PRISCYLA DANIELY MARCATO GASPARI SISTEMAS MICRO E ...repositorio.unicamp.br/jspui/bitstream/REPOSIP/248929/1/Gaspari_P… · CURRICULUM VITAE PRISCYLA DANIELY MARCATO GASPARI e-mail:

I

Universidade Estadual de Campinas Instituto de Química Departamento de Físico-Química

PRISCYLA DANIELY MARCATO GASPARI

SISTEMAS MICRO E NANOESTRUTURADOS: PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO NO

CARREAMENTO DE ATIVOS

Orientador: PROF. DR. NELSON EDUARDO DURÁN CABALLERO

CAMPINAS 2009

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Dedicatória

A conclusão desta tese de Doutorado foi um grande desafio e vitória para mim, a

qual dedico as pessoas mais importantes na minha vida:

A Deus, em quem deposito toda a minha confiança. Obrigada por me presentear

com uma família maravilhosa a qual amo muito.

“Não temas, que eu sou contigo; não te assombres, porque eu sou o teu Deus; eu te

esforço, e te ajudo e te sustento com a destra da minha justiça.” Isaías 41:10

Aos meus pais Nelcio e Yolanda, os quais sempre me apoiaram e incentivaram

nas realizações dos meus projetos. Agradeço por todo carinho e amor que sempre me

dedicaram e, principalmente, por acreditarem em mim. Obrigada por me ensinarem a

sempre ser correta e nunca desistir, a enfrentar desafios e acreditar nos meus sonhos.

“Entrega o teu caminho ao Senhor confia nele, e ele tudo fará” Salmos 37:5.

As minhas irmãs Alessandra e Andréia e ao meu cunhado Flávio, por todo apoio

e amizade. Agradeço por sempre torcerem por mim e pelos bons conselhos que sempre

me deram.

Ao meu grande Amor Alexandre, por sempre me apoiar e acreditar em mim.

Agradeço por toda paciência nos momentos difíceis, por me fazer rir mesmo quando

estava chorando e por sempre me apoiar nos meus sonhos. Obrigada por tornar a minha

vida mais bela e feliz.

“Põe-me como selo sobre o teu coração, como selo sobre o teu braço, porque o amor é

forte como a morte, e duro como a sepultura o ciúmes; as suas brasas são brasas de

fogo, labareda do Senhor.

As muitas águas não poderiam apagar esse amor nem os rios afogá-lo; ainda que alguém

desse toda a fazenda de sua casa por este amor, certamente a desprezariam” Cantares

de Salomão 8:6-7

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VII

AGRADECIMENTOS

Para o desenvolvimento desta tese, a participação e o apoio de muitas pessoas

foram fundamentais. Por isto gostaria de agradecer:

Ao Prof. Nelson Duran, por acreditar no meu potencial e me ensinar o que é ser

uma pesquisadora. Obrigada por me proporcionar muitas oportunidades que contribuíram

para a minha vida profissional e pela amizade que sempre teremos.

Aos amigos do laboratório, Adriana, Alessandra, Ana Paula, Carla, Capi, Chico,

Daniela, Jeanifer, Juliana, Leonardo, Lívia, Marcela, Patrícia, Sandra, Stephany,

Rose, Zaine e a Profa. Ljubica pela amizade, apoio e incentivo. Obrigada, pelas

importantes contribuições de cada um tanto para a minha tese quanto para a minha vida

pessoal. Obrigada pelas palavras amigas nos momentos difíceis e alegres, pelas risadas

e choros que juntos passamos neste período. Muitas pessoas passam pela nossa vida,

mas só algumas fazem diferença, deixando uma marca. Vocês são estas pessoas.

Aos meus alunos Wellington, Jeanifer, Leonardo, Stephany, Carla e Daniela

pelas valiosas contribuições para a realização deste trabalho. Obrigada pela amizade,

pelos momentos alegres e por todas as coisas que vocês me ensinaram. Vocês foram

muito importantes para mim durante este trabalho.

À profa. Patrícia S. Melo, sua aluna Iasmin e ao Neto, do Instituto de Biologia da

Universidade Estadual de Campinas, por todo apoio nos testes de citotoxicidade, pela

amizade e pelas valiosas contribuições para o desenvolvimento deste trabalho.

VIII

Às profas. Gisela Z. Justo e Carmen V. Ferreira e aos seus alunos Rodrigo e

Daisy, do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas, por todo apoio nos

testes de cito e fotoxicidade e pelo estudo in vivo com Zebrafish. Agradeço pela amizade

e pelas grandes contribuições de vocês à minha Tese.

À Profa Bartira Rossi-Bergmann e seu aluno Eduardo, do Instituto de Biofísica

Carlos Chagas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pelos estudos in vivo.

Agradeço o grande apoio de vocês na realização destes estudos que contribuíram

sigficativamente para a minha Tese.

Ao prof. Marcelo Brocchi e seus alunos Dorival e Gerson, do Intituto de Biologia

da Universidade Estadual de Campinas, pela realização ensaios de atividade

antimicrobiana. O apoio de vocês foi fundamental para a realização desta tese.

A todos os professores do Instituto de Química, que sempre me atenderam com

muito respeito e me ajudaram no desenvolvimento deste trabalho. Obrigada por

contribuírem com o meu crecimento profissional.

Aos funcionários Cláudia, Daniel e Carlos, pela paciência e ajuda na realização de

muitas análises. Obrigada pelo apoio e pela amizade de vocês.

A todos os funcionários, que sempre me atenderam com muito carinho e me

ajudaram no decorrer deste trabalho.

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CURRICULUM VITAE

PRISCYLA DANIELY MARCATO GASPARI

e-mail: [email protected]

1. FORMAÇÃO ACADÊMICA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS (UNICAMP)

• Bacharelado e Licenciatura em Química. Conclusão: Dez/2003

• Mestrado em Físico-Química Título: Preparação e caracterização de micro e nanopartículas poliméricas contendo estreptomicina

Orientador: Prof. Dr, Nelson Eduardo Duram Caballero Conclusão: Março/2006

2. PRODUÇÃO CIENTÍFICA

A. Artigo Publicado 1. Durán, N.; Marcato, P.D.; Alves, O.L.; Silva, J.P.S.; Souza, G.I.H.; Rodrigues, F.A.;

Esposito, E. Ecosystem protection by effluent bioremediation: silver nanoparticles impregnation in a textile fabrics process. J. Nanopart. Res., 12, 285-292, 2010.

2. Marcato, P. D. Preparação, caracterização e aplicações em fármacos e cosméticos de nanopartículas lipídicas sólidas. Rev. Eletronica Fármacia 6, 1-37, 2009.

3. Marcato, P.D.; Adami, L.F.; Caverzan, J.; Huber, S.C.; Misset, T.; den Hertog, J.; Ferreira, C.V. Durán, N. Solid Lipid Nanoparticles as Sunscreen Carrier System and its Toxicity in Zebrafish Embryos. Proceeding (615) Nanotechnology and Applications, 2008.

4. Melo, P.S.; De Azevedo, M.M.M. ; Frungillo, L.; Anazetti, M.C. ; Marcato, P.D.; Durán, Nelson. Nanocytotoxicity: Violacein and Violacein-Loaded Poly (D,L-lactide-co-glycolide) Nanoparticles Acting on Human Leukemic Cells. J. Biomed. Nanotechnol., 5, 192-201, 2009.

5. Marcato, P.D.; Durán, N. New Aspects of Nanopharmaceutical Delivery Systems. J. Nanosci. Nanotechnol., 8, 2216-2229, 2008.

6. Durán, N. ; Alvarenga, M. A. ; Silva, E. C. ; Melo, P. S. ; Marcato, P. D. Microencapsulation of antibiotic rifampicin in poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate). Arch. Pharm. Res., 31, p. 1509-1516, 2008.

7. Gade, A. K.; Bonde, P.; Ingle, A.P.; Marcato, P.D.; Durán, N.; Rai, M. K. Exploitation of Aspergillus niger for synthesis of silver nanoparticles. J. Biobased Mater. Bioenergy, 2, 243-247, 2008.

X

8. Durán, N.; Marcato, P.D.; Buffo, C.; De Azevedo, M.M.M.; Esposito, E. Poly(e-caprolactone)/propolis extract:microencapsulation and antibacterial activity evaluation. Die Pharmazie (Berlin), 62, 287-290, 2007.

9. Durán, N. ; Marcato, P. D. ; De Souza, G.I.H. ; Alves, O.L. ; Esposito, E. Antibacterial Effect of Silver Nanoparticles Produced by Fungal Process on Textile Fabrics and Their Effluent Treatment. J. Biomed. Nanotechnol., 3, 203-208, 2007.

10. Romano, J.S.; Marcato, P.D.; Rodrigues, F.A. Synthesis and characterization of manganese oxide-doped dicalcium silicates. Powder Technol., 178, 5-9, 2007.

11. Mansilla, H.D.; Mora, A.; Pincheira, C.; Mondaca, M.A.; Marcato, P.D. ; Durán, N.; Freer, J. New photocatalytic reactor with TiO2 coating on sintered glass cylinders. Appl. Catal. B-Environ., 76, 57-63, 2007.

B. Capítulo de Livro 1. N. Durán, P.D. Marcato, A. Ingle, A. Gade, M. Rai. (2009). Fungi-mediated synthesis

of silver nanoparticles: Characterization processes and applications. In Current Trends in Mycology: Biosynthesis of Nanoparticles by Microbes and Plants. Cap. 16.

C. Artigo no Prelo 1. Durán, N.; Marcato, P.D.; Teixeira, Z.; Durán, M.; Costa, F.T.M.; Brocchi, M. State of

art of nanobiotechnology applications in neglected diseases. Curr. Nanosci., 2009. 2. Durán, N.; Durán, M.; Tasic, L.; Marcato, P.D. Tecnologia de nanocristais em

fármacos. Quim. Nova, 2009.

D. Artigo Submetido 1. Duran, N.; Marcato, P.D.; De Conti, R.; Alves, O. L.; Costa, F.T.M.; Brocchi, M.

Potential Use of Silver Nanoparticles on Pathogenic Bacteria, their Toxicity and Possible Mechanisms of Action, J. Brazilian Chem. Soc.

2. Marcato, P.D., Adami, L. F.; Durán, N. Comparative study of peptide encapsulation in polymeric and in solid lipid nanoparticles. J. Biomed. Nanotechol.

3. Marcato, P.D., Caverzan, J.; Rossi-Bergmann, B; Pinto, E.F.; Machado, D.; Silva, R.A.; Justos, G.Z.; Ferreira, C.V.; Durán N. J. Nanosci. Nanotechnol.

E. Patente

• Caballero, N.E.D.; Alves, O.L.; Espósito, E.; Souza, G.I.M.H.; Marcato, P.D. Method for producing nanoparticles, protein stabilized silver nanoparticles, production of antibacterial textile products, antibacterial textile products and bioremediation method. PCT/BR2007/000233, WO/2008/034207.

3. Palestras e Minicursos Ministrados • Palestras: 13 • Minicursos: 3 nacionais e 2 internacionais

4. Co-orientação de Alunos • Iniciação Científica: 3 • Mestrandos: 3 • Estagiários: 1

XI

RESUMO

SISTEMAS MICRO E NANOESTRUTURADOS: PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO

NO CARREAMENTO DE ATIVOS: O objetivo deste projeto foi a preparação e a

caracterização de sistemas micro e nanoestruturados no carreamento de diferentes

substâncias. Micro e nanopartículas poliméricas, nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e

nanopartículas de prata assim como duas substâncias com diferentes solubilidades: um

modelo de tripeptídeo (glutationa) hidrofílico e um filtro solar hidrofóbico (benzofenona-3)

foram estudados. O objetivo deste trabalho foi a produção de uma plataforma de sistema

micro e nanoestruturados com aplicação cosmética e farmacológica. Para isto, diferentes

polímeros e lipídios foram estudados na preparação das partículas. Os métodos de

preparação dos sistemas foram dependentes da solubilidade dos ativos assim como do

tipo de material de cobertura. O método utilizado na preparação de nanopartículas de

alginato/quitosana foi gelificação iônica. Para os polímeros poli(ε-caprolactona) (PCL) e

poli(hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV) foram utilizados os métodos de

nanoprecipitação e emulsão (dupla ou simples) e evaporação de solvente. As NLS foram

preparadas pelo método de homogeneização à alta pressão a quente e as nanopartículas

de prata foram preparadas pelo método biossintético utilizando o fungo Fusarium

oxysporum. A eficiência de encapsulamento do ativo hidrofílico glutationa foi dependente

do tipo de nanoestrutura utilizada no seu encapsulamento. A maior eficiência de

encapsulamento da glutationa foi de 35% em NLS-revestidas com quitosana e em

nanopartículas de PCL. Em relação ao ativo lipofílico benzofenona-3, uma alta eficiência

de encapsulamento (maior que 95%) foi verificada independente da micro ou

nanoestrutura utilizada. Além disto, todas as partículas mostraram-se reprodutíveis e

estáveis por até 1 mês e meio. Nos estudos de permeação em pele humana foi observado

que as micropartículas de PHBV penetraram menos na pele do que as NLS devido,

provavelmente, a diferença de diâmetro e flexibilidade destas duas partículas. Em relação

às nanopartículas de prata, foi observado, por espectroscopia de UV-VIS que, em 28

horas, houve a formação das nanopartículas de prata estabilizadas por proteínas do fungo

com diâmetro médio de 5 nm. Os tecidos de algodão e poliéster impregnados com estas

partículas apresentaram atividade antimicrobiana frente a diversas bactérias Gram-

positiva e Gram-negativa.

