas solubles de VSGs y mucinas
expresadas ectópicamente (SP sin GPI), se ha observado retención en el ER (62-64).
Mecanismos de secreción no clásica Aunque la forma de secreción más caracterizada en trypanosomátidos es la que
involucra a la vía secretoria “clásica” detallada más arriba, hay evidencia acerca de la
existencia de vías de secreción alternativas o “no clásicas” independientes de la
presencia de SP. Un ejemplo de ello lo constituyen las proteínas HASPs (Hydrophilic
Acylated Surface Proteins), que carecen de SP y sin embargo se localizan en la
membrana y el BF de Leishmania spp. (65, 66). El posicionamiento en membranas de
las HASPs estaría mediado por miristoilación/palmitoilación (67, 68). De forma similar,
se mencionarán más adelante ejemplos de detección de numerosas proteínas carentes de
SP en secretomas que muestran la representatividad de vías alternativas de secreción en
trypanosomátidos (69-72).
20
Objetivos y organización de la Tesis
El presente trabajo de Tesis tiene como objetivos generales:
-i) la identificación de nuevas moléculas potencialmente implicadas en la
interacción de T. cruzi con el hospedador mamífero utilizando una estrategia de rastreo
y priorización in silico;
-ii) la validación y caracterización bioquímica inicial de los candidatos más
relevantes surgidos de dicha priorización.
A tal fin:
-i) se desarrolló una búsqueda bioinformática no sesgada sobre el genoma de
T. cruzi tendiente a jerarquizar candidatos plausibles de caracterización bioquímica de
acuerdo con su probabilidad de implicarse en la co-optación de las funciones de la
célula hospedadora en un escenario de infección por T. cruzi (Cap. I).
-ii) se caracterizó por primera vez a la proteína TCLP1 asociada al bolsillo
flagelar de estadios replicativos de T. cruzi y homóloga funcional a chaperonas
bacterianas del sistema de secreción de tipo III (Cap. II).
-iii) se caracterizó antigénica y funcionalmente a miembros relevantes de la
familia multigénica de las MASPs (Cap. III).
Por otra parte, para facilitar su lectura, el cuerpo de este trabajo se organizó en
los tres capítulos mencionados precedentemente, cada uno de ellos con su propia
Introducción (ajustada a la temática especial del capítulo), una sección Resultados y una
Discusión particular de cada capítulo. Finalmente, se presentan las Conclusiones
generales y perspectivas futuras como cierre global del trabajo.
Hechas estas aclaraciones, se sugiere el uso de los índices de secciones, figuras y
tablas para una lectura ágil de la presente Tesis.
21
Capítulo I. Búsqueda bioinformática y priorización de
moléculas efectoras
Introducción
Durante un ciclo típico en el hospedador mamífero, tanto los trypomastigotes
(aún en forma transiente) como los amastigotes de T. cruzi residen en el citoplasma
celular. Entonces, es válido suponer que existan moléculas de T. cruzi que expresadas
en estadios intracelulares y mediante señales específicas adecuadas (de secreción, etc.)
puedan acceder a distintos componentes y compartimentos de la maquinaria celular y
co-optar sus funciones en beneficio de la infección/replicación del parásito.
En general, la remodelación de las funciones de la célula hospedadora parece ser
una estrategia ampliamente diseminada en muchos parásitos intracelulares y por otra
parte compartir elementos comunes (73, 74). En ese sentido puede mencionarse la
conservación y especialización del sistema de secreción de tipo III (Type III Secretion
System, TIIISS) como ejemplo de una maquinaria ancestral encargada del envío de
efectores bacterianos al citoplasma de la célula eucariota (75). La secreción de
moléculas con efectos moduladores ha sido reportada en forma extensiva en procariotas
como Brucella abortus (76-79). En parásitos protozoarios pertenecientes al Phylum
Apicomplexa, se han reportado cambios en el transcriptoma de células infectadas
mediados por kinasas secretadas por taquizoítos de Toxoplasma gondii (80),
alteraciones inducidas por una proteína con motivos de unión al DNA que se localiza en
el núcleo de la célula hospedadora en Theilleria annulata (81), o la regulación negativa
de genes dependientes de la importación nuclear del factor de transcripción NF-B
mediada por la proteína del circumsporozoíto (CS) de Plasmodium falciparum (82).
Como se mencionó anteriormente, se sabe que T. cruzi está cubierto por una
gruesa capa de glicoproteínas que recubren y protegen al parásito del sistema inmune
del hospedador y le permiten infectar varias células y tejidos (13). Además, se ha
reportado que el parásito secreta activamente componentes de su cubierta en todos sus
estadios de desarrollo tanto al medio extracelular como al interior de la célula (83-85).
22
La secreción de estos materiales, principalmente GPI-proteínas se lleva a cabo por
mecanismos dependientes de fosfo-lipasas (86). Sin embargo, recientemente se han
identificado moléculas secretadas por trypomastigotes de T. cruzi pertenecientes a tres
poblaciones de exosomas con distintos mecanismos de secreción asociados (69).
Debido a dificultades técnicas, el secretoma de estadios intracelulares de T. cruzi
ha sido poco estudiado hasta el momento, y nunca usando estrategias intensivas.
Aunque se han identificado transialidasas (87) y mucinas (84) en el citoplasma de
células infectadas, su rol preciso durante la infección es desconocido. En cuanto a la
remodelación de las funciones de la célula hospedadora, el grupo de Hashimoto et. al
ha reportado la inhibición de la apoptosis mediada por c-FLIP en células infectadas por
T. cruzi (88) y la identificación de una molécula con un dominio RING finger
(SPRING) secretada por amastigotes de T. cruzi como una ubiquitín-ligasa dirigida al
núcleo de la célula hospedadora, capaz de interactuar con la proteína BCA-3 (Breast-
Cancer- Associated-Protein-3), y ubiquitinarla in vitro (89).
Dada la aparente relevancia de la remodelación de las funciones de la célula
hospedadora como mecanismo ampliamente difundido en otros parásitos intracelulares
y la escasa información al respecto en T. cruzi, se diseñó y llevo a cabo una estrategia in
silico basada en la plataforma TDR-Targets (90) a fin de identificar posibles actores
moleculares de este tipo de proceso. La aplicación de esta estrategia permitió identificar
una nueva proteína (TCLP1) cuya caracterización se presenta en el Cap. II, y posicionó
a la familia multigénica de las MASPs como candidatos susceptibles de caracterización
bioquímica en procesos de infección tratados en el Cap. III.
En este capítulo se muestran los resultados de la búsqueda bioinformática así
como la identificación y caracterización inicial de otros de los candidatos más
relevantes.
23
Resultados
I.1 Búsqueda in silico de efectores En colaboración con el Dr. Fernán Agüero, se desarrolló una plataforma basada
en la herramienta bioinformática TDR-Targets (tdrtargets.org) (90), que al tratarse de
una herramienta integrativa/no exclusiva permitió reordenar la totalidad de los genes de
T. cruzi CL-Brener anotados en el genoma (tritrypDB.org) de acuerdo a un peso dado
por un puntaje acumulado, positivo o negativo, resultante de puntajes individuales
asignados en forma arbitraria a atributos de interés bajo cierta hipótesis de trabajo.
De esta manera y de acuerdo al objetivo buscado, se priorizaron mediante
puntajes positivos principalmente genes poseedores en paralelo de señales de
localización nuclear (NLS) y SP/GPI, así como otros atributos relacionados con la
secreción o la interacción con organelas celulares, a saber: -i) probabilidad de estar
incluidas en exosomas, -ii) factibilidad de ser secretadas mediante mecanismos
independientes de SP, -iii) presencia de “atributos nucleares” (como motivos de unión al
DNA, cremalleras de leucinas, etc.), entre otros atributos. Asimismo, se le otorgaron
valores negativos de puntaje a proteínas como las mucinas y relacionadas que, aunque
poseedoras de señales de secreción bona fide (63), al ser extensamente glicosiladas
presentarían otras señales (peptídicas) de tránsito probablemente ocultas por
modificaciones post-transcripcionales (13). De manera similar, fueron asignados valores
negativos de puntaje a moléculas portadoras de señales de localización/retención en
otros compartimentos celulares (ER, mitocondria, glicosoma, etc.). Los dominios
transmembrana fueron penalizados a partir de estar presentes más de una vez, pero no
cuando eran únicos debidos a que muchas veces se superponían con predicciones de SP
(Tabla I.1).
24
Tabla I.1. Lista simplificada de los principales atributos priorizados y los correspondientes
puntajes otorgados en la búsqueda bioinformática
Atributos Puntaje arbitrario NLS (Predict NLS) 1000 GPI (GPI Som) 500 SP (SignalP) 300 Secretoma trypomastigote (69) 300 Ortólogos secretoma Leishmania (71) 300 secreted rel-5 (PSORT II) 200 Interspecies interacting protein 200 secreted rel-4 (PSORT II) 150 no TM domains 100 secreted rel-3 (PSORT II) 80 secreted rel-2 (PSORT II) 60 Nuclear 60 Leishmania (ortólogo) 50 Nucleic Acid Binding 50 DNA features 40 Chromosome features 40 Transcription regulator 40 secreted rel-1 40 Plasmodium (ortólogo) 25 Mycobacterium (ortólogo) 25 Signal transduction 10 Ligase activity 10 TM domains (1) -10 TM domains (2) -100 ER -1000 Golgi -1000 TM domains (+2) -2000 mucinas -2000 glicosoma (PSORT II) -2000 Mitocondria (PSORT II) -2000 Peroxisoma (PSORT II) -2000 Lisosoma (PSORT II) -2000
La Tabla muestra los atributos priorizados y el valor de puntaje (positivo o negativo) asignado
en cada caso. Entre paréntesis se indican los predictores bioinformáticos utilizados. Los
atributos puntuables en TDR Targets se muestran en su inglés original (cursiva).
Además de los atributos derivados de distintos predictores informáticos, y para
circunscribir los resultados de la priorización a candidatos expresados en estadios de
25
mamífero, se incluyeron listas puntuadas de genes asociados a datos de expresión
experimentales. En particular se priorizaron aquellos candidatos reportados en
secretomas de trypomastigotes (69), trypomastigotes y amastigotes (91), así como datos
derivados de EST (Expressed Sequence Tags, TriTrypDB.org).
La aplicación de puntajes arbitrarios permitió posicionar a cada gen de T. cruzi
en un ranking a escala genómica, de acuerdo a la suma de sus atributos positivos o
negativos. Con el objeto de acotar el universo de estudio, se estableció una línea de
corte (cut-off) arbitraria correspondiente a un puntaje acumulado de 1300. Este puntaje
se definió debido a que por debajo del mismo no se encontraron señales “clásicas” (SP,
GPI) de secreción y direccionamiento nuclear (NLS), Fig. I.1 A.
26
Figura I.1. Priorización del genoma de T. cruzi de acuerdo a los parámetros puntuados en la
búsqueda bioinformática
A) Arriba: Se muestran los valores de puntaje arbitrario para cada gen anotado en el genoma de
T. cruzi (25000 genes). El recuadro (I) indica los candidatos situados sobre el cut-off arbitrario
de 1300 (línea de puntos). Abajo: Gráfico de torta mostrando la composición porcentual de este
grupo de genes candidatos. Las denominaciones putativas de los genes se mantuvieron en el
inglés de la base de datos del genoma de T. cruzi. Hypoth.: Hypothetical. B) Gráfico de barras
mostrando los puntajes arbitrarios correspondientes a los genes candidatos sobre el cut-off
definido en A (Selección 1, 107 genes).
Dicha línea de corte dejó sobre sí un conjunto de 107 genes (en adelante
Selección 1), compuestos en su mayor parte por proteínas hipotéticas conservadas en los
TriTryps (62 genes, 58%) o exclusivas de T. cruzi (10 genes, 9%). Dentro del restante
32%, se encontraron genes putativos inferidos por homología. Entre ellos se destacan:
-i) miembros de familias multigénicas de moléculas de superficie de T. cruzi (MASPs,
gp83/transialidasas); -ii) proteínas con motivos de unión a DNA, como por ejemplo
homólogos a Chromatin Assembly Factor 1B (CAF-1B) (92), helicasas, nucleasas; -iii)
27
proteínas con homología putativa a intermediarios en el metabolismo del RNA,
asociadas al complejo del exosoma de RNA, implicado en la degradación del RNA
celular (93), al RNA ribosomal o al editosoma (94); -iv) varias proteínas kinasas, y -v)
proteínas asociadas al sistema de ubiquitinación/proteasoma (95); Fig. I.1 B.
I.2 La Selección 1 comprende proteínas putativas de membrana asociadas al metabolismo de ácidos nucleicos y la ubiquitinación de proteínas El análisis de las señales putativas de secreción y direccionamiento nuclear de
los 107 genes sobre el cut-off arbitrario (1300) determinó que este grupo se componga
en su mayoría por candidatos que poseen señales de secreción “clásicas” (SP, GPI)
junto con señales de direccionamiento al núcleo. Además, la mayoría de sus miembros
(a excepción de las MASPs y gp85/transialidasas, con predicción de anclas de GPI) se
caracterizaron por pertenecer a proteínas putativas de membrana o secreción de Tipo I;
es decir, con sólo SP como señal de tránsito (Fig. I.2 A).
Mediante el análisis de Gene Ontology (GO), se evidenció para este grupo un
enriquecimiento significativo (respecto del genoma total de T. cruzi) en varios términos
de GO asociados al componente celular, proceso biológico, o función molecular
(categorías Celular Component, Biological Process, Molecular Function; Fig. I.2B, C y
D, respectivamente). En particular, y en concordancia con lo visto en el análisis de la
composición de este grupo respecto de la denominación putativa de sus miembros, se
evidenció un enriquecimiento en los términos asociados a la categoría Celular
Component relacionados con el exosoma (GO:0000176), ribosomas (GO:0015934) y al
complejo de ubiquitinación dependiente de proteínas de tipo Cullin-RING (96). Esto
último resulta llamativo si se tiene en cuenta que el único precedente de una proteína
secretada por T. cruzi y dirigida al núcleo de la célula hospedadora pertenece a la
familia RING (89); Fig. I.2B. En la categoría Biological Process, el análisis de
enriquecimiento de términos de GO mostró que se encuentran sobre-representados
términos asociados tanto al establecimiento y la regulación de la localización, transporte
y secreción de proteínas (GO:0045184, GO:0051223, GO:0050708) como a la
patogénesis (GO:0009405); Fig. I.2C. Por último, en la categoría Molecular Function se
28
vieron enriquecidos términos relacionados con la actividad 3’-5’ exo-nucleasa
(GO:0008408), el binding a: -i) DNA (GO:0003690), -ii) proteínas ligasas del sistema
de ubiquitinación (GO:0031625, GO:0044390) o -iii) proteínas de shock térmico
(GO:0031072); Fig. I.2D.
En su conjunto, estos resultados sugieren que los genes de la Selección 1
constituyen un subgrupo del genoma de T. cruzi enriquecido en funciones putativas
asociadas al metabolismo de ácidos nucleicos, fundamentalmente a la degradación del
RNA (93) y al metabolismo de proteínas, en particular a su ubiquitinación. Este último
proceso implica múltiples efectos pleiotrópicos inherentes al metabolismo celular, entre
los cuales pueden mencionarse la regulación del tránsito, localización y degradación de
proteínas (95, 97-99).
Figura I.2. Análisis de señales de tránsito y términos de Gene Ontology (GO) de los genes en la
Selección 1
A) Diagrama de Venn mostrando la distribución de las señales de secreción (SP, GPI) o
direccionamiento al núcleo (NLS) en los miembros no redundantes de la Selección 1.
29
B) Gráfico de barras mostrando el enriquecimiento porcentual de términos de GO de la
categoría componente celular (Celular Component). C) Ídem de B para la categoría Biological
Process. D) Ídem de B para la categoría Molecular Function. Los términos de GO se
conservaron en Inglés.
I.3 El análisis de anotación del ATG inicial muestra casos posibles de mala anotación del genoma o trans-splicing alternativo Con el objeto de comenzar la validación bioquímica de algunos candidatos, se
efectuó una curación manual de la Selección 1. Brevemente, dicha curación consistió
en: -i) la eliminación de genes cuya anotación del SP o GPI resultara obviamente
errónea; -ii) la presencia de segmentos transmembrana adicionales no superpuestos con
el SP predicho; -iii) el análisis funcional de las proteínas predichas utilizando
herramientas computacionales adicionales (PFAM, KEGG, InterPro, etc.); y -iv) su
potencial para participar en redes de interacción proteína-proteína y/o vías de
transducción de señales (atributos atractivos en un escenario hipotético de co-optación),
entre otros criterios.
Como resultado de esta nueva selección más restrictiva, se redujo el universo de
trabajo a 10 candidatos, que fueron elegidos para la caracterización bioquímica (Tabla
I.2). Entre éstos se destacan miembros de la familia multigénica de las MASPs y
proteínas hipotéticas sin función reconocida, pero entre las cuales se evidencia la
presencia de moléculas putativas posiblemente implicadas en la modulación de la célula
hospedadora (kinasas, proteínas de shock térmico, etc.).
Tabla I. 2. Candidatos emergentes luego de la curación manual de la Selección 1
Gene ID (TcCLB.5…) SPa TMb GPIc NLS/NESd,e Artibutos
Nuclearesf Otros
Atributosg
10205.50
(MASP 205) + - +
KEEGKRKKKKKIRRRRRRKSKK163
/ LPLLLVV260
Nucleolin
10241.10 (TCLP1) +
+
(superpuesto al SP)
- RAKEREVNIRKK318 RRLTQLREREAQRAARR244 Chaperone-
like motif
30
Gene ID (TcCLB.5…) SPa TMb GPIc NLS/NESd,e Artibutos
Nuclearesf Otros
Atributosg
10759.170 + +
(superpuesto al SP)
- RRWKEFLYNSSQRRMLK192
RMLKEADRMRR204
DNA binding motif
11249.80 + +
(superpuesto al SP)
- RKGKLRRE193/ LIFALFFSV26
DNA binding motif
10431.280 + - - DRRRGRLA87/ LALELTV376 mRNA editing motif
09139.20 - - - SRRRKTRRE448 DNA
binding motif
10181.60 + - - KKKRKL578/ LDKVAARLTI376 Chromatin remodeling
motif
11277.250 + - - KRKEREEKRRKERERRRRF391
KKKAEESTRLMEELKRKV 367/ IALFLGVLAM15
08479.150 + - - KKSKKKKKK72
KKKKKMFLKLFKRDKKEKD80 Ser/Threo
kinase
09979.20 + - - RKGRRRRRRR37
11283.200 + - - RKKGKRKMFMGRKK602 Leucine zipper motif
Los identificadores genómicos de los candidatos resultantes de la curación manual se indican en
forma abreviada (TcCLB.5…, columna 1). a Predicción funcional del péptido señal (SP) y los
motivos de clivado realizados mediante los programas SignalP 3.0 y Target P1.1. b Predicción
funcional de dominios transmembrana mediante el programa TMHMM 2.0. c Predicción
funcional de motivos de ancla de GPI mediante DGPI v.2.04 (de D. Buloz & J. Kronegg en
Swiss Institute of Bioinformatics, University of Geneva, Geneva, Switzerland). Todas las señales
fueron analizadas adicionalmente utilizando PSORT II. d,e Predicciones funcionales de señales
de localización nuclear (NLS) y de exportación nuclear (NES) realizadas mediante los
programas predictNLS y NLStradamus, y NetNES, respectivamente). La secuencia y posición
relativa de los NLS/NES predichos se indica en cada caso. f,g Predicciones de dominios o
motivos indicativos de funciones putativas realizado mediante SMART (Simple Modular
31
Architecture Research Tool) y CDD (Conserved Domain Database), herramientas disponibles
en NCBI. Se conserva el inglés del original.
Tal como se explicó en la Introducción, en los trypanosomátidos todos los
mRNAs inmaduros son sintetizados de manera poli-cistrónica y reciben capping y poli-
adenilación en un proceso denominado trans-splicing (37). Adicionalmente a este
proceso general explicado previamente, la remoción de las regiones 5’ río arriba de un
dado ATG (tractos de poli-pirimidinas, sitios AG) puede “desenmascarar” secuencias
crípticas de trans-splicing alternativo, generando dos productos distintos a partir de una
única secuencia génica. El trans-splicing alternativo es un proceso que tiene efectos
mayúsculos en el transcriptoma de los trypanosomátidos, afectando principalmente la
localización subcelular de proteínas (6, 41-44).
Todas estas evidencias indican que: -i) no se pueden realizar predicciones a
priori acerca de la localización subcelular de proteínas con predicción de SP, y -ii) las
posibles variantes de trans-splicing (si existen) deben ser detectadas antes del estudio de
un producto dado. De allí la importancia cardinal del análisis del ATG inicial.
Entonces, como primer paso previo a la validación bioquímica de los candidatos
seleccionados, se analizaron in silico los ORFs predichos para cada candidato mediante
un programa desarrollado específicamente para la detección de ORFs en T. cruzi
(resultados no publicados del Dr. Esteban Serra). Este programa calcula la
“probabilidad para ser codificante” de una dada región de un ORF tomando en cuenta
para ello el uso de codones de T. cruzi. Aunque efectuado también para los candidatos
miembros de la familia de las MASPs, este análisis cobró especial importancia para los
restantes candidatos, la mayoría genes hipotéticos de copia única, pudiendo presentar
errores de asignación del ATG inicial durante la anotación automática del genoma de T.
cruzi o bien ser susceptibles de trans-splicing alternativo. La aplicación del programa a
los candidatos más relevantes mostró varios casos (4/10, 40%) de posibles errores en la
asignación del ATG inicial o trans-splicing alternativo que se evidenciaron debido a
presentar bajas “probabilidades para ser codificante” en la región inicial de su secuencia
(Fig. I.3, G-J). Notablemente, estos candidatos presentan codones inicio (ATG)
alternativos justamente en las regiones donde la probabilidad se vuelve cercana a 1
32
(codificante). El análisis ulterior de la mayoría de ellos se trata más abajo
(TcCLB.510181.60 y TcCLB.511277.50) y en el Cap. II (TCLP-1). Además de estos
casos, el análisis de las regiones internas de baja probabilidad codificante en candidatos
con valores altos de probabilidad en sus regiones 5’ (Fig. I.3, D-F) también permitió la
identificación de posibles secuencias de adición de mini-exón con tractos de poli-
pirimidinas y sitios AG aceptores de mini-exón (SL, cfr. Introducción) bastante más
internas, río arriba de codones inicio (ATG) alternativos (Fig. I.4).
33
Figura I.3. Análisis de anotación y ATG inicial
Se muestra en cada caso el gráfico obtenido tras la aplicación del programa de predicción de
ORFs a los candidatos más relevantes de la Selección 1 (Tabla I.2). Se grafica la “probabilidad
(0-1) de ser codificante” versus posición en la secuencia nucleotídica (bp). A-C) Miembros de la
familia de las MASPs. D-F) Candidatos hipotéticos con valores de probabilidades altos en el
extremo 5’ (ATG inicial). G-J) Candidatos hipotéticos con valores de probabilidades bajos en el
extremo 5’.
Figura I.4. Identificación de posibles sitios de trans-splicing alternativo en dos candidatos con
valores altos de probabilidad en el extremo 5'
34
A) Gráfico de probabilidad codificante del candidato TcCLB.510759.170. Se muestran los
posibles codones inicio (ATG) a lo largo de la secuencia como líneas verdes sobre la caja negra
(arriba). Recuadro azul: Identificación de sitios posibles de trans-splicing alternativo. Se
muestra una región de secuencia interna con valores bajos de probabilidad codificante y el
alineamiento de dicha región en ortólogos del grupo T. cruzi. Los tractos de poli-pirimidinas se
muestran subrayados, los sitios AG aceptores en cursiva y los codones inicio (ATG) alternativos
en sombreado azul. B) Ídem para el candidato TcCLB.510431.280.
I.4 Validación bioquímica de las señales de tráfico citoplasma-núcleo De acuerdo a la hipótesis original de trabajo, y como etapa inicial de la
caracterización bioquímica de los candidatos, se eligió como estrategia la expresión
heteróloga de los mismos en células de mamíferos como versiones truncadas
desprovistas de SP ó GPI y fusionadas al N-terminal a la proteína verde fluorescente
(Green Fluorescent Protein, GFP) en el vector de expresión eucariota pEGFP. Esta
estrategia permitió evaluar la localización de la señal fluorescente de los constructos
mediante su transfección transiente en células (VERO ó HeLA) y así validar
bioquímicamente los NLS putativos. Alternativamente, los candidatos fueron clonados
como fusión C-terminal al epitope 3xFLAG en el vector pcDNA 3.1, con idénticos
resultados respecto de su localización. Como se muestra en la Fig. I.5A, la transfección
transiente de células HeLA con los candidatos más relevantes permitió la identificación
de un candidato cuya señal fluorescente se encontró claramente en el núcleo:
TcCLB.510181.60, con homología putativa al factor de remodelación de la cromatina 1-
B (CAF1-B). Aunque este candidato fue el único en exhibir localización nuclear, los
restantes candidatos no fueron descartados en este sentido, debido a que, como se
muestra en la Tabla I.2, varios de ellos poseían predicciones de señales de exportación
nuclear (NES, Nuclear Export Signal). Bajo el supuesto de poseer un NES funcional,
los candidatos con esta señal adicional podrían no presentar una localización nuclear
clara en su estado estacionario. Para “desenmascarar” NLS funcionales en proteínas con
translocación núcleo-citoplasma, se evaluó la intensificación de la señal nuclear
fluorescente en presencia de Leptomicina B (LMB), inhibidor de la exportación nuclear
mediada por CRM-1 (100), utilizando como control positivo del efecto de LMB, la
35
acumulación nuclear de la proteína AID::GFP (Activation-Induced Deaminase) (101).
En efecto, en presencia de LMB, los candidatos TcCLB.510241.10 (TCLP1, Cap. II),
TcCLB.510205.50 (MASP 205, Cap. III) y la proteína hipotética TcCLB.511277.250
mostraron acumulación nuclear (Fig. I.5B).
En suma, estos resultados muestran que varios (4/6) de los candidatos analizados
resultantes de la lista curada presentan NLS y NES funcionales validados in vivo.
Figura I.5. Validación bioquímica de las señales de localización nuclear
A) Micrografía de epi- fluorescencia mostrando la localización subcelular de candidatos
(TcCLB.5…) transfectados como versiones (SP, GPI) fusionadas a GFP (señal verde). Los
36
núcleos se tiñen con DAPI. Nucl: Nucleoplasmina (Control positivo nuclear), hAldo: Aldolasa
Humana (Control de citoplasma). La barra indica 5 m. B) Ensayo de Leptomicina B (LMB).
Micrografía de epi- fluorescencia de células tratadas (LMB+) o no (LMB-) con 30 ng/mL de
LMB. Se muestra el control positivo de AID::GFP (véase texto). La barra corresponde a 5 m.
I.5 TcCLB.510181.60 (CAF1-B) posee NLS funcional y es secretado en forma independiente de SP Como se mencionó en la sección precedente, los candidatos TcCLB.510181.60
y TcCLB.511277.250 mostraron localización nuclear en el ensayo de transfección de
células eucariotas bien en forma directa o luego del agregado de LMB, respectivamente
(Fig. I.5A y B). A los efectos de la validación de estos candidatos bajo la hipótesis
original de trabajo se efectuó una caracterización bioquímica de los mismos tendiente a:
-i) determinar la validez de las señales de secreción putativas y detectar su presencia en
extractos de secreción (o medios condicionados, CM) libres de células, y -ii) analizar el
patrón de expresión endógena de estos candidatos en estadios de T. cruzi. A fin de
realizar dicha caracterización se pusieron en práctica entonces diversos enfoques
bioquímicos complementarios entre sí que involucraron: -i) ensayos de RT- PCR (Retro
Transciptase-Polymerase Chain Reaction) a fin de validar la anotación del ATG inicial,
-ii) la transfección estable de parásitos axénicos (formas epimastigotes) con versiones
completas de los candidatos a fin de evaluar la localización subcelular de los mismos y
su eventual secreción al CM, -iii) el análisis de su expresión endógena en estadios de T.
cruzi mediante anticuerpos derivados de la inmunización de ratones y/o conejos con los
candidatos expresados en forma recombinante en bacterias o bien con péptidos
sintéticos derivados de su secuencia aminoacídica y acoplados a la proteína KLH
(Keyhole Limpet Hemocyanin, véase Mat. & Mét.).
Dado que el análisis de ortólogos junto con la validación del codón de inicio
mediante RT-PCR constituye un método efectivo para la detección de señales de
secreción N-terminales (SP) erróneamente anotadas (102), se efectúo un análisis
comparativo de los ortólogos del candidato CAF1-B (TcCLB.510181.60) respecto de la
anotación del ATG inicial. Como resultado de esta evaluación se pudo constatar que
ninguno de los ortólogos estudiados (a excepción de CAF1-B) posee predicción de SP y
37
que la anotación del codón de inicio para todos ellos se encuentra situado río abajo del
anotado para este candidato. En particular, los transcriptos de todos los ortólogos de
CAF1-B pertenecientes al “grupo T. cruzi” comienzan en el ATG169, que a su vez está
conservado y en fase traduccional en CAF1-B. Más aún, el alineamiento de las
secuencias nucleotídicas de ortólogos y CAF1-B permitió la detección de tractos de
poli-pirimidinas y sitios AG aceptores en este último (Fig. I.6A). Por otra parte, puede
notarse que este candidato tiene baja probabilidad codificante en los primeros 200
nucleótidos de su ORF anotado (Fig. I.3G). Todo esto sugeriría fuertemente que el SP
para CAF1-B sería artefactual y debido a un error de anotación.