XII

XIII

Abstract

MICRO AND NANOSTRUCTURED SYSTEMS: PREPARATION AND

CHARACTERIZATION IN ACTIVE CARRIER: The aim of this project was preparation and

characterization of micro and nanostructured system as carriers of different substances.

Polymeric micro and nanoparticles, solid lipid nanoparticles (SLN) and silver nanoparticles

as well as two substances with different solubilities: a model of hydrophilic tripeptide

(glutathione) and a hydrophobic sunscreen (benzophenone-3) were studied. The goal of

this work was also the production of micro and nanostructured system platform for

cosmetic and pharmacological application. For that, different polymers and lipids were

studied in the particles preparation. The particles preparation methods were dependents

on active solubility as well as the kind of coverage material. The method of ionic gelation in

alginate/chitosan nanoparticles preparation was used. For the polymers poly(ε-

caprolactone) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) were used

nanoprecipitation and emulsion (double or simple) and solvent evaporation methods. SLN

were prepared by hot high pressure homogenization method and silver nanoparticles by

biosynthetic method with fungi Fusarium oxysporum. The encapsulation efficiency of

hydrophilic active glutathione was dependent of the kind of nanostructure used in its

encapsulation. The biggest encapsulation efficiency for glutathione was 35% in NLS-

covered with chitosan and in PCL nanoparticles. Regarding the lipophilic active

benzophenone-3, high encapsulation efficiency (greater than 95%) was found

independently of micro or nanostructure used. Furthermore, all particles were reproducible

and stable at least for up to 1 month and half. In human skin permeation studies was

observed that PHBV microparticles penetrated less in the skin than SLN, due to probably,

to the difference in the diameter and flexibility of these two particles. Regarding the silver

nanoparticles, it was observed, by UV-VIS spectroscopy that, in 28 hours, there was the

formation of silver nanoparticles stabilized by proteins of the fungi with average size of 5

nm. The cotton and polyester fabrics impregnated with these particles exhibit antimicrobial

activity against several bacteria Gram-positive and Gram-negative.

XIV

XV

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Valores de diâmetro, índice de polidispersidade (PdI) potencial zeta e eficiência de encapsulamento (EE) das nanopartículas de alginato/quitosana................................. 61

Tabela 2: Influência da variação da massa de PHBV adicionada na preparação das micropartículas. ................................................................................................................. 90

Tabela 3: Quantidade de PVA residual nas micropartículas produzidas com diferentes massas de PHBV. ............................................................................................................. 92

Tabela 4: Fator de proteção solar (FPS) da BZ3 livre e encapsulada em micropartículas de PHBV. .......................................................................................................................... 94

Tabela 5: Eficiência de encapsulamento de BZ3 em diferentes NLS e CLN. ................... 96

Tabela 6: Temperatura de fusão e de cristalização dos lipídios e do estabilizante utilizado na preparação das nanopartículas lipídicas sólidas. ....................................................... 126

Tabela 7: Valores de temperatura de fusão, entalpia e índice de recristalização (IR) dos materiais utilizados na preparação das NLS. .................................................................. 128

Tabela 8: Valores de concentração inibitória mínima (CIM) de nanopartículas de prata produzidas pelo método biológico e químico frente a diversas bactérias........................ 143

Tabela 9: Tamanho do halo de inibição dos tecidos impregnados 2 ou 4 vezes com nanopartículas de prata frente a diferentes bactérias. Parte clara = central do tecido, parte escura= extremidade do tecido. ............................................................................. 150

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XVII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: A) CLN imperfeito, B) CLN amorfo, C) Múltiplo CLN......................................... 29

Figura 2: Estrutura da Glutationa. .................................................................................... 31

Figura 3: Estrutura da Benzofenona-3 (2-hidroxi-4-metoxi- benzofenona)....................... 32

Figura 4: Estrutura da pele humana. ................................................................................ 33

Figura 5: Esquema da célula de difusão de Franz. .......................................................... 50

Figura 6: Curva de calibração de GSH............................................................................. 59

Figura 7: Estabilidade de GSH no pH 4 em diferentes dias. ............................................ 60

Figura 8: Gráfico comparativo de reprodutibilidade em função do diâmetro e do Potencial Zeta de nanopartículas preparadas com diferentes razões de Alginato/quitosana: 1,5 (barras azuis) e 0,75 (barras rachuradas). ........................................................................ 62

Figura 9: Gráfico comparativo da estabilidade de nanopartículas preparadas com diferentes razões de Alginato/quitosana: 1,5 (barras azuis) e 0,75 (barras rachuradas). . 62

Figura 10: Gráfico de diâmetro e potencial zeta das nanopartículas poliméricas de alginato/quitosana de razão: A) 0,75, B) 1,5, em função do pH. ....................................... 63

Figura 11: Micrografia das nanopartículas de Alginato/Quitosana (razão de alginato/quitosana de 0,75): A) x 22000, B) x 35000. ....................................................... 64

Figura 12: Gráfico da viabilidade das células V-79 na análise dos alvos celulares MTT e VN da glutationa livre. ....................................................................................................... 65

Figura 13: Gráfico da viabilidade das células V-79 na análise dos alvos celulares MTT e VN das nanopartículas de alginato/quitosana (barras cinza) e nanopartículas de alginato/quitosana com GSH (barras verdes). .................................................................. 65

Figura 14: Gráfico comparativo de: A e B) Reprodutibilidade em função do diâmetro e potencial zeta, C) Estabilidade das nanopartículas de PCL preparadas pelo método de dupla emulsão e evaporação de solvente. ........................................................................ 66

Figura 15: Gráfico do efeito da diluição das dispersões de NLS no diâmetro das partículas........................................................................................................................... 67

Figura 16: Variação do diâmetro e do índice de polidispersidade das NLS de PC em função da: A) Proporção de Lipídio:Pluronic F-68:Epikuron 200 (m/m/m), B) Pressão de homogeneização no primeiro estágio, C) Número de ciclos de homogeneização. ........... 68

Figura 17: A) Influência do tipo de lipídio no diâmetro e no índice de polidispersidade das NLS, B) Estabilidade das NLS preparadas com diferentes lipídios. .................................. 69

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Figura 18: Gráfico comparativo de NLS de EC em função da: A) Reprodutibilidade, B) Estabilidade: à 4 oC (barras brancas e linha preta) e à temperatura ambiente (barras cinzas e linha azul)............................................................................................................ 70

Figura 19: Curva de calibração de BZ3............................................................................ 89

Figura 20: Micrografias de micropartículas de PHBV preparadas com: A) 50 mg de PHBV x 2000 B) 50 mg de PHBV x 23000, C) 100 mg de PHBV x 30000, D) 100 mg de PHBV x 14000. ............................................................................................................................... 90

Figura 21: Curva de calibração do PVA. .......................................................................... 91

Figura 22: Gráfico comparativo da dissolução da BZ3 livre (curva preta) e liberação da BZ3 encapsulada em micropartículas de PHBV preparadas com 50 mg de PHBV (curva vermelha) e 100 mg de PHBV (curva verde)..................................................................... 93

Figura 23: Distribuição da BZ3 livre e encapsulada em micropartículas de PHBV em diferentes partes da pele................................................................................................... 94

Figura 24: Aumento percentual do edema das orelhas de camundongos (n =4). ............ 95

Figura 25: Comparação do diâmetro e do índice de polidipersidade de NLS e CLN prepardados com diferentes lipídios.................................................................................. 96

Figura 26: Gráfico comparativo de estabilidade das NLS e CLN preparadas com o lipídio sólido: A) Cetil Palmitato (CP), B) Ésteres Cetílicos (EC). ................................................ 96

Figura 27: Termogramas do: A) lipídio palmitato de cetila (curva preta), Pluronic F68 (curva vermelha) e benzofenonana-3 (BZ3) (curva azul), B) NLS com BZ3 (curva laranja) e do lipídio palmitato de cetila (curva preta).................................................................... 127

Figura 28: Imagem de AFM: A) e B) Representação em 3D da topografia de pele humana, C) Imagem de contraste de fase da pele humana............................................ 129

Figura 29: Imagem de AFM: A), C) e E) Representação em 3D da topografia de pele humana após experimento de permeação cutânea com NLS-BZ3, B) D) e F) Imagem de contraste de fase da pele humana após experimento de permeação cutânea com NLS-BZ3.................................................................................................................................. 130

Figura 30: Imagem fungo do F. oxysporum (cepa 07D) em meio sólido. ....................... 133

Figura 31: Imagem de TEM das nanopartículas de prata preparadas com: A) e B) 10-2 M de nitrato de prata, C) e D) 10-3 M de nitrato de prata..................................................... 142

Figura 32: Curva de tempo-morte de: A) S. aureus, B) S. epidermidis,C) E. coli, D) Salmonella tythimurium. .................................................................................................. 145

Figura 33: A) Espectro de EDS, B) Imagem de elétrons retroespalhados do tecido de algodão contendo nanopartículas de prata. .................................................................... 146

XIX

Figura 34: Imagens de elétrons retroespalhados dos tecidos de: A) Algodão (2 passagens), B) Algodão (4 passagens), C) Poliéster (2 passagens), D) Poliéster (4 passagens), E) 3M (2 passagens), F) 3M (4 passagens)................................................ 147

Figura 35 Imagens de elétrons retroespalhados dos tecidos de: A) Algodão (parte central), B) Algodão (extremidade), C) Poliéster (parte central), D) Poliéster (extremidade), E) 3M (parte central), F) 3M (extremidade). .................................................................... 148

Figura 36: Fotos dos halos de inibição produzidos pelos tecidos impregnados com nanopartículas de prata frente a diferentes bactérias. A) S. aureus, B) S. epidemidis, C) E. coli, D) P. Aeruginosa, E) Salmonella tythimurium, F) tecido de algodão sem prata frente à bactéria E. coli................................................................................................................. 151

Figura 37: Gráfico comparativo da atividade antimicrobiana frente à bactéria Gram-positiva S. aures dos tecidos: A) Algodão e B) poliéster, impregnados 2x (colunas brancas) e 4 x (colunas cinzas) com nanopartículas de prata após sucessivas lavagens......................................................................................................................................... 152

Figura 38: Gráfico comparativo da atividade antimicrobiana frente à bactéria Gram-negativa E. coli dos tecidos: A) Algodão e B) poliéster, impregnados 2x (colunas brancas) e 4 x (colunas cinzas) com nanopartículas de prata após sucessivas lavagens............. 153

Figura 39: A) Gráfico comparativo da atividade antimicrobiana dos tecidos de algodão e poliéster impregnados 2 vezes com nanopartículas de prata antes do processo de lavagem (barras brancas) e após 10 ciclos de lavagens (barras cinzas), B) Fotos dos halos de inibição produzidos pelos tecidos de algodão após 10 ciclos de lavagem frente à bactéria E. coli................................................................................................................. 154

Figura 40: Gráfico da absorbância das amostras nas diferentes regiões do tecido. ...... 155

Figura 41: A) Aumento da lesão na orelha de camundongos após a administração de tampão PBS (curva preta), anfotericina B (2 mg/kg) (curva vermelha), nano de Ag química (21,6 µg/Kg) (curva azul) e nano de Ag biológica (6,5 µg/Kg) (curva verde). (B) Carga parasitária medida por unidades de fluorescência específica, obtida 42 dias após a infecção........................................................................................................................... 156

Figura 42: Fotografia das orelhas dos camundongos infectadas, o halo vermelho indica o local de infecção.............................................................................................................. 157

XX

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INDICE

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 25

1.1. Sistema de Liberação Sustentada........................................................................ 25

1.2. Nanopartículas Poliméricas.................................................................................. 26

1.3. Nanopartícula lipídica sólida (NLS) ...................................................................... 27

1.4. Nanopartículas de prata ....................................................................................... 29

1.5. Ativos ................................................................................................................... 31

1.6. A pele, envelhecimento e cicatrização ................................................................. 32

1.7. Penetração cutânea ............................................................................................. 34

2. OBJETIVOS.................................................................................................................. 35

2.1. Geral .................................................................................................................... 35

2.2. Específico............................................................................................................. 35

3. METODOLOGIA ........................................................................................................... 36

3.1. Encapsulamento do tripeptídeo GSH e do fotoprotetor benzofenona-3 .................. 36

3.1.A. Encapsulamento do tripeptídeo GSH em Nanoestruturas Poliméricas............. 36

a. Método de gelificação iônica ................................................................................... 36

b. Método de dupla emulsão água em óleo em água e vaporação de solvente.......... 37

3.1.B. Encapsulamento da Benzofenona-3 em Micro e Nanoestruturas Poliméricas.. 37

a. Método de Nanoprecipitação................................................................................... 37

b. Método de Emulsão e Evaporação de solvente ...................................................... 38

3.1.C. Encapsulamento do tripeptídeo GSH e da Benzofenona-3 em Nanopartículas Lipídicas Sólidas ......................................................................................................... 38

a. Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) .................................................................. 38

b. Carreador lipídico Nanoestruturado (CLN) .............................................................. 39

c. Dupla emulsão......................................................................................................... 39

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d. NLS-Quitosana........................................................................................................ 39

3.1.D. Liofilização das nanopartículas......................................................................... 40

3.2. Biossíntese das Nanopartículas de Prata ............................................................... 40

3.2.A. Impregnação das nanopartículas de prata em tecidos ..................................... 40

3.2.B. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) .................................. 41

3.2.C. Curva tempo-morte ........................................................................................... 41

3.2.D. Teste Antimicrobiano ........................................................................................ 42

3.2.E. Ensaio in vivo anti-leishmaniose ....................................................................... 42

3.3. Caracterização das Partículas................................................................................. 43

3.3.A. Microscopia eletrônica de Varredura (MEV) ..................................................... 43

3.3.B. Microscopia de Força Atômica (AFM)............................................................... 43

3.3.C. Microscopia de transmissão (TEM) .................................................................. 44

3.3.D. Tamanho médio e distribuição de tamanho das partículas e potencial zeta..... 44

3.3.E. Estudo da influência do pH no diâmetro e no potencial zeta das nanopartículas.................................................................................................................................... 44

3.3.F. Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) .................................................... 45

3.3.G. Quantificação do PVA residual em micropartículas de PHBV .......................... 45

3.4. Eficiência de encapsulamento................................................................................. 45

3.4.A. Quantificação da Benzofenona-3 (BZ3) ............................................................ 45

3.4.B. Quantificação do tripeptídeo GSH .................................................................... 46

3.5. Liberação in vitro ..................................................................................................... 47

3.5.A. Liberação in vitro da BZ3 .................................................................................. 47

3.5.B. Liberação in vitro da GSH ................................................................................. 48

3.6. Preparação de formulações semi-sólidas ............................................................... 48

3.7. Determinação do Fator de Proteção Solar (FPS).................................................... 49

3.8. Estudo in vitro da permeação cutânea da BZ3........................................................ 49

XXIII

3.9. Avaliação da alergenicidade cutânea da Benzofenona-3 livre e micro/nanoencapsulada - Teste de medida de edema de orelha (mouse ear swelling test - MEST).......................................................................................................................... 50

3.10. Citotoxicidade em células V79 .............................................................................. 51

3.10.A. Preparo das Culturas de células ..................................................................... 51

3.10.B. Captuta do corante Vermelho Neutro (VN) (análise da integridade lisossomal).................................................................................................................................... 52

3.10.C. Redução do corante metiltiazoletetrazolium (MTT) (análise da integridade mitocondrial)................................................................................................................ 52

3.11. Fototoxicidade e citotoxicidade em células 3T3 e HaCaT..................................... 53

3.11.A. Preparo das Culturas de células ..................................................................... 53

3.11.B. Ensaio de fototoxicidade por captação de vermelho neutro (NRU) ................ 54

3.11.C. Determinação do Fator de Foto-irritação (PIF) ............................................... 54

3.12. Estudo in vivo de toxicidade de NLS-BZ3 ........................................................... 55

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 56

CAPÍTULO 1 – Encapsulamento de GSH ................................................................... 57

1. Quantificação de GSH................................................................................................ 59

2. Nanopartículas de Alginato-Quitosana....................................................................... 59

A. Estudo da Influencia do pH no diâmetro e potencial zeta das nanopartículas ........ 62

B. Morfologia das partículas ........................................................................................ 63

C. Citotoxicidade das nanopartículas de alginato/quitosana ....................................... 64

3. Nanopartículas de PCL e nanopartícula lipídica sólida (NLS).................................... 65

A. Nanopartículas de PCL ........................................................................................... 66

B. Nanopartículas de Lipídica Sólida (NLS) ................................................................ 66

Artigo: Comparative study of peptide encapsulation in polymeric and in solid lipid nanoparticles ................................................................................................................... 71

CAPITULO 2 - Encapsulamento da benzofenona-3...................................................87

1. Quantificação de BZ3................................................................................................ 89

XXIV

2. Micropartículas de PHBV .......................................................................................... 89

A. Quantificação de PVA residual ............................................................................... 91

B. Liberação in vitro..................................................................................................... 92

C. Avaliação do bloqueio da Radiação UV e Determinação do Fator de Proteção Solar (FPS)........................................................................................................................... 93

D. Avaliação da permeação cutânea........................................................................... 94

E. Teste in vivo de alergenicidade............................................................................... 94

3. Carreador lipídico nanoestruturados (CLN) .............................................................. 95

4. Nanopartículas de PCL e nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) ............................. 97

Artigo: Nanostructured polymer and lipid carriers for sunscreen. Biological effects and skin permeation ........................................................................................... 99

Proceeding: Solid lipid nanoparticles as sunscreen carrier system and its toxicity in zebrafish embryos .................................................................................................... 117

5. Análise de Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) ........................................ 126

6. Citotoxicidade em fibroblastos V-79........................................................................ 128

7. Estudo de AFM da pele........................................................................................... 128

CAPÍTULO 3 – Nanopartículas de Prata ................................................................... 131

1. Produção de Nanopartículas de Prata .................................................................... 133

Artigo: Antibacterial effect of silver nanoparticles produced by fungal process on textil fabrics and their effluent treatment .................................................................... 135

2. Concentração Inibitória Mínima (CIM)..................................................................... 142

3. Curva tempo-morte ................................................................................................. 143

4. Impregnação de nanopartículas de prata em diferentes tecidos............................. 145

5. Avaliação das propriedades antimicrobianas em diferentes tecidos ....................... 148

6. Permeação cutânea das nanopartículas de prata em célula de difusão de Franz.. 154

7. Atividade anti-leishimaniose.................................................................................... 155

5. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 157

6. REFERÊNCIAS........................................................................................................... 159

25

INTRODUÇÃO

1.1. Sistema de Liberação Sustentada

Sistemas de liberação sustentada utilizando carreadores coloidais têm sido

extensivamente estudados com objetivo de serem utilizados para manter o efeito do

fármaco ou ativos cosmético no tecido, solubilizar ativos, melhorar estabilidade física e

química, minimizar os efeitos colaterais e reduzir a toxicidade (Mehnert e Mader, 2001).

Dentre os carreadores utilizados, os lipossomas vêm sendo estudados há mais tempo. Os

lipossomas são vesículas esféricas compostas por uma ou mais bicamadas de

fosfolipídios. A adição de polietilenoglicol (PEG) na superfície dos lipossomas possibilita o

aumento do tempo de permanência deste carreador na corrente sanguínea por minimizar

a sua captura por macrófagos. No entanto, esta nanoestrutura apresenta problemas de

instabilidade frente ao armazenamento (Frézard e col. 2005, Marcato e Durán, 2008).

Posteriormente, foram desenvolvidos os nanocarreadores poliméricos, que são

constituídos de polímeros naturais ou sintéticos. Duas vantagens deste sistema são: a

variabilidade de polímeros biodegradáveis que podem ser utilizados como materiais de

cobertura das partículas e a estabilidade destas partículas em fluidos biológicos (Wissing

e Muller, 2003). Além disto, é possível modificar quimicamente a estrutura do polímero,

incluindo a síntese de copolímeros. Esta modificação pode diminuir a toxicidade dos

polímeros e pode direcionar as partículas para alvos específicos. Entretanto, um dos

maiores desafios destes carreadores é o seu escalonamento e a eliminação de solvente

orgânico no processo de produção (Marcato e Durán, 2008, Marcato, 2009).

Outro tipo de nanoestrutura descoberta recentemente é as nanopartículas lipídicas

sólidas (NLS). Estas partículas são as mais promissoras dentre os carreadores coloidais

já que as vantagens de partículas sólidas e lipossomas foram combinadas para o

desenvolvimento de NLS. Suas vantagens em relação aos outros carreadores incluem:

alta estabilidade temporal e térmica, baixo custo de produção e fácil produção em larga

escala. Além disto, em aplicações intravenosas, as NLS têm a vantagem de serem

estáveis na presença de vários metabólitos e biomacromoléculas, e em aplicações

tópicas as NLS são estáveis, não agregando em géis e agentes emulsificantes que

geralmente são utilizados na preparação de cremes. Outra vantagem das NLS é que

26

estas partículas atuam com oclusivas podendo aumentar em até 32% a hidratação da

pele devido à formação de um filme sobre a pele diminuindo a perda de água

transepidermal (Üner e col., 2007).

A encapsulação de substâncias nesses sistemas de liberação pode exercer efeitos

benéficos à pele por aumentar ou diminuir a penetração de ativos na mesma, aumentar o

bloqueio de radiação solar, agindo como filtros físicos, devido as suas estruturas

cristalinas além de estabilizar as moléculas em formulações semi-sólidas.

1.2. Nanopartículas Poliméricas

O termo nanopartícula é usado de acordo com o tamanho da partícula a que está

se referindo. Partículas com tamanho menor que 1000 nm são consideradas

nanopartículas, enquanto que as partículas maiores são denominadas micropartículas

(De Oliveira e André Filho, 1999). Além disto, micro e nanopartículas podem se

apresentar em duas estruturas diferentes: a micro/nanoesfera e a micro/nanocápsula.

Denominam-se micro/nanoesferas aqueles sistemas em que o fármaco encontra-se

homogeneamente disperso no interior da matriz polimérica. Dessa forma, obtém-se um

sistema monolítico onde não é possível identificar um núcleo diferenciado.

Micro/Nanocápsulas, ao contrário, constituem sistemas do tipo reservatório onde é

possível identificar um núcleo diferenciado que, pode ser líquido ou sólido. Neste caso, a

substância ativa encontra-se envolvida por uma membrana, geralmente polimérica,

isolando o núcleo do meio externo, em estudos do tipo caroço-casaca (Durán e De

Azevedo, 2002).

Os materiais-suportes para a produção de micro ou nanopartículas podem ser

compostos não-poliméricos como lipídeos e cera de carnaúba, poliméricos sintéticos

como copolímeros de poli(D,L-láctico-co-glicólico) (PLGA), poliacrilatos (PA) e poli(ε-

caprolactonas) (PCL) ou poliméricos naturais como polihidroxialcanoatos (PHA’s),

gelatina, alginato e quitosana (Panyam e Labhasetwar, 2003, Qurrat-ul-Ain e col., 2003).

Vários métodos de preparação de micro e nanopartículas poliméricas são descritos

na literatura. Estes métodos podem ser classificados em duas principais categorias: a que

requer uma reação de polimerização ou aquelas em que se utiliza diretamente uma

macromolécula ou um polímero pré-formado (Couvreur e col., 1995). Os métodos

27

encontrados na literatura são emulsificação e evaporação de solvente,

emulsificação/difusão de solvente, nanoprecipitação, salting-out, polimerização interfacial

in situ, gelificação iônica entre outras.

Os princípios ativos, quando encapsulados no interior de matrizes poliméricas, não

estão prontamente disponíveis para o sistema biológico como quando em solução. Assim,

o polímero tem que degradar para que o princípio ativo possa ser liberado, ou então o

princípio ativo tem que se difundir para o exterior da matriz. Em geral, a liberação do ativo

encapsulado mostra um padrão em termos de taxa de liberação: uma rápida liberação

inicialmente, devido à presença de ativo adsorvido na superfície das partículas e uma

posterior liberação exponencial devido à difusão do ativo do interior da partícula para o

meio externo (Govender e col., 1999).

1.3. Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS)

O termo nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) foi introduzido por Müller e Lucks

em 1996 quando patentearem um método de produção de NLS por homogeneização à

alta pressão (Müller e Lucks, 1996). As NLS usualmente consistem de ingredientes bem

toleráveis fisiologicamente e já aprovados para aplicações farmacêuticas em humanos,

apresentando 10-100 vezes menos toxicidade do que as partículas poliméricas. Além

disto, as NLS podem ser facilmente produzidas em larga escala, têm boa capacidade de

estocagem, - apresentando estabilidade de até 3 anos - e têm um largo espectro de vias

de administração que incluem parenteral, oral, oftálmica e tópica (Pedersen e col., 2006;

Cavalli et col., 1997).