Sin embargo, y con el objeto de constatar la localización subcelular de este
candidato en epimastigotes de T. cruzi, se transfectaron parásitos con las dos versiones
posibles de CAF1-B (ATG1-10181 y ATG169-10181) expresadas como fusiones
traduccionales al epitope 3xFLAG en su extremo C-terminal (Fig. I.6B). Al evaluar la
localización de dichos constructos mediante inmuno-fluorescencia indirecta (IFI)
utilizando el anticuerpo monoclonal (mAb) FLAG, se observó que para la versión
ATG1-10181 (con SP) la señal se localizó en un compartimiento anterior próximo a
zona de la base del flagelo, mientras que la forma ATG169-10181 mostró localización
mayormente nuclear, aunque también se observó cierta cantidad de señal en
compartimentos anteriores (Fig. I.6B). Aunque no se lograron obtener resultados
fidedignos para la expresión de ATG1-10181 (SP-CAF1-B) mediante Western-Blot
(WB), debido a la factibilidad de mecanismos alternativos de secreción descriptos en
trypanosomátidos (69-71), se eligió realizar una separación de microsomas/ER y
citoplasma empleada previamente (63) sobre epimastigotes transfectados con la versión
desprovista de SP (ATG169-10181, Fig. I.6C). Notablemente, en presencia de controles
apropiados (PAbP, BiP) y a diferencia del candidato TcCLB.510241.10 (TCLP1), se
detectó la presencia de ATG169-10181 en fracciones de membranas (ER). Además, y
utilizando como control de lisis celular a TcCLB.510241.10 (TCLP1), fue posible
detectar a ATG169-10181 en extractos de secreción (CM, Fig. I.6C). Estos resultados
sugieren: -i) que el candidato CAF1-B posee un NLS de función conservada en
parásitos y células eucariotas, y -ii) a pesar de la alta probabilidad del carácter
artefactual de su SP, es factible que sea secretado mediante algún mecanismo de
secreción alternativo (independiente de SP).
38
Figura I.6. Caracterización bioquímica del candidato TcCLB.510181.60 (CAF1-B)
A) Análisis de ortólogos. Arriba: Se muestra un alineamiento (cladograma) para los ortólogos
de CAF1-B más relevantes dentro de los TriTryps. En rojo se muestran los ortólogos sin
predicción de SP. En verde CAF1-B, SP positivo. Abajo: Alineamiento de las secuencias
nucleotídicas (primeras 180 bp) para CAF1-B y ortólogos. El ATG anotado para CAF1-B se
muestra con un asterisco, los restantes ATG se muestran como cajas sombreadas. Los tractos de
poli-pirimidinas y probables sitios AG aceptores se muestran subrayados y en cursiva,
respectivamente. B) Micrografías de epi-fluorescencia mostrando la señal del anticuerpo
FLAG correspondiente a la localización subcelular de ATG1-10181::3xFLAG (con SP) y
ATG169-10181::3xFLAG (sin SP). La barra corresponde a 5 m. C) Análisis mediante WB de
la expresión del constructo ATG169-10181::3xFLAG. Arriba: Distribución de ATG169-
10181::3xFLAG y 10241 (TCLP1) en fracciones de citoplasma (Cit) y microsomas (ER). Se
muestran como controles a PAbP y BiP, respectivamente. Abajo: Detección de ATG169-
39
10181::3xFLAG en extractos de secreción. WB (sobre-expuestos) con lisados totales (P) y
extractos de secreción (CM) para ATG169-10181::3xFLAG y 10241::3xFLAG (TCLP1,
utilizado como control negativo).
I.6 TcCLB.511277.250 muestra evidencias de trans-splicing alternativo y secreción estadio-específica Así como para CAF1-B, para el candidato hipotético TcCLB.511277.250
(11277) se evaluaron las predicciones de SP y los ORFs de sus ortólogos anotados en
los genomas de otros trypanosomátidos. En este caso sin embargo, la predicción de SP
se observó para todos los ortólogos, salvo para aquellos pertenecientes al grupo de
Leishmania spp. Además, al analizar el alineamiento de las secuencias nucleotídicas 5’
codificantes para los ortólogos SP positivos (grupos T. cruzi y T. brucei spp.), se detectó
en todos los casos inmediatamente río abajo del ATG inicial anotado un tracto de poli-
pirimidinas y un sitio AG aceptor seguidos de un segundo ATG en fase traduccional
con el primero (Fig. I.7A). Es interesante resaltar que si bien el programa de predicción
de ORFs determinó una región de baja probabilidad codificante en el extremo 5’ para el
ORF de este candidato, de manera similar a lo ocurrido para CAF1-B (Fig. I.3I), los
resultados obtenidos del análisis de ortólogos sugerirían en este caso más bien un
escenario de trans-splicing alternativo antes que de mala anotación del ATG inicial. A
diferencia de lo verificado para CAF1-B, para este candidato sí fue posible obtener un
producto de 320 bp en ensayos de RT-PCR sobre RNA total de estadios de T. cruzi,
utilizando cebadores correspondientes al Mini-Exón 2 (SL) de T. cruzi en todos los
casos y un cebador interno (reverso) específico derivado de la secuencia de cada
candidato. El subsiguiente clonado y secuenciación de este producto determinó
finalmente que el 5’ UTR (Un-Translated-Region) correspondiente a 11277 es de 73 bp,
sugiriendo que la primera metionina (ATG) o codón inicio es el anotado en los genomas
de T. cruzi y ortólogos exceptuando Leishmania spp. (Fig. I.7B). Además, la
secuenciación del extremo 5’ del mRNA maduro de 11277 corrobora la presencia del
tracto de poli-pirimidinas y sitio AG aceptor río arriba del segundo ATG en fase
traduccional. Aunque no pudo ser aislado, no podría ser descartada la existencia de un
40
producto más corto que incluyera solamente al segundo ATG. Este producto hipotético
daría como resultado una proteína desprovista de SP (Fig. I.7B).
Con el objeto de caracterizar la expresión de 11277 a nivel proteico, se llevaron
a la práctica dos estrategias complementarias de análisis: -i) la transfección de parásitos
con la versión “completa” (con SP) de 11277, y -ii) la obtención de anticuerpos de un
conejo inmunizado con el péptido N353-EVDDSEEKEEIIQ-C365 derivado de la
secuencia de 11277. Mediante el uso de este anticuerpo (1277) en ensayos de IFI sobre
epimastigotes transfectados se verificó un patrón de expresión citoplasmático para
11277. Este patrón fue similar aunque no idéntico en epimastigotes WT (Wild Type, CL
Brener). El anticuerpo 1277 también mostró una señal bastante intensa en amastigotes
y mucho menos intensa en trypomastigotes WT. En parásitos WT, la expresión de
11277 se mostró más claramente asociada a “parches” discretos, algunos de ellos
compatibles conle localización en la membrana plasmática (Fig. I.7C). Esto último sería
además compatible con datos proteómicos ya reportados que incluyen a este candidato
(91, 103, 104) y (105). El análisis de la expresión endógena de 11277 mediante WB
arrojó resultados similares a los obtenidos en IFI: la expresión mayor se apreció en
epimastigotes (Fig. I.7E), seguida de amastigotes (Fig. I.7F) y trypomastigotes (Fig.
I.7G). El análisis de WB sobre extractos de citoplasma, ER y secreción en epimastigotes
recombinantes determinó la existencia de varias bandas tanto citoplasmáticas como
microsomales de pesos moleculares diversos, sin observarse ninguna banda en extractos
de secreción (CM, Fig. I.7D). Notablemente, dichas bandas presentaron una distribución
diferencial en las fracciones evaluadas. En particular, la banda de 55 kDa fue detectada
mayoritariamente en el citoplasma, mientras que en la fracción de ER se detectaron
bandas de mayor peso molecular (70 y >70 kDa). Todas estas observaciones serían
compatibles con eventos de trans-splicing alternativo (evidenciados más arriba) dando
lugar a la existencia de dos versiones (una citoplasmática y una reticular) de 11277. Por
otro lado, el tamaño mayor de la forma reticular de este candidato podría deberse a
modificaciones post-traduccionales.
Con respecto a la expresión endógena de 11277, el análisis de WB mostró que,
además de presentar niveles de expresión aparentemente estadio-dependientes, en el
único estadio en que se observa retención reticular es en el epimastigote (Fig. I.7E-G),
en forma similar a lo observado para los parásitos recombinantes (Fig. I.7D). Así, al
41
evaluar la expresión de 11277 en amastigotes y trypomastigotes, sólo se pudo detectar a
la versión citoplasmática (55 kDa) de este candidato. Por otra parte, al evaluar la
presencia de esta proteína en sobrenadantes de secreción (CM), se evidenció su
presencia únicamente en estadios de mamífero (amastigotes, trypomastigotes, Fig.
I.7H). Estas evidencias permitirían inferir que las diferencias en la distribución de
bandas en epimastigotes respecto de amastigotes y trypomastigotes podrían deberse a
algún mecanismo de regulación de la secreción estadio-específica de este candidato.
Figura I.7. Caracterización bioquímica del candidato hipotético TcCLB.511277.250 (11277)
42
A) Análisis de ortólogos. Derecha: Se muestra el alineamiento (cladograma) para los ortólogos
de 11277 más relevantes dentro de los TriTryps. En rojo se muestran los ortólogos sin
predicción de SP, en verde los SP positivos. Izquierda: Alineamiento de las secuencias
nucleotídicas (primeras 120 bp) para 11277 y sus ortólogos positivos para SP (grupos T. cruzi
spp. y T. brucei spp.). Los ATG (2) en fase traduccional se muestran como cajas sombreadas, y
el primer ATG (anotado en el genoma) con asterisco. El tracto de poli-pirimidinas y el sitio AG
aceptor se muestran subrayados y en cursiva, respectivamente. B) Derecha: Ensayo de RT-PCR
sobre RNA total de estadios de T. cruzi utilizando el oligonucleótido específico (reverso)
REV262. RT+: ensayos positivos (con transcriptasa reversa), RT-: ensayos negativos
(controles). Se utilizaron oligonucleótidos específicos para UBP-1 como control sobre RT+,
RT- y DNA genómico de CL Brener (gDNA). pUC, 400bp: marcadores de longitud (bp).
Izquierda: Secuenciación de clones (3) correspondientes al producto aislado (320 bp) en el
ensayo de RT-PCR. Las secuencias de los oligonucleótidos T. cruzi Mini-Exón 2 (SL, directo) y
REV262 (reverso) y los ATG en fase traduccional se muestran con cajas sombreadas. El tracto
de poli-pirimidinas y el sitio AG aceptor se muestran subrayados y en cursiva, respectivamente.
Se indica la secuencia aminoacídica (traducción) del SP para 11277 sobre la secuencia
nucleotídica. C) Micrografías de epi-fluorescencia mostrando la señal del anticuerpo 1277
sobre -arriba: epimastigotes transfectados con ATG1-11277 (completo, con SP), -centro:
epimastigotes WT (CL Brener), -abajo: amastigotes y trypomastigotes WT. Se indican los
tamaños con barras (5 y 2 m). D) Análisis de WB (1277) sobre fraccionamientos
subcelulares (Citoplasma/ER) y extractos de secreción de epimastigotes transfectados con
11277. E-G) Análisis de WB (1277) sobre fraccionamientos (Citoplasma/ER) de epimastigotes
(E), amastigotes (F) y trypomastigotes (G) CL Brener (WT). H) Detección de 11277 en
extractos de secreción. Arriba: Análisis de WB (1277) sobre lisados totales de epimastigotes
(E), amastigotes (A) y trypomastigotes (T) CL Brener. Abajo: Análisis de WB (1277) sobre
extractos de secreción de E, A, T (CL Brener).
43
Discusión
En este capítulo se mostraron los resultados obtenidos de una priorización
genómica a fin de identificar moléculas efectoras expresadas en estadios de T. cruzi
asociados al hospedero mamífero, secretadas al medio extracelular y principalmente
dirigidas al núcleo de la célula hospedadora, así como los resultados de la
caracterización bioquímica inicial de algunos candidatos identificados. Los antecedentes
en T. cruzi de proteínas que cumplan con las condiciones de la hipótesis original de
trabajo se limitan hasta el momento a un único caso (89). Además, el conocimiento del
secretoma es pobre, con escasos avances recientes en su exploración a nivel proteómico
(69). Más aún, estos enfoques proteómicos no aportan información adicional respecto a
nuevas moléculas secretadas, sino que más bien abundan en la identificación de familias
multigénicas de vasta representatividad a nivel genómico ya ampliamente caracterizadas
como gp85/transialidasas, mucinas, MASPs, etc (13, 63, 106-108). De modo tal que
cualquier aporte alternativo es valioso a fin de identificar y validar nuevos efectores de
T. cruzi implicados en la co-optación de las funciones de la célula hospedadora. En este
sentido, el desarrollo y la aplicación de una herramienta de priorización a escala
genómica basada en la plataforma TDRTargets (90, 109) permitió la identificación de
nuevos posibles efectores, la mayoría de los cuales resultaron ser hipotéticos.
Desde un punto de vista funcional, los candidatos hipotéticos encontrados fueron
analizados mediante la inspección de: -i) sus asignaciones funcionales putativas, -ii)
términos de KEGG, y -iii) términos de GO. Con respecto a sus anotaciones funcionales,
los pocos candidatos no hipotéticos mostraron anotaciones asociadas al metabolismo de
ácidos nucleicos (DNA, RNA), ubiquitinación, actividad kinasa, y además el subgrupo
de MASPs y transialidasas. Aunque mediante el análisis de términos KEGG no fue
posible establecer una vía metabólica especialmente representada, el análisis de
enriquecimiento de términos de GO evidenció un aumento significativo en procesos y
funciones relacionadas con la unión a ácidos nucleicos, el exosoma de RNA y la
ubiquitinación. Esto último se relaciona con la proteína SPRING, ya reportada en la
modulación de las funciones de la célula hospedadora (89). Por otra parte, y dado que el
mayor volumen de información proteómica asociada a secretomas en trypanosomátidos
proviene de trabajos realizados sobre Leishmania spp. (70, 71, 110), vale destacar que
44
en el secretoma de Leishmania donovani, se encontraron también enriquecidos términos
de GO asociados al metabolismo de ácidos nucleicos (fundamentalmente RNA y
traducción), así como funciones relacionadas a la unión a ácidos nucleicos (71).
Desde un punto de vista estructural, y con excepción de las MASPs, la mayoría
de los candidatos hallados resultaron ser proteínas hipotéticas de “Tipo I” es decir,
portadoras solamente de un péptido señal N-terminal (SP) de direccionamiento al ER.
Este aspecto es destacable, ya que diferencia estructural y mecanísticamente al grupo de
candidatos encontrado respecto de familias multigénicas (transialidasas, mucinas),
donde tanto la asociación a la membrana como la liberación al medio externo están
relacionadas a la presencia de anclas de GPI (21, 63) o su secreción a través de
vesículas (104, 105). Debido a la alta prevalencia de este tipo de proteínas en T. brucei
(por ejemplo, ISGs (111)), pero escasas en T. cruzi y Leishmania (110), el análisis
exhaustivo de los ORFs respecto de la anotación del ATG inicial cobró especial
relevancia. La aplicación de un programa de predicción de ORFs a los candidatos más
relevantes no solamente aportó datos interesantes respecto de la anotación del codón
inicio, sino además a la identificación de posibles regiones de trans-splicing alternativo,
proceso bastante reportado en trypanosomátidos (6, 41, 42, 44). Para el candidato
hipotético 11277 en particular, fue posible detectar dos “isoformas” con distinta
localización subcelular, probablemente debidas a un fenómeno de trans-splicing
alternativo afectando al SP.
Por otra parte, durante el desarrollo de la presente Tesis, resultados obtenidos
por otros grupos analizando los secretomas de Leishmania spp. determinaron que la “vía
clásica” (ER/ Golgi dependiente) mediada por SP podría no representar la forma más
conspicua de secreción en estos parásitos. Más precisamente, los trabajos sobre los
secretomas de Leishmania (Viannia) braziliensis (70) y Leishmania donovani (71)
mostraron una muy baja representatividad de proteínas con SP putativo. En su lugar, se
evidenció la presencia de mecanismos alternativos de secreción relacionados con
exosomas que podrían por otra parte estar conservados en T. cruzi (69, 72). En este
sentido, puede destacarse la detección en extractos de secreción del candidato CAF1-B
(TcCLB.510181.60) recombinante expresado sin SP en epimastigotes. Este hecho
supone la existencia de algún mecanismo alternativo de secreción independiente de SP
45
debido a que este candidato exhibe una localización subcelular mayoritariamente
nuclear, conservada respecto de células eucariotas y su ortólogo en T. brucei (112).
Con respecto a la caracterización bioquímica funcional del NLS, además de los
candidatos 11277 y CAF1-B, se encontraron NLS funcionales en TcCLB.510241.10
(TCLP1) y miembros de la familia multigénica de las MASPs. Dadas sus características
particulares, estas moléculas son tratadas en los Caps. II y III respectivamente.
Cabe destacar que hasta el momento solamente se identificaron dos candidatos
estrictamente relacionados con la hipótesis de trabajo de la búsqueda bioinformática y
que parecen cumplir con las premisas de dicha hipótesis. Sin embargo, su
caracterización funcional no es completa en este punto y debe continuarse así como la
de otros candidatos interesantes no reportados aquí pero presentes en nuestra
priorización genómica, que como tal representa aún un punto de partida hacia el
descubrimiento de nuevas moléculas efectoras.
46
Capítulo II. Caracterización de TCLP1
Introducción
Como se mencionó anteriormente, una característica definitoria de los
trypanosomátidos es la presencia de un único flagelo requerido para su movilidad, que
emerge desde el cuerpo de la célula a través del BF. Esta organela no sólo representa
una cavidad, sino que constituye un sitio activo y estratégico, participando en procesos
como la replicación, morfogénesis y el mantenimiento de la polaridad celular, entre
otros (113). De importancia superlativa, la membrana del BF constituye la única
superficie en el cuerpo del parásito que carece de la red de microtúbulos subpeliculares
(114). El espaciamiento estrecho y el entrecruzamiento de los microtúbulos en esta red
impone un impedimento estérico que restringe a los procesos de endo/exocitosis
específicamente a la membrana del BF (114, 115).
El papel fundamental del BF en la endo/exocitosis ha sido delineado en forma
detallada en T. brucei, donde esta organela regula el reciclado de moléculas de
superficie, o la adquisición de nutrientes esenciales (113). Brevemente, la endocitosis
dependiente de clatrina es la ruta principal para la internalización de proteínas ancladas
por GPI (principalmente VSGs) y de tipo I (ISGs) en T. brucei, proceso que es esencial
y regulado de acuerdo al estadio (116, 117). Aunque las VSGs se encuentran
distribuidas en toda la membrana plasmática, el movimiento flagelar actúa
direccionando complejos de VSG opsonizada por inmunoglobulinas hacia el BF para su
internalización, constituyendo así un mecanismo de evasión de la respuesta inmune
(118). La endocitosis de ISGs, que se localiza exclusivamente en el BF, requiere además
de la ubiquitinación de residuos de lisinas citoplasmáticos (119). En T. cruzi, por otro
lado, la endocitosis está íntimamente relacionada con la adquisición de nutrientes y la
metaciclogénesis, proceso que a su vez es activado por stress nutricional (120). En
resumen, tanto la secreción como la retención selectiva y el reciclado de moléculas en el
BF son procesos altamente regulados en trypanosomátidos (115, 118).
Espacialmente, el BF se encuentra en una posición precisa respecto de otras
organelas y compartimentos del sistema secretor, como por ejemplo el ER, el Golgi, los
47
cuerpos multivesiculares, endosomas y la vacuola contráctil (CV), una organela
especializada en la osmoregulación y probablemente también involucrada en secreción
(121-123). Es importante destacar que el BF posee una organización compleja, con
límites que claramente demarcan sub-dominios espacial y funcionalmente distintivos (3,
113). Entre los sub-dominios más prominentes se pueden mencionar: -i) el collar, que se
encuentra en el cuello del BF, donde el flagelo emerge del cuerpo celular, -ii) el
collarette, donde el flagelo ingresa en el cuerpo celular y presumiblemente sirva de
anclaje entre la membrana y el axonema del flagelo, y -iii) el lumen, una invaginación
de la membrana plasmática externa llena con una matriz abundante en hidratos de
carbono pero de composición desconocida. Tanto el collar como el collarette están
asociados a estructuras organizadas y conectadas a través de la membrana y el
citoesqueleto (113).
Hasta hoy, sólo unas pocas proteínas asociadas al contexto del BF han sido
descriptas y caracterizadas. Sin embargo, la mayoría de ellas demostraron ser
esenciales, debido a que su pérdida o direccionamiento erróneo llevaron a defectos
morfológicos disruptivos de funciones celulares (113). Además el hecho de que la
endocitosis está profundamente relacionada con la virulencia, diferenciación,
supervivencia y transporte de drogas (121, 122), señala al BF como un blanco
terapéutico particularmente valioso.
En el presente capítulo se mostrarán los resultados de la caracterización de una
nueva proteína asociada al BF de T. cruzi.
Resultados
II.1 TCLP1 pertenece a una nueva familia de proteínas quiméricas conservadas en trypanosomátidos
TCLP1 (TcCLB.510241.10) fue inicialmente identificada debido a que emergió
como uno de los candidatos susceptibles de validación en la búsqueda bioinformática
(Cap. I), debido a que posee predicciones para señales de secreción (SP) y de
direccionamiento al núcleo (NLS/NES, respectivamente).
48
Anotada en TriTrypDB (http://tritrypdb.org/tritrypdb/) como una proteína
hipotética conservada de 776 aminoácidos, TCLP1 posee tres dominios inferidos por
homología: -i) un dominio N-terminal “Ubiquitin-like” (ULD) (95), con homología a
Rad23 (124), -ii) un dominio (IPRO10261) con homología estructural a CesT
(Chaperone for E. coli secretion of Tir), una chaperona conservada en bacterias
enteropatógenas involucrada en la exportación de factores de virulencia a través del
sistema de secreción de tipo III (Type III Secretion System, TIIISS) (125, 126), en
adelante referido como CEST, y -iii) un dominio C-terminal PSD95/Dlg1/zo-1 (PDZ)
(127) involucrado en interacciones proteína-proteína. Adicionalmente a estos dominios
automáticamente asignados, un análisis in silico más profundo determinó que TCLP1
posee una predicción de SP N-terminal y dos NLS putativos: uno localizado entre el
dominio ULD y CEST y un NLS bi-partito entre CEST y PDZ. Además, se detectó una
NES entre los dominios ULD y CEST (Fig. II.1).
Figura II.1. Secuencia predicha y dominios putativos de TCLP1
Se muestra la secuencia de TCLP1 anotada en TriTrypDB y los dominios y motivos inferidos
por homología presentes en la misma. Abreviaturas: SP, péptido señal; ULD, Ubiquitin-like
Domain, NLS, Nuclear Localization Signal, NES, Nuclear Export Signal, CEST, Chaperone for
E. coli Secretion of Tir (dominio), PDZ, dominio PSD95/Dlg1/zo-1.
El hallazgo de un dominio procariota (CEST) en TCLP1 nos condujo a realizar
un análisis filogenético más exhaustivo. Dentro del gran grupo Eukarya, CEST sólo se
49
encuentra presente en el orden Kinetoplastida, representado en este caso por distintas
especies de los géneros Leishmania spp. y Trypanosoma spp. Este análisis mostró
además que el motivo CEST de las proteínas CEST-like de trypanosomátidos comparte
mayor similitud de secuencia con el grupo procariota Chlamydiae/Verrucomicrobia,
compuesto por patógenos intracelulares obligados que expresan TIIISS funcionales
durante todo su ciclo infectivo (128, 129) (Fig. II.2A).
Dentro de los trypanosomátidos, las proteínas poseedoras el motivo CEST en su
secuencia (en adelante, proteínas CEST-like), mostraron ser todas quiméricas, con dos
arquitecturas de dominios, que a su vez definen dos subgrupos o tipos monofiléticos: -i)
el Tipo I, compuesto por proteínas CEST-like que además contienen los dominios ULD
y PDZ (ULD-CEST-PDZ), o bien; -ii) el Tipo II, proteínas CEST-like de donde el
dominio PDZ C-terminal falta (ULD-CEST). Además, mientras que el Tipo II se
encuentra presente en todos los géneros de trypanosomátidos, el Tipo I se encuentra
ausente en los Trypanosomas africanos (T. brucei spp., Fig. II.2B y C). Debido a que el
Tipo I representa al grupo monofilético más divergente en los trypanosomátidos, y que
por otra parte, no se encuentran otras proteínas CEST-like (de ningún tipo) fuera de este
grupo eucariota, una hipótesis posible acerca del origen evolutivo de estas proteínas
implicaría que: -i) el motivo CEST habría sido transferido horizontalmente desde las
Chlamydiaceae hacia algún ancestro trypanosomátido, -ii) las proteínas CEST-like de
Tipo II se habrían originado a partir de la duplicación génica a partir del Tipo I, y la
pérdida posterior del dominio PDZ, y -iii) el Tipo I habría sido perdido
secundariamente en los Trypanosomas africanos.
50
Figura II.2. Análisis filogenético de TCLP1 y sus ortólogos en Bacteria y Trypanosomatidae
A) Alineamiento simplificado (ClustalW) entre el motivo CEST de TCLP1 y las proteínas CesT
procariotas más relevantes. Los aminoácidos conservados en TCLP1 y sus ortólogos bacterianos
se muestran sombreados. El porcentaje de similitud entre TCLP1 y cada ortólogo se muestra a
la derecha (%). B) Árbol filogenético entre proteínas CEST-like de trypanosomátidos y
ortólogos bacterianos, mostrando a E. coli como raíz (grupo externo). La arquitectura de
dominios (Tipo I, ULD-CEST-PDZ (rojo); Tipo II, ULD-CEST (verde) o CEST (celeste)) se
indica con cajas redondeadas a la derecha de cada clado. C) Árbol basado en un alineamiento
(ClustalW, 100 Bootstrap) entre proteínas CEST-like (Tipos I y II) de trypanosomátidos. Se
indican los valores de Bootstrap en las ramas principales. La escala indica la distancia
(sustitución de aminoácidos) para cada rama. Abreviaturas: TcCLB…, T. cruzi CL Brener;
MOQ, T. cruzi marinkellei; TCSYLVIO, T. cruzi Sylvio cepa X-10; Lbr, Leishmania
braziliensis; Lta, L. tarentolae; Lmx, L. mexicana; Lmj, L. major; Lin, L. infantum; LDBPK, L.
donovani; Tb, T. brucei; Tbg, T. brucei gambiense; TvY, Trypanosoma vivax.
51
II.2 El motivo CEST de TCLP1 presenta similitud estructural con chaperonas del TIIISS de Salmonella sp Con el objeto de evaluar la posible similitud estructural del motivo CEST
presente en TCLP1 respecto de chaperonas bacterianas relacionadas, se realizó una
búsqueda de estructuras obtenidas experimentalmente (templados en formato PDB)
utilizando la plataforma otorgada por el servidor SWISS-MODEL (130). Debido a que
no fue posible encontrar templados pertenecientes a Chlamydiaceae, dos estructuras
derivadas de Salmonella enterica fueron elegidas de acuerdo a su similitud con CEST.
El primer templado (código PDB: 3epuA) corresponde a la estructura obtenida por
difracción de rayos-X con una resolución de 2.5 Å de la chaperona del TIIISS SrcA
(131), mientras que el segundo (1jyoD) corresponde a la estructura de la chaperona SicP
(1.9 Å) (132).
Aunque los alineamientos entre las secuencias del motivo CEST de TCLP1 y
3epuA ó 1jyoD mostraron baja homología de secuencia (19 y 17%, respectivamente,
Fig. II.2A), al realizar predicciones de estructura secundaria mediante los predictores
independientes PROMALS3D (133) y JPred (134), se encontró una apreciable
superposición de estructuras de tipo hélices ó láminas β entre estas tres proteínas (Fig.
II.3A). Utilizando 3epuA o 1jyoD como templados para modelar la estructura
tridimensional del motivo CEST de TCLP1, se observó asimismo una razonable
superposición de las láminas plegadas β hidrofóbicas y hélices externas previamente
reportadas para la chaperona SicP (132) (Fig. II.3B). Los valores QMEAN (algoritmo
utilizado para estimar la calidad de alineamientos estructurales) de los modelos de
CEST basados en 3epuA o 1jyoD fueron de 0.627 y 0.601 respectivamente, que pueden
ser considerados aceptables (135). Más aún, al superponer las estructuras de 3epuA y
1jyoD para construir un modelo, se obtuvo un valor de QMEAN de 0.638, no muy
distinto a los valores obtenidos para el motivo CEST de TCLP1 (Fig. II.3B).
Estos resultados muestran entonces que pese a la baja similitud de secuencia del
motivo CEST de TCLP1 respecto de sus homólogos bacterianos, existe sin embargo
homología estructural apreciable y comparable a la que se observa entre distintas
chaperonas procariotas del TIIISS.
52
Figura II.3. Conservación estructural entre el motivo CEST de TCLP1 y chaperonas del TIIISS
de Salmonella spp
A) Las secuencias del motivo CEST de TCLP1 y las estructuras PDB 3epuA y 1jyoD fueron
alineadas con el programa PROMALS3D. Los motivos de estructuras secundarias para ambas
moléculas se muestran como cajas negras sólidas ( hélices) o vacías (láminas ß). Los motivos
de estructura secundaria calculados independientemente para el motivo CEST de TCLP 1
utilizando el predictor Jpred3 se muestran como cajas grises sólidas ( hélices) o vacías
(láminas ß). B) Superposición de modelos tridimensionales para el motivo CEST en TCLP1 con
los templados 3epuA y 1jyoD. Izquierda: modelo I (basado en 3epuA, rojo) superpuesto con la
estructura 3epuA (verde). Medio: modelo II (basado en 1jyoD, rojo) superpuesto con la
53
estructura 1jyoD (azul). Derecha: Modelo de 1jyoD basado en 3epuA (verde) superpuesto con la
estructura de 1jyoD (azul). Los valores QMEAN se muestran bajo cada panel.