As nanopartículas lipídicas podem ser classificadas em três diferentes estruturas:

nanopartículas lipídicas sólidas (NLS), carreador lipídico nanoestruturado (CLN) e

conjugado fármaco-lipídio (CFL). As NLS são formadas por lipídios sólidos à temperatura

ambiente e corporal, e estabilizadas por tensoativos. Os lipídios utilizados na preparação

de NLS são triglicerídeos, mistura de glicerídeos ou ceras. A desvantagem dessa

estrutura é a sua baixa capacidade de encapsulamento que varia de 25-50% dependendo

da solubilidade do ativo na matriz lipídica, do método utilizado e do estado polimórfico da

matriz lipídica. A utilização de lipídios muito semelhantes gera cristais perfeitos. Como o

fármaco se localiza entre as cadeias lipídicas e nas imperfeições dos cristais, a alta

28

organização dos cristais diminui a eficiência de encapsulamento. Para minimizar este

efeito, utilizam-se lipídios complexos como mono-di-triglicerídeos. Entretanto, o ativo pode

ser expulso da partícula após a transição polimórfica da forma α para a modificação mais

estável β. Este processo pode ocorrer durante a estocagem da dispersão (Müller e col.,

2007; Müller e col., 2000).

Os CLN (carreadores lipídicos nanoestruturados) podem ser de 3 tipos (Wissing e

col., 2004). O primeiro modelo consiste na mistura de glicerídeos compostos por

diferentes ácidos graxos. Esta mistura aumenta a distância entre as cadeias de ácidos

graxos dos glicerídeos ocasionando imperfeições no cristal. Estas imperfeições geram

mais espaço para acomodar mais ativo aumentando, desta maneira, a eficiência de

encapsulamento. Este modelo é conhecido como “CLN imperfeito” (Figura 1A). O

segundo modelo é a mistura de lipídios sólidos com lipídios líquidos (óleo) como, por

exemplo, triglicérideos cáprico/caprílico. Este modelo é chamado de “CLN amorfo” no

qual, a alta quantidade de óleo misturado com o lipídio sólido gera partículas em um

estado sólido amorfo (Figura 1B). Esta estrutura evita a expulsão do ativo das partículas

durante a estocagem, já que o processo de cristalização do lipídio para a forma β não

ocorre nessas condições. O terceiro modelo é chamado de “múltiplo CLN” que pode ser

considerado um análogo da emulsão água em óleo em água, isto é, uma dispersão de

óleo em lipídio sólido em água (Figura 1C). Neste modelo, a solubilidade das moléculas

de óleo no lipídio sólido é excedida levando a uma separação de fases e formação de

nanocompartimentos de óleo dentro da matriz lipídica sólida (Üner e col., 2007; Jenning e

col., 2000).

Os CFL (conjugado fármaco-lipídio) podem ser produzidos por dois métodos. O

primeiro método é chamado de formação de sal que consiste em dissolver o ativo (sal) e

o lipídio em um solvente que é, em seguida, evaporado à baixa pressão. O segundo

método é chamado de ligação covalente, no qual o ativo (sal) e um álcool graxo reagem

em presença de um catalisador formando grandes partículas de CFL que são purificados

por cristalização. Estas grandes partículas de CFL são misturadas em uma solução de

tensoativo e homogeneizadas à alta pressão formando nanopartículas de CFL. Em geral,

os CFL são utilizados no carreamento de princípios ativos hidrofílicos com eficiencia de

encapsulamento de mais de 33% (Wissing e col., 2004).

29

Figura 1: A) Carreador lipídico nanoestruturado (CLN) imperfeito, B) CLN amorfo, C) Múltiplo CLN

(modificado de Wissing e col., 2004).

Existem 5 métodos de preparação de nanopartículas lipídicas sólidas que incluem

microemulsificação à quente, emulsificação e evaporação de solvente, difusão de

solvente, spray-drying e homogeneização à alta pressão. Entretanto, o método mais

viável para uma produção em alta escala é o método de homogeneização à alta pressão

(Marcato, 2009).

1.4. Nanopartículas de prata

Nanopartículas inorgânicas têm sido empregadas com grande eficácia em várias

áreas das ciências biológicas, biomédicas e farmacêuticas. Devido à alta atividade

antimicrobiana das nanopartículas de prata, estas têm sido utilizadas na preparação de

materiais antimicrobianos como vestimentas, materiais cirúrgicos, eletrodomésticos,

produtos orais entre outros, sendo que já é possível encontrar estes produtos no

mercado. Este grande investimento em produtos antimicrobianos se deve à grande

eficácia da prata inclusive em microorganismos resistentes. Uma das áreas mais

carentes em produtos antimicrobianos é a área da saúde devido ao alto índice de

infecções hospitalares provenientes de microorganismos, que em muitos casos, são

resistentes aos antibióticos tradicionais. Uma única infecção hospitalar pode gerar um

gasto de aproximadamente 40.000 dólares em custos de cuidados médicos chegando até

a aproximadamente 60.000 dólares em sepsia de pós-operatório, na ocorrência de um

grave surto (Gibbins e Warner, 2005). Nesta linha, produtos antimicrobianos como

lençóis, vestimentas de médicos e pacientes, material cirúrgico entre outros poderiam

reduzir os casos de infecções hospitalares e conseqüentemente de óbito. Além do efeito

antimicrobiano das nanopartículas de prata, estas têm sido utilizadas no tratamento de

Ativo

A B

Lipídio amorfo

C

Óleo nanocompartimentado

Lipídio sólido

30

lesões como queimaduras (Maneerung e col., 2008). Tian e col. (2007) estudaram os

benefícios que as nanopartículas de prata proporcionam quando aplicadas em lesões.

Neste trabalho foi verificado que o processo de cicatrização é acelerado, apresentando

pouca fibrose e crescimento normal de pêlos, sendo, portanto, esteticamente viável. Além

disso, no estudo do efeito da prata nas citocinas (IL-6, IL-10, TGF-β1, IFN-γ) através de

análises de PCR em tempo real (RT-PCR) foi observado que as partículas além de seu

poder antimicrobiano, também modulam a produção de citocinas inflamatórias, auxiliando

eficientemente no processo de cicatrização (Tian e col., 2007). Schaller e col. (2004)

verificaram que a prata coloidal (que contem nanopartículas de prata) foi mais eficiente e

menos tóxica do que íons de prata no tratamento de feridas, promovendo um aumento da

re-epitelização quando comparada com antibióticos (Schaller e col., 2004).

As nanopartículas de prata ou íons de prata também tem sido impregnados em

tecidos como algodão, náilon, poliéster entre outros para a obtenção de materiais estéreis

(Durán e col., 2005, Vigneshwaran e col., 2007). Durán e col. (2007) estudaram a

impregnação de nanopartículas de prata produzidas pelo método biológico em tecidos de

algodão. Os autores observaram que os tecidos impregnados com as nanopartículas

apresentaram atividade antibacteriana frente à bactéria S. aureus, reduzindo o número de

Unidades Formadores de Colônias (UFC) em 99,9%. Perelshtein e col. (2008) estudaram

a impreganação de nanopartículas de prata em diferentes tipos de tecidos (náilon,

poliéster e algodão) pelo método de irradiação ultrasonica. Neste estudo os autores

verificaram que a quantidade de nanopartículas de prata aderidas nos três tipos de

tecidos foi o mesmo (~1,1-1,4 % em massa). Este resultado indica que a interação destas

partículas foi independente do tipo dos grupos funcionais presentes na superfície dos

tecidos. Além disso, os tecidos impregandos com nanopartículas de prata apresentaram

atividade antibacteriana frente às bactérias E. coli e S. aures. Resultados similares foram

obtidos por Perkas e col. (2007). Para aumentar a interação das nanopartículas de prata

com tecidos de algodão, Khalil-Abad e col., (2009) produziram grupos catiônicos na

superfície do algodão aumentando, consequentemente, a atividade antibacteriana desses

tecidos.

Outra aplicação importante das nanopartículas de prata é a associação destas com

antibióticos como, por exemplo, gentamicina (Gade e col., 2008) e amoxicilina (Li e col.,

2005). Esta associação pode direcionar estes fármacos para alvos específicos, além de

31

potencializar o seu efeito diminuindo a resistência de microorganismos (Gimenez e col.,

2005).

Atualmente vários métodos químicos e biológicos têm sido empregados em

preparações de nanopartículas de prata, mas a grande dificuldade é o controle do

tamanho das partículas que pode ser obtido pelo método biológico (Gade e col., 2008,

Durán e col. 2007). Vários organismos e microrganismos são conhecidos por produzirem

materiais inorgânicos extra ou intracelularmente (Durán e col., 2005). Um exemplo é o

fungo Fusarium oxysporum que quando exposto a uma solução de ouro ou prata, reduz

rapidamente estes dois metais, produzindo nanopartículas altamente estáveis de

dimensões entre 2 e 50 nm (Durán e col., 2007).

1.5. Princípios Ativos

Um importante ativo biológico responsável por inibir processos oxidativos danosos

é a glutationa (modelo de tripeptídeo), que também apresenta funções metabólicas,

catalíticas e de transporte. Glutationa é um tripeptídeo natural composto por glutamina-

cisteina-glicina (GSH) (Figura 2), que tem um papel de proteção de células contra

espécies reativas de oxigênio e xenobióticos como radicais livres (Lopedota e col, 2007).

Devido a estas propriedades o GSH pode ser utilizado como anti-oxidante em produtos

cosméticos. Entretanto o GSH se administrado sem proteção sofre rápida degradação por

glutamil-transpeptidases e glutamil ciclotransferases, resultando em baixa proteção contra

radicais (Trapani e col, 2007). Em vista disso, o encapsulamento do GSH em

nanoestruturas pode aumentar a sua estabilidade possibilitando o seu uso como anti-

oxidante em produtos cosméticos.

Figura 2: Estrutura da glutationa.

32

Benzofenona-3 (BZ3) (2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona) é usada como filtro de UV

de amplo espectro em concentrações de até 10% em produtos para protetor solar sozinho

ou em combinação com outros filtros UV (Figura 3). Além desta aplicação da

benzofenona-3, esta também é incorporada em outros tipos de cosméticos em

concentrações entre 0,05-0,50% agindo com fotoprotetor (HCP-EC, 2006).

Figura 3: Estrutura da benzofenona-3 (2-hidroxi-4-metoxi- benzofenona).

Embora a grande aplicação deste composto seja como protetor solar, pouca

atenção tem sido dada para a sua penetração na pele. Estudos mostram que

concentrações de 2% de benzofenona-3 têm sido excretadas na urina após 48 horas da

sua aplicação tópica, sendo que a maior concentração plasmática foi observada em

homens (Janjua e col., 2008). Devido a esta absorção sistêmica a BZ-3 apresenta

toxicidade. Okereke e col. (1995) observaram que a BZ-3 é tóxica para ratos quando

administrada em uma dose maior que 100 mg/kg de peso corporal. Além de ser tóxica

para ratos, a BZ3 pode causar reações foto-alérgicas em humanos. Berne e Ros (1998)

verificaram um maior número de reações alérgicas quando se utilizou BZ-3 do que os seis

demais fotoprotetores analisados neste estudo. Estas características da benzofenona-3

têm preocupado as autoridades de saúde pública e aumentado o interesse do seu

encapsulamento em micro e nanoestruturas (Berne e Ros, 1998).

1.6. A pele, envelhecimento e cicatrização

A pele possui três camadas, a epiderme, a derme e a hiporderme. A epiderme é

formada por epitélio estratificado e a derme (responsável pela nutrição da pele) é formada

por tecido conjuntivo denso, uma trama de colágeno e elastina. Abaixo ainda encontra-se

CH3O

OH O

33

a hipoderme, rica em tecido adiposo, não apresentando uma considerável difusão

medicamentosa (Figura 4) (Cevc, 2004).

Figura 4: Estrutura da pele humana (site universitário).

A pele, assim como os demais órgãos do nosso corpo, sofre alterações e

envelhece ao longo do tempo. Mas fatores externos como o estresse da vida moderna,

fumo e, principalmente, a exposição solar pode acelerar esse processo, levando a um

envelhecimento precoce. Com o envelhecimento, a pele fica sem brilho e luminosidade,

sem elasticidade, com manchas, rugas, aspereza e pequenos vasos. Estas

características ocorrem devido a alterações em todas as camadas da pele. A epiderme

vai ficando cada vez mais fina, com diminuição das suas camadas e aumento da

atividade dos melanócitos, responsáveis pelas indesejáveis "manchas da idade". Na

derme, ocorre uma diminuição progressiva das fibras de sustentação da pele, o que

resulta numa diminuição da firmeza e da elasticidade da mesma gerando rugas e linhas

de expressões (Instituto de Química-USP, 2001). A estimulação da síntese de proteínas

da matriz extracelular da derme e de colágeno pode amenizar estes efeitos. Isto pode ser

obtido através da estimulação dos fibroblastos presentes na derme.

Já a cicatrização é o processo celular para a regeneração do organismo e redução

da área celular danificada ou necrosada. A cicatrização envolve a remoção do tecido

necrosado e a reabilitação deste tecido. Esta reabilitação pode ocorrer por regeneração

das células necrosadas, sendo substituídas pelo mesmo tecido original; ou reparação

onde o tecido danificado é substituído por tecido conjuntivo (cicatriz). Em geral, ambos os

mecanismos ocorrem. Além disto, as células necessitam também de um esqueleto de

colágeno para o crescimento, essa malha de colágeno é feita por fibroblastos.

Fibroblastos produzem inicialmente abundante quantidade de colágeno do tipo III (função

34

de manutenção da estrutura de tecidos delicados e expansíveis) que preenche a abertura

da ferida, sendo formado das bordas para o centro. Com a maturação do tecido, os

fibroblastos começam a produzir um colágeno mais resistente do tipo I (função de

resistência a trações), outros fibroblastos maturam para miofibroblastos que contem o

mesmo tipo de actina presente no músculo, a qual é capaz de contrair e reduzir o

tamanho da ferida. Com o decorrer da maturação, as células desnecessárias sofrem

apoptose e colágeno do tipo III transforma-se em colágeno do tipo I (Craig e col.,2005).

1.7. Penetração cutânea

A via cutânea apresenta-se como uma via de administração bastante atrativa e

acessível para a administração sistêmica de fármacos ou outras substâncias, pelo fato de

não apresentar os problemas associados com as vias de administração oral e parenteral

(Cevec, 2004). Há três rotas possíveis de penetração cutânea de ativos: através do

folículo pilossebáceo, via ductos sudoríparos ou através da camada córnea. Dentre estas

vias, a via mais comum de penetração é através dos folículos pilosos. Isto ocorre, pois a

espessura da camada córnea é menor ao nível da invaginação correspondente à bainha

do pelo e que na base do folículo a epiderme se reduz a uma única assentada de células

não queratinizadas. Apesar da via cutânea ser muito interessante para a administração

de fármacos e cosméticos, esta via é altamente seletiva em relação aos ativos que

conseguem difundir passivamente pela camada mais externa da pele que é o estrato

córneo, devido a sua função de barreira. Esta função de barreira do extrato córneo pode

ser demonstrada claramente quando esta camada é retirada através da utilização de uma

fita adesiva. Após este processo, observa-se um forte aumento da permeabilidade de

água e outros componentes que anteriormente não apresentavam esta facilidade de

difusão (El-Kattan e col., 2000). Nesta linha, sistemas que aumentem a penetração

cutânea de substâncias têm sido amplamente estudados. Uma estratégia para aumentar

a absorção de ativos através da pele é através de sistemas de liberação sustentada como

lipossomas e nanopartículas (Kandavilli e col.,2002). O encapsulamento de minoxidil em

nanopartículas do polímero biodegradável de poli(ε-caprolactona) (PCL) aumentou

significativamente a penetração da molécula através da camada córnea (Shim e

35

col.,2004). Resultados similares foram obtidos por Gu e Roy (2004) que sugeriram o

emprego de partículas de poli(lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA).

Resultados promissores estão sendo obtidos com lipossomas aumentando a

permeação cutânea de ativos lipofílicos e hidrofílicos (Chorilli e col.,2004). Artman e col.

(1990) propuseram o uso de lipossomas para promover a penetração cutânea de

anticorpos monoclonais em pele de porco in vivo, os quais apresentavam massa molar de

20 a 60 g/mol. Depois de 40 minutos, foi possível verificar a presença do complexo de

anticorpos tanto na derme quanto na epiderme através de coloração específica. Todavia,

o anticorpo isoladamente não penetrou na pele. Nanopartículas lipídicas sólidas (SLN)

também demonstraram aumento da penetração cutânea. Borgia e col. (2005) observaram

um aumento de quatro vezes na penetração do corante vermelho do Nilo quando

encapsulado em SLN em relação a um creme contendo vermelho do Nilo. Resultados

similares foram obtidos por Chen e col. (2006) no encapsulamento de podofilotoxin (POD)

utilizado no tratamento do vírus papiloma humano (HPV) em SLN. Eles verificaram um

aumento na penetração cutânea de 5 vezes do POD quando encapsulado em SLN em

relação ao POD livre.

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Preparar e caracterizar sistemas micro e nanoestruturados para o carreamento de

diferentes princípios ativos com aplicações tópicas e na preparação de tecidos

antimicrobianos.

2.2. Específico

− Preparar nanopartículas com polímeros biodegradáveis (alginato/Quitosana, poli(ε-

caprolactona) e poli(hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato));

− Preparar nanopartículas lipídicas sólidas;

− Estudar o encapsulamento em micro e nanoestruturas de duas substâncias com

diferentes solubilidades: glutationa (hidrofílica) e benzofenona-3 (lipofílica);

36

− Preparar nanopartículas de prata utilizando o fungo Fusarium oxysporum;

− Avaliar in vivo o efeito anti-leishmaniose das nanopartículas de prata;

− Impregnar as nanopartículas de prata em tecidos de algodão e tecidos de poliéster;

− Avaliar o efeito antimicrobiano dos tecidos com e sem nanopartículas de prata contra

bactérias Gram-positiva e Gram-negativa;

− Caracterizar os sistemas micro e nanoestruturados quanto ao diâmetro,

polidispersidade, morfologia, Potencial zeta;

− Avaliar a eficiência de encapsulamento e a cinética de liberação in vitro dos ativos

encapsulados;

− Desenvolver e caracterizar formulações semi-sólidas de uso tópico na incorporação

dos ativos encapsulados em micro/nanoestruturas;

− Estudar a penetração transcutânea das formulações semi-solidas preparadas.

3. METODOLOGIA

3.1. Encapsulamento do tripeptídeo GSH e do fotoprotetor

benzofenona-3

Nesta tese duas moléculas com solubilidades distintas foram encapsuladas em

diferentes estruturas: o tripeptídeo glutationa que é hidrofílico e o filtro solar benzofenona-

3 que é lipofílica. Em vista desta diferença de solubilidade foram utilizados métodos

diferentes no encapsulamento destas duas moléculas.

3.1.A. Encapsulamento do tripeptídeo GSH em Nanoestruturas Poliméricas

a. Método de gelificação iônica

Para a preparação de nanopartículas poliméricas foi utilizado o método de

gelificação iônica como descrito por Douglas e col. (2006). Para isto, inicialmente foram

preparadas duas soluções sendo uma de alginato de sódio (~250 cps, Sigma) em água e

outra de quitosana (105 g/mol / ~81% acetilação, Polymar) em ácido acético. O pH das

soluções foi ajustado para 4,3. As nanopartículas foram obtidas adicionando-se 0,5 mL ou

37

1 mL da solução de quitosana na solução de alginato de sódio sob agitação magnética. O

ativo glutationa (GSH, 307 g/mol Sigma) foi adicionado nos diferentes volumes da solução

de quitosana antes do seu gotejamento na solução de alginato. A quantidade de GSH

adicionada foi 1/5 da massa total de polímero em cada uma das preparações.

b. Método de dupla emulsão água em óleo em água e vaporação de solvente

As nanopartículas foram preparadas pelo método de dupla emulsão e evaporação

de solvente (Meng e col., 2003). Para isto, inicialmente foi preparada uma fase aquosa

com 0,5% de álcool polivinílico (PVA, Sigma) e com GSH. Esta fase foi adicionada em

uma fase orgânica de acetato de etila com o polímero poli(ε-caprolactona) (PCL) (MM

65.000 g/mol, Aldrich) sob agitação de 6000 rpm (Ultra Turrax, T18) formando uma

emulsão água em óleo. Em seguida, esta emulsão foi adicionada em uma solução

aquosa de 1% de PVA (30.000-70.000 g/mol, Aldrich) e 0,9% de NaCl sob agitação de

10000 rpm (Ultra Turrax) formando a dupla emulsão água em óleo em água. Após este

período, o solvente orgânico foi evaporado à baixa pressão em um rotaevaporador

(Bucchi-RE 111).

3.1.B. Encapsulamento da Benzofenona-3 em Micro e Nanoestruturas

Poliméricas

a. Método de Nanoprecipitação

As nanopartículas foram preparadas pelo método de nanoprecipitação utilizando

o polímero PCL (MM 65.000 g/mol, Aldrich) (Fessi e col., 1989). Para isto, uma fase

orgânica contendo PCL e benzofenona-3 (BZ3) solubilizados em acetona foi adicionada

em uma fase aquosa de 0,3% de Tween 80 (Oxiteno) sob agitação de 6000 rpm em um

Ultra-Turrax. Em seguida, o solvente orgânico foi evaporado a baixa pressão em um

rotaevaporador (Bucchi-RE 111) à temperatura de 30 °C.

38

b. Método de Emulsão e Evaporação de solvente

As micropartículas foram preparadas pelo método de emulsão e evaporação de

solvente utilizando o polímero poli(hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) com 9,8% de

hidroxivalerato (PHBV) (MM 23.000 g/mol, PHB Industrial) (Baran e col., 2002). Para isto,

uma fase orgânica contendo 50 ou 100 mg de polímero e benzofenona-3 solubilizados em

clorofórmio foi vertida em uma fase aquosa de 1% PVA sob agitação de 6000 rpm em um

Ultra-turrax formando uma emulsão óleo em água. Após este período a emulsão foi

vertida em uma fase aquosa de PVA 1% e mantida sob agitação magnética por 12 horas

para a evaporação solvente orgânico. Após este período as micropartículas foram

centrifugadas a 19656 g por 30 minutos e lavadas com água destilada três vezes. Em

seguida as partículas foram congeladas em nitrogênio líquido, e secas em um liofilizador

(Terroni – LB 300TT).

3.1.C. Encapsulamento do tripeptídeo GSH e da Benzofenona-3 em

Nanopartículas Lipídicas Sólidas

a. Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS)

Neste estudo foram utilizados 4 tipos de lipídios sólidos: palmitato de cetila (PC),

ésteres cetílicos (EC), ácido esteárico (AC) e miristato de miristila (MM) pelo método de

homogeneização à alta pressão (Üner, 2006, Marcato, 2009). Todos os lipídios foram

gentilmente doados pela Croda. As NLS foram preparadas aquecendo o lipídio 10 ºC

acima da sua temperatura de fusão e, em seguida, o ativo (GSH ou BZ3) foi adicionado.

Esta mistura foi adicionada em uma solução de Pluronic F68 (Aldrich) na mesma

temperatura do lipídio sob agitação de 6000 rpm em Ultra-Turrax formando uma pré-

emulsão óleo em água. Em seguida, esta pré-emulsão foi adicionada ainda quente ao

homogeneizador de alta pressão (GEA Niro Soavi). A homogeneização foi realizada com

pressão no primeiro estágio de 600-1000 bar e pressão no segundo estágio de 10% da

pressão do primeiro estágio por até 3 ciclos. Após os ciclos a dispersão foi resfriada a 25 oC formando as nanopartículas lipídicas sólidas.

39

b. Carreador Lipídico Nanoestruturado (CLN)

Os carreadores lipídicos nanoestruturados foram preparados pelo método de

homogeneização à alta pressão usando os lipídios sólidos: palmitato de cetila (PC) e

ésteres cetílicos (EC) e o lipídio líquido triglicerídeo cáprico e caprílico (Croda). Os CLN

foram preparados aquecendo o lipídio 10 ºC acima da sua temperatura de fusão e, em

seguida, foi adicionado o lipídio líquido (1% m/m) e o ativo benzofenona-3. Esta mistura

foi adicionada em uma solução com o estabilizante Pluronic F68 (Aldrich) na mesma

temperatura do lipídio sob agitação de 6000 rpm em Ultra-Turrax formando uma pré-

emulsão. A pré-emulsão foi homogeneizada à alta pressão (600/60 bar - 1°/2°estagio).

Após este processo, a dispersão foi resfriada em um banho de gelo até a temperatura de

25 oC obtendo os carreadores lipídicos nanoestruturados.

c. Dupla emulsão

Para o encapsulado do ativo hidrofílico GSH foi realizado o método de dupla

emulsão e homogeneização à alta pressão. Neste método foram utilizados os lipídios

sólidos: ésteres cetílicos (EC) e miristato de miristila (MM). Inicialmente, uma solução

aquosa de GSH foi adicionada no lipídio fundido sob agitação de 6000 rpm formando uma

emulsão água em óleo. Em seguida, esta emulsão foi adicionada à solução quente de

Pluronic F68 (Aldrich) (0,5 % m/v) sob agitação de 6000 rpm formando a dupla emulsão

água em óleo em água. Esta dupla emulsão foi homogeneizada à alta pressão (600/60

bar - 1°/2° estagio). Após este processo, a dispersão foi resfriada em um banho de gelo

até a temperatura de 25 oC obtendo as nanopartículas lipídicas sólidas.

d. NLS-quitosana

NLS recobertas com quitosana foram preparadas com o lipídio sólido miristato de

miristila (MM) e revestidas com quitosana (105 g/mol / ~81% acetilação). Para isto,

inicialmente foi preparada uma fase aquosa contendo 0,5% de Pluronic F68 e quitosana.