II.3 El motivo CEST de TCLP1 complementa funcionalmente a SicP de Salmonella typhimurium Dada la similitud estructural encontrada para el motivo CEST de TCLP1 y las
estructuras cristalográficas de chaperonas bacterianas pertenecientes al TIIISS, la
plausibilidad de una eventual conservación de la funcionalidad de este dominio en
bacterias enteropatógenas resultó una cuestión de sumo interés desde el punto de vista
evolutivo y como posible blanco de intervención terapéutico para el desarrollo de
agentes antiparasitarios.
A fin de evaluar esta posibilidad, se eligió la cepa bacteriana Salmonella
enterica serovar Typhimurium LT2 (S. thyphimurium LT2) como sistema ideal para
generar una cepa mutante por deleción de la chaperona SicP, que contribuye a la
virulencia de este patógeno (136), y que se corresponde exactamente con 1jyoD, una de
las estructuras con mayor similitud al dominio CEST de TCLP1 mostradas en la sección
anterior. Por otra parte, esta bacteria puede manipularse genéticamente con relativa
facilidad mediante transformación directa con fragmentos de DNA lineales
parcialmente homólogos a través el sistema de recombinasas del bacteriófago “ Red”
(137). Utilizando este sistema, se introdujo el cassette de resistencia a cloranfenicol
interrumpiendo el locus sicp en el genoma de S. thyphimurium LT2 transformadas
establemente con el sistema “ Red” (genes gam, bet y exo contenidos en el vector
pkD46), mediante el producto de PCR obtenido a partir de la construcción SicP::CAT::
pGEM-T easy con los oligonucleótidos T7 y SP6 (Fig. II.4A y Fig. AI.4A, B). Se
obtuvieron de este modo varios clones resistentes a cloranfenicol y positivos para la
inserción del cassette de resistencia, dando como resultado amplicones de 1200 bp
respecto del producto de 400 bp obtenido con oligonucleótidos SicP F y SicP R y
esperado para S. thyphimurium LT2 WT (Fig. II.4A, B). Otros análisis genotípicos no
mostrados terminaron de verificar la correcta inserción del cassette de resistencia.
54
Con el objeto de complementar funcionalmente esta cepa carente de SicP, se
generaron dos construcciones que fueron expresadas en forma ectópica mediante el
vector pbbr: -i) RBS::SICP (445 bp), consistente en la proteína completa SicP de
S. thyphimurium LT2 precedida de la secuencia de unión al ribosoma (RBS) y un
epitope 6xHis y -ii) RBS::CEST (485 bp), consistente en el motivo CEST de TCLP1
precedido de RBS y 6xHis. Además, y como sistema reportero a fin de evaluar el
fenotipo de las cepas WT, mutantes por deleción de SicP, y mutantes complementadas
con RBS::SICP ó RBS:: CEST, se generó la construcción SptP::3xFLAG (Fig. II.4C y
Fig. AI.4D), consistente en el efector SptP, una fosfatasa de tirosinas que cuando es
secretado en forma exclusivamente dependiente de SicP altera el citoesqueleto de actina
de la célula hospedadora pero que en ausencia de esta chaperona del TIIISS es retenido
en el citoplasma y eventualmente degradado (136, 138).
Al evaluar los perfiles electroforéticos de los extractos totales y de secreción de
las cepas WT y mutantes de deleción para SicP, se observó que mientras los extractos
totales permanecieron sin cambios apreciables en todas las cepas, los extractos de
secreción en las cepas mutantes mostraron perfiles mucho menos intensos, compatibles
con una secreción alterada. Por otra parte, la expresión ectópica de SicP en cepas WT
produjo también cambios en la distribución de bandas en su perfil de secreción,
sugiriendo que probablemente la secreción mediada por SicP esté finamente regulada en
forma quizás estequiométrica (Fig. II.4D arriba). Este efecto se reprodujo en forma
similar en cuanto a la secreción del reportero SptP::3xFLAG evaluada mediante WB en
los mismos extractos con el mAb FLAG: no se detectó señal para SptP::3FLAG tanto
en extractos totales como de secreción en bacterias WT complementadas con SicP. Este
fenómeno puede deberse al acoplamiento traduccional de SicP con SptP y el hecho de
que en ausencia de dicho acoplamiento, el mRNA de sptp adopta una estructura
inhibitoria que impide su traducción (138). No obstante esto, fue posible restaurar la
secreción y expresión de SptP (ausente en extractos de secreción y totales en cepas
mutantes por deleción de SicP y transformadas sólo con el vector parental pbbr) tanto
mediante la expresión de RBS::SICP como de RBS::CEST, demostrándose entonces
que el motivo CEST presente en TCLP1 de T. cruzi está funcionalmente conservado
como una chaperona activa en el TIIISS de S. thyphimurium LT2.
55
Figura II.4. Complementación de la cepa mutante de deleción para SicP con el motivo CEST
de TCLP1
A) Construcciones utilizadas para la deleción de SicP mediante el sistema de recombinación
homóloga -red. Arriba: construcción SICP::CAT::pGEM T easy utilizada para obtener la
secuencia lineal de SicP interrumpida por el gen de resistencia a cloranfenicol (CAT) mediante
oligonucleótidos T7, SP6 (flechas blancas). Esta secuencia de DNA lineal (1200 bp) recombina
en forma homóloga con SicP endógeno (abajo). B) Clones positivos (2,3,5 y 8) para la
interrupción del ORF de SicP mediante PCR utilizando oligonucleótidos SicP F, SicP R (A,
flechas blancas). La calle 9 (-) corresponde al control sin templado y la calle 10 a S.
thyphimurim LT2 WT (producto de 400 bp). C) Arriba: construcciones utilizadas para la
expresión ectópica de SICP o el motivo CEST de TCLP1 mediante el vector pbbr-mcs2 en
cepas WT o carentes de SicP (complementación). Abajo: construcción con el efector SptP como
fusión N-terminal al epitope 3xFLAG (SptP::3xFLAG, reportero, véase además Fig. AI.4). D)
Arriba: Perfiles electroforéticos (Coomassie-Blue PAGE) de extractos totales (izq.) y de
secreción (der.) para las cepas WT y mutante de deleción de SicP (KO). Abajo: Análisis de WB
56
con anticuerpo FLAG y detección de SptP::3xFLAG en extractos totales (izq.) y de secreción
(der.) para las cepas WT y mutante de deleción de SicP (KO).
II.4 Ortólogos y parálogos de TCLP1 presentan evidencia de expresión estadio-específica en los TriTryps
El análisis de datos bibliográficos mostró que existe evidencia experimental de la
expresión diferencial así como de fenotipos asociados para algunos ortólogos y
parálogos de TCLP1 (Tabla II.1). En T. cruzi, tanto TCLP1 (Tipo I) como sus parálogos
de Tipo II (TcCLB.504137.70 y TcCLB.504057.50) poseen evidencia de expresión
estadio-específica a nivel transcripcional. Mientras que TCLP1 aparece con niveles
positivos de mRNA en amastigotes y epimastigotes, TcCLB.504137.70 aparece con
niveles positivos en amastigotes y trypomastigotes metacíclicos, y TcCLB.504057.50
en epimastigotes y trypomastigotes metacíclicos (139). En Leishmania spp. también
existen evidencias de expresión diferencial. La expresión del mRNA de la proteína
CEST-like de Tipo I LinJ.04.0710 de Leishmania infantum aumenta en amastigotes
intracelulares, mientras que sus parálogos de Tipo II, LinJ.31.0770 y LinJ.34.2950, se
encuentran disminuidos (140). Por otra parte, tanto LmxM.04.0710 (Tipo I), y
LmxM.30.0740 (Tipo II) fueron detectadas en el secretoma de amastigotes
intracelulares de Leishmania mexicana (141). Finalmente, en T. brucei, Tb.927.10.9240
(parálogo de Tipo II), produce un fenotipo de crecimiento anormal al día 6 post-
inducción de su silenciamiento mediante RNA de interferencia (142), y su mRNA
aumenta levemente durante el shock térmico (143).
57
Tabla II.1. Evidencia de expresión y fenotipos reportados para TCLP1 y ortólogos relacionados
GI Clase Evidencia de expresión/Fenotipo Reportado en TcCLB.510241.10
(TCLP1) I Epimastigotes, Amastigotes
TcCLB.504137.70 II Amastigotes, Metacíclicos
TcCLB.504057.50 II Epimastigotes, Metacíclicos
(139), Esta Tesis (TCLP1)
LinJ.04.0710 I Amastigotes intracelulares
LinJ.31.0770 LinJ.34.2950 II Expresión regulada negativamente en Amastigotes
(141)
LmxM.04.0710 I LmxM.30.0740 II Secretoma de Amastigotes (141)
Crecimiento anormal en formas sanguíneas (142) Tb.927.10.9240 II
Ligero incremento de expresión durante shock térmico, procíclicos (143)
La Tabla muestra las evidencias experimentales colectadas de la bibliografía respecto de la
expresión y fenotipos observados para TCLP1 y sus ortólogos de tipo I y II en
trypanosomátidos. GI: Identificador Genómico.
II.5 El transcripto maduro de TCLP1 se detecta en T. cruzi como un producto desprovisto de SP Como se mencionó anteriormente, TcCLB.510241.10 (TCLP1) está anotada en
el genoma de T. cruzi como una proteína hipotética de 776 aminoácidos que posee un
péptido señal (SP) N-terminal putativo (Fig. II.1). Sin embargo, el SP está muy poco
conservado en otras proteínas CEST-like de trypanosomátidos (Fig. II.5A). Por otra
parte, el análisis de secuencias de DNA de ortólogos de TCLP1 de distintas cepas y
aislamientos de T. cruzi muestra que aquellos ortólogos que poseen SP putativo tienen
además un codón AUG211 (metionina) en fase y río abajo de la metionina inicial
putativa, que se encuentra conservado en todos los ortólogos de TCLP1, incluyendo a
aquellos carentes de SP (Fig. II.5B). Entonces, la secuencia que comprende el SP
putativo (0-211 bp), poco conservada entre ortólogos de TCLP1, podría en realidad
formar parte de la secuencia 5’ no codificante (UTR) y contener regiones para el
58
reconocimiento del sitio para la adición de mini-exón, pudiendo estar inclusive ausente
en el mRNA maduro una vez concluido su procesado durante el trans-splicing (cfr.
Introducción). En efecto, los tractos de poli-pirimidinas y los sitios AG para la adición
del mini-exón son fácilmente identificables en el alineamiento producido por estas
secuencias (Fig. II.5B).
El análisis in silico del ORF putativo de TCLP1 constató que los valores de
probabilidad son bajos y cercanos a cero en la región de 0-211 bp y que precisamente en
el codón AUG211 comienza a tener valores cercanos a 1, es decir, con probabilidad
máxima de representar una secuencia codificante (Fig. II.6A). Por otro lado, se realizó
un análisis de RT-PCR sobre RNA total de una mezcla de los tres estadios de T. cruzi
CL Brener, utilizando como sondas oligonucleótidos específicos para el mini-exón de T.
cruzi y una región específica para el ORF de TCLP1 situada a 260 bp río abajo de su
codón inicio putativo (Fig. II.6B). En estas condiciones, podrían esperarse a priori dos
productos de amplificación específicos no mutuamente excluyentes: -i) un producto de
tamaño mayor a 260 bp, correspondiente a un transcripto maduro conteniendo SP, y -ii)
un producto de tamaño menor correspondiente a un transcripto maduro sin SP. Como
resultado de este experimento, únicamente fue posible aislar un producto específico de
aproximadamente 170 bp, es decir, de tamaño menor al esperado para un transcripto
con SP (Fig. II.6C). El posterior clonado y secuenciación de este producto permitió
identificar un único sitio aceptor de mini-exón (sitio AG), situado a 115 bp río abajo del
codón inicio predicho para TCLP1 en TriTrypDB, sugiriendo al codón AUG211 como el
único codón inicio presente en el transcripto aislado (Fig. II.6B).
Con el objeto de evaluar la presencia y abundancia relativa de TCLP1 a nivel
transcripcional, se realizó un análisis de Real Time-PCR sobre RNA total de los tres
estadios principales de T. cruzi CL Brener. Aunque en general en baja cantidad, el
transcripto de TCLP1 fue detectado en forma mayoritaria en amastigotes y en menor
medida en epimastigotes, en acuerdo con datos reportados previamente (Fig. II.6D,
(139)). Estos resultados muestran que TCLP1 se expresa en forma mayoritaria (si no
únicamente) como un transcripto desprovisto de SP y que dicha expresión se asocia a
estadios replicativos (epimastigotes, amastigotes) de T. cruzi.
59
Figura II.5. Análisis de la metionina inicial/codón inicio en TCLP1 y ortólogos
A) Alineamiento (ClustalW) de los primeros 120 aminoácidos de TCLP1 con sus ortólogos
trypanosomátidos de tipo I (rojo) y II (verde). Se muestra la predicción de SP para TCLP1 como
un recuadro negro. Las metioninas (M) iniciales tal como se hallan predichas en TriTrypDB se
muestran en recuadros. La M211 de TCLP1 se muestra también recuadrada. B) Alineamiento
(ClustalW) entre los primeros 350 nucleótidos de TCLP1 y sus ortólogos de diversas cepas de
T. cruzi. Los codones inicio reportados en TriTrypDB se muestran como recuadros rojos. Los
codones (AUG211) alternativos se muestran como recuadros verdes. Se muestran subrayados los
tractos de poli-pirimidinas y en recuadros azules los sitios AG de adición de mini-exón. La
secuencia 5’ UTR de TCLP1 determinada experimentalmente (ver abajo) se muestra en azul.
60
61
Figura II.6. Validación experimental de la metionina inicial/codón inicio en TCLP1
A) Gráfico derivado de la predicción de novo del ORF de TCLP1. Se muestran los valores de
probabilidad (1 máxima; 0, nula) para constituir una secuencia codificante en función de la
posición nucleotídica (5’- 3’) del ORFs de TCLP1. B) Alineamiento (ClustalW) entre el ORF
predicho (TriTrypDB) para TCLP1 y dos de los productos de secuenciación para el transcripto
aislado mediante RT-PCR. Se muestra la secuencia aminoacídica del SP predicho (verde), los
sitios de apareamiento de los oligonucleótidos utilizados (flechas), el sitio de clivado del SP,
sitio aceptor de SL (mini-exón) y la metionina inicial validada experimentalmente para TCLP1.
C) Productos de la RT-PCR realizada sobre RNA total de una mezcla de los tres estadios de T.
cruzi. RT +: transcriptasa reversa, RT-: control sin enzima, Mk: Marcadores de peso molecular
(bp). D) Gráfico con los resultados del análisis de Real-Time PCR sobre los tres estadios
principales de T. cruzi. A: Amastigotes, E: Epimastigotes, T: Trypomastigotes.
62
II.6 TCLP1 se expresa en estadios replicativos de T. cruzi como una proteína citoplasmática asociada a la región del bolsillo flagelar La expresión endógena de TCLP1 en estadios de T. cruzi fue evaluada mediante
un anticuerpo generado en conejo y dirigido hacia un péptido específico presente en la
secuencia primaria de TCLP1 (péptido TCLP1, Fig. II.1). La especificidad de este
anticuerpo (en adelante TCLP1) fue evaluada sobre sistemas de expresión heterólogos
(células transfectadas y bacterias transformadas con las construcciones pEGFP::TCLP1
y pTrcHis::CEST, respectivamente) y mediante experimentos de desplazamiento con el
péptido TCLP1 (Fig. II.7A-C).
Al ensayarse sobre parásitos WT mediante IFI, TCLP1 produjo señal
detectable sólo en estadios replicativos (epimastigotes, amastigotes) de T. cruzi (Fig.
II.8A). Estos resultados son similares a los obtenidos mediante el análisis de Real Time-
PCR (Fig. II.6D, (139)). Además, TCLP1 mostró una distribución subcelular dual en
ambos estadios replicativos, acumulándose en regiones posteriores del cuerpo de los
parásitos y de forma más intensa en una región puntual anterior al kinetoplasto, que
presumiblemente podía tratarse del BF (Fig. II.8A). Lamentablemente, el anticuerpo
TCLP1 no permitió detectar la expresión endógena de esta proteína en ensayos de WB
sobre lisados totales de T. cruzi CL Brener (Fig. II.7D). Dada esta limitación práctica, y
como alternativa para el posterior estudio bioquímico de TCLP1, se generó una línea
recombinante de T. cruzi (cepa Adriana) transfectada en forma estable con una versión
de TCLP1 fusionada traduccionalmente al epitope 3xFLAG y clonada en el vector de
expresión pRIBOTEX (144). De acuerdo a los resultados obtenidos anteriormente
respecto de su expresión a nivel transcripcional, TCLP1 fue expresada en pRIBOTEX a
partir del ATG211, es decir, sin SP. Los parásitos recombinantes (TCLP1::3xFLAG)
permitieron la identificación de una señal específica en ensayos de WB e IFI realizados
utilizando como sonda al mAb anti-FLAG (FLAG, Fig. II.7D y E). En WB, el mAb
FLAG reconoció bandas específicas de 100, 70 y < 55 kDa (Figs. II.8D y II.9D).
Dado que el tamaño predicho para TCLP1 es de 75 kDa, la aparición de estas bandas
adicionales de tamaños mayores y menores al esperado podría deberse a algún tipo de
modificación post-traduccional y/o degradación, respectivamente.
63
Tanto en los parásitos recombinantes como en los WT (Fig. II.8B), TCLP1
mostró una casi indistinguible distribución sub-celular (Fig. II.8A). En ambos casos
TCLP1 mostró una acumulación mayor y conspicua en una zona anterior próxima al
BF, pero también se detectó en posiciones posteriores en algunos parásitos. El análisis
mediante microscopía electrónica de transmisión (MET) de la señal de FLAG en
parásitos recombinantes mostró que, en efecto, además de localizarse mayormente en la
vecindad del BF, TCLP1 se acumula en menor medida en regiones cercanas al
kinetoplasto, peri-nucleares y posteriores (Fig. II.8C).
Con el objeto de evaluar la distribución de TCLP1 mediante un abordaje
bioquímico alternativo, se realizó un fraccionamiento citoplasma/ER (fracción
microsomal) a partir de parásitos recombinantes y se evaluó la distribución de TCLP1
en dichas fracciones. Mediante este análisis, se detectó a TCLP1 en fracciones
citoplasmáticas (Fig. II.8D). Además y a pesar de que TCLP1 fue expresada desprovista
de SP, la evaluación de su presencia en extractos de secreción fue considerada relevante
debido a la importante significancia de mecanismos de secreción “no canónicos” en
trypanosomátidos (145), y el hecho de que dos de las proteínas CEST-like de L.
infantum (carentes de SP predicho) fueron no obstante encontradas en su secretoma
(Tabla II.1, (141)). TCLP1 no fue detectada en extractos de secreción de epimastigotes
de T. cruzi, aún cuando en estos extractos fue posible la detección de las mucinas
recombinantes TcSMUG S y TcSMUG S (63), ambas etiquetadas con 3XFLAG y
utilizadas como controles positivo y negativo, respectivamente (Fig. II.8D).
Estos resultados muestran que TCLP1 se expresa como una proteína
citoplasmática que se acumula preferencialmente en la vecindad del BF de formas
replicativas (epimastigotes, amastigotes) de T. cruzi.
64
Figura II.7. Validación experimental del anticuerpo TCLP1
A) Células (HeLa) transfectadas con EGFP::TCLP1 fueron incubadas con TCLP1 (arriba) o
un anticuerpo no relacionado derivado de conejo y purificado por afinidad (mock, abajo).
B) Lisados totales de E. coli expresando pTrcHisC o bien pTrcHisC::TCLP1 inducidas (ind) o
no inducidas (unind) fueron incubadas con His (arriba) o bien TCLP1 (abajo). Marcadores de
peso molecular (kDa) se indican a la izquierda. C) Desplazamiento de la señal de TCLP1 en
epimastigotes WT (CL Brener). Se agregó TCLP1 en todos los casos. Arriba: sin péptido;
Medio: 0.1 g de péptido no relacionado (mock); Abajo: 0.1 g de péptido TCLP1. D) Análisis
(WB) de lisados totales de parásitos Adriana WT (Ad WT) o transfectados con TCLP1,
revelado con mAb αFLAG (izquierda) o TCLP1 (derecha). E) Control de especificidad de
αFLAG en IFI. Ad WT (Izquierda) o parásitos TCLP1 incubados con mAb αFLAG.
65
Figura II.8. Análisis de la expresión de TCLP1 en T. cruzi
66
A) Epimastigotes (arriba), mezclas de trypomastigotes y amastigotes (medio) y células HeLa
infectadas con amastigotes de T. cruzi (CL Brener, abajo) fueron permeabilizadas y analizadas
mediante IFI utilizando αTCLP1 (verde). Las señales de DAPI se muestran en azul. Se muestran
regiones ampliadas (I, II y III) como rectángulos en las imágenes originales (MERGE).
B) Epimastigotes (Adriana) transfectados con TCLP1::3XFLAG (Ad TCLP1) fueron analizados
mediante IFI utilizando FLAG (verde). La señal de DAPI se muestra en azul. Una región
ampliada (I) que contiene la región correspondiente al BF se muestra con un rectángulo en la
imagen MERGE original. C) Inmuno-microscopía electrónica de epimastigotes Ad TCLP1
marcados con FLAG (partículas de oro de 10 nm). Se muestra una sección longitudinal del
parásito mostrando el BF, Núcleo (N) y Kinetoplasto (K). Se indican áreas ampliadas mostrando
la señal de FLAG en el BF (I), N/K (II) y la región posterior del epimastigote (III) como
recuadros en la imagen original. D) Análisis (WB) de fraccionamientos bioquímicos. Arriba,
Izquierda: fracciones de citoplasma (Cyt) y microsomales (Mic), de parásitos Adriana Wild-
Type (Ad WT) y Ad TCLP1 incubadas con FLAG. Arriba, Derecha: fracciones similares
(incluyendo Pellets de parásitos, P) de Ad TCLP1 incubados con PABP (marcador
citoplasmático) o BIP (marcador microsomal). Abajo: Lisados totales (P) y extractos de
secreción (SN) de Ad TCLP1 o epimastigotes (Adriana) transfectados con construcciones de
TcSMUG S o TcSMUG S ∆∆ incubados con FLAG. Marcadores de peso molecular (kDa) se
indican a la izquierda.
II.7 TCLP1 co-localiza con marcadores moleculares y funcionales del bolsillo flagelar Con el objeto de circunscribir con más detalle la localización de TCLP1 se
realizaron una serie de ensayos de co-localización con distintos marcadores moleculares
y funcionales relacionados con el BF o sus proximidades. Los marcadores moleculares
de la vacuola contráctil (VC) y el aparato de Golgi, Acuaporina-1 (Aqp-1) (146) y
GRASP (147), respectivamente, no mostraron co-localización apreciable con la señal de
TCLP1 proveniente de FLAG en parásitos transfectados TCLP1::3xFLAG (Fig. II.9A)
o TCLP1 en parásitos WT (no mostrado). De acuerdo a lo esperado, tanto la señal de
Aqp-1 como la de GRASP se evidenciaron próximas a la región del BF (y a la señal de
TCLP1), aunque ligeramente posteriores a él (3, 146). La proteína del citoesqueleto
Bilbo-1, originalmente descripta y caracterizada en T. brucei (148), constituye
67
actualmente el único marcador del collar del BF (149). Esta proteína fue recientemente
clonada y expresada en epimastigotes de T. cruzi, localizándose también en el BF (150).
Utilizando parásitos establemente transfectados con Bilbo-1 (pTREX::mCherry::Bilbo-
1), fue posible constatar co-localización entre la señal de este marcador y de TCLP1
endógena (TCLP1, Fig. II.9A).
Como análisis complementario para determinar la localización de TCLP1 a nivel
ultra-estructural se utilizó el anticuerpo TCLP1 sobre cortes ultra-finos de
epimastigotes y amastigotes de T. cruzi CL Brener (WT) obteniéndose imágenes de
MET. Como se muestra en la Fig. II.9B, las partículas de oro se acumularon en la
proximidad del BF en ambos estadios. Cabe mencionar, sin embargo, que TCLP1 no
fue detectada en la membrana del BF ni en su lumen, sino exclusivamente en
compartimentos intracelulares citoplasmáticos. Más precisamente, TCLP1 fue detectada
o bien subyacente a la membrana del BF, en el collar o collarette o a lo largo del cuerpo
del flagelo emergente (Fig. II.9B y no mostrado). Por último, y coincidente con los
experimentos de MET en parásitos transgénicos (Fig. II.8C), en epimastigotes y
amastigotes WT también se encontró marca de oro acumulada, aunque en menor
proporción, en la vecindad del kinetoplasto, la región peri-nuclear y compartimentos
posteriores del cuerpo del parásito (Fig. II.9B).
Como se mencionó anteriormente, los procesos de endo/exocitosis se encuentran
restringidos estéricamente al BF en trypanosomátidos (113). Debido a esto, se
realizaron ensayos adicionales de co-localización entre TCLP1 y marcadores
funcionales de estos procesos. La lectina Concanavalina A (ConA) es un excelente
marcador de la actividad endocítica asociada a membranas (151). Cuando esta sonda
(ConA-rodamina) fue puesta en contacto con epimastigotes de T. cruzi, todo el sistema
endocítico de los parásitos se marcó, incluyendo el BF y compartimentos tubulares
posteriores. TCLP1 sólo mostró co-localización con compartimentos endocíticos
tempranos; es decir, asociados al BF (Fig. II.10).
Como se mencionó anteriormente (Figs. II.8A-C y II.9B), TCLP1 mostró
acumulaciones posteriores compatibles a priori con reservosomas: compartimentos
endosomales tardíos similares a lisosomas (52). La proteína cruzipaína (CZP), la mayor
cisteín-proteasa de T. cruzi, constituye un marcador positivo para estos compartimentos
degradativos (152). Sin embargo, cuando se analizó la posible co-localización de
68
TCLP1 con este marcador, se vio que aunque las acumulaciones posteriores de TCLP1
se encontraron próximas a compartimentos CZP-positivos, no se observó co-
localización aparente entre ambas señales (Fig. II.10).
Finalmente, se analizó la posibilidad de que TCLP1 tuviera alguna asociación
con la ubiquitinación de proteínas, dado que este proceso se encontró asociado a la
endocitosis/degradación de proteínas transmembrana de tipo I (ISGs) en trypanosomas
africanos (111, 119). A tal fin, se utilizó el mAb FK-2, que reconoce específicamente
proteínas mono y poli-ubiquitiniladas (153). Esta sonda marcó el citoplasma, núcleo y
kinetoplasto tanto de amastigotes como epimastigotes (Fig. II.10), de acuerdo a lo
reportado para la caracterización del proteasoma 20S de T. cruzi (154). Sin embargo,
además de estos compartimentos, FK-2 también mostró señal positiva en el BF, y esta
señal además co-localizó con TCLP1 (Fig. II.10). Para determinar si esto último se
debía a la proximidad de TCLP1 con proteínas ubiquitiniladas o a la también factible a
priori ubiquitinación de TCLP1 a través de su dominio ULD (95), se llevaron a cabo
varios intentos de inmunoprecipitación de TCLP1::3xFLAG en parásitos transgénicos
aunque sin éxito (no mostrado).
En su conjunto, los resultados de esta sección sugieren que TCLP1 muestra co-
localización con marcadores moleculares y funcionales del BF, y que parecería
asociarse a procesos endocíticos tempranos, no degradativos.
69
Figura II.9. Análisis de localización subcelular fina de TCLP1
A) Análisis de co-localización con marcadores moleculares del BF y estructuras relacionadas.
Ensayos de IFI sobre parásitos transfectados (TCLP1::3XFLAG) incubados con FLAG (verde)
y co-teñidos o bien con Acuaporina 1 (Aqp, paneles superiores) o GRASP (panel medio),
ambos en rojo. Panel inferior, parásitos transgénicos (TcBilbo-1::mCherry, BILBO, rojo) fueron
teñidos con anticuerpo TCLP1 (verde). Las señales de DAPI se muestran en azul y regiones
rectangulares ampliadas se indican en las capturas originales (MERGE). B) Análisis (MET) de
epimastigotes (panel superior) y amastigotes (panel inferior) de T. cruzi CL Brener marcados
con TCLP1 (partículas de oro de 5 nm). Se muestran secciones longitudinales de parásitos
subrayando el bolsillo flagelar (BF), Núcleo (N) y Kinetoplasto (K). Las regiones ampliadas
mostrando la reactividad de TCLP1 en el BF se indican con rectángulos en las imágenes
originales. Los asteriscos resaltan partículas de oro. Barra de escala: 0.2 µm.
70
Figura II.10. TCLP1 co-localiza con marcadores de la vía endocítica no degradativa
IFI de epimastigotes recombinantes TCLP1::3XFLAG o amastigotes Adriana WT (panel
inferior) teñidos con FLAG o TCLP1 (ambos en verde) co-teñidos con ConA-rodamina
(ConA, rojo), cruzipaína (CZP, rojo) o FK2 (rojo). La señal de DAPI se muestra en azul y
ampliaciones rectangulares se señalan en las imágenes MERGE originales.
II.8 Los parásitos sobre-expresantes de TCLP1 muestran supervivencia disminuida durante la fase estacionaria tardía de crecimiento Dado que la expresión de TCLP1 se encontró asociada a estadios replicativos de
T. cruzi (epimastigotes, amastigotes), se consideró importante evaluar los posibles
efectos que su sobre-expresión pudieran tener sobre el crecimiento de los parásitos.