O pH desta solução foi ajustado para 4,3. O lipídio MM fundido contendo GSH foi

adicionado à fase aquosa na mesma temperatura do lipídio sob agitação de 6000 rpm em

40

Ultra-Turrax formando uma pré-emulsão óleo em água. Esta pré-emulsão foi

homogeneizada à alta pressão sob pressão (600/60 bar - 1°/2°estagio). Em seguida, a

dispersão foi resfriada em um banho de gelo até a temperatura de 25 oC obtendo as

nanopartículas lipídicas sólidas.

3.1.D. Liofilização das nanopartículas

Para a secagem das nanopartículas, estas foram congeladas em gelo seco/etanol

e liofilizadas em um liofilizador (Terroni LB 300TT) por 24 horas. Para amenizar a

agregação das partículas, antes do congelamento das mesmas foi adicionado

crioprotetores. Os crioprotetores estudados foram glicose e maltose nas porcentagens de

5, 10, 20, 30 % (m/v). Antes e após o processo de liofilização, o diâmetro das

nanopartículas foi medido como descrito no item 3.3.D.

3.2. Biossíntese das Nanopartículas de Prata

Neste projeto foi empregado o fungo F. oxysporum (cepa 07SD) procedente da

coleção de culturas do laboratório de Genética Molecular da ESALQ-USP (Piracicaba). O

fungo foi cultivado em meio sólido (0,5 % extrato de levedura, 2 % de extrato de malte, 2

% ágar e água destilada) e mantidos à temperatura de 28 °C por 7 dias. Após esse

período, a biomassa produzida foi filtrada à vácuo, pesada e adicionada em água

destilada na proporção de 10 g/100 ml. Depois de 72 horas, a biomassa foi novamente

filtrada à vácuo e o sobrenadante (líquido fúngico) foi separado. Nitrato de prata foi

adicionado no líquido fúngico na concentração de 10-3 mol/L e mantida sob proteção da

luz por 28 horas. A produção de nanopartículas de prata foi acompanhada por

espectroscopia de ultravioleta-visível (Durán et al., 2005).

3.2.A. Impregnação das nanopartículas de prata em tecidos

Os tecidos de algodão e poliéster com dimensão de 10 cm x 10 cm foram lavados,

esterilizados por 15 minutos em uma autoclave à 121 oC e, sem seguida, secos antes do

uso. Os tecidos foram imersos na dispersão de nanopartículas e, em seguida, submetidos

41

a uma compressão entre dois rolos (método padding). Este processo foi realizado por

duas ou quatro vezes. Em seguida os tecidos foram secos à temperatura ambiente

(Durán et al., 2007).

3.2.B. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Esta parte do projeto foi desenvolvida com a colaboração do Dr. Marcelo Brocchi

do Instituto de Biologia da Unicamp.

A eficiência antimicrobiana das nanopartículas de prata frente a diferentes

bactérias foi avaliada. Para isto a Concentração Inibitória Mínina (CIM) foi determinada

frente às bactérias Staphylococcus aureus meticilina resistente (cepas HC562, Rib1 e

BEC 9393), Staphylococcus aureus não resistentes (cepas ATCC 05923 e ATCC 29213),

Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Escherichia

coli (ATCC 25923), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Salmonella enterica (LT2).

Neste experimento, em cada cavidade de uma placa de microtitulação (placa de

ELISA) foi adicionado 50 µL de meio Miller Hilton (MH, Difico) e 106 bactérias/mL.

Sucessivas diluições de nanopartículas de prata foram adicionadas em diferentes

cavidades (poços) da placa de ELISA. O controle foi realizado com meio de cultura e

bactérias. A CIM das nanopartículas de prata corresponde à primeira cavidade com a

menor concentração de prata existente, sem apresentar o crescimento bacteriano.

3.2.C. Curva tempo-morte



A curva tempo-morte foi realizada com as bactérias Salmonella typhimurium,

Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis. Neste

experimento, num tubo falcon foi adicionado 10 mL de meio MH com 106 bactérias/mL

(controle), e em outro tubo foi colocado 10 mL de MH com a mesma concentração de

bactéria e nanopartículas de prata numa concentração 2 ou 8 vezes acima da CIM. Os

tubos foram colocados no shake, sob agitação a 37 °C durante 24 horas, e

periodicamente foram retiradas alíquotas de 100 µL para análise. Estas alíquotas foram

42

diluída sucessivamente com solução salina em tubos eppendorfs. Os tubos foram

agitados no agitador de tubos e, sem seguida, 25 µL da amostra de cada tubo foi

adicionado numa placa de Petri contendo meio MH solidificado. Este teste foi realizado

em duplicata. Após 24 horas o número de colônias nas placas de Petri foi contado

usando um microscópio ótico.

3.2.D. Teste antimicrobiano



Os testes de atividade antimicrobiana foram avaliados em meio sólido contra as

bactérias Gram-positivas: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Staphylococcus

epidermidis (ATCC 12228) e Gram-negativas: Salmonella typhimurium (LT-2), Escherichia

coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 399).

Os experimentos foram realizados com pedaços dos tecidos nas dimensões de 1,5

x 1,0 cm. Foi avaliada a parte central (mais clara) e a parte terminal (mais escura) dos

tecidos com o objetivo de verificar possíveis diferenças na concentração de

nanopartículas de prata e seu potencial antimicrobiano. Os tecidos antes e após

sucessivas lavagens foram inoculados em placas de ágar contendo as bactérias (1,3-1,6

105 bactérias/mL). Após 24 horas a placa foi esterilizada e o tecido foi analisado por

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e por Espectroscopia de Energia Dispersiva

(EDS) da Jeol (JSM-6360LV).

3.2.E. Ensaio in vivo anti-leishmaniose

Esta parte do projeto foi desenvolvida em colaboração com a Profa Bartira Rossi-

Bergmann do Instituto de Biofísica da UFRJ.

Neste ensaio foram utilizados camundongos BALB/c, entre 8 e 12 semanas de

idade sendo que a variação do peso médio dos animais não excedeu 20 %. Os

camundongos foram infectados com 2 x 106 promastigotas de L.amazonensis GFP na

orelha. Após 10 dias de infecção, os animais foram aleatoriamente separados em grupos

de 4, e tratados com injeções intralesionais duas vezes por semana com doses de 0,16

43

µg de nanopartículas de prata produzidas pelo fungo F. oxysporum (nano de Ag

biológica) e 0,54 µg de nanopartículas de prata produzidas pelo método químico (nano de

Ag química) durante 4 semanas. As nanopartículas de prata produzidas pelo método

químico foram cedidas pela Dr. Roseli De Conti do Intituto de Química-Unicamp. Estas

partículas foram preparadas com borohidreto de sódio e estabilizadas com poli(vinil

pirrolidona).

O grupo controle positivo recebeu 2 mg/kg de anfotericina B, e o controle negativo

recebeu 10 µL de tampão fosfato (PBS, pH 7,4). Durante 42 dias o crescimento da lesão

foi acompanhado durante o experimento com o auxílio de paquímetro. Este aumento da

lesão foi calculado pela equação 1.

Lesão (mm) = espessura da orelha infectada - espessura antes da infecção (eq. 1)

Além do aumento da lesão, a carga parasitária foi medida após 42 dias da infecção

por unidades de fluorescência específica como descrito por Pinto e col. (2003).

3.3. Caracterização das Partículas

3.3.A. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

As partículas foram caracterizadas quanto à morfologia por microscopia eletrônica

de varredura (MEV). Uma pequena quantidade de micropartículas ou dispersão de

nanopartículas foi adicionada em uma fita de carbono fixada em um porta-amostra de

latão. Em seguida, as amostras foram metalizadas com Au/Pd pelo processo de

Sputtering utilizando-se um metalizador BAL-TEC. As análises foram realizadas em um

microscópio eletrônico de varredura Jeol (JSM-6360LV), utilizando-se uma tensão de

aceleração de 20 kV.

3.3.B. Microscopia de Força Atômica (AFM)

As amostras de nanopartículas foram analisadas por Microscopia de Força

Atômica. Para isto, a dispersão de nanopartículas foi diluída 10 vezes em água

44

deionizada e uma gota dessa dispersão foi adicionada sobre mica fixada em um porta-

amostra de latão e secas por 24 h à temperatura ambiente. As imagens foram obtidas em

um microscópio de AFM (SPM-9600, Shimadzu) utilizando o modo dinâmico (modo

intermitente). Foi utilizado cantilever comercial de silício e a freqüência de ressonância da

ponta foi de 210–230 khz.

3.3.C. Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

As nanopartículas de prata também foram analisadas por TEM. Para isto uma gota

da dispersão diluída 10 vezes foi gotejada em um suporte de cobre (copper grids-Ted

Pella) recoberto com parlódio. As análises foram realizadas em um microscópio eletrônico

de transmissão (80 KeV, Carl Zeiss, CEM 902) equipado com um filtro de energia

Castaing-Henry-Ottensmeyer (Durán e col., 2008).

3.3.D. Tamanho médio e distribuição de tamanho das partículas e potencial

zeta

O diâmetro médio das nanopartículas foi determinado através da técnica de

espectroscopia de correlação de fótons utilizando o aparelho Zeta Sizer Malvern. Para

isto 1 mL de amostra diluída em água (1:10) foi adicionado em uma cubeta de acrílico e

as medidas realizadas no Zeta Sizer da Malvern.

A carga superficial das nanopartículas foi analisada por um Zeta Sizer Malvern.

Para isto a dispersão das nanopatículas foram diluidas 10 vezes com uma solução de KCl

(1 mM) e as medidas de potencial zeta foram realizadas no Zeta Sizer da Malvern.

3.3.E. Estudo da influência do pH no diâmetro e no potencial zeta das

nanopartículas

Um estudo da influência do pH no diâmetro e no potencial Zeta das partículas foi

realizado utilizando um titulador MTP-2 Multi Purpose Titrator (Malvern) acoplado ao

Zeta Sizer Malvern. Soluções titulantes de NaOH (0,25 e 1M) e de HCl (0,25 e 1 M) foram

45

utilizadas nestes experimentos. Neste estudo o pH foi variado de 4 a 10 e o diâmetro e os

valores de potencial zeta foram medidos a cada variação de 0,5 no pH.

3.3.F. Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC)

Os termogramas de DSC foram obtidos por um Calorímetro Diferencial de

Varredura DSC-Q10 (TA instruments) usando um porta-amostra padrão de alumínio

selado. As análises foram feitas em atmosfera de nitrogênio, a um fluxo de 50 mL.min-1,

na faixa de temperatura de + 5 a +75 0C e taxa de aquecimento de 10 0C/min (Xia e col.,

2007).

3.3.G. Quantificação do PVA residual em micropartículas de PHBV

A determinação da porcentagem do estabilizante residual PVA em micropartículas

de PHBV foi realizada de acordo com Sahoo e col. (2002). Para isto, 2 mg de

micropartículas de PHBV foram adicionadas em 2 mL de NaOH 0,5 mol/L sob banho–

maria a 60 ºC por 15 minutos. Depois esta solução foi neutralizada com 1 mL de HCl 1

mol/L. O volume foi completado com água destilada para 5 mL . A esta solução foram

adicionados 3 mL de solução de ácido bórico (0,65 mol/L); 0,5 mL de solução de iodeto

de potássio/iodo (0,15/0,05 mol/L) e 1,5 mL de água destilada. Em seguida, esta mistura

foi mantida em repouso por 15 minutos e a absorbância foi lida em um espectrofotômetro

UV-VIS (Hitachi U2000) a 680 nm. A concentração de PVA foi calculada a partir de uma

curva de calibração previamente construída.

3.4. Eficiência de encapsulamento

3.4.A. Quantificação da benzofenona-3 (BZ3)

46

A benzofenona-3 foi quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE) (Shimadzu CBM 20A) (Sarveiya e col., 2004). Neste estudo, foi utilizada uma

coluna C18 (4.6 mm × 250 mm, Varian), a fase móvel foi metanol-água (80:20), o fluxo foi

de 1 mL/min e o volume de injeção foi de 20 µL. O comprimento de onda para a

quantificação da BZ3 foi de 357 nm e o tempo de corrida foi de 10 minutos.

Para a quantificação da eficiência de encapsulamento da BZ3 encapsulada em

nanopartículas (PCL e NLS), 0,5 mL de amostra da dispersão de nanopartículas contendo

o ativo foi centrifugado à 4000 g por 10 minutos em um filtro Microcon com corte de

massa molar de 10.000 g/mol (Millipore). O filtrado foi analisado em um cromatógrafo

líquido com detector de ultravioleta-visível (Shimadzu, SPD-20AV). A concentração foi

calculada a partir de uma curva de calibração previamente construída. A eficiência de

encapsulamento (EE) foi calculada pelas equações 2 e 3.