Dicha sobre-expresión respecto de la cepa Adriana WT (Ad WT) fue evaluada mediante
WB y citometría de flujo (Fig. II.7D y II.11A).
Al realizarse las curvas de crecimiento, se observó primeramente que las cepas
recombinantes mostraron un crecimiento distinto al de las WT. Concretamente, los
parásitos Ad WT mostraron una fase pre-exponencial (lag) más larga que los parásitos
71
transfectados con el vector pRIBOTEX. Esta diferencia en el crecimiento se manifestó
en varias líneas recombinantes a priori no relacionadas entre sí (TI y TII, Fig. II.11B) y
por ende no es atribuible a la sobre-expresión de TCLP1 en particular sino a un efecto
inespecífico de la transfección en general o el mantenimiento de los parásitos bajo
presión de selección mediante el antibiótico G418 (Mat. & Mét.) reportados
previamente (144, 155).
Debido a este efecto de la transfección, se realizaron las comparaciones de
crecimiento entre la cepa TCLP1::3xFLAG y las cepas transfectantes TI y TII,
correspondientes a los genes TcCLB.511277.250 y TcCLB.510181.60 (véase Cap. I)
respectivamente, que por otra parte, fueron transfectadas de forma análoga a TCLP1 y
mantenidas bajo las mismas condiciones de cultivo. Dichas cepas no mostraron
diferencias en su crecimiento ya sea entre sí o con respecto a TCLP1 en etapas
tempranas de la curva (0-4 días, Fig. II.11B y II.12A). TCLP1 tampoco mostró
diferencias significativas respecto de TI o TII en la fase estacionaria (4-8 días) pero sí
en la fase estacionaria tardía (o fase de muerte, 8-10 días, Fig. II.12A). Es decir, aunque
todos los parásitos se encuentran disminuyendo sus números en esta fase, TCLP1 lo
hizo con una pendiente o velocidad mayor que TI ó TII. La observación al microscopio
no mostró diferencias apreciables en la morfología de las poblaciones de parásitos en
cada fase de crecimiento salvo en la fase estacionaria tardía (ET, Fig. II.12B), en la cual
se observó para TCLP1 una proporción significativamente mayor de morfologías
semejantes a esferomastigotes; formas redondeadas no infectivas y no replicativas de T.
cruzi (12).
Dado que las diferencias se dieron en la fase estacionaria tardía, caracterizada por
el agotamiento de nutrientes, se realizó otro experimento con el objeto de dilucidar si
este fenotipo de crecimiento podía ser revertido mediante la suplementación de medio
agotado o condicionado (MC) con 10% de suero fetal bovino (MC 10%). Es decir, si el
fenotipo de crecimiento observado (menor supervivencia en condiciones de
hambreado), podía atribuirse a una mayor susceptibilidad a la escasez de nutrientes o
bien a la acumulación de toxinas, ambas posibilidades no mutuamente excluyentes.
De acuerdo con lo visto en la Fig. II.12A, la Fig. II.12C muestra que los
epimastigotes TCLP1 y TI en fase estacionaria no mostraron diferencias significativas
en su densidad celular luego de 24 o 48 hs. en condiciones normales (medio no
72
condicionado, NC). Sin embargo, los parásitos TCLP1 mostraron una disminución
patente en su densidad celular respecto de TI tanto a las 24 como a las 48 hs. luego de
transferirse al medio condicionado (MC). Aunque en presencia de MC tanto TI como
TCLP1 disminuyeron su densidad, en todos los casos, las diferencias fueron
significativamente mayores para TCLP1. Sin embargo, este fenotipo fue restablecido en
forma parcial al suplementar el medio con suero (MC 10%). Para mostrar con mayor
claridad esto, se calcularon las tasas de crecimiento acumulativas para cada condición y
se graficaron en su valor porcentual (Fig. II.12C). En este caso, el único valor
significativamente distinto de crecimiento acumulativo porcentual (negativo) fue el
obtenido para los parásitos TCLP1 creciendo en MC.
Todos los experimentos explicados más arriba fueron realizados en fase
estacionaria o bien estacionaria tardía, donde los parásitos no se encuentran en activa
división. Para evaluar si el fenotipo de crecimiento observado para TCLP1 también
podía apreciarse en parásitos en activa división, se realizó una dilución de cultivos de
parásitos en fase exponencial de crecimiento en MC. Bajo estas condiciones, se observó
una disminución significativamente mayor para TCLP1 en MC respecto de TI. Más aún,
TCLP1 mostró una tendencia negativa de crecimiento, cuando TI por el contrario
aumentó su densidad luego de pasarse a MC (Fig. II.12D).
En su conjunto, estos resultados muestran que la sobre-expresión de TCLP1
produce una disminución en la supervivencia en la fase estacionaria de crecimiento
cuyo factor desencadenante es el agotamiento del medio, sugiriendo algún defecto
probablemente relacionado con adquisición de nutrientes.
Figura II.11. Análisis cuantitativo de la sobre-expresión de TCLP1 y efecto general de la
transfección sobre el crecimiento de la cepa Adriana
73
A) Epimastigotes de la cepa Adriana (Ad WT, verde) y epimastigotes transfectados con
TCLP1::3xFLAG (TCLP1, rojo) permeabilizados y teñidos con TCLP1 y analizados por
citometría de flujo. El control de isotipo (sin Ab) se muestra en gris. B) Curvas de crecimiento
para epimastigotes de la cepa Adriana (AdWT) o transfectados con TCLP1::3xFLAG (TCLP1),
TcCLB.511277.250 (TI) o TcCLB.510181.60 (TII), bajo condiciones standard en ausencia de
G418. Se tomaron muestras de parásitos en los tiempos indicados, que fueron fijadas, diluidas y
contadas en cámara de Neubauer. Los asteriscos (***) denotan diferencias significativas
(p<0.001, prueba t de Student) entre las cepas recombinantes y AdWT.
Figura II. 12. Los parásitos transfectados con TCLP1 muestran una progresión acelerada hacia
la fase estacionaria tardía de crecimiento
74
A) Curva de crecimiento standard para epimastigotes recombinantes (TCLP1, TI, TII). Se
tomaron alícuotas en los tiempos indicados y se contaron parásitos fijados en cámara de
Neubauer. Los asteriscos (***) denotan diferencias significativas (p<0.001, prueba t de Student)
entre TI ó TII y TCLP1. B) Arriba, se muestran imágenes representativas de DIC para TI, TII y
TCLP1 en fase exponencial (Exp) y estacionaria tardía (ET). Abajo, se muestran los resultados
porcentuales de la cuantificación de formas redondeadas versus formas normales (Red./Norm.).
Los asteriscos (**) denotan diferencias significativas (p<0.05) entre TCLP1 y TI ó TII durante
la fase estacionaria tardía (ET). C) Arriba, curva de crecimiento para parásitos TCLP1 y TI
realizada como en A), pero cambiados alternativamente a medio normal no condicionado (NC,
BHT 10% SFB), medio condicionado (MC), o medio condicionado suplementado con 10% SFB
(MC 10%). Luego de 24 y 48 horas, se contaron parásitos en cada condición. Los asteriscos
(***, **, *) denotan diferencias significativas (p<0.001, p<0.01 y p<0.05, respectivamente,
prueba t de Student). Abajo, valores de la Tasa de Crecimiento Acumulada (%), para la
variación en la densidad de parásitos en cada condición entre las 24 y 48 horas. El asterisco (*)
denota diferencias significativas (p<0.05, prueba t de Student) entre TCLP1 y TI. D) Se muestra
una curva de crecimiento standard para TCLP1 y TI en condiciones normales (NC) hasta la fase
exponencial (día 4), luego de la cual fueron diluidos a la mitad (flecha vertical) y cambiados a
medio condicionado por dos días más. Los asteriscos (***) denotan diferencias significativas
entre TCLP1 y TI (p<0.001, prueba t de Student).
II.9 Los parásitos sobre-expresantes de TCLP1 presentan actividad endocítica disminuida Teniendo en cuenta los resultados mostrados arriba, se realizaron ensayos para
medir y comparar la actividad endocítica de epimastigotes TCLP1 respecto de la cepa
WT. A tal efecto, se midió la internalización dinámica de los marcadores fluorescentes
ConA-rodamina y Transferrina conjugada al fluoróforo Alexa 488 (Tf-Alexa 488),
ambos bien establecidos como sondas para el monitoreo de la vía endocítica (151, 156).
La endocitosis de estas sondas fue directamente monitoreada por citometría de flujo o la
cuantificación de la intensidad de señal en la zona del bolsillo flagelar mediante
microscopía de epi-fluorescencia (Fig. II.13).
Luego de una incubación inicial de 10 min. a 0 ºC, para la cual se verifica
únicamente el pegado pasivo de las sondas a sus receptores en el BF, los parásitos
75
fueron transferidos a una temperatura de 28 ºC durante 2 o 15 min., de manera de
permitir los procesos activos de endocitosis. Luego de las respectivas incubaciones,
alícuotas de parásitos fueron fijadas, lavadas exhaustivamente y analizadas mediante
citometría de flujo. Para ambas sondas y en todos los tiempos analizados, la
fluorescencia fue menor para los parásitos TCLP1 que para la cepa parental (Fig.
II.13A). Además, esta diferencia de intensidad también se presentó en el tiempo 0,
sugiriendo que la sobre-expresión de TCLP1 podría llevar a una disminución en el
pegado efectivo tanto de ConA-rodamina como de Tf-Alexa488.
El análisis mediante microscopía de epi-fluorescencia (Fig. II.13B) mostró que la
marca de ambas sondas se acumuló tanto en el BF (a tiempos cortos) como en
compartimentos posteriores, presuntamente degradativos (a tiempos más largos) de
acuerdo con datos previamente reportados (157). En general, y consistentemente con los
datos obtenidos mediante citometría de flujo, los parásitos recombinantes TCLP1
mostraron una menor marca tanto en el BF como en compartimentos posteriores que la
cepa WT para las dos sondas utilizadas (Fig. II.13A,B). Esta observación fue
confirmada con la cuantificación de fluorescencia en la región del BF (Fig. II.13C).
Aunque siempre menor en magnitud, la fluorescencia en los parásitos TCLP1 siguió la
tendencia de cambio en el tiempo (aumento, disminución de la señal) respecto de la
cepa WT (Fig. II.13A-C). Entonces, si bien no se pueden descartar en forma absoluta
efectos sobre otras etapas de la endocitosis (velocidad de internalización, acumulación
en compartimentos degradativos, y/o degradación de productos internalizados, etc.), los
resultados obtenidos sugieren que la sobre-expresión de TCLP1 estaría afectando la
internalización de nutrientes y macro-moléculas requeridas para la nutrición mediante la
disminución de sus receptores efectivos en la membrana del BF.
76
Figura II.13. Los parásitos transfectados con TCLP1 muestran disminución en su capacidad endocítica A) La internalización de ConA-rodamina (arriba) o Tf-Alexa488 (abajo) por epimastigotes de
epimastigotes transfectados con TCLP1 (TCLP1) o su cepa parental Adriana WT (AdWT) fue
monitoreada mediante citometría de flujo en los tiempos indicados (0, 2 y 15 min.). El control
de marca se muestra en gris (sin sonda). B) Imágenes representativas de epimastigotes Ad WT
(paneles superiores) o TCLP1 (paneles inferiores) luego de diferentes tiempos de incubación
con ConA-rodamina (ConA, arriba) o Tf-Alexa 488 (Tf, abajo). C) Cuantificación de la
fluorescencia atribuida a la sonda en el área del BF. Se grafican los valores de fluorescencia
promedio y sus desviaciones standard para TCLP1 (rojo) y Ad WT (verde) para cada tiempo y
sonda. Los asteriscos denotan diferencias significativas (***, p<0.001; **, p<0.01; prueba t de
Student).
77
Discusión
En el presente capítulo se presentaron los resultados correspondientes a la
identificación y caracterización de una nueva proteína de T. cruzi, denominada TCLP1,
con homología estructural y funcional a la chaperona CesT del TIIISS bacteriano (158).
Según nuestro conocimiento, este constituye el primer reporte de este dominio
procariota en un organismo eucariota como T. cruzi. Más aún, TCLP1 es el “miembro
fundador” de una familia de proteínas quiméricas con una arquitectura de dominios
bastante conservada en trypanosomátidos. Además, se mostró que la expresión de
TCLP1 se restringe a formas replicativas de T. cruzi como una proteína citoplasmática
asociada a la porción intracelular del bolsillo flagelar, y que su sobre-expresión provoca
una disminución en la actividad endocítica que se manifiesta como un fenotipo asociado
al crecimiento de epimastigotes durante condiciones de hambreado.
De acuerdo al análisis filogenético realizado, la hipótesis más parsimoniosa para
explicar la introgresión del dominio CEST en el linaje de los trypanosomátidos
implicaría la adquisición de dicho dominio a partir de algún miembro de las
Chlamydiaceae. La idea de eventos de transferencia horizontal de genes entre las
Chlamydiae y trypanosomátidos fue postulada previamente en base a comparaciones a
nivel genómico entre estos grupos (159). Más aún, la proteína NP_219546, mencionada
por los autores como hipotética y supuestamente transferida horizontalmente a
trypanosomátidos es de hecho una proteína CEST-like (159). El análisis del dominio
CEST presente en TCLP1 mostró que aunque con muy baja identidad de secuencia este
dominio presenta similitud estructural significativa con chaperonas implicadas en la
secreción de factores de virulencia a través del TIIISS de bacterias entero-patógenas
(125, 126). Más aún, a través de la utilización del sistema de recombinación homólogo
-red se generó una cepa de S. thyphimurium LT2 mutante por deleción para SicP, la
cual pudo ser complementada funcionalmente con el dominio CEST presente en
TCLP1. De modo tal que a pesar de la escasa homología de secuencia y estructural,
existe una función evolutivamente conservada entre los dominios CEST de TCLP1 y
SicP. Esto plantea interesantes interrogantes desde el punto de vista evolutivo. La
extensión del análisis de complementación a los dominios CEST de otros miembros de
la familia y la evaluación de los efectos de esta complementación sobre la infección de
78
S. thyphimurium LT2 constituyen cuestiones inmediatas a ser respondidas, que están
siendo llevadas a cabo en nuestro laboratorio.
Existen dos evidencias adicionales, ambas in silico, respecto de la presencia de
elementos asociados al TIIISS en los genomas de trypanosomátidos y adquiridos
horizontalmente desde bacterias (160, 161). En particular, un análisis filogenético
determinó la conservación de secuencias entre efectores del TIIISS en Salmonella sp. y
las regiones terminales de algunas MASPs (161). En la misma línea, recientemente fue
reportado que la proteína META1, un factor de virulencia de Leishmania sp., guarda
cierta similitud de secuencia y estructura con MxiM de Shigella sp., proteína de
membrana externa requerida para la translocación de efectores dependiente del TIIISS
(160, 162). Interesantemente, META1 estaría implicada funcionalmente en la secreción
de la fosfatasa-ácida SAP de Leishmania donovani (160).
Proteínas pertenecientes a la familia META comparten con TCLP1 y otras
proteínas CEST-like algunas características funcionales y estructurales interesantes
dignas de mención (163-165). Primeramente, sus perfiles de expresión (a nivel
transcripcional) no son homogéneos durante el ciclo de vida del parásito, sugiriendo que
se encuentran bajo algún tipo de programa de regulación del desarrollo (163, 165)
(Tabla II.1). Por otro lado, las proteínas META se han visto asociadas a la infectividad,
crecimiento y resistencia al shock térmico en Leishmania spp. (160, 164, 165). Los
efectos de las proteínas META sobre el crecimiento de Leishmania spp. se manifiestan
en etapas estacionarias tardías asociadas a la metaciclogénesis, de manera similar a
nuestros resultados obtenidos para la sobre-expresión de TCLP1 y el crecimiento de
epimastigotes de T. cruzi (158, 160, 165). De manera similar, el silenciamiento
mediante RNA de interferencia (RNAi) para el parálogo de TCLP1 en T. brucei,
Tb.927.10.9240, indujo un defecto tardío en el crecimiento de formas sanguíneas, en el
día 6 post-inducción (Tabla II.1, (142)). Cabe destacar además que las proteínas META
aparecieron asociadas al flagelo y citoplasma de Leishmania amazonensis (158, 164).
Los resultados del estudio de la localización subcelular de TCLP1 endógena y en
parásitos recombinantes mediante microscopía óptica y electrónica apoyan su
acumulación en el área del BF. Actualmente se sabe muy poco acerca de señales de
direccionamiento hacia el BF en trypanosomátidos o T. cruzi en particular. Hasta el
momento se han descrito motivos de secuencia que actúan en cis responsables del
79
tráfico hacia el BF de la proteína CRAM (Cysteine-rich acidic trans-membrane protein),
y TLTF (T-lymphocyte triggering factor) en T. brucei (166, 167). Sin embargo, estas
señales son altamente divergentes; mientras que CRAM posee una secuencia corta N-
terminal, TLTF depende de una región interna larga de 144 aminoácidos necesaria para
su direccionamiento al BF. Para TCLP1 entonces, la acumulación en el BF podría
lograrse directamente mediante determinantes estructurales y/o de secuencia
desconocidos hasta el momento o bien indirectamente a través de su posible interacción
con proteína/s transportadora/s. En este sentido, vale la pena recalcar que, si bien no fue
evaluado aquí, TCLP1 porta un dominio PDZ putativo, responsable de la organización y
ensamblado de complejos multi-proteicos en otros sistemas (168). En cualquier caso,
para responder estas cuestiones y discernir entre estas posibilidades, se requerirían
análisis de deleción y mapeado e inmuno-precipitación no realizados hasta el momento.
Los experimentos de co-localización con marcadores de endocitosis sugieren que
TCLP1 está muy próxima o vinculada a procesos endocíticos asociados a membrana.
De hecho, TCLP1 mostró co-localización positiva tanto con ConA como con ubiquitina
en la región del BF. Además, el análisis in silico de TCLP1 mostró que posee un
dominio ULD putativo, lo cual sugiere que podría unirse a ubiquitina ó proteínas
ubiquitinadas (95). Cabe destacar que la ubiquitinación ha sido asociada a la
degradación de proteínas a través del proteasoma, el tráfico vesicular y la regulación de
la endocitosis entre otros roles (97, 98), de manera que sería perfectamente factible que
TCLP1 esté de hecho relacionada con eventos de endocitosis dependiente de ubiquitina.
Aunque dichos eventos no están caracterizados en profundidad en T. cruzi, se sabe
que la ubiquitinación está involucrada en la regulación de la internalización y expresión
de proteínas de membrana en eucariotas y T. brucei. Por ejemplo, la internalización de
ISGs requiere la ubiquitinación de lisinas presentes en sus dominios citoplasmáticos
(111, 119). Una vez ubiquitinadas, son endocitadas y reconocidas por ubiquitín-ligasas
y dirigidas hacia cuerpos multi-vesiculares para ser degradadas en lisosomas (169).
Dado que la sobre-expresión de TCLP1 disminuye el pegado en el BF de los
marcadores endocíticos ConA y Tf, y que TCLP1 mostró co-localización con un
compartimiento FK-2 positivo, podría esperarse un rol posible de esta molécula en el
reciclado de receptores de superficie y/o proteínas transmembrana susceptibles de
internalización dependiente de ubiquitina. En relación con esto, es interesante
80
mencionar que los dominios ULD presentes en proteínas CEST-like en
trypanosomátidos son similares a aquellos presentes en la proteína Rad23, que protege
proteínas citoplasmáticas de su degradación por el proteasoma (99, 170).
Por otra parte, Rad23 se transloca al núcleo en respuesta a daños en el DNA
inducidos por radiación UV, participando en su reparación por mecanismos de escisión
de nucleótidos (Nucleotide Excision Repair, NER (170)). Considerando entonces que
TCLP1 posee señales de direccionamiento al núcleo (NLS, NES), cuya funcionalidad
fue validada mediante su expresión heteróloga en células de mamífero (Cap. I), sumado
esto a su compleja arquitectura de dominios, la existencia de nuevas funciones
adicionales aún no exploradas para esta proteína no puede descartarse.
Nuestros resultados demuestran que la sobre-expresión de TCLP1 conduce a una
disminución significativa en el número de epimastigotes presentes en fases estacionarias
tardías de crecimiento en condiciones de cultivo axénico. Proponemos que este
fenómeno se debe, al menos en parte, a un defecto en la endocitosis que opera en forma
constitutiva en los epimastigotes transgénicos pero sólo se traduce en un fenotipo de
crecimiento mensurable durante el cultivo en un medio agotado o bien en fases tardías
de crecimiento. Esta susceptibilidad agravada al stress nutricional podría a su vez
deberse o bien a un defecto en la internalización de nutrientes ó a una exacerbada
acumulación de (o susceptibilidad a) toxinas presentes en un medio agotado, ambas
posibilidades no mutuamente excluyentes. Dado que nuestros resultados muestran que:
-i) el fenotipo de crecimiento observado en parásitos sobre-expresantes de TCLP1
puede revertirse parcialmente mediante el agregado de suero fresco al medio
condicionado, y -ii) los parásitos sobre-expresantes de TCLP1 exhiben una disminución
en su capacidad endocítica, proponemos que el fenotipo de crecimiento asociado a la
sobre-expresión de TCLP1 se ajusta más a un defecto en la internalización de nutrientes.
Finalmente, dado su origen bacteriano, funciones putativas y acumulación en el
BF de estadios replicativos de T. cruzi, sitio estratégico profundamente involucrado en
la virulencia, diferenciación, supervivencia e internalización y tránsito de drogas (121),
proponemos a TCLP1 y sus ortólogos en trypanosomátidos como posibles nuevos
blancos de intervención contra éstos parásitos.
81
Capítulo III. Caracterización antigénica, bioquímica y
funcional de las MASPs
Introducción
Una característica notable del genoma de T. cruzi es la expansión de diversas
familias de proteínas de superficie (171, 172), entre las cuales se encuentran las
previamente caracterizadas gp85/transialidasas (106), mucinas (13) y gp63-
metaloproteasas (172, 173). La secuenciación del genoma de T. cruzi, además, permitió
la identificación de una nueva familia de glicoproteínas de membrana, denominada
MASPs por su proximidad con las mucinas. La familia de las MASPs está compuesta
por aproximadamente 1.400 miembros y sus genes son exclusivos de T. cruzi y se
encuentran formando conjuntos discretos en zonas del genoma de baja sintenia
(conservación de orden y orientación génica con respecto a otras especies de parásitos
relacionados), situadas en regiones sub-teloméricas (14, 171). Los genes y pseudogenes
correspondientes a las MASPs se encuentran además localizados río-abajo de genes que
codifican para miembros de la familia TcMUC II (14), que constituyen el esqueleto de
las mucinas del trypomastigote (108). Dada la regulación de la expresión génica
particular que en T. cruzi impone la transcripción poli-cistrónica (174), se sugirió la
posible co-expresión de los productos de TcMUCII y MASPs en la superficie del
trypomastigote (171). De hecho, datos transcriptómicos y proteómicos provenientes de
trabajos recientes indicaron que la expresión de las MASPs se encuentra sobre-regulada
en formas infectivas en el mamífero (14, 26, 91). Estos trabajos también sugirieron la
existencia de variaciones respecto de la sub-población de MASPs expresada tanto entre
distintas poblaciones de parásitos en el contexto de infecciones sucesivas (26) así como
también entre una población de trypomastigotes en un mismo momento (14). Además,
trabajos recientes dan indicios de la existencia de variaciones a nivel transcripcional en
la expresión de MASPs en una misma población clonal isogénica (175, 176).
Los productos deducidos para las MASPs se caracterizan por poseer regiones
flanqueantes (N- y C-terminales) altamente conservadas que codifican para SP y
82
secuencias consenso para la adición de un ancla de GPI, respectivamente, las que
dirigirían y anclarían estas moléculas a la bi-capa externa de la membrana plasmática
(172, 177). La región central de las MASPs está compuesta por una sucesión de
repeticiones de péptidos de una variabilidad muy llamativa, aportando a la secuencia
aminoacídica en dicha región una estructura de tipo “mosaico” (178). A pesar de su alta
variabilidad, esta región posee señales putativas para múltiples modificaciones post-
traduccionales, incluyendo N- y O-glicosilación así como también fosforilaciones en
Serinas/Treoninas. De forma similar a lo que fue hipotetizado previamente para las
mucinas de T. cruzi (13), se ha especulado que la alta variación de las secuencias
aminoacídicas de las MASPs podría contribuir a la evasión de la respuesta inmune o la
interacción (e invasión) de múltiples tipos celulares. Con referencia a este último
aspecto, un trabajo reciente indicó que al menos un miembro de la familia de las
MASPs (MASP 52), podría estar involucrado en este fenómeno (25).
La co-ocurrencia de señales putativas de secreción (SP, GPI) y direccionamiento
al núcleo (NLS, NES) colocaron a un subgrupo particular de las MASPs como
candidatos de muy alto puntaje en la Búsqueda Informática detallada en el Cap. I. En el
presente capítulo se abordará la caracterización de este sub-grupo que, como se verá
más adelante, constituye una muestra bastante representativa del comportamiento
general de la familia de las MASPs. Dicha caracterización se inicia con una descripción
antigénica de esta familia para luego estudiar aspectos funcionales de miembros
relevantes mediante abordajes bioquímicos y genéticos.
Resultados
III.1 Priorización antigénica de las MASPs A los fines de caracterizar antigénicamente a la familia de las MASPs, resultó
particularmente útil el análisis a gran escala a través de micro-arreglos de péptidos de
alta densidad (179, 180). Para las MASPs en particular, primeramente se generó una
lista curada de las mismas. Este grupo (Fig. III.1A) se compuso de un total de 232
83
secuencias aminoacídicas no redundantes, de las cuales 53% representa a los 132 grupos
definidos en (14), el 26% a MASPs reportadas en vesículas secretadas por
trypomastigotes (69), el 7% a una biblioteca genómica realizada en nuestro laboratorio,
y el resto (6, 5 y 1%) a distintas MASPs descriptas en la literatura como asociadas al
estadio infectivo trypomastigote y las cuatro MASPs resultantes de nuestra búsqueda
bioinformática (14, 25, 91).
Luego de determinada su reactividad serológica de acuerdo a los criterios de
positividad definidos en (180), emergieron un total de 69 MASPs ‘antigénicas’.
Interesantemente, este grupo de MASPs positivas se vio enriquecido en general respecto
del grupo “parental” precisamente en aquellos miembros asociados al estadio
trypomastigote y en particular en los candidatos emergentes de la búsqueda
bioinformática (Fig. III.1A). Las 69 MASPs positivas mostraron bastante dispersión en
sus valores de reactividad acumulada, calculada sumando los valores de reactividad para
cada péptido presente en determinada molécula (Fig. III.1B, C). Dicha dispersión
también se evidenció al comparar la reactividad general de las MASPs con otros
antígenos de superficie asociados a formas infectivas en mamífero como transialidasas
(TS), mucinas (TcMUC) y otros antígenos de relevancia diagnóstica como TcD/Ag13
(181) también evaluados en (180). Además, el grupo de las MASPs mostró una baja
reactividad antigénica respecto de estos otros grupos (Fig. III.1D). Por último, y en
estrecha relación con el enriquecimiento en el grupo de MASPs positivas de elementos
asociados al estadio infectivo trypomastigote, la reactividad de estos miembros fue
significativamente mayor al compararla con las MASPs positivas en general (Fig.
III.1E).
84
Figura III.1. Priorización antigénica de las MASPs
A) Izquierda: Gráficos de torta mostrando la composición del grupo parental (n=232) utilizado
para generar los péptidos en el micro- arreglo y la composición del grupo resultante luego del
análisis serológico del Chagas-Chip (n=69). Derecha: Análisis de enriquecimiento de subgrupos
de MASPs. Se muestran los porcentajes de cada subgrupo antes y luego de la evaluación
serológica. B) Ejemplo de la ubicación y contribución de cada péptido antigénico al valor de
reactividad acumulada de una MASP (TcCLB.507071.100, asterisco en C). C) Gráfico de
reactividad acumulada para la totalidad de las MASPs positivas no redundantes emergentes del
Chagas-Chip (n=69). D) Gráfico de cajas mostrando reactividad media, máxima, mínima y
desvío standard de los valores de antigenicidad (reactividad absoluta) de los péptidos derivados
de: MASPs, otras familias de moléculas de superficie (TcMUC, TcD/Ag13, TS) y las restantes
proteínas positivas del Chagas-Chip (Misc.). E) Gráfico de cajas mostrando la antigenicidad
(reactividad absoluta) de los péptidos derivados de las MASPs positivas (MASPs) respecto de
cada subgrupo de la población parental. ***= diferencias significativas (p<0.001, prueba t de
Student), *=ídem (p<0.05).
85
III.2 Análisis posicional de péptidos antigénicos en las MASPs Debido a su mosaicismo y al tipo de aproximación experimental utilizada, el
grupo de MASPs positivas (n=69) antes mencionado puede descomponerse en 86
péptidos únicos de 15 aminoácidos de longitud (15-meros) con un determinado valor de
reactividad asociado. Aunque se incluyeron las secuencias correspondientes a sus
señales de tráfico, dentro de los péptidos reactivos no se encontraron secuencias
correspondientes al SP o al GPI (Fig. III.2A). Estos resultados contradicen a los
mostrados en otro trabajo reciente donde en cambio se sugiere que la secuencia
presuntamente clivable para la adición de GPI sería antigénica y secretada en exo-
vesículas (182).
Para facilitar el tratamiento de este conjunto de péptidos, se realizó un
ordenamiento basado en el alineamiento de sus secuencias y análisis filogenético que
permitió organizarlos en 8 clusters o grupos (I al VIII) de los cuales uno (cluster VIII)
se compone de péptidos que no pudieron asignarse a ningún grupo en particular (Fig.
III.2B). El cluster I es el más numeroso (27%) y a su vez el más reactivo, seguido en
reactividad por el cluster II (8%). Estos dos grupos se diferencian significativamente de
los restantes, que poseen valores similares (y bajos) de reactividad (Fig. III.2C). Una
cuestión interesante resultó evaluar la posición relativa de los péptidos correspondientes
a los ocho clusters y su posible correlación con sus valores de reactividad. Para efectuar
este análisis, fue necesario relativizar la posición de cada péptido en cualquier MASP en
estudio, dado que al tener distintos tamaños, la posición absoluta (posición en la
secuencia lineal de aminoácidos) de un dado péptido no representa en sí mismo un
parámetro adecuado de comparación. Se eligió entonces como mejor relativización a
aquella consistente en realizar el cociente entre el tamaño total de la MASP en estudio y
el final de la secuencia del péptido en cuestión, quedando definida la posición relativa
de cualquier péptido en una escala del 0 al 1 (Fig. III.2D). De este modo, y al graficar
la distancia relativa versus la reactividad relativa (también relativizada en una escala del
0 al 1 dividiendo por el máximo valor de reactividad absoluta), se encontró una
correlación positiva (coeficiente de correlación R=0,51; p<0.001) entre la proximidad al
GPI o extremo C-terminal de las MASPs y la reactividad antigénica. Mas aún, sólo los
péptidos pertenecientes a los clusters I y II poseen valores de reactividad superiores al
86
primer cuartil (0.25) y se encuentran en el último cuartil de posición relativa (>0.75,
Fig. III.2E).
Estos resultados muestran que dentro de las MASPs estudiadas, los mayores
valores de antigenicidad se encuentran restringidos principalmente a una familia de
péptidos ricos en Alanina, Glicina, Treonina y Lisina (A, G, T, K, cluster I), ubicados
en el extremo C-terminal del polipéptido maduro, muy próximas a la secuencia
consenso para la adición del ancla de GPI (ver más adelante y en Fig. III.1B).
87
Figura III.2.Análisis posicional de péptidos antigénicos
A) Valores de reactividad (absoluta) para los 86 péptidos únicos derivados de la priorización
antigénica de las MASPs. B) Análisis filogenético de los péptidos. Se muestra un árbol
representativo del agrupamiento de los péptidos luego de realizarse un alineamiento mediante el
algoritmo MUSCLE y análisis filogenético mediante el método de máxima parsimonia (100
bootstrap) implementados en Phylogeny.fr. Los clusters (I a VII) obtenidos se señalan en
números romanos y colores. Cada rama del árbol corresponde a un péptido del grupo original
(n=86). El número (1-86) que antecede a la secuencia del péptido es correlativo a su reactividad
(en A). C) Arriba: Gráfico de torta mostrando la representatividad (%) de cada cluster (I a VIII)
en el grupo original. Abajo: Gráfico de cajas mostrando la reactividad media, máxima y mínima
y desvío standard para cada cluster. ***= diferencias significativas (p<0.001, prueba t de
Student). D) Relativización de distancia (respecto del extremo C-terminal) o posición de los
péptidos. Se muestran dos péptidos (clusters V y VII, respectivamente) pertenecientes a dos
MASPs (TcCLB511173.64 y TcCLB.508125.140) con distintas posiciones absolutas pero la
misma distancia relativa (drel, calculada como el cociente entre el fin de la proteína y la posición
del último aminoácido del péptido). E) Gráfico de drel versus reactividad relativa, calculada
como el cociente entre la reactividad de un péptido y la reactividad máxima encontrada, o sea la
88
reactividad del péptido 1. Se muestra el valor del coeficiente de correlación R de Pearson
(R=0.5146, p<0.001) para el análisis de correlación entre drel y la reactividad relativa. Los
números en cada punto representan la posición del péptido respecto a su reactividad absoluta
(como en A).
La Fig. III.3A muestra la distribución de distancias relativas para los 8 clusters
identificados y sus alineamientos de secuencia representados como esquemas de
WebLogo. Puede apreciarse que los clusters I y II presentan una distribución que parece
agruparse hacia el C-terminal de las MASPs, mientras que los otros grupos (de
reactividad significativamente menor) parecen tener una disposición más dispersa.
Con el objeto de profundizar en la validación de estos resultados provenientes
del meta-análisis de los datos obtenidos en (180), se evaluó la reactividad de un total de
75 sueros humanos crónicos para la infección con T. cruzi y negativos (controles) sobre
algunas MASPs recombinantes expresadas como fusiones a GST (Glutathione-S-
Transferase) mediante ensayos de ELISA (Fig. III.3B y C). Dentro del conjunto de
MASPs que pudieron ser clonadas, expresadas y purificadas adecuadamente a los fines
de servir a este propósito, se eligieron dos de ellas para ser utilizadas en los ensayos de
ELISA, a saber: TcCLB.511173.64 (ó simplemente 173) y TcCLB.507959.280 (ó 959),
ambas emergentes de la búsqueda bioinformática (Cap. I). La primera de ellas (173) fue
elegida porque: -i) presentó un puntaje alto en la priorización ( 40, Fig. III.1C), -ii) fue
identificada en el secretoma de trypomastigotes (69), y -iii) posee en su extremo
C-terminal un epitope (N228- TATKNTTATTGDSDGS- C243) perteneciente al cluster I
susceptible de validación (Fig. III.3B). La segunda (959) fue elegida prácticamente por
las razones contrarias, funcionando como control negativo, dado que esta MASP no
aparece como positiva en la priorización y carece de cualquier péptido obvio
perteneciente a los clusters identificados. De ambas MASPs fue posible la expresión en
forma soluble de los fragmentos indicados como 173 y 959 en la Fig. III.3B. Cuando
estas fusiones a GST fueron evaluadas mediante ELISA frente a sueros humanos, sólo
173 mostró reactividad apreciable frente a sueros positivos (aunque baja, como ya se
había visto para MASPs positivas). 959 en cambio, mostró frente a estos mismos sueros
reactividad comparable a GST. Más aún, la construcción 173C (Fig. III.3B), en donde
89
se delecionó la región C-terminal conteniendo la mayoría de los epitopes de 173 pierde
la reactividad a valores comparables a GST o 959 frente a sueros positivos. Estos
resultados sugieren con mayor fuerza que los epitopes inmuno-dominantes se
encuentran restringidos a regiones C-terminales en las MASPs estudiadas. Validaciones
más exhaustivas, utilizando un número mucho mayor de sueros y de ‘epitopes’ de
MASPs en forma de proteínas recombinantes están siendo llevadas a cabo en este
momento en el laboratorio.
Figura III.3. Validación de regiones C-terminales como regiones inmuno-dominantes
A) Izquierda: Gráfico mostrando los clusters de péptidos antigénicos versus su distancia
relativa. Derecha: Diagramas de WebLogo con los consensos para cada cluster encontrado.
90
B) Alineamiento entre algunas MASPs (TcCLB.5…) y los fragmentos expresadas en forma
recombinante como fusiones a GST (abreviados 173, 173C, 205 y 959). El SP y GPI en las
secuencias completas están subrayados. Los péptidos antigénicos presentes en 173 se indican
sombreados y a color. Se muestra además la secuencia completa de TcCLB.510205.50 (MASP
muy relacionada en su extremo C-terminal con TcCLB.511173.64) y su fragmento
recombinante (205). C) Validación mediante ELISA frente a sueros humanos crónicos
(positivos) y negativos de los fragmentos recombinantes 173, 173C, 959, GST y Ag1
(utilizado como control positivo). La línea punteada señala el valor correspondiente a la
reactividad media de sueros positivos frente a GST +2SD.
III.3 El análisis de MASPs recombinantes sugiere la participación de estas moléculas en los procesos de adhesión e infección de T. cruzi A fin de evaluar el binding de MASPs recombinantes en monocapas celulares, se
seleccionaron fragmentos recombinantes provenientes de la validación antigénica, a
saber: 173, 959 y 205. Este último fragmento recombinante (205) pertenece a una
MASP emergente de la búsqueda bioinformática (TcCLB.510205.50), que es 84%
homóloga en su región C-terminal a TcCLB.511173.64, y comparte los mismos
péptidos antigénicos en esa región (Fig. III.3B).
El binding de estos fragmentos recombinantes sobre monocapas celulares fue
evaluado mediante un ensayo de ELISA sobre células (HeLa) similar al implementado
en (24), donde se evalúa el binding de distintas concentraciones de proteínas
recombinantes puestas en contacto con monocapas celulares. En este ensayo, GST fue
utilizada como control negativo, dado que está presente como fusión a todos los
fragmentos de MASPs recombinantes. Como resultado del análisis, se observó binding
saturable únicamente para el fragmento 173 (Fig. III.4A). Alternativamente, se
evaluaron cualitativamente las diferencias de binding de las proteínas recombinantes
mediante la realización del mismo ensayo utilizando como anticuerpo secundario -IgG
(Mouse) conjugado a Alexa-488 y observando monocapas de células (VERO) fijadas
mediante microscopía de epi-fluorescencia (Fig. III.4B). En este caso, la señal para 173
se manifestó como la más intensa y se localizó en regiones yuxta-nucleares, a diferencia
de las restantes proteínas recombinantes. Es interesante destacar que el fragmento 205
91
(TcCLB.510205.50), homólogo a la región C-terminal de 173 (TcCLB.511173.64), no
presentó binding apreciable, sugiriendo que la región C-terminal (inmuno-dominante)
de estas MASPs no estaría implicada en el binding a células.
Dado que se encontró binding saturable para 173, resultó interesante evaluar el
posible efecto de esta proteína recombinante sobre la infección in vitro de monocapas
celulares por T. cruzi. A tal efecto, se efectuaron infecciones de células (VERO) en
cultivo pre-tratadas con distintas concentraciones de 173 o GST (control negativo) con
trypomastigotes de T. cruzi CL Brener, y se calculó el porcentaje de infección en cada
caso. Como resultado de estos ensayos se observó que el pre-tratamiento de las células
con 173 causó un aumento en el porcentaje de infección (respecto del pre-tratamiento
con GST) que sólo se volvió estadísticamente significativo a la concentración de
1 mg/ml. Estos resultados sugieren que 173 y tal vez TcCLB.511173.64 estarían
implicados en el binding e infección de T. cruzi. En particular, el resultado del pre-
tratamiento con 173 respecto del porcentaje de infección (aumento), sugiere que esta
molécula actuaría en trans favoreciendo la infección de T. cruzi.
Figura III.4. Ensayos de binding e infección de MASPs recombinantes
92
A) Gráfico mostrando los valores de Absorbancia 450 nm (Abs.) para el ensayo de ELISA sobre
células (HeLa). Las células se incubaron con 5, 15, 25 y 50 g/ml de proteína recombinante. La
reactividad en el ELISA se determinó mediante anticuerpo de ratón (1rio) -GST y -ratón-
HRP (2rio). B) Visualización de binding de las proteínas recombinantes sobre células fijadas
mediante microscopía de epi-fluorescencia. Se muestra en gris (1er. panel) la señal
correspondiente al anticuerpo -mouse A488, en verde y azul la señal de -mouse A488 y
DAPI (núcleos), respectivamente (2do. panel), y el contraste de fase (PHASE) y DAPI (3er.
panel). La barra indica 5 m. C) Efecto del fragmento recombinante 173 sobre la infección de
monocapas celulares con T. cruzi. Se muestran los porcentajes de infección (% Infección),
calculados como Células Infectadas/Células Totales.100 para monocapas celulares (VERO) pre-
tratadas con 0.2, 0.5 o 1 mg/ml del fragmento recombinante 173 o GST (control negativo). ***=
diferencias significativas, Prueba t de Student, p<0.001.
III.4 Análisis de la expresión endógena de la familia de las MASPs Además de utilizarse para la validación antigénica de las MASPs, los fragmentos
expresados en forma heteróloga como fusiones a GST fueron utilizados a su vez para
generar anticuerpos específicos de dos fuentes. Por un lado, se obtuvieron anticuerpos
de ratón mediante su inmunización con estas proteínas recombinantes. Por otro lado, las
proteínas de fusión fueron utilizadas a su vez como “carnada” para purificar por
afinidad inmunoglobulinas específicas presentes en sueros de conejos infectados con T.
cruzi. Todos estos anticuerpos fueron oportunamente probados mediante WB en
extractos totales, fraccionamientos subcelulares o bien IFI sobre distintos estadios de T.
cruzi a fin de explorar los patrones de expresión endógena de esta familia.
Un aspecto importante a tener en cuenta es la eventual reacción cruzada de los
anticuerpos generados dado el “mosaicismo” de secuencias presente en la familia de las
MASPs. En la Fig. III.5A se muestra el alineamiento de secuencia entre tres miembros
(TcCLB.511401.100 ó MASP401, TcCLB.507959.280 ó MASP959 y TcCLB.11173.64
ó MASP173) de la familia cuyos fragmentos recombinantes pudieron ser clonados y
expresados en forma adecuada a los fines propuestos. Entre cualesquiera de estas
secuencias existe una similitud de ~25%, y como se ve en la Fig. III.5B, no se detectó
reacción cruzada de los anticuerpos de inmunización.
93
Los anticuerpos de ratón MASP401, MASP959 y MASP173 fueron
utilizados para estudiar el patrón de expresión en lisados totales de los distintos estadios
de T. cruzi CL Brener (Fig. III.5C). Con respecto al patrón de expresión de estas
MASPs, algunos aspectos importantes son dignos de mención: -i) de acuerdo a las
bandas observadas en WB, se evidenciaría expresión diferencial para las MASPs bajo
estudio (T,A para 401, E para 959, T,A >>E para 173), -ii) en general, el patrón de
expresión no se compone de una única banda, encontrándose bandas reactivas de 25-35,
40-55 y 55-70 kDa, -iii) la abundancia relativa de las señales también es diferencial de
acuerdo a su intensidad (173>>401>959). Todos estos aspectos sugieren un patrón de
expresión complejo para las MASPs bajo estudio.
Las diferencias en abundancia relativa podrían deberse bien a diferencias en los
niveles de expresión a nivel de proteína de una MASP en particular o bien a la
abundancia relativa de múltiples “alelos” (o miembros con alta similitud de secuencia).
Por otro lado, la presencia de múltiples bandas de distintos tamaños podría deberse a la
presencia de distintas formas de una misma MASP (o varias de igual tamaño) que
sufran modificaciones post-traduccionales (nótese que las bandas más escasas son
aquellas cercanas al tamaño “desnudo” de la proteína), o bien nuevamente a la reacción
cruzada con múltiples alelos de distintos tamaños. Debe aclararse que ambas
posibilidades además no son mutuamente excluyentes, pudiendo esperarse efectos
combinados de estos dos posibles escenarios.
Para intentar aclarar estas cuestiones, se realizó una búsqueda informática de
posibles “alelos” múltiples mediante la herramienta blastp implementada en NCBI-
BLAST, utilizando como templado las secuencias aminoacídicas de los fragmentos
recombinantes expresados de MASP401, MASP959 y MASP173. Se estableció como
criterio de inclusión para un “alelo” dado una similitud de secuencia superior al 70%
con el templado y un tamaño superior a 15 aminoácidos. En la Fig. III.5D se muestran
esquematizados los resultados de este análisis, de los cuales cabe destacar que: -i) la
abundancia de miembros que cumplen con los criterios de inclusión en cada subgrupo
parece corresponderse con la abundancia relativa en WB; esto es especialmente cierto
para MASP173, que posee 96 miembros que satisfacen los criterios de inclusión versus
MASP401 o MASP959 con apenas 5 y 6 miembros, respectivamente, y -ii) la variación
en tamaño de los distintos miembros de cada subgrupo no permitiría explicar
94
variaciones tan grandes en el tamaño de las bandas observadas en WB, que sugieren
más bien modificaciones post-traduccionales.
En suma, estos resultados sugieren que el análisis de la expresión de las MASPs
no es una cuestión trivial dada la estructura altamente variable de la familia respecto de
su expresión (14, 176).
Figura III.5. Expresión endógena de las MASPs I (Análisis de WB)
A) Alineamiento (ClustalV) de secuencias entre TcCLB.511401.100 (MASP 401),
TcCLB.507959.280 (MASP 959) y TcCLB.511173.64 (MASP 173). Las secuencias del SP y
95
GPI se muestran subrayadas. Los aminoácidos conservados respecto de cualquiera de las
MASPs se muestran sombreados (celeste). La secuencia en azul corresponde al fragmento
recombinante expresado en cada caso. B) Análisis (WB) de reacción cruzada entre sueros de
ratones inmunizados y MASPs recombinantes expresadas como fusiones a GST (GST-401,-
173,-959). En cada membrana (recuadro), incubada con el correspondiente anticuerpo de ratón
( MASP-401, -959, -173), se sembraron iguales cantidades de cada MASP recombinante.
Derecha: marcadores de peso molecular (kDa) C) Análisis de WB sobre extractos totales de
T. cruzi CL Brener. Cantidades iguales de lisados totales de parásitos correspondientes a los tres
estadios (epimastigote, E; trypomastigote (T), amastigote (A), fueron incubadas con anticuerpos
de ratón anti-MASP ( MASP-401, -959, -173). Derecha: marcadores de peso molecular (kDa).
D) Grupos de MASPs relacionadas a cada MASP recombinante expresada. Esquema de las
MASPs obtenidas mediante blastp que satisfacen criterios de inclusión (ver texto). Se muestra
el tamaño de la MASP que genera el alineamiento en cada caso (templado). El tamaño de las
MASPs restantes es proporcional, así como el SP, GPI (cajas blancas). El grado de similitud
(%) y la cobertura se muestran como cajas de color (100-90% rojo, 90-80% celeste, 80-70%
verde). Los miembros correspondientes al subgrupo de 173 no se muestran en su totalidad
(n=96).
III.5 La expresión endógena de las MASPs presenta variabilidad dentro de una misma población y entre poblaciones Como análisis complementario de la expresión endógena de las MASPs, se
utilizaron anticuerpos purificados por afinidad a partir de sueros de conejos infectados
con T. cruzi utilizando las MASPs recombinantes como “carnada”. Los mejores
resultados para estos anticuerpos se obtuvieron en ensayos de IFI (Fig. III.6). Los
mismos reconocieron a MASP401 en la superficie de epimastigotes. En algunos
parásitos, fue posible detectar señal concentrada en una región anterior al kinetoplasto y
próxima a la base del flagelo (Fig. III.6A, MI). MASP959 se detectó también en la
superficie de algunos epimastigotes (Fig. III.6A, MASP959 MI, MIII) pero además en
la de algunos trypomastigotes metacíclicos (Fig. III.6A, MASP959 MII y MIV).
MASP173 apenas fue detectada en epimastigotes con estos anticuerpos (Fig. III.6A).
Con respecto a la expresión en formas de mamífero, MASP401 fue detectada
mayormente en la superficie de amastigotes axénicos y prácticamente indetectable en
96
trypomastigotes (Fig. III.6B, MI y MII). Por otra parte, los anticuerpos de conejo
detectaron a MASP959 en la superficie de trypomastigotes como una señal “punteada”
similar a la esperada para proteínas de membrana asociadas a lipid-rafts (Fig. III.6B,
MASP959 MI y MII). MASP173 fue también detectada en la superficie de
trypomastigotes con un patrón de distribución similar (Fig. III.6B, MASP173, MI-
MIII). Obsérvese además que en ambos casos la expresión no es conspicua en todos los
parásitos.
Al analizar la expresión en células infectadas de las MASPs 959 y 173 (Fig.
III.6C), se observó un patrón de expresión opuesto en intensidad al observado en formas
de mamífero axénicas (Fig. III.6B). MASP959 presentó una señal tenue en amastigotes,
aunque caracterizada por acumulación de señal en compartimentos anteriores,
posteriores y yuxta-nucleares presumiblemente en el citoplasma de amastigotes (Fig.
III.6C, izq., arriba). En células cargadas con trypomastigotes diferenciados del mismo
preparado, MASP959 presentó una señal muy intensa en la superficie de
trypomastigotes (Fig. III.6C, izq., abajo). Con respecto a la expresión en células
infectadas de MASP173, el patrón de expresión fue similar en cuanto a distribución
pero inverso respecto a intensidad, en tanto que una elevada expresión de esta MASP en
compartimentos presumiblemente citoplasmáticos en amastigotes se corresponde con
una señal menos intensa en trypomastigotes (Fig. III.6C, der.).
En resumen, los resultados obtenidos respecto de la expresión de las MASPs en
ensayos de IFI sobre estadios de T. cruzi reveló variaciones dentro (variabilidad en la
expresión en un mismo preparado) como entre ensayos (variaciones en los niveles de
expresión de una dada MASP en IFIs independientes). Una posible explicación a estos
resultados podría relacionarse con hallazgos efectuados por otros grupos (14, 176), que
aportan evidencias respecto de la expresión variable tanto intra- como inter-poblacional
de las MASPs, posiblemente asociada a variación antigénica dentro de esta familia (14,
26).
97
Figura III.6. Expresión endógena de las MASPs II (Análisis de IFI)
A) Micrografías de ensayos de IFI sobre epimastigotes de T. cruzi CL Brener utilizando
anticuerpos purificados por afinidad de conejos infectados (r MASP401, r MASP959, r
MASP173). En la primer columna se muestran los canales correspondientes a la señal (verde) y
al DAPI (azul, núcleo y kinetoplasto). La segunda columna corresponde al contraste de fases
(PHASE), y se indican mediante recuadros numerados (I-IV) distintas regiones ampliadas en la
tercer columna (véase texto). La barra de escala corresponde a 10 m. B) Micrografías de
ensayos de IFI sobre formas de mamífero (trypomastigotes, amastigotes) de T. cruzi CL Brener
utilizando los anticuerpos r MASP401, r MASP959 y r MASP173 (véase texto). La barra
de escala corresponde a 10 m. C) Micrografías de ensayos de IFI con anticuerpos r
MASP959 y r MASP173 sobre células infectadas (véase texto).
98
III.6 Las múltiples bandas observadas en WB para MASP173 pertenecen a distintas fracciones subcelulares El patrón de expresión evidenciado en WB para las MASPs presentó varias
bandas, la mayoría de un peso molecular mayor al predicho para la proteína “desnuda”
(Fig. III.5C). Dado que al estudiar el patrón de expresión de las MASPs mediante IFI se
evidenciaron (en forma más notable en amastigotes) acumulaciones presumiblemente
citoplasmáticas de señal (Fig. III.6C), se llevó a cabo un fraccionamiento subcelular
para proteínas ancladas por GPI (63). Se eligió estudiar la distribución de la MASP173
en este fraccionamiento debido a que demostró ser la más abundante dentro de la ya
discutida variabilidad en la expresión de la familia de las MASPs.
Las bandas de 25-35 kDa y visualizadas con el anticuerpo m MASP173 se
distribuyeron exclusivamente en la fracción S2, correspondiente a proteínas solubles
(citosol, véase Mat. & Mét.), mientras que la banda de 55-70 kDa se acumuló
preferencialmente en la fracción de GPI y también en extractos de secreción de
trypomastigotes, amastigotes y epimastigotes (Fig. III.7A). La expresión de MASP173
en este último estadio podría resultar contradictoria debido a la poca o nula señal en WB
(Fig. III.5C) o IFI (Fig. III.6A) observada previamente. Sin embargo, puede justificarse
o bien debido a la variabilidad en la expresión de las MASPs discutida previamente o a
la reacción cruzada con las MASPs TcCLB.510697.40 y TcCLB.508759.60 (Fig.
III.7B) que comparten homología C-terminal con MASP173 y poseen evidencia de
expresión en el estadio epimastigote (183).
Con el objeto de circunscribir más el análisis a una única MASP, se empleó una
estrategia ya implementada en el estudio de la familia (14), que consiste en la
generación de anticuerpos anti-péptido. Se eligió el péptido MASPEP (N196-
PDDDDPAADAAG-C207) para obtener anticuerpos de conejo (r MASPEP). La
elección de MASPEP responde a un compromiso entre la antigenicidad predicha
(pertenece al cluster V de péptidos antigénicos) y su especificidad para MASP173
evaluada mediante el algoritmo blastp (NCBI). Al ensayar este anticuerpo en IFI sobre
una mezcla de trypomastigotes y amastigotes, se observó señal en la superficie de
algunos pero no la totalidad de los parásitos. Esta señal sin embargo, fue bastante más
tenue respecto de la obtenida con r MASP173 purificado de infección (Fig. III.7C).
99
Asimismo, como se muestra en la Fig. III.7D, al evaluar la distribución de
bandas en WB obtenidas con este anticuerpo en el fraccionamiento de GPI efectuado
sobre una mezcla de amastigotes y trypomastigotes, se observó una disposición similar
a la obtenida antes con m MASP173 (Fig. III.7A): las bandas de menor peso
molecular (25-35, 35-40 kDa) se acumularon en la fracción S2, mientras que la banda
de 55-70 kDa fue la única presente en fracciones de GPI. Esta última banda se detectó
menos en fracciones de GPI, pero se verificó su desaparición del pellet (P) y
concomitante incremento en el sobrenadante (SN) al tratar fracciones de GPI de
trypomatigotes y amastigotes con fosfo-lipasa C de fosfatidil-inositol (PI-PLC, por sus
siglas en inglés). Esto último refuerza el hecho de que las bandas de 55-70 kDa
corresponderían a formas maduras de MASPs en membrana, ancladas por GPI (14).
Por otro lado, que las múltiples bandas observadas en el patrón de expresión de
MASP173 no co-purifiquen en fracciones de GPI sumado a los resultados con
r MASPEP sugieren fuertemente que estas bandas corresponderían a distintas formas
de una misma proteína durante distintas instancias de su maduración/procesamiento.
Figura III.7. Expresión endógena de las MASPs III (Fraccionamientos subcelular y análisis con
el anticuerpo r MASPEP)
100
A) WB sobre fraccionemiento (S3, S2, GPI) de GPI basado en el detergente Tritón 114 (TX-
114, véase Materiales y Métodos) utilizando el anticuerpo de ratón m MASP173.
B) Alineamiento (Clustal V) de TcCLB.511173.64 (MASP173), TcCLB.510697.40 y
TcCLB.508759.60, con evidencia de expresión en epimastigotes. Se muestran con cajas verdes
sólo los aminoácidos conservados con el fragmento recombinante expresado de MASP173. El
péptido MASPEP (N196-PDDDDPAADAAG-C207) se muestra recuadrado sobre la secuencia de
MASP173. C) Micrografías de ensayos de IFI sobre trypomastigotes y amastigotes de T. cruzi
CL Brener utilizando el anticuerpo r MASPEP. Se muestran imágenes compuestas de las
señales de DAPI (azul) y r MASPEP (verde), contraste de fases (PHASE) y selecciones
ampliadas de los campos MI y MII. La barra de escala representa 5 m. D) Arriba: WB sobre
fracciones de TX-114 (P1, P2, S2, S3, GPI) reveladas con anticuerpo r MASPEP. Abajo:
Tratamiento con PI-PLC de fracciones de GPI reveladas con r MASPEP. PI-PLC+: tratadas,
PI-PLC-: no tratadas (control negativo). P: Pellet, SN: sobrenadante (fase acuosa, véase
Materiales y Métodos para más datos).
III.7 La expresión homóloga estable de una única MASP muestra aspectos relacionados a su procesamiento Para continuar el análisis de las MASPs, se optó por la utilización de un sistema
de expresión homólogo en parásitos de la cepa Adriana, de manera similar a lo hecho
para TCLP 1 (Cap. II). Dada la heterogeneidad de bloques conservados presente en la
familia y la presencia de regiones N- y C-terminal altamente conservadas, no se
pudieron obtener construcciones 100% homólogas a TcCLB.511173.64. Sin embargo,
dos MASPs relacionadas a MASP173; TcCLB.511173.360 y TcCLB.507957.320
(57.8% y 55% de homólogas a TcCLB.511173.64, respectivamente) se clonaron en el
vector de expresión en T. cruzi pTrex-Omni (184) con un epitope FLAG anterior al sitio
de clivaje de la secuencia consenso para la adición de GPI (Fig. III.8A). Con el objeto
de estudiar el rol de esta señal en el destino final de las proteínas transgénicas, se
transfectaron epimastigotes de T. cruzi con dos versiones en cada caso: -i) una versión
con ambas señales de direccionamiento (SP::FLAG::GPI) y -ii) una variante de deleción
(SP::FLAG) para la secuencia consenso para la adición de GPI (Fig. III.8B, C). Debido
101
a ser idénticos para cualesquiera de las MASPs clonadas, se muestran de aquí en más
sólo los resultados obtenidos para las versiones transgénicas de TcCLB.511173.360.
Al evaluar la expresión en epimastigotes transfectados de las versiones
recombinantes SP::FLAG::GPI y SP::FLAG mediante IFI con mAb FLAG, se observó
en ambos casos señal mayoritaria en una región anterior al kinetoplasto, próxima a la
base del flagelo (Fig. III.8B, C). Para la construcción SP::FLAG::GPI (Fig. III.8B), este
resultado difiere del esperado, o sea una distribución en superficie dada la inclusión de
una señal de GPI funcional, de manera similar a lo visto anteriormente para TcMUC,
TcSMUG (63). Sin embargo, al evaluar la expresión de SP::FLAG::GPI con m
MASP173, se obtuvo señal en superficie además de la acumulación anterior (Fig.
III.8B, abajo). Por el contrario, para los parásitos SP::FLAG, no se observó señal
superficial, sino más bien una señal en compartimentos posteriores similares a
reservosomas (compartimentos degradativos característicos de T. cruzi (52), Fig. III.8C,
abajo). Más allá de la ausencia de señal en superficie con mAb FLAG, atribuible a
algún impedimento estérico en la membrana del epimastigote, estos resultados sugieren
que la señal de GPI es necesaria para la correcta disposición de las MASPs en la
superficie celular y evita su degradación en lisosomas, como fue mostrado antes para
otras GPI-moléculas (53, 63, 185, 186).