% não encapsulada = ([BZ3] na solução filtrada/[BZ3] adicionado inicial) x 100 (eq. 2)

EE (%) = 100 - % não encapsulada (eq. 3)

A quantificação de BZ3 encapsulada em micropartículas de PHBV foi realizada

pela dissolução das micropartículas (4 mg) em 4 mL de uma solução de metanol com 10

% de diclometano. Em seguida este sistema foi centrifugado (Eppendorf Centrifuge 5424)

a 1398 g por 3 minutos e o sobrenadante foi analisado por CLAE. A eficiência de

encapsulamento (EE) foi calculada pela equação 4.

EE (%) = (massa de BZ3 na micropartícula/massa de BZ3 total adicionada) x100 (eq. 4)

3.4.B. Quantificação do tripeptídeo GSH

GSH foi quantificado pelo método de ultravioleta-visível após a reação do GSH com

sulfidrila 5,5-ditio-bis (2-acido benzóico) (DTNB) (Aldrich) para a formação do derivado

amarelo 5-tio-2-acido nitrobenzóico (TNB), que apresenta máxima absorção em 413 nm

(equação 5)(Rahman e col., 2007).

47

Para a quantificação da eficiência de encapsulamento, 0,5 mL de amostra da

dispersão de nanopartículas contendo o ativo GSH foi centrifugado à 4000 g por 10

minutos em um filtro Microcon com corte de massa molar de 10.000 g/mol (Millipore). O

volume de 0,1 mL do filtrado foi adicionado em um cubeta de quartzo juntamente com 0,4

mL de tampão fosfato (pH 7,4). Em seguida, 0,5 mL de solução de DTNB foram

adicionados e após 1 minuto de reação, a absorbância foi medida em 413 nm em um

espectrofotômetro UV-VIS (Agilent 8453). A concentração foi calculada a partir de uma

curva de calibração previamente construída. A eficiência de encapsulamento (EE) foi

calculada pelas equações 6 e 7.

% não encapsulada = ([BZ3] na solução filtrada/[BZ3] inicial) x 100 (eq. 6)

EE (%) = 100 - % não encasulada (eq. 7)

3.5. Liberação in vitro

3.5.A. Liberação in vitro da BZ3

Antes do estudo de liberação in vitro, foi realizado um estudo para a determinação

da concentração de BZ3 que garantisse as condições sink durante este experimento.

(eq. 5)

TNB

DTNB Glutationa redutase

48

Para isto, diferentes concentrações de BZ3 foi dissolvida em uma solução de tampão

fosfato 50 mmol.L-1 (pH 7,4) contendo 5% de Tween 80 e a concentração de BZ3 foi

determinada por CLAE como descrito no item 3.4.A. Em seguida foi realizado o

experimento de liberação in vitro. Para isto, 1 mg de BZ3 livre ou encapsulada em

micro/nanopartículas foi adicionado em 10 mL de tampão fosfato 50 mmol.L-1 (pH 7,4)

contendo 5% de Tween 80 em tubos falcon. Os tubos foram mantidos em uma

incubadora Orbital a 32 ± 0,1 oC sob agitação de 120 rpm. No caso das microparticulas

de PHBV, em determinados intervalos de tempo, os tubos foram centrifugados a 786 g

durante 15 minutos e uma alíquota de 0,5 mL do sobrenadante foi coletada e separada

para análise (Brinon e col., 1999). Para as nanopartículas (PCL e NLS) uma alíquota de

0,5 mL foi retirada em determinados intervalos de tempo e centrifugada em um filtro

Microcon de massa molar 10.000 g/mol (Millipore) por 10 minutos. Em todos os casos, o

mesmo volume de alíquota retirado foi reposto com tampão/Tween 80. A BZ3 liberada foi

determinada por CLAE como descrito no item 3.4.A.

3.5.B. Liberação in vitro da GSH

Neste estudo 0,5 mg de GSH livre ou nanoencapsulada foi adicionado em 20 mL

de tampão fosfato 50 mmol.L-1 (pH 7,4) em tubos falcon. Os tubos foram mantidos em

uma incubadora Orbital a 36.5 ± 0,1 oC sob agitação de 120 rpm. Em determinados

tempos uma alíquota de 0,5 mL foi retirada e centrifugada em um filtro Microcon de

massa molar 10.000 g/mol (Millipore) por 10 minutos. O mesmo volume de alíquota

retirado foi reposto com tampão. O GSH liberado foi determinada por UV-Vis como

descrito no item 3.4.B.

3.6. Preparação de formulações semi-sólidas

Para a preparação das formulações semi-sólidas (géis) foi preparado um gel de 1%

(m/m) de Carbopol 940 (ácido poliacrílico) (Alves e col., 2007). Para preparar 10 g de gel,

100 mg de Carbopol 940 foram adicionados em um almofariz juntamente com 9,9 g de

água. Após a homogeneização destes componentes com o pistilo, uma gota de

trietanolamina foi adicionada para ajustar o pH para 7,0. Após a formação do gel foi

49

adicionado propilenoglicol como agente umectante. Foram misturados no gel ou

micropartículas de PHBV secas ou dispersões de NLS ou nanopartículas de PCL.

3.7. Determinação do Fator de Proteção Solar (FPS)

A determinação do FPS in vitro foi realizada segundo metodologia de Mansur e col.

(1986). Para isto 1 mg de BZ3 livre ou encapsulada em micropartículas de PHBV ou em

nanopartículas lipídicas sólidas foi adicionado em 0,2 g de gel de carbopol. As

formulações foram adicionadas em 50 mL de etanol PA, agitadas e sonicadas. Em

seguida as amostras foram medidas em um espectrofotômetro UV-VIS. O FPS foi

calculado de acordo com equação 8.

290 FPS espectrofotométrico = FC . ∑ EE (λ) . I (λ) . abs(λ) (eq. 8)

320

Onde, FC = Fator de correção (igual a 10), EE (λ) = Efeito eritematogênico da radiação no

comprimento de onda λ, I (λ) = Intensidade da luz solar no comprimento de onda λ, Abs

(λ) = Leitura espectrofotométrica para absorbância da solução no comprimento de onda

(λ). Os valores de EE (λ) x I (λ) são tabelados e descritos em relação a cada

comprimento de onda de leitura (Mansur et al., 1986).

3.8. Estudo in vitro da permeação cutânea da BZ3

Os estudos de permeação foram realizados em células de difusão de Franz com

pele humana abdominal de mulheres com idade entre 29 e 40 anos, doadas de cirurgia

plástica. A pele doada foi previamente limpa através da remoção da hipoderme,

recortadas na forma circular e congeladas por até 3 meses. A Figura 5 mostra o esquema

da célula de difusão de Franz (Marcato, 2009).

50

Figura 5: Esquema da célula de difusão de Franz.

Neste experimento, a célula receptora foi preenchida com uma solução de 5% de

Tween 80 em tampão fosfato (50 mmol/L, pH 7,4). A pele foi colada com Super-Bonder

sobre a cela receptora e fechada com a cela doadora. Em cada célula de difusão de

Franz foram adicionados, separadamente: gel de carbopol, gel de carbopol com BZ3 livre,

gel de carbopol BZ3 encapsulada em micropartículas de PHBV ou NLS ou nanopartículas

de PCL e gel de carbopol com as micro/nanopartículas sem ativo. As células foram

mantidas a 32 °C sob agitação. Após 24 horas, as células foram retiradas e a

porcentagem do ativo no extrato córneo, na epiderme, derme e no fluido receptor foram

quantificados por CLAE como descrito no item 3.4.A. A porcentagem de ativo na

epiderme foi feito pelo método de tape-striping. Este método consiste em colar fitas

adesivas sobre a pele e retirá-las. Em seguida, o ativo foi extraído das fitas com metanol.

Para a quantificação do ativo na derme, o restante da pele foi cortado em pequenos

pedaços e colocado em metanol, agitado e o sobrenadante foi quantificado por CLAE.

Todos os experimentos foram realizados com n=8.

3.9. Avaliação da alergenicidade cutânea da benzofenona-3 livre e

micro/nanoencapsulada - Teste de medida de edema de orelha (mouse

ear swelling test - MEST)

51

Esta parte do projeto foi desenvolvida em colaboração com a Profa Bartira Rossi-

Bergmann do Instituto de Biofísica da UFRJ.

Inicialmente, foi realizada a fase de indução. Para isto, a uma área na região dorsal

dos camundongos do grupo-ensaio e do grupo-controle foram tricotomizadas e as

formulações (Gel de carbopol, Gel de carbopol com BZ3 livre e Gel de carbopol com BZ3

encapsulada) foram aplicadas. Oxazolona (0,5%) foi utilizada como controle positivo e

acetona como controle negativo. As aplicações tópicas das formulações (100 µL) foram

realizadas 3 vezes a cada 2 dias (dias 0, 2 e 4) no dorso dos camundongos. Após 5 dias,

foi realizado a fase de desafio aplicando 25 µl das formulações no dorso de ambas as

orelhas dos camundongos. Após 24 e 48 horas da fase de desafio foram realizadas

medidas do inchaço das orelhas dos camundongos (Osborne e col., 2008, Paese e col.,

2009).

A porcentagem do inchaço da orelha foi calculada pela equação 9.

% do aumento da espessura da orelha = [(espessura da orelha pós-tratamento – (eq.9)

espessura da orelha pré-tratamento)/ espessura da orelha pré-tratamento] × 100

3.10. Citotoxicidade em células V79

Esta parte do projeto foi desenvolvida em colaboração com a Profa Patrícia S.

Melo do Instituto de Biologia da Unicamp.

3.10.A. Preparo das Culturas de células

Os fibroblastos V79 foram mantidos em cultura contínua através de repiques

periódicos, até atingirem a densidade de confluência. Este cultivo foi realizado em meio

DMEM (Dulbeccos modified Eagles medium) contendo 100 U/mL de penicilina e 100

mg/mL de estreptomicina, suplementado com 10% de soro fetal bovino. As células foram

descoladas usando solução de ATV (tripsina versene-tripsina a 0,1% e versene a

0,016%). O número de células viáveis para o cultivo e plaqueamento foi determinado

52

homogenizando-se uma alíquota da suspensão celular com a quantidade equivalente de

solução de Azul de Tripan a 0,1%, contando as células em câmara de Neubauer e

excluindo as células que incorporam o corante. O cultivo foi realizado em meio DMEM

suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). A incubação foi feita em estufa a 37 oC sob atmosfera úmida e contendo 5% de CO2. Para os três diferentes ensaios de

citotoxicidade, descritos a seguir, o plaqueamento foi realizado inoculando 3 x 104

células/mL em cada poço da placa (24 cavidades) e incubando a 37ºC por 48 h (Corrêa e

col. 2005). As células foram tratadas com diferentes concentrações de GSH ou BZ3 livre

ou encapsuladas em nanopartículas. Após 24 horas foi avaliada a citotoxicidade por

captuta do corante vermelho neutro e redução do corante metiltiazoletetrazolium como

descrito abaixo.

3.10.B. Captuta do corante Vermelho Neutro (VN) (análise da integridade

lisossomal)

O meio de cultura com os ativos (GSH ou BZ3) ou com nanopartículas foi

removido e trocado por outro contendo 50 µmol.L-1 (segundo padronização) do corante

VN, pré-incubado durante 12 h a 37ºC e filtrado, em membrana Millipore (0,22 µm), antes

do uso. Após 4 horas de incubação a 37 oC, as células foram lavadas com PBS-Ca2+ (pH

7,4) para retirada do excesso de corante não incorporado pelos lisossomas. Em cada

cavidade foi adicionado 100 µL de solução aquosa contendo ácido acético glacial (1%) e

etanol (49%) para fixar as células e extrair o corante VN incorporado nos lisossomas. As

placas foram agitadas por 5 min em um agitador de placas e a absorbância das soluções

foram lidas em um Microplate reader (Cambrige technology –IMC) a 540 nm (Borefreund

and Puerner, 1984).

3.10.C. Redução do corante metiltiazoletetrazolium (MTT) (análise da

integridade mitocondrial)

O meio de cultura com os ativos (GSH ou BZ3) ou com as nanopartículas foi

removido e trocado por outro sem soro contendo o corante MTT (brometo de 3-(4,5-

53

dimetilazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) (1 mg/mL), e as células foram incubadas durante 4 h,

tempo necessário para ocorrer a redução do MTT formando cristais de formazan de

coloração azul (equação 10). O meio foi retirado cuidadosamente e foi adicionado 100 µL

de etanol para solubilização do formazan. As placas foram agitadas por 5 min em um

agitador de placas e a absorbância das soluções foram lidas em um Microplate reader

(Cambrige technology –IMC) a 570 nm (Denizot & Lang, 1986).

(eq. 10)

3.11. Fototoxicidade e citotoxicidade em células 3T3 e HaCaT

Esta parte do projeto foi desenvolvida em colaboração com a Profa Gisele Zenker

Justo do Instituto de Bioquímica da UNIFESP e da Unicamp.