Como puede verse en la Fig. III.8D, la expresión recombinante de una única
MASP (TcCLB.511173.360), evaluada mediante WB sobre fracciones de GPI, también
produjo múltiples bandas de 55-40 kDa, 35-25 kDa, y una banda de 15 kDa no vista
anteriormente. Es decir, que el patrón de múltiples bandas observado previamente con
los anticuerpos MASP173 y MASPEP puede ser recapitulado por una única
molécula. Nótese además que en el análisis de WB utilizando el anticuerpo FLAG, no
se observan bandas de 70-55 kDa, sólo detectables con el anticuerpo MASP173 sobre
parásitos SP::FLAG::GPI (Fig. III.8D, derecha), de manera similar a lo observado en
IFI. Estos resultados sugieren que las múltiples bandas se deben entonces muy
probablemente a distintas etapas del procesamiento intracelular de las MASPs.
Debido a que el ER constituye el sitio inicial de ensamblado de la mayoría de las
proteínas de membrana o lisosomales (10), se efectuó una separación entre fracciones
citoplasmáticas (Cit) y de ER, acoplado a una separación por resina de ConA, a fin de
distinguir a su vez entre proteínas glicosiladas/no glicosiladas similar al descripto
102
previamente (63). Como resultado de estos ensayos, se determinó que las formas de 55-
40 kDa son formas citoplasmáticas y no glicosiladas, mientras que la forma de 15 kDa
corresponde a una forma glicosilada presente en el ER y de tamaño inferior a 28 kDa
esperado para la proteína completa (Fig. III.8D, centro). Debido a que esta forma no se
observa en los fraccionamientos Cit/ER para la cepa SP::FLAG (Fig. III.8E, centro), es
posible inferir que su existencia depende de la señal de GPI y que probablemente se
trate de una variante trunca retenida en el ER. Por otra parte, las bandas de 35-25 kDa,
que podrían corresponderse con la proteína desnuda, sólo pudieron detectarse en
fracciones S2.
Al realizar el mismo análisis sobre la cepa SP::FLAG (Fig. III.8E) se verificó un
patrón similar pero no idéntico de bandas: -i) en la fracción S2 parecen estar sobre-
representadas las formas de 55-40 kDa y además aparecen bandas de muy alto peso
molecular; -ii) no se detectan formas en ER glicosiladas en ningún caso, aunque sí se
evidencian niveles ínfimos de formas de 35-25 kDa (proteína desnuda); y -iii) el
anticuerpo MASP173 no detecta bandas en GPI, pero sí la forma de 35-25 kDa en S2
(Fig. III.8E, derecha). Esta última banda se correspondería con la señal en
compartimentos posteriores similares a reservosomas observada en IFI (Fig. III.8C,
abajo).
Hasta aquí, los resultados mostrados confirman que las bandas observadas en el
patrón de expresión endógeno de las MASPs pueden explicarse todas ellas a partir de
una misma molécula con distintos grados de procesamiento post-traduccional. Además,
aportan información acerca del procesamiento de éstas moléculas en el estadio
epimastigote. Más importante aún, la detección de bandas (55-40 kDa) en el citoplasma
de parásitos recombinantes sugiere la posibilidad de la existencia de un retro-transporte
desde el ER al citoplasma que podría ser semejante a eventos de degradación asociados
al retículo endoplásmico o ERAD (ER-Associated Degradation), reportados
previamente en T. cruzi (187).
103
Figura III.8. Análisis de expresión de construcciones derivadas de la MASP
TcCLB.511173.360 en epimastigotes transgénicos de T. cruzi Adriana
104
A) Alineamiento (Clustal V) entre la MASP173 (TcCLB.511173.64) y las MASPs
TcCLB.511173.360 y TcCLB.507957.320, clonadas y expresadas en forma completa en
epimastigotes de T. cruzi cepa Adriana. Los aminoácidos sombreados están conservados
respecto de MASP173. Se indican el SP y GPI (líneas) y el sitio ω de clivado predicho para la
adición del ancla de GPI (flecha vertical). Las secuencias del epitope FLAG insertado en
TcCLB.511173.360 y TcCLB.507957.320 se muestran recuadradas. B) IFIs sobre parásitos
SP::FLAG::GPI. Se muestran los resultados para el análisis de IFI de los parásitos transfectados
establemente con la versión completa de TcCLB.511173.360 con la adición de un epitope
FLAG río arriba del GPI. En el panel superior se muestra la señal para el mAb FLAG y en el
panel inferior la señal de reactividad cruzada del anticuerpo MASP173. La primera foto
corresponde a la mezcla de los canales de anticuerpo (verde) y DAPI (azul, núcleos y
kinetoplasto). La segunda foto corresponde al contraste de interferencia (DIC). Las regiones MI-
MIII corresponden a ampliaciones de las imágenes originales indicadas como recuadros en el
DIC. C) IFIs sobre parásitos SP::FLAG. Se muestran los mismos resultados para la cepa
mutante de deleción para la señal de GPI. D) Fraccionamientos subcelulares sobre la cepa
SP::FLAG::GPI analizados por WB. Izquierda y derecha: Enriquecimiento en fracciones de GPI
(S3, S2, GPI) revelados con mAb FLAG y MASP173 respectivamente. Centro:
Fraccionamiento citoplasma/retículo (Cit/ER) acoplado a separación de ConA-Sefarosa (In:
input, Ub: unbound, B: bound, véase Materiales y Métodos). Los pesos moleculares (kDa) se
indican a la izquierda de cada WB. E) Fraccionamientos subcelulares sobre la cepa SP::FLAG
analizados por WB. Se muestran los mismos resultados para la cepa mutante de deleción para la
señal de GPI.
III.8 Las MASPs recombinantes en el estadio trypomastigote muestran localización en membrana y son susceptibles al clivaje por PI-PLC Para continuar con el análisis de la expresión de las MASPs, se obtuvieron
trypomastigotes recombinantes a partir de la diferenciación in vitro de epimastigotes
SP::FLAG::GPI. En aras de la brevedad, se muestran los resultados obtenidos para la
forma recombinante homóloga de TcCLB.511173.360 (Fig. III.9). Análisis de IFI
mostraron una intensa señal en la superficie tanto de trypomastigotes como amastigotes
(Fig. III.9 AI y II). Este resultado difiere respecto al obtenido en epimastigotes (Fig.
III.8A), sugiriendo que: -i) el contexto de la membrana plasmática del trypomastigote
105
expone mejor el epitope FLAG; o bien -ii) el procesamiento de SP::FLAG::GPI hasta su
forma madura es más eficiente en este estadio.
Además de las formas amastigote y trypomastigote la cepa Adriana presenta
formas intermedias similares a epimastigotes no bien caracterizadas (188, 189). El
análisis de estas formas mediante IFI dio como resultado la detección de una señal casi
inexistente en la membrana y la aparición de una señal puntual anterior en la base del
flagelo similar a la observada previamente en formas epimastigotes (Fig. III.9 AIII). El
análisis de WB del fraccionamiento Cit/ER acoplado a ConA muestra que existen
bandas citoplasmáticas no glicosiladas de 55-40 kDa muy probablemente asociadas a
estas formas intermedias. Por otro lado, a diferencia de lo observado en formas
epimastigotes, no se detectó acumulación en el ER de ninguna forma glicosilada (Fig.
III.9D).
El análisis de WB sobre fraccionamientos subcelulares de SP::FLAG::GPI en
trypomastigotes revela una fuerte expresión de bandas de 25-15 kDa que se acumulan
preferencialmente en fracciones de GPI (Fig. III.9B, izquierda). De acuerdo a su
tamaño, estas bandas podrían corresponderse a la proteína desnuda. Aunque esta forma
es la más abundante, también se detectó una forma de 70 kDa presente en fracciones de
GPI y que además está glicosilada (Fig. III.9B, centro). Tanto la forma glicosilada de 70
kDa como las otras formas de menor tamaño (de 35-25 kDa, y la más abundante de 25-
15 kDa), dejan de detectarse en el pellet (P) luego del tratamiento con PI-PLC de
fracciones enriquecidas en proteínas ancladas por GPI (S4, Fig. III.9B, derecha) (63).
Por otro lado, y en forma consistente con lo observado en el análisis de la expresión
endógena de las MASPs, se detectó una forma de 70 kDa en extractos de secreción (Fig.
III.9C).
En resumen, estos resultados muestran la expresión abundante de varias formas
ancladas por GPI en la membrana de trypomastigotes y que todas son susceptibles de
ser liberadas al medio extracelular por medio de PI-PLC. Además, el análisis de las
formas intermedias similares a epimastigotes y epimastigotes (Fig. III.8B) sugiere
diferencias estadio-dependientes respecto a la eficiencia en el procesamiento de
SP::FLAG::GPI.
106
Figura III.9. Análisis de expresión de construcciones derivadas de la MASP
TcCLB.511173.360 en trypomastigotes transgénicos (SP::FLAG::GPI) de T. cruzi Adriana
A) Análisis de IFI sobre la población de parásitos transgénicos diferenciados. Se muestran
imágenes de la mezcla de los canales verde ( FLAG) y azul (DAPI) para: trypomastigotes (I),
amastigotes (II), y formas intermedias (III). La barra de escala indica 5 m. B) Análisis de WB
sobre fraccionamientos subcelulares de fracciones de GPI de trypomastigotes transgénicos
(anticuerpo FLAG). Izquierda: Fracciones de GPI. Centro: Separación por ConA-Sefarosa de
fracciones de GPI. Derecha: Tratamiento de PI-PLC sobre fracciones de GPI. -,+ indican no
tratamiento y tratamiento con PI-PLC respectivamente. C) Análisis de WB en sobre extractos de
secreción (FLAG). Se muestran resultados de WB con menor (I) y mayor exposición (II) para
la detección de la forma de 70 kDa en extractos de secreción. D) Fraccionamiento Cit/ER
acoplado a separación por ConA-Sefarosa ( FLAG). In: Input, UB: Unbound, B: Bound.
III.9 Las MASPs recombinantes en el estadio trypomastigote afectan el binding en cis/trans y exhiben un curioso fenotipo de secreción Ensayos de infección revelaron un incremento significativo en el porcentaje de
células infectadas por trypomastigotes de Ad SFG (SP::FLAG::GPI) versus Ad WT
107
(Fig. III.10A). Este incremento en la infectividad está de acuerdo con resultados previos
obtenidos con la MASP 173 expresada en forma recombinante (véase sección III.3).
Debido a que además se observó que la MASP 173 recombinante resultó ser positiva en
ensayos de binding mediante ELISA sobre células, se comparó el binding de las cepas
Ad WT y Ad SFG a distintos tiempos sobre monocapas celulares, observándose un
notorio aumento de la adhesión de los parásitos Ad SFG respecto de Ad WT en todos
los tiempos y en forma incremental (Fig. III.10B). Además, ensayos de binding
revelaron una mayor adhesión de los parásitos Ad WT en presencia del sobrenadante de
Ad SFG respecto del control (Fig. III.10C).
Hasta aquí los resultados respecto de la cepa Ad SFG muestran que la expresión
homóloga de una MASP en su versión completa en trypomastigotes de T. cruzi afecta el
binding de parásitos actuando en cis y/o trans pudiendo tal vez generar cambios en la
célula hospedadora que aumentan la adhesión de los parásitos.
Durante la caracterización funcional de esta cepa, se observó un notable
fenotipo de secreción consistente en la presencia de “rastros” FLAG-positivos con
forma de trypomastigote que describen trayectorias discretas y que culminan por lo
general en un parásito (Fig. III.10D). Este curioso fenotipo asociado a la secreción de la
MASP TcCLB.511173.360 (MASP 173.360) madura expresada en trypomastigotes Ad
SFG resulta sumamente similar en apariencia al gliding en parásitos del Phyllum
Apicomplexa (Plasmodium, Toxoplasma spp.) carentes de cilias o flagelos como medio
de locomoción (190, 191). Más aún, la visualización de los rastros o huellas en estos
parásitos se ha verificado sobre cubreobjetos cubiertos de poli-lisina de manera similar a
lo observado en IFI para la cepa Ad SFG (192).
Como se muestra en la Fig. III.11, no se observaron rastros al fijar
inmediatamente con PAF-4% durante 30 min. (Fig. III.11a), pero sí al incubar por el
mismo tiempo a los parásitos sobre cubreobjetos cubiertos en poli-lisina (Fig. III.11b-
d). Estos resultados muestran que la secreción de la MASP 173.360 y la generación de
rastros es un proceso que requiere de la viabilidad de los parásitos.
108
Figura III.10. Efectos sobre la infección, binding y fenotipo de secreción de la MASP 173.360
expresada en la cepa Ad SFG
A) Ensayos de infección para la cepa Ad WT y Ad SFG. Se muestran los valores del porcentaje
de infección (% de células infectadas) a las 48 hs. post-infección. *** denota diferencias
significativas (p< 0.001) según prueba t de Student. B) Ensayos de binding de parásitos a
monocapas celulares. Se muestran la relación de parásitos/células para las cepas Ad WT y Ad
SFG incubadas sobre monocapas celulares durante 10, 20 y 40 min. *** denota diferencias
significativas (p< 0.001). C) Ensayo de binding de la cepa Ad WT suplementada (o no) con el
sobrenadante de la cepa Ad SFG. D) Fenotipo de secreción similar al gliding: Izq.: IFI
mostrando parásitos teñidos con mAb FLAG (amarillo, señal de MASP 173.360 madura). Se
aprecian los rastros sobre cubres cubiertos de poli-lisina característicos del fenotipo de secreción
para esta MASP. Los núcleos y kinetoplastos se muestran en azul (DAPI), y los parásitos
adheridos en DIC. Los recuadros blancos señalan las regiones ampliadas I y II, que
109
corresponden a las dos trayectorias mostradas a la derecha en escala de grises para mayor
definición.
Figura III.11.El fenotipo de secreción requiere de la viabilidad de los parásitos
Se muestran los resultados obtenidos al incubar parásitos fijados previamente con PAF 4%
durante 30 min. (a) e incubados durante 30 min. sin pre- tratamiento con PAF en cubreobjetos
cubiertos de poli-lisina (b-d). Los recuadros blancos representan las regiones ampliadas I-IV,
que muestran algunas trayectorias discretas observadas. Las fotos se muestran en escala de
grises para mayor definición.
110
III.10 El fenotipo de secreción se asocia al estadio trypomastigote, que sufre diferenciación a amastigote durante su adhesión al sustrato Durante los ensayos de migración sobre poli-lisina, se observó en forma
conspicua una alta desproporción entre la cantidad de huellas o rastros con forma de
trypomastigote, y las formas celulares adheridas en los cubreobjetos en las que la forma
trypomastigote siempre representó la fracción minoritaria.
Como se mencionó anteriormente, la población de parásitos Adriana derivados
de infección de células son altamente heterogéneos en su composición debido a que
además de las formas trypomastigote y amastigote, posee formas intermedias similares
a epimastigotes (189), esferomastigotes (193) y trypomastigote “broad” (Fig. Int.1),
derivado del trypomastigote que no puede concretar una infección exitosa y que
representa el estadio previo a la diferenciación a amastigote (12, 194). Curiosamente,
muchas trayectorias observadas culminaron en formas de aspecto “broad” (Fig. III.11),
sugiriendo la posibilidad de una diferenciación al estadio amastigote.
Para caracterizar mejor este fenómeno, se evaluó primeramente la composición
diferencial de la cepa Adriana en esferomastigotes, epimastigotes derivados de células,
trypomastigotes y amastigotes. Se utilizó el anticuerpo SSP4 como herramienta para
distinguir a los amastigotes de los trypomastigotes derivados de células debido a que
este antígeno de superficie se encuentra diferencialmente expresado en amastigotes
(194). Se observó que tanto las formas tipo epimastigote como los esferomastigotes
(además de los amastigotes) se tiñeron con este anticuerpo, mientras que ningún
trypomastigote presentó señal positiva (Fig. III.12A). Aún cuando los trypomastigotes
representaran siempre la fracción minoritaria, se observó una gran cantidad de huellas
con su forma, que tendieron a incrementarse al realizar ensayos de migración sobre poli-
lisina a distintos tiempos (10, 30 y 120 min., Fig. III.12B,C). En estos experimentos, se
cuantificó la variación porcentual relativa de las formas trypomastigotes, amastigotes y
formas intermedias, teñidas con sueros de infección T. cruzi. Notablemente, mientras
que las formas intermedias permanecieron con una proporción constante en la población
en función del tiempo, las formas trypomastigotes sufrieron una caída significativa a los
30 y 120 min. post-incubación, acompañada por un incremento significativo de las
proporciones correspondientes a los amastigotes (Fig. III.12C, arriba). Por otra parte, el
111
recuento de huellas sufrió un aumento significativo a los 30 min., para luego
estabilizarse a los 120 min. (Fig. III.12C, abajo).
Tomados en forma conjunta, estos resultados sugieren que el fenotipo de
secreción y huellas está asociado funcionalmente al estadio trypomastigote que además
se diferencia a amastigote luego de algún tiempo de contacto con el sustrato con
independencia de la infección a células, como ya fue propuesto antes (194).
112
Figura III.12. Análisis del fenotipo de secreción y diferenciación de trypomastigotes en
ensayos de migración sobre poli-lisina
A) Composición pleomórfica de la cepa Adriana. Ensayo de IFI sobre parásitos derivados de
células (trypomastigotes, amastigotes y formas intermedias utilizando el anticuerpo FLAG
(parásitos transfectados Ad SFG, amarillo) SSP4 (amastigotes y formas intermedias, azul).
Los recuadros representan las regiones ampliadas I y II (abajo). Se indican con * los
trypomastigotes y con ** los esferomastigotes. B) Micrografías del ensayo de migración sobre
poli-lisina en función del tiempo (10, 30, 120 min.). Amarillo: FLAG, azul: T. cruzi (suero
de infección). C) Arriba: Cuantificación de los porcentajes relativos (% de células totales) de
cada forma (trypomastigotes, amastigotes y formas intermedias) respecto del tiempo (10, 30 y
120 min. incubación). Abajo: Cuantificación de las huellas por campo en función del tiempo.
***= diferencias significativas (p< 0.001, prueba t de Student).
Discusión
Hasta aquí se mostraron los resultados referidos a la caracterización antigénica y
funcional de las MASPs. Esta familia multigénica fue descripta hace relativamente poco
en forma conjunta a la secuenciación del genoma de T. cruzi y todavía no ha sido
caracterizada en forma exhaustiva (14, 25, 26, 171, 177).
Como se indicó anteriormente, esta familia multigénica se destaca por: -i) la
posesión de señales putativas (SP, GPI) de posicionamiento en la superficie celular (14,
25); -ii) una compleja localización genómica en regiones sub-teloméricas de baja
sintenia y la presencia de bloques conservados en sus secuencias aminoacídicas
generando en cada molécula una estructura de mosaico (14), y -iii) un perfil de
expresión también variable posiblemente asociado a algún mecanismo de variación
antigénica (26, 177). Dadas estas características, resultó particularmente útil como
herramienta la priorización a gran escala de motivos antigénicos (179, 180) como
primer enfoque para el estudio de esta familia.
La antigenicidad global de las MASPs evaluadas mediante este análisis resultó
ser baja al compararse frente a otras familias de moléculas de superficie como mucinas
(TcMUC) y transialidasas (TS). Este dato probablemente esté relacionado con el alto
113
grado de variación a nivel de secuencia de la familia actuando en forma conjunta con su
expresión variable en el tiempo (14, 26). Por otra parte, dentro del grupo de las MASPs
evaluado, los mayores valores de reactividad se dieron en subgrupos asociados de algún
modo al estadio infectivo trypomastigote, en forma coherente con resultados reportados
previamente (14, 25, 26).
Probablemente los resultados más interesantes de la caracterización antigénica
de las MASPs surgen del análisis de los epitopes inmunodominantes y su perfil
posicional de antigenicidad. Si bien se identificaron inicialmente un gran número de
péptidos antigénicamente positivos, la evaluación de su antigenicidad mostró que los
péptidos con valores más altos de antigenicidad se circunscriben a unos pocos clusters
que además se encuentran asociados a regiones conservadas C-terminales próximas al
sitio consenso para la adición del ancla de GPI. Con respecto a esto último, debe
mencionarse que aunque se ha sugerido la antigenicidad de las secuencias
correspondientes al SP y el GPI de las MASPs sensu stricto (177, 182), en nuestra
caracterización antigénica mediante el Chagas-Chip (que incluyó ca. 250 de estas
secuencias altamente conservadas en su diseño), no se detectaron péptidos positivos
pertenecientes a estas señales de tránsito altamente conservadas para las cuales se
esperaría además que sufrieran clivaje proteolítico durante el procesamiento de los
precursores intracelulares de las MASPs maduras (58-61).
El análisis antigénico de las MASPs no sólo permitió el descubrimiento de
epitopes relevantes y su ubicación relativa sino que además sirvió para circunscribir y
jerarquizar a algunas MASPs como especialmente relevantes para su caracterización
bioquímica posterior. De este modo cobró especial importancia el estudio de la MASP
173 y parálogos relacionados portadores del motivo correspondiente al cluster I y que
demostraron estar abundantemente representadas en estadios infectivos de mamífero. En
particular, esta MASP expresada en forma recombinante como fusión a GST mostró
binding saturable in vitro a monocapas celulares. Más interesante, la MASP 173
recombinante ejerció un efecto de incremento de la tasa de infección al ser adicionada
exógenamente. Este resultado es bastante compatible con un efecto de tipo “eat-me
response” sobre células epiteliales reportado previamente para moléculas de la familia
de las transialidasas (195), más que actuar directamente como una molécula de adhesión
canónica como por ejemplo TSSA (24). La detección de las MASPs en
114
fraccionamientos proteómicos asociados a vesículas o exosomas (69, 104) refuerza la
factibilidad de que estas moléculas actúen en forma parácrina sobre células diana en el
contexto de la infección.
El estudio de la expresión endógena de las MASPs más relevantes mediante
anticuerpos policlonales de origen diverso, mostró que el patrón de expresión de esta
familia es complejo y altamente variable, como ya se ha sugerido antes (26). El análisis
de la expresión endógena de las MASPs permitió inferir que: -i) las múltiples bandas
observadas en WB se deben a distintas formas de una misma molécula, -ii) que se
distribuyen en forma diferencial en fracciones citoplasmáticas y GPI, y -iii) que la
forma madura de las MASPs corresponde a la forma de 70 kDa descartada en trabajos
previos como inespecífica (14).
La caracterización de epimastigotes transfectados con versiones completas
(SFG) o truncadas (SF) de MASPs relacionadas a MASP173 recapitularon los patrones
de expresión endógena observados antes. La presencia de señal acumulada en la zona
anterior compatible con el bolsillo flagelar (BF) en epimastigotes y formas intermedias
es coherente con datos publicados previamente para la MASP 52 (25).
La diferenciación de los parásitos Adriana SFG mostró : -i) la prevalencia menor
de formas maduras de 70 kDa ancladas por GPI en epimastigotes, -ii) la acumulación
de señal de FLAG en compartimentos anteriores cercanos al BF y su ausencia en la
membrana de epimastigotes, y -iii) la retención diferencial de formas de bajo peso
molecular en el ER de epimastigotes. La ausencia de señal de FLAG en epimastigotes
SFG podría explicarse en parte por diferencias en la topología de la membrana debido a
la presencia de otras moléculas (TcMUC, SMUG, transialidasas, etc.). Las diferencias
respecto de la acumulación diferencial en el ER, la prevalencia de formas maduras en
superficie, y la acumulación en compartimentos cercanos al BF parecen señalar
cuestiones estadio-dependientes relacionadas al procesamiento de estas moléculas. En
relación a esto último fueron reportados comportamientos distintos respecto del tráfico
y procesamiento de las glicoproteínas de superficie gp82 y gp90 durante la
metaciclogénesis (diferenciación de epimastigotes a trypomastigotes metacíclicos) de
T. cruzi. Notablemente, durante su diferenciación a trypomastigote la cepa Adriana SFG
exhibe en su forma intermedia “tipo epimastigote” una localización anterior cercana al
BF similar a la reportada para gp90 en la metaciclogénesis (196).
115
Claramente los mayores niveles de expresión de la construcción SFG como una
forma madura glicosilada y anclada a la membrana por GPI se observan en el estadio
trypomastigote, donde además es patente un fenotipo de secreción sobre poli-lisina muy
similar en aspecto al gliding en parásitos del Phyllum Apicomplexa (191, 192). El
deslizamiento sobre un sustrato mediado por la interacción transiente a través de
proteínas de anclaje (AMA-1, TRAP) y acoplado a un motor de actina-miosina
constituye el único medio de locomoción en estos parásitos carentes de cilias o flagelos
como organelas especializadas en la locomoción (190). En T. cruzi, se ha reportado la
liberación de huellas mayormente asociadas con amastigotes sobre superficies cubiertas
con poli-lisina o ConA, de manera dependiente de la temperatura y viabilidad de los
parásitos pero no relacionada con su movimiento (85). Los resultados presentados aquí
constituyen la primera evidencia bi-unívoca implicando a una molécula (MASP)
individual con la generación de huellas asociadas al estadio trypomastigote. Este
descubrimiento plantea numerosos interrogantes respecto de la funcionalidad de este
fenómeno. Por ejemplo, los experimentos desarrollados hasta ahora no permiten
discernir entre la posibilidad de que estos procesos representen una forma alternativa de
desplazamiento basada en el deslizamiento y eventualmente independiente del
movimiento flagelar, o alternativamente, un mecanismo de anclaje transiente entre dos
puntos de una trayectoria asistida por el movimiento flagelar. Otra cuestión importante
constituye el mecanismo y composición de las huellas observadas. Si bien el tratamiento
con PI-PLC exógena mostró la liberación en forma soluble de la forma SFG,
recientemente se ha postulado que el estadio trypomastigote podría carecer de PI-PLC
funcional en su membrana (104), de modo que las huellas bien podrían constituirse en
este caso de vesículas secretadas de composición lipídica. Dado que las MASPs han
sido detectadas en exosomas/vesículas por varios trabajos previos (69, 104), esta
posibilidad resulta interesante no sólo en el contexto del fenotipo de secreción asociado
a la construcción SFG, sino a su rol parácrino sobre el binding/infección, mecanismo ya
reportado para miembros de la familia de las transialidasas (104). Con todo, este
hallazgo plantea interesantes preguntas respecto de la funcionalidad de este proceso en
el contexto de la infección de T. cruzi que se encuentran actualmente en estudio.
116
Conclusiones generales y perspectivas futuras
Durante el presente trabajo se mostraron los resultados obtenidos para la
identificación y caracterización de efectores implicados en la interacción de T. cruzi
con el hospedador.
Como resultado general para la primera parte de priorización bioinformática,
puede destacarse la identificación de varios efectores plausibles de subsiguiente
caracterización bioquímica. Debido a la heterogeneidad de los efectores priorizados,
cada caso presentará aspectos particulares de acuerdo a los procesos putativos a los que
puedan ser asociados los candidatos. Dado que la gran mayoría son proteínas hipotéticas
esa tarea será más difícil. Afortunadamente, la posibilidad de manipulación genética ha
ido en aumento en los últimos años, reduciendo entonces serias limitaciones que el
modelo T. cruzi impone (197). La principal dificultad encontrada al realizar la
búsqueda informática fue la elevada cantidad de problemas relacionados con la
secuenciación del genoma de T. cruzi (171). La disponibilidad actual de genomas para
otras cepas de T. cruzi haría más factible la resolución de muchas ambigüedades
generadas por estos problemas. Un segundo aspecto interesante y susceptible de futuras
indagaciones es la aparente alta prevalencia de secuencias intergénicas con posiblidad
de participación en eventos de trans-splicing alternativo, proceso por otra parte
ampliamente distribuido en otros trypanosomátidos (42).
El descubrimiento y caracterización inicial de TCLP1 representa otro aspecto
relevante de este trabajo. Aunque esta proteína probablemente tenga efectos
pleotrópicos ya hipotetizados y no caracterizados aún, lo más importante de esta
proteína es la conservación funcional del dominio CEST de T. cruzi en S. thiphymurim
LT2. Esto plantea cuestiones sumamente interesantes desde el aspecto evolutivo, pero
sobre todo desde el punto de vista de la intervención como posible blanco de drogas.
Además, la presencia de proteínas “CEST-like” en los TriTryps impone el estudio de la
eventual conservación funcional de sus dominios CEST en S. thyphimurium LT2 u otras
bacterias enteropatógenas. Estos ensayos se están llevando a cabo actualmente en
nuestro laboratorio.
117
El último capítulo de esta Tesis presenta la caracterización antigénica y
funcional de las MASPs. La aplicación de un enfoque de alta cobertura como el Chagas-
Chip (180) para la priorización de epitopes antigénicos resultó ser de suma utilidad para
el estudio de esta familia multigénica y constituye una herramienta fundamental en el
desarrollo de vacunas derivadas de péptidos, como ya se ha visto precisamente para las
MASPs (198). A este respecto, los resultados presentados aquí representan una prueba
de concepto que puede ser aplicada al estudio de otras familias multigénicas con
regiones altamente variables o bien para la ampliación de este análisis dentro de las
MASPs a fin de evaluar la totalidad de las secuencias que conforman este grupo en
lugar de una muestra representativa. Esto último se está realizando actualmente.
Funcionalmente, el estudio de la expresión endógena de las MASPs junto con la
generación de sistemas de expresión homólogos para algunos miembros de esta familia
aportó información interesante respecto de su procesamiento en estadios de T. cruzi y de
sus roles en el contexto de la infección como moléculas secretadas profusamente en el
estadio trypomastigote y que generan un fenotipo de secreción particular.
Desde el punto de vista estructural, la generación de trypomastigotes expresando
MASPs en un sistema de expresión homólogo plantea la posibilidad de la determinación
(a través de la purificación) del patrón de glicosilación de las formas maduras de las
MASPs, desconocido aún y que aportará información importante acerca de las zonas
efectivamente relevantes desde el punto de vista antigénico o funcional. Además, dado
que recientemente se asoció a las MASPs con vesículas de secreción implicadas en la
transialidación “parácrina” de mucinas en la membrana del trypomastigote (104), la
determinación de las MASPs como posibles sustratos de la transialidasa es una cuestión
pendiente de suma relevancia en la infección por T. cruzi. Aunque se intentó el estudio
de la secreción y direccionamiento al núcleo de la célula hospedadora de las MASPs
recombinantes en un contexto de infección in vitro, estos ensayos requieren de controles
de especificidad y enfoques alternativos que deben llevarse a cabo.
Por otro lado, el rol de las MASPs en la invasión como adhesinas y su presencia
en rastros de secreción o “huellas” reportados paralelamente para mucinas de T. cruzi
(resultados sin publicar de la Tesis del Dr. Andrés Lantos) genera nuevos interrogantes
desde el punto de vista funcional. La similitud de este fenotipo (al menos en apariencia)
con el gliding impone la continuación de su estudio para determinar, por ejemplo, si
118
este fenómeno constituye en sí mismo una forma alternativa de locomoción (asociada
íntimamente a un sustrato) o bien un mecanismo de “anclaje y liberación” asistido por el
movimiento flagelar. Además, la identidad de los sustratos fisiológicos que las MASPs
implicadas en el fenotipo de secreción pudieran tener representa otro interrogante
interesante desde el punto de vista funcional.
Como nota final, se espera que este trabajo represente un aporte útil y funcional
al conocimiento de ciertos aspectos relacionados con la interacción de T. cruzi con el
hospedador mamífero, dada la relevancia que dicha interacción tiene sobre la salud
humana.
119
Materiales y Métodos
Análisis Bioinformático
Búsqueda Bioinformática
Para la identificación de candidatos susceptibles de caracterización bioquímica
se desarrolló una versión especial de la herramienta TDR Targets (90), que permitió la
priorización de posibles efectores mediante la aplicación de operadores booleanos
(sumas, restas, intersecciones) sobre distintos atributos de los genes de T. cruzi.
Obtención, análisis y alineamiento de secuencias
Para la obtención de secuencias se utilizaron las bases de datos y repositorios de
secuencias TriTrypDB (tritrypdb.org/tritrypdb/) y NCBI (ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). En
las búsquedas de homólogos/ parálogos de candidatos en general (Cap. I) y TCLP1 y
MASPs en particular (Caps. II, III) se utilizaron algoritmos de BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) implementado en estas plataformas.
Los alineamientos de secuencias se realizaron utilizando el algoritmo ClustalW
implementado en el programa MegAlign del paquete Lasergene, o bien el algoritmo
ClustalOmega (ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Para los alineamientos de secuencia
destinados a la construcción de árboles filogenéticos de TCLP1 y ortólogos (Cap. II) se
utilizó MUSCLE v3.7 (199), y las regiones ambiguas fueron removidas con Gblocks
v0.91b (200). Finalmente, la construcción de los árboles se realizó de acuerdo al método
de máxima parsimonia implementado en PhyML program v3.0 (201).
Predictores informáticos
La predicción de NLS se realizó mediante los programas cNLS Mapper (nls-
mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/) o bien NLStradamus (moseslab.csb.utoronto.ca). Para la
predicción de NES se utilizó NetNES 1.1 (cbs.dtu.dk/services/NetNES/) y para la
predicción de señales N-terminales de secreción/direccionamiento al ER (SP) se usó
SignalP 4.0 (cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Además, para validar la anotación de GPI
120
realizada por DGPI incluido en TDRTargets se utilizaron adicionalmente los predictores
PredGPI (gpcr.biocomp.unibo.it/predgpi/) y GPI-SOM (gpi.unibe.ch/).
Materiales y técnicas de Laboratorio
Bacterias Cepas
Para procedimientos estándar de clonado se utilizaron bacterias E. coli DH5,
Genotipo: F– Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK–,
mK+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1.
Durante el sub-clonado BamHI/XbaI de candidatos clonados BamHI/NotI en
pcDNA3.1::3xFLAG se utilizó la cepa de E. coli DSM4509, Genotipo: F− thr-1 araC14
leuB6(Am) Δ(gpt-proA)62 lacY1 tsx-33 supE44(AS) galK2(Oc) hisG4(Oc) rfbD1 mgl-
51 rpoS396(Am) rpsL31(Strr) kdgK51 xylA5 mtl-1 argE3(Oc) thi-1 dam (202).
La expresión de proteínas recombinantes se llevó a cabo en bacterias E. coli
BL21-Codon Plus®, Genotipo: F- ompT hsdS (rB - mB -) dcm+ Tetr gal λ endA Hte
(argU ileY leuW Camr).
Cultivo
El crecimiento de bacterias se efectuó a 37 ºC con agitación en medio líquido LB
(Luria Bertani: 10g/L Tryptone, 5 g/L Yeast extract, 5 g/L NaCl, pH:7, NaOH 1N,
estéril por autoclavado). Para el plaqueo se utilizó LB-Agar con la misma formulación y
agregado de 15 g/L de Bacto-Agar antes de autoclavar. La selección se llevó a cabo
suplementando el medio (líquido o sólido) con los antibióticos Ampicilina, Kanamicina,
o Estreptomicina 20-100 g/ml según el caso.
Generación y transformación de bacterias competentes
La generación de bacterias E. coli DH5, DSM4509 y BL21-Codon Plus®
ultra-competentes por CaCl2 fue levada a cabo a través del método de Inoue et al. (203).
121
La transformación de bacterias con DNA plasmídico fue efectuada mediante shock
térmico a 42 ºC según (204).
Células Cultivo
Se cultivaron células VERO o HeLA a 37 ºC en una atmósfera de 5% CO2 en
medio mínimo esencial (MEM) o bien D-MEM (Dulbecco’s-modified MEM),
suplementados con 5-10 % suero fetal bovino (SFB), y 100 UI/ml de Estreptomicina/
Penicilina.
Transfección de células mediante lipofección
Las células fueron transfectadas mediante el método de lipofección con el
lípido catiónico Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) siguiendo el protocolo
indicado por el fabricante.
Ensayo de Leptomicina B (LMB)
Para el ensayo de LMB las células fueron transfectadas, y tratadas (o no) con
30ng/mL de LMB durante 6 hs., fijadas y teñidas con DAPI (4’,6-Diamidino-2-
Phenylindole,Dihidrochloride) y montadas para su observación al microscopio de epi-
fluorescencia. En éstos ensayos, las construcciones AID::EGFP (Activation Induced
Deaminase), que presenta translocación núcleo/citoplasma (101) y EGFP sola fueron
utilizadas como controles positivos y negativos, respectivamente.
Parásitos Cepas Se trabajó mayoritariamente con la cepa de T. cruzi CL Brener (205) de
referencia para el proyecto genoma (171), y la cepa Adriana (TcI), que fue utilizada
previamente para la obtención de parásitos transgénicos por su facilidad en la
transfección (21, 24, 63).
122
Cultivo y obtención de estadios
El estadio epimastigote fue obtenido de cultivos axénicos crecidos a 28 ºC con
agitación en medio BHT (Brain-Heart infusion-tryptose: 33 g/l brain–heart infusion,
3 g/l tryptose, 4 g/l Na2HPO4, 0.4 g/l KCl y 2 g/l glucosa, pH 7.5, estéril y suplementado
con hemina (20 μg/l), penicilina (100 IU/ml), estreptomicina (100 μg/ml) y 10% (v/v)
SFB. Se cosecharon en fase exponencial de crecimiento. Los epimastigotes
transfectados con TCLP1 fueron crecidos y cosechados por centrifugación en fases
estacionaria y estacionaria tardía, o bien en MC (Medio Condicionado, obtenido a partir
de sobrenadantes esterilizados por filtración de cultivos en fase estacionaria tardía).
Los estadios trypomastigote y amastigote derivados de células fueron obtenidos
axénicamente a partir de monocapas de células VERO infectadas con T. cruzi (CL
Brener) y crecidas en medio MEM suplementado con 5% SFB y penicilina (100 IU/ml),
estreptomicina (100 μg/ml). Los trypomastigotes fueron enriquecidos por natación y
cosechados del sobrenadante por centrifugación a 3000 rpm a los 5 d.p.i. Los
amastigotes fueron obtenidos por centrifugación diferencial a partir de pellets de células
lisadas 7 d.p.i.
El estadio trypomastigote (cepa Adriana) derivado de la diferenciación de
epimastigotes transfectados con SP::FLAG::GPI (Cap. III) fue obtenido a partir de
cultivos en fase estacionaria tardía crecidos a 28 ºC sin agitación.
Transfección de epimastigotes por electroporación
Epimastigotes axénicos (Adriana) en fase exponencial de crecimiento fueron
lavados dos veces con BHT sin SFB a una concentración final de 5 x 108 parásitos/ml.
Se dispensaron alícuotas de 0.35 ml en cuvetas de electroporación de 0.4 mm
conteniendo 10 g de DNA plasmídico en un volumen de 10-15 l. Los parásitos
fueron electroporados con un electroporador mediante dos pulsos sucesivos de 335 V y
1400 μF. Luego de 5 min. en hielo, los parásitos fueron diluidos 10 veces en BHT 10%
SFB y dejados en recuperación por 24 hs a 28 ºC, luego de lo cual se agregó Geneticina
(G418) a una concentración de 250 μg/ml. Luego de la selección, los parásitos fueron
crecidos como se explicó más arriba, con el suplemento de G418 250 μg/ml.
123
Curvas de crecimiento, obtención de medio condicionado (CM) y cálculo de TCA
Para realizar las curvas de crecimiento de parásitos AdWT y TCLP1 (Cap. II), se
tomaron alícuotas de cultivos axénicos de dichos parásitos (típicamente cada 24 hs.), se
diluyeron apropiadamente en PBS-PAF 4% y se contaron en cámara de Neubauer. El
antibiótico fue removido de la cepa TCLP1 durante estos ensayos.
La obtención de CM (medio condicionado), es análoga a la de extractos de
secreción (véase más abajo). Brevemente, se centrifugaron (5,000 rpm, 5 min.) parásitos
en fase estacionaria tardía de crecimiento y el sobrenadante fue esterilizado por
filtración a través de filtros de nylon de 0.22 m.
El cálculo de la Tasa de Crecimiento Acumulada (TCA), se efectuó de acuerdo
a: TCA(%) = 100 – (Nro. de parásitos a las 48 hs. / Nro. de parásitos a las 24 hs. x 100).
Para las comparaciones pareadas se utilizó el test t de Student de dos colas
implementado en el programa GraphPad Prism
Infecciones de células con trypomastigotes
Para los ensayos de infección de células en general, se infectaron 104 células
VERO sobre vidrios circulares en placas multiwell de 24 con 105 trypomastigotes/
well (M.O.I. = 10). Luego de 24 o 48 hs., las células se fijaron con para-formaldehído
(PAF) 4% v/v en PBS (PAF- PBS) durante 30 min. a temperatura ambiente. Los vidrios
fueron teñidos con DAPI para realizar recuentos celulares y/o procesados para IFI. Para
recuentos, se contaron aproximadamente entre 300 y 1000 células por condición
utilizando un microscopio de epi-fluorescencia Nikon Eclipse 80i acoplado a una
cámara CCD DS-Qi1.
Para evaluar el efecto de la MASP173 recombinante sobre las infecciones se
procedió de igual modo pero se pre-trataron las células durante 30 min. con MASP173-
GST o GST sola en distintas concentraciones lavando y sin lavar luego con PBS (Cap.
III). En los experimentos de cambios de sobrenadantes entre Ad WT y SFG durante
infecciones, los parásitos se centrifugaron a 4000 rpm 4 min., los sobrenadantes se
filtraron por 0.22 m en filtros de micro-centrífuga y se usaron para resuspender los
parásitos previamente a la infección.
124
Ensayos de endocitosis (TCLP1)
Para medir la actividad endocítica de parásitos TCLP1 o WT (Cap. II), se
procesaron los parásitos como se describió previamente para la internalización de
ConA, (151). Brevemente, los parásitos fueron lavados dos veces en PBS e incubados
en hielo (4 ºC) durante 10 min. en BHT sin SFB suplementado con 100 g/mL de
ConA-rodamina (Invitrogen), luego de lo cual fueron puestos a 28 ºC durante 15 segs. y
5 min. (para permitir la internalización de la sonda). Inmediatamente después fueron
puestos en hielo y fijados con PAF-PBS 4% y procesados para su análisis por
microscopía de epi-fluorescencia. Para la cuantificación de la internalización de ConA,
se analizó la intensidad de fluorescencia de secciones poligonales correspondientes a la
zona del BF de parásitos TCLP1 y TII mediante el programa ImageJ. Se midieron al
menos 100 parásitos en cada caso y se obtuvieron valores medios de intensidad cuya
significancia estadística fue evaluada mediante contrastes pareados con el test t de
Student de dos colas implementado en el programa GraphPad Prism.
Técnicas de Biología Molecular y DNA recombinante Purificación de DNA total de T. cruzi
Para la purificación de DNA genómico (gDNA) de T. cruzi se cosecharon
cultivos de epimastigotes (CL Brener) en fase exponencial centrifugando a 4.000 rpm, 5
min. a 4 ºC y lavando tres veces con PBS (Phosphate Buffer Saline: 8 g/L NaCl, 0.2 g/L
KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4, pH: 7.4 HCL 1M). Los parásitos se
resuspendieron en buffer (Tris-HCl 10 mM pH 7.6, NaCl 100 mM, EDTA 100 mM), y
se lisaron mediante el agregado de SDS 1% final. El lisado se incubó con proteinasa K
100 μg/ml durante 16 hs a 55°C. A este lisado se le realizaron varias extracciones con 1
vol. de fenol:CHCl3:isoamílico (1:24:1) hasta la desaparición de proteínas en la
interfase. Las fases se separaron por centrifugación a 12.000 rpm, 5 min. Los restos de
fenol se extrajeron dos veces con 1 vol. de CHCl3:isoamílico (24:1). El DNA se
precipitó con 2,5 vol. de EtOH 100%. El pellet se lavó en EtOH 70%, se secó 5 min. (T
ambiente) y se resuspendió en buffer TE (Tris-HCl 10mM pH7,6; EDTA 1mM). Se
trató luego con RNAsa A (20 μg/ml) durante 45 min. a 37 ºC. Se realizó una extracción
con fenol:CHCl3:isoamílico y una vez con CHCl3:isoamílico, y se precipitó con 0.1 vol.
125
de CH3COONa 3M pH: 5.2 y 2.5 vol. de EtOH 100%. Se centrifugó a 14.000 rpm 30
min., 4 ºC. El pellet final se lavó en EtOH 70% y se resuspendió en buffer TE
Purificación de RNA total de T. cruzi
Se utilizó el reactivo comercial TRIzol (Life Technologies), basado en el método
de iso-tiocianato de guanidina y fenol:CHCl3 (206). Se siguieron las indicaciones del
fabricante, resuspendiendo aproximadamente 108 parásitos/ml de TRIzol.
Purificación de DNA plasmídico
El DNA plasmídico se purificó en general mediante el método de lisis alcalina
(Mini-Prep) según (207). Para el DNA destinado a secuenciación las muestras fueron
desaladas y precipitadas con NaCl 0.4 M y PEG8000 2.5%. La purificación de bandas
escindidas de geles de agarosa fue realizada mediante el pegado del DNA a sílica con el
kit QIAEX II (Qiagen)
Digestión con enzimas de restricción
Se empleó de rutina 1 UE (unidad enzimática) por g de DNA a digerir de
acuerdo las recomendaciones del fabricante. En general, las digestiones se realizaron en
el buffer recomendado durante 3 horas a 37 ºC, o en forma secuencial al tratarse de
enzimas incompatibles.
Ligación de fragmentos de DNA
Las reacciones de ligación se realizaron en un volumen final de 10 μl, utilizando
50 ng de vector y la cantidad de inserto para satisfacer la relación 3:1= inserto:vector.
Las incubaciones se realizaron en el buffer específico para la enzima, con 0,4 U de
ADN ligasa del bacteriófago T4 a 16 °C, por lo general durante 16 hs. Los vectores
fueron tratados con fosfatasa alcalina, utilizando 1U/pmol de vector en buffer de
restricción. Las ligaciones de productos de PCR se realizaron en el vector comercial
pGEM-T easy (Promega) en las condiciones indicadas por el fabricante.
126
PCR (Polymerase Chain Reaction)
La amplificación de genes se realizó mediante PCR utilizando oligonucleótidos
específicos derivados de las secuencias de los genes de interés (véase Anexo I). La
reacción de PCR se realizó utilizando Taq DNA polimerasa recombinante (Invitrogen)
en el buffer provisto por el fabricante. La concentración de MgCl2 utilizada de rutina fue
1,5 mM y se utilizaron 100 ng de cada oligonucleótido por reacción y 100 μM
concentración final de cada desoxi-nucleótido (dNTP, deoxy-Nucleotide Tri-
Phosphate) en un volumen final de 50-100 μl. La amplificación de los fragmentos se
realizó en 35 ciclos que constaron de: -desnaturalización 5 min. a 95°C, -hibridización
30 min. a una 4°C menor que la Tm del oligonucleótido de menor Tm, -extensión a
72°C durante 1 min. por cada 1 Kpb a amplificar. El cálculo de la Tm de los
oligonucleótidos se efectuó de acuerdo a la ecuación Tm = 4(G + C) + 2(A + T) oC, o
bien utilizando la suministrada por el programa Vector NTI Advance (Invitrogen).
RT-PCR (Reverse Transcriptase- PCR)
La reacción de transcriptasa reversa con el objeto de validar la anotación del
ATG inicial se efectuó utilizando AMV Reverse Transcriptase (Promega) con los
buffers, dNTPs y reactivos provistos por el fabricante. La síntesis de la primera hebra se
realizó con oligonucleótidos específicos (reversos, véase Anexo I) para el gen de interés
en cada caso sobre 0,5-1 g de RNA total de estadios de T. cruzi, incubando a 42 °C
durante 15 min. en 20 l (volumen final) seguido de la inactivación de la enzima a
95 °C durante 5 min. y 4 °C durante 5 min. Esta muestra (cDNA) se diluyó 5 veces y se
utilizaron 10-20 l como templado en reacciones de PCR utilizando TcME2 y el
oligonucleótido reverso específico en cada caso (véase Anexo I) en un volumen final de
50-100 l.
PCR cuantitativa (Real Time qPCR)
Para evaluar la expresión de TCLP1 en estadios de T. cruzi mediante PCR
cuantitativa, se prepararon muestras de cDNA de los distintos estadios (E,A,T) de
T. cruzi CL Brener como se explicó más arriba (RT-PCR), y se realizaron corridas de
qPCR utilizando SYBR green-based Real-Time PCR system (Bio-Rad) de acuerdo a las
127
indicaciones del fabricante y como se describió previamente (21) y los resultados
obtenidos fueron normalizados a la expresión del RNA ribosomal 18S (208).
Corridas de Geles de DNA
Los fragmentos de DNA fueron separados con fines analíticos o preparativos en
geles con diversos porcentajes de agarosa teñidos con bromuro de etidio 0,5 μg/ml y
corridos en cubas electroforéticas a 5V/cm. Las muestras fueron sembradas en buffer de
siembra: Ficoll 400 15% p/v, EDTA 6 mM pH: 8 y naranja G 2% p/v). El buffer de
corrida utilizado de rutina fue TBE: Tris-Borato 90 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA
2,5 mM pH: 8,3 y ocasionalmente TAE: Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1mM. El DNA
fue visualizado exponiendo a la luz UV el gel teñido con bromuro de etidio.
Expresión y análisis de proteínas recombinantes Expresión y purificación de proteínas recombinantes en sistemas procariotas
Para la expresión de proteínas recombinantes como fusiones traduccionales a la
enzima Glutatión- S- Transferasa (GST), se utilizaron vectores de expresión procariota
de la línea pGEX (Pharmacia Biotech). También se expresaron construcciones como
fusiones a corridas de histinas (His) en vectores pTrcHis (Invitrogen).
La purificación de las proteínas de fusión a GST se realizó a partir de un cultivo
bacteriano crecido durante una noche que fue diluido 10 veces en 500 ml de LB y
crecido 1 h a 37 ºC con agitación hasta una densidad óptica (DO) de 0,5 medida a 600
nm en un espectrofotómetro. El cultivo se indujo con el agregado de Iso-Propil-Tio-β-
D-Galactósido (IPTG) 0,1 mM y se dejó crecer por 3 hs adicionales a 37 ºC en
agitación. El pellet de bacterias cosechado se resuspendió en 10 ml de buffer TBS (Tris-
HCl 50 mM pH: 7.6, NaCl 150 mM), suplementado con 1 mM de PMSF (Phenyl-
Methyl-Sulfonyl-Fluoride) y 5 mM de EDTA (ácido Etilén-di-Amino-tetra-Acético).
Las bacterias fueron lisadas por sonicación (4 pulsos de 20 segs. en hielo). Luego de
centrifugar a 10.000 rpm, 10 min., el sobrenadante (fracción soluble) se llevó a 1%
Tritón-X 100 y se aplicó a una columna de afinidad de de Glutatión acoplado a agarosa.
Las proteínas de fusión se eluyeron con Glutatión reducido 15 mM en Tris-HCl 50 mM,
128
pH: 7,6. Las fracciones fueron visualizadas mediante SDS-PAGE (Sodium Dodecyl
Sulfate- Poly Acrylamide Gel Electrophoresis).
SDS-PAGE
Se utilizaron geles de distintos porcentajes (principalmente 12,5%) de
acrilamida: bis-acrilamida 29:1 según (207). Las muestras se sembraron en geles
desnaturalizantes 4:1 con buffer de muestra (100 mM Tris- HCl pH: 6,8, 2 % SDS, DTT
200 mM, glicerol 20% y azul de bromofenol 0,1%). Los geles se corrieron en cubas
electroforéticas a una corriente constante de 15 mA. Luego fueron teñidos con
Coomassie Blue G-250 o transferidos a membranas (para análisis de WB).
Inmunización de animales y obtención de anticuerpos
Obtención de sueros de inmunización murinos y de conejo
A fin de obtener sueros específicos para los candidatos de interés, las proteínas
expresadas como fusiones a GST fueron inyectadas en ratones BALB/c (de 60-90 días
de vida) una vez en forma intra-peritoneal con 25 μg de proteína en 1 ml de PBS con 1
ml de adyuvante completo de Freund, seguido de dos inoculaciones extra (boosts) con
12,5 μg de proteína en adyuvante incompleto con intervalos de 14 días. Los ratones se
sangraron a blanco y los sueros se obtuvieron por centrifugación después de dejar
coagular la sangre por 30 min. a 37 ºC.
Se realizaron además inmunizaciones de conejos con péptidos sintéticos
acoplados a KLH (keyhole limpet hemocyanin, Pierce) a través de un residuo de cisteína
C-terminal según las indicaciones del fabricante, siguiendo luego el mismo protocolo de
inmunización utilizado para proteínas recombinantes. Los péptidos acoplados a KLH
fueron también utilizados en la inmunización de conejos de acuerdo al protocolo
utilizado por el servicio de inmunización de animales de la Universidad Nacional de
Quilmes (UNQui).
Sueros de infección
Durante la evaluación antigénica de las MASPs, se utilizaron sueros crónicos de
infección humanos provenientes de diferentes paneles. Los sueros negativos (individuos
129
sanos, n= 38) y los sueros positivos (n=91, pacientes crónicamente infectados) fueron
obtenidos del Laboratorio de Parasitología-Chagas, Hospital de Niños Dr. Ricardo
Gutierrez, o de diferentes bancos de sangre: -Fundación Hemocentro Buenos Aires, -
Hospital de Enfermedades Infecciosas Dr. Francisco Javier Muñiz, -Hospital Italiano de
Buenos Aires (Buenos Aires, Argentina), y -Hospital Municipal Dr. Diego E.
Thompson (San Martín, Buenos Aires, Argentina (179).
Inmunoensayos. Western-Blot (WB).
Los geles SDS-PAGE fueron transferidos a membranas de PVDF (Poly-
Vinylidene Di Fluoride) mediante el dispositivo de transferencia semi-seca (BioRad) de
acuerdo a las indicaciones del fabricante. Para el análisis de WB, las membranas
bloquearon 30 min.-1 h. a temperatura ambiente con leche descremada 5% en TBS y se
incubaron con los sueros de inmunización (sueros de ratón MASP11173,
MASP11401, MASP10959, MASP10205) anticuerpos de conejo purificados por
afinidad (1277, TCLP1, MASPEP) o anticuerpos monoclonales (FLAG) en la
dilución adecuada (generalmente 1:100- 1:500 para los sueros de inmunización, 1:10-
1:50 para los anticuerpos purificados y 1:1000- 1:10000 para FLAG; todo en TBS-
leche) durante 1- 1.30 hs. a temperatura ambiente, o bien toda la noche a 4 ºC. Los
lavados (2-3, 5 min. c/u) se realizaron en TBS-Tween 0,05%. Finalmente se incubó con
anticuerpos secundarios ( ratón, conejo) acoplados a HRP (Horse-Raddish
Peroxidase, Sigma) durante 1 h. y se reiteraron los lavados. El revelado se efectuó por
quimio-luminiscencia sobre placas radiográficas, utilizando el sustrato Super-Signal
West Pico o bien (Fempto) Chemiluminescent Substrate (PIERCE).
Microscopía de epi-fluorescencia (Inmuno-Fluorescencia Indirecta, IFI)
Para el análisis de IFI, parásitos o células adheridos a vidrios tratados con poli-
lisina 1:10, fueron fijados en PAF- PBS, lavados (3x) con PBS, bloqueados con PBS-
4% BSA (Bovine Serum Albumin), o PBS-A suplementado con saponina 0,5% para
permeabilizar durante 30 min. e incubados con el anticuerpo primario correspondiente
en la dilución apropiada (24, 63). Luego de varios lavados con PBS, se incubó con
130
anticuerpos secundarios ( ratón, conejo) acoplados a fluoróforos Alexa (Molecular
Probes) usados 1:500-1:1000. Los núcleos se tiñeron con DAPI previamente al montaje
en FluorSave Reagent. Para IFI, los anticuerpos primarios se utilizaron a la misma
dilución que para WB (arriba). Los anticuerpos poli-clonales TbGRASP (147) y
TcCruzipaína (152) fueron usados 1:500, el suero TcAcuaporina (146) 1:200 y el
mAb FK-2 fue usado 1:1000.
Microscopía electrónica de transmisión (MET)
Para el análisis de parásitos AdWT y TCLP1 mediante TEM (158), se
cosecharon 109 parásitos y fueron lavados (3x) con buffer fosfato 0.2 M pH 7.5 (PB),
fijados en hielo por 1 h. con 0.25% glutaraldehído, 4% PAF-PB, y lavados (3x) con PB.
Las muestras fueron incluidas en resina LR-White, seccionadas en cortes ultrafinos y
preparadas para TEM de acuerdo a los procedimientos establecidos en el servicio de
microscopía LANAIS-MIE (UBA-CONICET). Para el análisis de TEM, las muestras
fueron teñidas con o bien mAb FLAG o αTCLP1 utilizados en diluciones 1:100 y
1:10, respectivamente, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados a partículas de
oro de 5 o 10 nm (Sigma). Los preparados finales fueron observados en un microscopio
Zeiss EM 109-T acoplado a una cámara CCD Gatan ES1000W. El procesamiento de las
imágenes se realizó mediante el programa ImageJ.
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) y ELISA sobre células
El análisis serológico de las MASPs (Cap. III) se realizó mediante ELISA sobre
MASPs recombinantes adsorbidas en placas de 96 wells de acuerdo a (179). Los
antígenos se disolvieron en buffer carbonato: 50 mM Na2CO3/NaHCO3 pH: 9.6 (buffer
de pegado) en 10 μg/ml. Las placas fueron incubadas a 4°C con 100 μl de la solución
de antígeno, lavadas (3x) con PBS-0.05% Tween 20 (PBST), y bloquedas 1 h. con 4%
leche descremada en PBST (PBST-leche) a 37°C. Las placas fueron luego nuevamente
lavadas (3x) en PBST antes del agregado de los sueros de infección humanos diluidos
1:500 en PBST-leche. Luego de incubar 1 h. a 37°C y lavar (3x) con PBST, se incubó
durante 1 h. a 37 ºC con anticuerpo de cabra humano acoplado a HRP (Sigma) 1:5000
en PBST-leche. Las placas fueron lavadas en incubadas con 100 μl de buffer
citrato/fosfato: 20 mM citrato, 50 mM Na2HPO4, pH: 5.0 suplementado con 0.2% H2O2,
131
seguidos por 50 μl del sustrato TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine). La reacción 100
μl de H2SO4 2 M, y se midió la absorbancia a 450 nm (A450). Se obtuvieron al menos
tres réplicas técnicas para cada combinación de suero/ MASP recombinante.
Para los ensayos de ELISA cobre células o In-Cell ELISA, se siguió un protocolo
explicado previamente (24). En forma abreviada, se sembraron 5×104 células HeLA o
VERO en placas de 96-wells y se crecieron 16 hs. en DMEM o MEM respectivamente.
Las células fueron fijadas con PBS- PAF 4% por 10 min., blocked with PBS-10% v/v
SFB por 30 min., e incubadas 1 h. con la proteína de fusión a GST (173-GST, 205-GST,
959-GST o GST sola), luego de lo cual se incubó con un suero policlonal -GST o bien
mAb -GST (GST-2, Sigma), ambos 1:1000 en PBS-2% v/v SFB. Seguidamente, las
placas fueron lavadas con PBS (4x, 5 min./lavado), y el anticuerpo secundario acoplado
a HRP correspondiente en cada caso fue agregado en una dilución 1:5000 en PBS-2%
v/v SFB. Finalmente, se procedió con el protocolo habitual de ELISA explicado
anteriormente.
Análisis de citometría de flujo (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting)
Para el análisis de citometría de flujo de los parásitos AdWT y TCLP1 (Cap. II),
se procedió de acuerdo a (63). Brevemente, los parásitos permeabilizados con saponina
0.5 % p/v en PBS fueron teñidos con el anticuerpo de conejo TCLP1 diluido 1:10 de
acuerdo al protocolo habitual de IFI utilizando -conejo acoplado al fluoróforo Alexa
488 (Invitrogen) 1:1000 como anticuerpo secundario. Para el análisis de actividad
endocítica, se utilizaron ConA-rhodamina o Transferrina-Alexa 488 (Invitrogen) a fin
de monitorear su internalización de estas sondas por parte de parásitos AdWT y TCLP1.
El procesamiento de los parásitos fue similar al explicado más arriba. Las muestras
fueron analizadas por un citómetro CyFLOW Partec y mediante el software FloMax.
Fraccionamientos bioquímicos Fraccionamiento Citoplasma- ER (Cit/ER)
Este fraccionamiento (Caps. I, II y III) fue utilizado en forma intensiva para
separar proteínas asociadas a membranas (en términos generales, microsomales) de
fracciones solubles o citoplasmáticas. Se realizó de acuerdo a lo explicado en (63, 187).
132
Brevemente, los parásitos se lavaron (2x) en: 0.25 M sacarosa, 5 mM KCl, y se
mantuvieron congelados al menos 48 hs., luego de las cuales fueron descongelados a
4 ºC y resuspendidos en: 50 mM Tris-HCl, pH: 7.6, 0.15 M NaCl, 1 mM E-64. Luego
de contrifugación a 15,000 xg durante 10 min., se recuperó el sobrenadante (fracción
citoplasmática, Cit) y el pellet se resuspendió en el mismo buffer suplementado con 1%
del detergente Nonidet P40. La suspension fue centrifugada como antes y se recuperó el
sobrenadante (fracción microsomal, ER) (187). Las fracciones fueron analizadas
mediante WB con distintos anticuerpos como se explicó más arriba. Para la validación
del fraccionamiento, las muestras se analizaron con sueros TbBiP como marcador de
ER (64) o bien con sueros TcPAbP como marcador de citoplasma (209), ambos
utilizados 1:1000.
Purificación de fracciones enriquecidas en proteínas ancladas con GPI
Este fraccionamiento fue utilizado en Cap. III para evaluar la presencia de las
MASPs en estudio en fracciones enriquecidas en proteínas de anclaje a membrana
mediante GPI. El protocolo está basado en la partición diferencial de fases a 37 ºC con
el detergente TX-114 (Tritón X-114 (63, 210). Para ello, se homogenizaron
1.5 × 108 parásitos en 2 ml de buffer de lisis: 10 mM Tris-HCl, pH:7.4, 150 mM NaCl,
2% TX-114, 1 mM PMSF e inhibidores de proteasas y se incubaron por 1 h. en hielo,
para ser procesados de acuerdo a (210). Brevemente, el homogenato se centrifugó a
8,800 xg por 10 min. a 0 °C, y el sobrenadante (S1) se guardó a -20 ºC durante 24 hs.
El pellet (P1) se lavó con 1 ml de buffer A (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl,
0.06% TX-114, 1 mM PMSF), se sonicó, y resuspendió in buffer de siembra (6 M urea).
S1 fue descongelado y sometido a separación de fases a 37 °C por 10 min. seguido de
centrifugación a 3,000 xg por 3 min. a temperatura ambiente. La fase acuosa (S2) fue
recuperada y la fase de detergente (TX-114) fue re-tratada con 1 ml de buffer A. La fase
acuosa (S3) fue recuperada y la fase TX-114 fue re-tratada con 1 ml de buffer A,
homogenizada, incubada por 30 min. a 0 °C, y centrifugada a 18,000 xg por 10 min. a
0 °C. El sobrenadante fue sometido a una nueva separación de fases luego de la cual la
fase de detergente (TX-114) fue considerada la fracción de GPI (210). Esta última
fracción fue precipitada con acetona y resuspendida en buffer de siembra para su
análisis por WB.
133
Fraccionamiento ConA- sefarosa
A fin de determinar la glicosilación de las MASPs recombinantes, se efectuó una
separación por resinas de ConA-Sefarosa (63). Se obtuvieron pellets de parásitos
(107/ml) de dstintos estadios de T. cruzi y fueron resuspendidos en buffer ConA: 50
mM Tris-HCl, pH: 7.4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% desoxicolato de sodio, 1
mM PMSF, 50 μM TLCK, 1 mM DTT) y fraccionados en 200 l de ConA-Sefarosa.
Luego de varios lavados, la elución se llevó a cabo con 300 μl de buffer ConA
suplementado con 0.5 M α- metil-manósido. Las fracciones unidas (bound, B) y no
unidas (unbound, UB) fueron analizadas por WB.
Preparación de extractos de secreción
Para la preparación de extractos de secreción (medio condicionado ó CM), se
procedió de acuerdo a lo establecido previamente (63). Se incubaron parásitos
(epimastigotes a 28 °C y trypomastigotes ó amastigotes a 37 ºC) por 3 hs. en medio sin
SFB (BHT para epimastigotes, MEM para trypomastigotes y amastigotes). La
suspensión de parásitos fue centrifugada en forma suave (5 min. a 3,500 xg) y el
sobrenadante fue filtrado por 0.22 m y usado como medio condicionado (CM).
134
Anexo I – Oligonucleótidos, vectores y construcciones
Oligonucleótidos
Tabla AI.1. Oligonucleótidos utilizados para generar las construcciones mostradas en la
presente Tesis
I- Oligonucleótidos para el clonado de candidatos en vectores pcDNA3xFLAG/pEGFPC-1
Candidato (TcCLB5. … ) Secuencia (5’-3’)
for: AGGGATCCCCAGGAATTCCGGG 10205.50 (MASP 205) rev: AAGCGGCCGCGGTGCTGCCGTCACTGTCGCC
for: AAGGATCCATGAACGCCAACGA 10241.10 (TCLP1)
rev: TAGCGGCCGCTTGTCACACGCTTGTAATCT for: AGGGATCCATGCGGGAAAAGCA
10759.170 rev: AAGCGGCCGCCAGTCAAATCCACTAACTCATC
for: AAGGATCCATGACCGCTAAAAGTGTCTCTAA 11249.80
rev: AAGCGGCCGCGGGTGGCTTCATGGTAAAAGT
for: TTGGATCCATGCGAGGAGCCACTTGTCTT 10431.280
rev: TTGCGGCCGCAGGCCGGTTTCTTCTTCGA
for: ATGGATCCATGAAGTCCACCAGTTACCAG 10181.60
rev: ATGCGGCCGCAAATGTTCTCCATCAGTTCT
for: ATGGATCCATGAGCCACTCTGAAGCATTC 11277.250
rev: TAGCGGCCGCGTCATTTCTTCAATTACCTCTCG
for: AAGGATCCATGGAAGAAAGTCATAGTACCTGC 08479.150
rev: ATGCGGCCGCTCAAGTGGTTATCCGCTGTGC
for: AAGGATCCATGACGGCTGCTGGAGAGGAGA 11283.200
rev: ATGCGGCCGCACTGCTCACCAAGATCTAGCG
II- Oligonucleótidos (for) para el clonado de candidatos con SP (putativo) en pRIBOTEX
Candidato (TcCLB5. …) Secuencia (5’-3’)
10181.60 for: CGGGATCCATGCCTTTCCTTGCG
11277.250 for: CGGGATCCATGCTTTATGCTTTTATTGC
135
III- Oligonucleótidos para el clonado del motivo CesT, SicP y SptP en el sistema -red
Nombre Secuencia (5’-3’)
RBS CEST CGGAATTCCAAGAGGAAAGTAAAATGCATCATCATCATCATCATCGAGAAAATGCCATTGACAAC
CEST REV CCAAGCTTTCATTGCGTATCTACAGTGCTCAGTAACTC
RBS SICP CGGAATTCCAAGAGGAAAGTAAAATGCATCATCATCATCATCATTTGCAAGCACACCAGGATATT
SICP REV CCAAGCTTTCATACTTTAGCATATTCCTGCAGTATGTT
SPTP FOR GGCAAGCTTATGCTAAAGTATGAGGAGAG
SPTP REV GGTCTAGAGCTTGCCGTCGTCATAAGCA
T7 (for) TGTAATACGACTCACTATAGGG
SP6 (rev) ATTTAGGTGACACTATAG
IV- Oligonucleótidos para el análisis de ORF (verificación ATG inicial)
Nombre Secuencia (5’-3’)
TcME2 (for) ATTATTGATACAGTTTCTGTACTAT
0241 rev200 AATCGTTTCCCATCGTCTG
1277 rev262 ACGGATAATTTGTTTGCTGAA
V- Oligonucleótidos para la expresión de MASPs recombinantes (fragmentos) en pGEX
Fragmento Secuencia (5’-3’)
for: GGATCCCCAGGAATTCAAGACATTAA 173
rev: GCGGCCGCGGTGCTGCCGTCACTGTC
for: GGATCCCCAGGAATTCAAGACATTA 173 C
rev: GCGGCCGCATCATTCTCCTCTTCTTTCT
for: GGATCCCCAGGAATTCTTCTGCAATAA 959
rev: GCGGCCGCGGTGCTGCCGTCCTGTCGC
for: GGATCCCCAGGAATTCCGGGTGGTGC 205
rev: GCGGCCGCGGTGCTGCCGTCACTGTC
for: GGATCCGCCGGCCGTAGACCTCCTCAA 401
rev: GCGGCCGCTCTTTCCCGCTGCTTCTTCGT
VI- Oligonucleótidos para la expresión de MASPs recombinantes en parásitos
Nombre Secuencia (5’-3’)
11173 SP FOR ATTCTAGAATGATGATGACTGGCCGCCTGCTG
11173 SP REV TAATCGATTCGCTTTTCCTCTCGTGTT
11173 GPI FOR CTCAATTGAATGAAAATAAAGAAGCCAAT
11173 GPI REV GACTCGAGTCACGCGGCCACCACCGCAG
11173 REV FLAG XHO GACTCGAGTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTA
136
Vectores
A continuación (Fig. AI.1) se muestran por orden de aparición los vectores
definitivos (A-E, se obvian vectores intermediarios) utilizados para la generación de las
construcciones mostradas en esta Tesis.
Figura AI.1. Vectores utilizados para las construcciones mostradas en esta Tesis
137
A) pEGFP (Invitrogen): Vector pEGFP utilizado para generar candidatos expresados en células
eucariotas como fusiones C-terminales a GFP (Cap. I). Se muestran los sitios BamHI y XbaI
utilizados para introducir en forma direccionada los insertos provenientes de pcDNA::3xFLAG
y el cassette de resistencia a Neomicina (Neomycin R). B) Vector pRIBOTEX (144) utilizado
para generar construcciones de candidatos expresados en epimastigotes de T. cruzi (Caps. I y
II). Se muestran los sitios BamHI, HindIII utilizados para clonar en forma direccionada los
candidatos como fusiones N-terminales al epitope 3xFLAG. También se muestran la región para
la inserción en el locus ribosomal (RTS, Ribosomal Transcribed Spacer), las secuencias
intergénicas correspondientes al gen de GAPDH (Glyeraldehyde-3- Phosphate dehydrogenase),
y los cassettes de resistencia a G418 (Neomycin R) para la selección en parásitos y Ampicilina
(Amp R) para la selección en bacterias. C) Vector de expresión pbbr1-mcs2 (211), replicativo en
Salmonella sp. utilizado para expresar 6xHis::SicP y 6xHis::TCLP1 en los ensayos de
complementación de cepas de Salmonella typhimurium LT2 mutantes para SicP (Cap. II). Se
muestran los elementos requeridos para la recombinación y la replicación en Salmonella sp.
(mob y rep, respectivamente), el cassette de resistencia a Kanamicina (Kan R) y los sitios de
múltiple clonado interrumpiendo el gen LacZ (LacZ). D) Vector psb 5334 utilizado para clonar
al efector SptP de Salmonella sp. como fusión traduccional N-terminal al epitope 3xFLAG. Se
indica el cassette de resistencia a Ampicilina (Amp R) y la ubicación del epitope 3xFLAG río
abajo de los sitios HindIII y XbaI. E) Vector pGEX-2T con el sitio de clonado múltiple (MCS)
modificado (179) utilizado para la expresión y purificación en bacterias de fragmentos
recombinantes de algunas MASPs como fusiones C-terminales a la proteína GST (Cap. III). Se
muestra la región correspondiente a GST, los sitios de clonado únicos presentes en MCS, el
orígen de replicación en bacterias (Rep Origin 1), y el represor lactosa (lac rep) y su sitio de
unión (lac) para la inducción por IPTG. F) Vector pTREX-Omni (184) utilizado para la
transfección de epimastigotes y posterior diferenciación a trypomastigotes de T. cruzi con
MASPs recombinantes expresadas con un epitope FLAG interno (antes del GPI). Se muestra el
sitio de clonado múltiple que permite generar constructos con FLAG y/o EGFP fusionados. Los
restantes elementos del vector son similares a B).
138
Construcciones
A continuación se mostrarán de manera esquemática las estrategias de clonado
implementadas para la generación de las construcciones finales mostradas en esta Tesis.
Construcciones para la expresión de candidatos como fusiones a GFP
Para la expresión de los candidatos emergentes de la búsqueda bioinformática
como fusiones traduccionales a GFP a fin de validar las señales de localización nuclear
(NLS, NES) predichas (Cap. I), se amplificaron a partir de gDNA de T. cruzi versiones
truncadas (sin SP y/o GPI) de los mismos. En los oligonucleótidos específicos directo y
reverso utilizados a tal fin se incluyeron los sitios BamHI y NotI respectivamente a fin
de clonarlos en forma direccionada en el vector pcDNA3.1::3xFLAG generado en
nuestro laboratorio que contiene 3 epitopes FLAG introducidos mediante los sitios NotI
y XbaI y que contiene además su propio codón stop (Fig. AI.2A). De esta manera se
generaron construcciones de candidatos clonados como fusiones traduccionales N-
terminales al epitope 3xFLAG en el vector pcDNA3.1. A partir de este vector, y
utilizando los sitios BamHI y XbaI, se sub-clonaron los candidatos en el vector pEGFP
como fusiones traduccionales C-terminales a la proteína verde fluorescente GFP (Fig.
AI.2B). Dado que el sitio XbaI de pEGFP está normalmente metilado en bacterias
dam+, se utilizaron competentes dam- (cepa E. coli DSM4509 (202), a fin de digerir
con esta enzima.
139
Figura AI.2.Construcciones de candidatos expresados como fusiones traduccionales a EGFP
(Validación funcional de NLS, NES)
A) Se muestra ejemplificada la generación de la generación de la construcción 10241::3xFLAG
en el vector pcDNA 3.1. Para la construcción de los restantes candidatos se aplicó la misma
estrategia. B) Se muestra ejemplificada la generación de la construcción
EGFP::10241::3xFLAG en el vector pEGFP-C1. Esta construcción se utilizó como vector
aceptor BamHI/NotI de los restantes candidatos.
Construcciones para la expresión de candidatos en epimastigotes de T. cruzi
A fin de expresar a los candidatos de interés en epimastigotes de T. cruzi para
evaluar su localización subcelular (Caps. I y II, TCLP1), se generaron construcciones de
los mismos como fusiones N- terminales al epitope 3xFLAG. Para ello, los candidatos
fueron clonados en el vector de expresión en T. cruzi pRIBOTEX (144). Para generar
las construcciones completas (incluyendo SP y/o GPI), se re-amplificaron los
candidatos a partir de gDNA de T. cruzi como se explicó más arriba utilizando un nuevo
oligonucleótido directo con el sitio BamHI. A su vez, se generó un vector
140
pRIBOTEX::3xFLAG aceptor BamHI/NotI clonando al candidato TCLP1 mediante
PCR a partir del vector pcDNA3.1::3xFLAG utilizando el oligonucleótido directo 0241
FOR y el reverso REVFLAG HindIII, que posee el sitio HindIII río abajo del epitope
3xFLAG (Fig. AI.3). En general, todos los demás productos de PCR o digestiones
BamHI/NotI (del vector pcDNA3.1 o bien pEGFP) fueron clonadas en el vector
pRIBOTEX::3xFLAG aceptor BamHI/NotI mediante estos sitios de restricción.
Figura AI.3.Generación de construcciones para la expresión de candidatos en epimastigotes de
T. cruzi en fase traduccional con el epitope 3xFLAG
Se muestra ejemplificada la generación de la generación de la construcción 10241::3xFLAG en
el vector pRibotex mediante PCR a partir de 10241::pcDNA3xFLAG con el oligonucleótido
REV FLAG HIND. Esta construcción funcionó como aceptor BamHI/NotI de los restantes
candidatos.
Construcciones para el ensayo de complementación funcional de Salmonella
A fin de realizar los ensayos de complementación funcional de SicP con el
motivo CEST de TCLP1 (Cap. II), se generó una cepa de Salmonella enterica serovar
141
Typhimurium LT2 (S. thyphimurium LT2) mutante por deleción para la chaperona SicP
mediante el sistema de recombinación homólogo “-red” (137). Este sistema requiere
de la electroporación de bacterias con fragmentos lineales de DNA con el gen para la
resistencia a algún antibiótico flanqueado por regiones 5’ y 3’ homólogas al gen de
interés. Para lograr esto se generó primero una construcción consistente en el gen para
la enzima cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) que confiere resistencia al antibiótico
cloranfenicol flanqueado en sus extremos 5’ y 3’ por 200 bp correspondientes a la
secuencia del gen para la chaperona SicP (SicP::CAT). Para la generación de
SicP::CAT, la secuencia de SicP fue amplificada a partir de gDNA de S. thyphimurium
LT2 con los oligonucleótidos SICP FOR y SICP REV y clonada en el vector pGEM-T
easy (Invitrogen). Aprovechando la presencia de un sitio EcoRV interno en la secuencia
de SicP, la construcción SicP::pGEM-T easy fue linealizada mediante la digestión con
EcoRV para ser luego ligada con el gen CAT extraído por digestión con SmaI del vector
pRY-109 (212). Esta ligación fue posible debido a que tanto EcoRV como SmaI dejan
extremos romos. La construcción SicP::CAT:: pGEM-T easy fue utilizada finalmente
para la obtención del fragmento lineal SicP::CAT mediante PCR con oligonucleótidos
T7 y SP6 que luego de su purificación fue electroporado en bacterias S. thyphimurium
LT2 previamente transformadas con el sistema “-red” contenido en el vector pkD46
(213); Fig. AI.4A y B.
Por otra parte, para la complementación funcional de bacterias S. thyphimurium
LT2 WT o bien deficientes (Knock-Out, K.O.) en SicP con esta proteína o bien el
motivo CesT presente en TCLP1, se generaron construcciones de estos dos motivos en
el vector pbbr1-mcs2 (211). Para lograr esto, se amplificaron mediante PCR las
secuencias correspondientes a SicP y CesT (TCLP1) utilizando los oligonucleótidos
SICP FOR/SICP REV y TCCEST FOR/TCCEST REV; respectivamente. Los
oligonucleótidos SICP FOR y TCCEST FOR poseen ambos en su secuencia sitios para
el reconocimiento por el ribosoma (Ribosomal Binding Site, RBS) y un arreglo N-
terminal de 6 histidinas en tándem (epitope 6xHis) a fin de poder reportar la expresión
de estas proteínas recombinantes en S. thyphimurium LT2. Los productos resultantes
fueron clonados en pGEM-T easy (Invitrogen) obteniéndose las construcciones
SicP::pGEM-T easy (mencionada más arriba) y CesT::pGEM-T easy (Fig. AI.4A y B),
que fueron utilizadas para sub-clonar SicP y CesT utilizando el sitio EcoRI del vector
142
pGEM-T easy en el vector final pbbr1-mcs2 (211) previamente digerido con esta
enzima de restricción (Fig. AI.4C).
Por último, se generó la construcción SptP::FLAG para expresar en S.
typhimurium LT2 al efector SptP que es secretado en forma dependiente de SicP por el
TIIISS y utilizado en nuestro sistema como reportero del efecto de deleción de SicP, ya
que en ausencia de esta chaperona SptP es retenido en el citoplasma de la bacteria y
eventualmente degradado (136, 138). Para esto, el gen correspondiente a SptP fue
amplificado a partir de gDNA de S. thyphimurium LT2 con los oligonucleótidos SPTP
FOR y SPTP REV y fue clonado en forma direccionada en el vector psb.5334 mediante
los sitios HindIII y XbaI río arriba y en fase traduccional al epitope 3xFLAG contenido
en el vector (Fig. AI.4D).
Figura AI.4.Construcciones para el ensayo de complementación funcional de Salmonella
typhimurium LT2 con el motivo CesT de TCLP1
143
A) Esquema de la PCR sobre gDNA de Salmonella con oligonucleótidos SICP FOR/ REV y
TCCEST FOR/ REV. Se muestra el sitio EcoRV presente en el amplicón de SicP utilizado para
generar la construcción SicP::CAT::pGEM-T easy. B) Construcción intermediaria
SicP::pGEM-T easy. Una construcción similar se obtuvo para el motivo CesT de
TCLP1 (CesT::pGEM-T easy). Esta construcción se usó para generar SicP::CAT::pGEM-
T easy mediante la inserción de CAT a través del sitio EcoRV. Se muestran además los
sitios de pegado de los oligonucleótidos T7 y SP6. C) Construcción 6xHIS::SicP::pBBR MCS-2
obtenida mediante la inserción EcoRI de 6xHis::SicP contenida en SicP::pGEM-T easy (B). Una construcción análoga se obtuvo para el motivo CesT de TCLP1. D) Construcción
Sptp::3xFLAG- psb.5334. Se muestra el esquema de la PCR sobre gDNA de Salmonella con
oligonucleótidos SPTP FOR/ REV con sitios HindIII y XbaI respectivamente utilizados para
clonar en forma direccionada al efector SptP como fusión traduccional al epitope 3xFLAG
contenido en el vector psb.5334.
Construcciones para la expresión recombinante de proteínas de fusión a GST
Para expresar en forma recombinante candidatos como fusiones C-terminales a
GST a fin de su purificación y su utilización en la generación de anticuerpos o ensayos
de ELISA y binding sobre células (Cap. III), se utilizó un vector pGEX 2T con su sitio
de múltiple clonado (MCS) modificado (179). Se diseñaron oligonucleótidos para
amplificar fragmentos recombinantes de los candidatos en cuestión que fueron clonados
en forma direccionada utilizando combinaciones distintas de los sitios de restricción
incluidos en el MCS (Tabla AI.1 y Fig. AI.1E).
Construcciones de MASPs con epitope FLAG
Las construcciones de las MASPs SP::FLAG::GPI y SP::FLAG utilizadas para
transfectar parásitos y evaluar la funcionalidad de estas señales de tráfico (Cap. III)
fueron generadas utilizando el vector pTREX-Omni (184). Este vector contiene varias
regiones para construir distintas fusiones traduccionales, como GFP y 3xFLAG (Fig.
AI.1F). Para construir las versiones con el epitope FLAG interno (río arriba de la
secuencia consenso para la adición de GPI, SP::FLAG::GPI), se amplificaron por PCR
a partir de gDNA de T. cruzi CL Brener las regiones correspondientes a la secuencia
consenso GPI con los oligonucleótidos GPI FOR y GPI REV (Tabla AI.1). Este
144
producto fue clonado en forma direccionada mediante los sitios EcoRI/XhoI presentes
en el vector y los sitios MfeI (compatible con EcoRI) y XhoI presentes en los
oligonucleótidos GPI FOR y GPI REV respectivamente (Tabla AI.1). Al hacer esto, se
eliminó la secuencia correspondiente a GFP río abajo del epitope 3xFLAG en pTREX-
Omni y se generó la construcción pTREX::3xFLAG::GPI (Fig. AI.5A). Por otro lado,
se amplificó también la región restante de las MASPs mediante los oligonucleótidos SP
FOR y SP REV y se clonó en la construcción pTREX::3xFLAG::GPI mediante los
sitios XbaI/ClaI presentes en este vector intermediario y en los oligonucleótidos SP
FOR y SP REV respectivamente, obteniéndose la construcción definitiva
pTREX::SP::FLAG::GPI (Fig. AI.5B). Finalmente, para obtener la construcción GPI
(pTREX::SP::FLAG), se amplificó SP::FLAG de pTREX::SP::FLAG::GPI mediante
los oligonucleótidos SP FOR y SP REV FLAG XHO (Tabla AI.1) y se sub-clonó dicho
fragmento en forma direccionada digiriendo mediante las enzimas de restricción
XbaI/XhoI tanto al vector parental (pTREX-Omni ó pTREX::SP::FLAG::GPI) como al
producto SP::FLAG (Fig. AI.5C).
145
Figura AI.5.Construcciones para la expresión de MASPs recombinantes en parásitos de T. cruzi
A) Generación de la construcción intermediaria 11173::3xFLAG::GPI-pTREX Omni (I). El
amplicón correspondiente a la porción terminal (GPI) de la MASP 11173 obtenido con los
oligonucleótidos 11173 GPI FOR/ GPI REV fue ligado mediante los sitios MfeI/XhoI en el
vector pTREX Omni digerido EcoRI/XhoI. B) Obtención de la construcción completa 11173
SP::FLAG::GPI-pTREX Omni mediante PCR con oligonucleótidos 11173 SP FOR/ SP REV
seguida de la ligación con 11173::3xFLAG::GPI-pTREX Omni (I) mediante los sitios
XbaI/XhoI. C) Obtención de la construcción truncada 11173::SP::FLAG (GPI). El amplicón
generado a partir de PCR sobre SP::FLAG::GPI- pTREX Omni con los primers SP FOR/ REV
FLAG XHO fue digerido XbaI/XhoI y ligado en 11173::3xFLAG::GPI- pTREX Omni (I)
mediante estos sitios de restricción.
146
Anexo II -Publicaciones
Pósters o Presentaciones Orales
“TCLP1, una nueva proteína del bolsillo flagelar homóloga a chaperonas bacterianas e
implicada en el crecimiento de formas replicativas de T. cruzi.”
Takada R., Cámara M. de L., Briones G., Buscaglia C.A., Durante I.M. XXVIII Reunión Anual
de la Sociedad Argentina de Protozoología, Santa Fé (2016).
“Caracterización antigénica de las proteínas MASPs de Trypanosoma cruzi”
La Spina P.E., Durante I.M., Carmona S.J., Agüero F., Buscaglia C.A. XXVIII Reunión Anual
de la Sociedad Argentina de Protozoología, Santa Fé (2016).
“cAMP-Epac dependent regulation of T. cruzi invasion.”
Musikant D., Ferri G., Durante I.M., Buscaglia C.A., Altschuler D., Edreira M.M.. International
Molecular Parasitology Meeting, Estados Unidos (2014).
“cAMP-Epac dependent regulation of T. cruzi invasion.”
Musikant D., Ferri G., Durante I.M., Buscaglia C.A., Edreira M.M. XXVII Reunión Anual de la
Sociedad Argentina de Protozoología, Buenos Aires (2014).
“Híbridos de alcaloides y ácidos biliares con actividad tripanocida disminuyen la infección
por T. cruzi en células de mamíferos.”
Musikant D., Mild J., Leverrier A., Durante I.M., Buscaglia C.A., Palermo J., Edreira M. XXVI
Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología, Rosario (2013).
“Characterization of TcCesT, a novel Trypanosoma cruzi protein associated to the flagellar
pocket.”
Durante, I.M., Agüero, F., Buscaglia, C.A. XXLVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina
de Investigación en Bioquímica y Biología Molecular, Mendoza (2012).
147
“Screening of Molecules directed to the Host Cell Nucleus in Trypanosoma cruzi. ”
Durante, I.M., Carmona, S.J., Agüero, F., Buscaglia, C.A. XXLVII Reunión Anual de la
Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología Molecular, San Luís (2011).
“Búsqueda de moléculas dirigidas al núcleo de la célula hospedadora durante la infección
por Trypanosoma cruzi.”
Durante, I., Carmona, S., Agüero, F., Buscaglia, C.A. XXIV Reunión Anual de la Sociedad
Argentina de Protozoología, Córdoba (2010).
Trabajos
“Structural and functional characterization of mucin-associated surface proteins (MASPs)
in Trypanosoma cruzi”
Durante, I.M., Chidichimo, A., Buscaglia, C.A. (manuscrito en preparación).
“Antigenic characterization of the mucin-associated surface proteins (MASPs) family of
Trypanosoma cruzi”
Durante, I.M., La Spina, P., Carmona, S.J., Agüero F., Buscaglia, C.A. (manuscrito en
preparación).
“A Novel Trypanosoma cruzi Protein Associated to the Flagellar Pocket of Replicative
Stages and Involved in Parasite Growth.”
Durante, I.M., Cámara, M.de L., Buscaglia, C.A. PLoS One. 2015 Jun 18;10(6).
“Trypanosoma cruzi TcSMUG L surface mucins promote development and infectivity in
the triatomine vector Rhodnius prolixus.”
Gonzalez M.S., Souza M.S., Garcia E.S., Nogueira N., Cánepa G.E., Bertotti S., Durante I.M.,
Azambuja P., Buscaglia C.A. PLoS Negl Trop Dis 2013 7(11).
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