3.11.A. Preparo das culturas de células

Neste trabalho foram utilizadas as linhagens celulares de fibroblastos de embrião

de camundongo BALB/c 3T3, adquirida do NIH (National Institute of Health-Baltimore,

USA) e de queratinócitos humanos HaCaT, gentilmente cedida pela Dra. Liudmila Kodach

(Academic Medical Center, Amsterdam University). As células BALB/c 3T3 e HaCaT

foram cultivadas em meio DMEM e suplementadas com 10% de soro fetal bovino e 1% de

antibiótico. As células foram plaqueadas em garrafas de 75 cm2 ou em placas de 60 cm²,

na densidade de 1 x 104 células/mL para células Balb/c 3T3 e 7 x 10³ células/mL para

HaCaT e incubadas a 37°C sob atmosfera úmida com 5% de CO2.

54

3.11.B. Ensaio de fototoxicidade por captação de vermelho neutro (NRU)

As células BALB/c 3T3 e HaCaT foram plaqueadas numa densidade de 1x105

células/mL e 7x104 células/mL, respectivamente, em 2 placas de 96 poços. Em seguida,

as placas foram incubadas a 37oC, 5% de CO2 por 24 h (Borenfreund e Puerner, 1984).

Após esse período, o meio foi removido e os poços foram lavados duas vezes com

tampão fosfato (PBS) pH 7,4. As células foram tratadas com diferentes concentrações de

BZ3 livre e encapsuladas em NLS e em nanopartículas de PCL. Hematoporfirina IX (HP)

e tiourea foram utilizados como controle positivo e negativo de fototoxicidade,

respectivamente. O tempo de tratamento foi de uma hora. Posteriormente, uma placa de

cada tipo de célula foi exposta a uma dose de radiação UVA de 5 J/cm2 por 50 min

utilizando-se uma lâmpada de UVA (UVL-28 EL Series UV Lamp). A quantidade de

radiação aplicada nas placas foi determinada com a utilização de um radiômetro (Cole

Parmer, UVA - 365 nm). As outras placas de cada tipo de célula não foram expostas à

radiação UVA, entretanto foram mantidas nas mesmas condições das placas expostas à

radiação. Após exposição à radiação o meio foi removido, os poços foram lavados duas

vezes com PBS e meio de cultura com soro foi adicionado. Em seguida, as placas foram

incubadas por 22 h (período de recuperação). Após esse período, o meio de cultura foi

removido e em seguida avaliado a viabilidade celular pela captação do vermelho neutro

como descrito no item 3.10.B.

3.11.C. Determinação do Fator de Foto-irritação (PIF)

O fator de foto-irritação (PIF) é obtido pela razão entre os valores de IC50

(concentração do composto que diminui em 50% a viabilidade celular) obtidos no

experimento na ausência de radiação UVA (-UVA) e os valores de IC50 obtidos nos

experimentos na presença da radiação UVA (+UVA), portanto o cálculo do PIF é

determinado de acordo com a equação 11.

)(

)(

50

50

UVAIC

UVAICPIF

+

−= (eq. 11)

55

A equação 1 pode ser utilizada em situações onde é possível determinar os dois

valores de IC50, na presença e na ausência de radiação. Nesse caso, o composto será

considerado fototóxico se o valor de PIF for ≥ 5, no caso de PIF < 5 o composto será

considerado não fototóxico (Spielmann e col. 1998)

Caso não seja possível determinar o IC50 na ausência de radiação, o valor de IC50

(-UVA) deverá ser substituído pelo valor da concentração máxima testada [Cmax (-UVA)]

como mostrado na equação 12.

)(

)(

50 UVAIC

UVACPIF

máx

+

−= (eq. 12)

Caso o valor de PIF obtido pela equação 2 seja >1 o composto será considerado

fototóxico e para o PIF ≤1, o composto será considerado não fototóxico.

Caso não seja possível determinar o valor de IC50 na presença e na ausência de

radiação, o PIF será calculado segundo a equação 13.

1)(

)(=

+

−=

UVAC

UVACPIF

máx

máx (eq. 13)

Nesta situação o valor do PIF sempre será igual a 1, sendo o composto

considerado não fototóxico.

3.12. Estudo in vivo de toxicidade de NLS-BZ3

Os ensaios de estudo in vivo foram realizados em colaboração com a Profa

Carmen V. Ferreira do Instituto de Biologia da Unicamp e pelo Prof. Jeroen den Hertog do

Instituto Hubrecht-Holanda.

A toxicidade de NLS com e sem BZ3 foi avaliada in vivo usando modelo de

embriões de Zebrafish (peixe paulistinha). Neste experimento embriões de Zebrafish

foram coletados e adicionados em uma placa de 12 cavidades. Em cada cavidade

contendo 2 mL de meio (60 mg/mL de água salgada) foram adicionados 5 embriões. BZ3

56

livre e NLS com e sem BZ3 foram adicionadas ao meio após 6-48 horas pós-fertilização.

As placas foram incubadas à 30 ºC por 42 horas. Após este período, o efeito dos

compostos foi avaliado pela observação de alterações morfológicas nos embriões em um

microscópio óptico (Marcato e col., 2008).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

57

Capítulo 1 – Encapsulamento de GSH

58

59

1. Quantificação de GSH

Para a quantificação de GSH encapsulado, inicialmente foi realizada a construção

da curva analítica de acordo com o item 3.4.B. A curva foi realizada em triplicata e o

coeficiente de correlação em todos os casos foi de 0,99 (Figura 6). A equação da reta

obtida foi y = -0,02735 + 0,00496x. A partir desta curva a eficiência de encapsulamento

do GSH nas preparações de nanopartículas foi calculada.

0 20 40 60 80 100

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

[GSH] (uM)

Abs

orba

ncia

Figura 6: Curva de calibração de GSH.

2. Nanopartículas de Alginato-Quitosana

Devido à solubilidade da quitosana em pH ácido, inicialmente, foi realizado um

estudo de estabilidade do ativo hidrofílico GSH no mesmo pH das preparações das

nanopartículas (pH 4) pela quantificação do ativo em UV-VIS. Foi verificado que em 24

horas não houve degradação significativa do GSH em pH 4, porém uma degradação de

13 % e 40 % do GSH foi observada em 5 e em 14 dias, respectivamente (Figura 7). Desta

forma, após a preparação das partículas estas devem ser secadas ou conservadas em

uma solução com pH neutro.

No estudo de liofilização das nanopartículas de alginato/quitosana dois tipos de

crioprotetores (maltose e glicose) foram testados em concentrações de até 30% (m/v).

Entretanto, em todos os casos houve a coalescência das partículas não sendo possível a

sua redispersão em água após a secagem. Este resultado indica que o método de

liofilização não é um método adequado para a secagem deste tipo de partículas.

60

Dia 0 Dia 5 Dia 140

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% d

e G

SH

Figura 7: Estabilidade de GSH no pH 4 em diferentes dias.

Através do método de gelificação iônica foram obtidas nanopartículas com carga

negativa ou com carga positiva dependendo da quantidade de quitosana adicionada

durante a preparação das partículas. Partículas com carga negativa foram obtidas quando

foi utilizado a proporção alginato:quitosana de 1,5 e partículas positivas foram obtidas

utilizando a proporção de 0,75 de alginato:quitosana (Tabela 1). Esta mudança na carga

superficial das partículas se deve a maior quantidade de grupamentos amina protonados

da quitosana na superfície das partículas. Isto demonstra que esta preparação é uma

opção para a obtenção de partículas positivas, como observado por Prego e col. (2006).

Além disto, foi observado que a adição de uma maior quantidade de quitosana aumentou

o diâmetro das partículas em até 38,6% no caso das partículas sem GSH (Tabela 1). Em

relação à eficiência de encapsulamento foi observado que a maior eficiência de

encapsulamento (27%) foi obtida com as partículas preparadas com a razão de 0,75 de

alginato/quitosana, isto é, com as partículas com carga positiva. Este resultado demonstra

a afinidade do ativo pelo polímero quitosana por ser um polímero mais hidrofílico do que o

polímero alginato. Além disso, esta maior interação entre o ativo GSH e a quitosana pode

ser atribuída ao pH da formulação (4,3). Como o pKa da quitosana é ~6,5 e o pKa dos

grupos terminais do GSH (-COOH) é ~2,17 e 2,35, no pH 4,3 os grupos aminos da

quitosana estão protonados (-NH3+) e os grupos terminais do GSH estão desprotonados

(-COO-) aumentando, dessa forma, a interação entre estas duas moléculas, e

consequentemente aumentando a eficiência de encapsulamento. Desta forma, a

61

preparação com a razão alginato/quitosana de 0,75 é a mais indicada para a

encapsulamento de ativos hidrofílicos do que com a razão de 1,5.

Tabela 1: Valores de diâmetro, índice de polidispersidade (PdI) potencial zeta e eficiência de

encapsulamento (EE) das nanopartículas de alginato/quitosana.

ExperimentoRazão

Alginato/Quitosana

GSH

(mg)

Potencial

zeta (mV)

Diâmetro

(nm)

PdI EE

(%)

1 0,75 0 +21,8 300,8 0,316 -

2 0,75 5 + 27 361,4 0,330 27

3 1,5 0 -20 217 0,413 -

4 1,5 3,5 -23 211,6 0,400 1

A reprodutibilidade das nanopartículas com as duas razões de alginato/quitosana

foi avaliada (n = 6). Neste estudo foi observado que as partículas preparadas com uma

razão alginato/quitosana de 1,5 apresentou maior reprodutibilidade em relação ao

diâmetro e potencial zeta do que as partículas preparadas com uma razão

alginato/quitosana de 0,75 como mostra a Figura 8. Entretanto, as partículas com carga

positiva apresentaram maior estabilidade do que as partículas com carga negativa como

mostra a Figura 9. Em 37 dias, o diâmetro das partículas com carga negativa aumentou

51 % enquanto que o diâmetro das partículas positivas aumentou 16 % (n = 3). Este

resultado demonstra que as partículas com carga positiva apresentam alta estabilidade

em função do tempo.

62

1 2 3 4 5 60

80

160

240

320

400

Experimentos

Diâ

met

ro (

nm)

0,0

0,2

0,4

ìndice de Polidispersidade (P

dI)

1 2 3 4 5 60

10

20

30

Experimentos

Razão 0,75

Pot

enci

al Z

eta

(mV

)

Experimentos

1 2 3 4 5 6

-30

-20

-10

0 Razão 1,5

Pot

enci

al Z

eta

(mV

)

Figura 8: Reprodutibilidade em função do diâmetro e do potencial zeta de nanopartículas

preparadas com diferentes razões de alginato/quitosana: 1,5 (barras azuis) e 0,75 (barras

rachuradas).

Dia 0 Dia 2 Dia 7 Dia 9 Dia 16 Dia 370

100

200

300

400

Diâ

met

ro (

nm)

-0,2

0,0

0,2

0,4


dI)

Figura 9: Estabilidade de nanopartículas preparadas com diferentes razões de

alginato/quitosana: 1,5 (barras azuis) e 0,75 (barras rachuradas).

A. Estudo da Influência do pH no diâmetro e potencial zeta das

nanopartículas

A estabilidade das nanopartículas de alginato/quitosana em diferentes pHs foi

estudada. A Figura 10A mostra o gráfico de diâmetro e potencial zeta das nanopartículas

poliméricas de alginato/quitosana com carga positiva (razão de alginato:quitosana de

0,75) em função do pH. Nesta figura pode-se observar que o aumento do pH ocasionou

63

um aumento de 300% no diâmetro da preparação e o potencial zeta ficou negativo,

variando de +17 mV para -33 mV. Já para as nanopartículas de alginato/quitosana com

carga negativa (razão de alginato:quitosana de 1,5) um aumento menor no diâmetro das

partículas (163%) foi observado, e o potencial zeta reduziu de -3 mV para -10 mV (Figura

10B). Nos dois casos, a partir do pKa da quitosana (~6,5) houve a aglomeração das

partículas (aumento do diâmetro). Este resultado evidencia que as propriedades da

superfície das nanopartículas são predominantemente governadas pela quitosana.

Resultados similares foram obtidos por Chuah e col. (2009) com nanopartículas de

quitosana/lecitina. Além do aumento do diâmetro houve, nos dois casos, uma redução do

potencial zeta devido à desprotonação dos grupamentos aminos em pH básico, sendo

que no primeiro caso – razão alginato/quitosana de 0,75 – esta variação foi maior devido

a grande quantidade de quitosana presente na superfície das partículas (Torres e col.,

2007).

5 6 7 8 9 100

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Diâmetro Potencial Zeta

pH

Diâ

met

ro (

nm)

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

Potencial Z

eta (mV

)

5 6 7 8 9 10 11 12100

150

200

250

300

Diâmetro Potencial Zeta

pH

Diâ

met

ro (

nm)

-30

-20

-10

0

Potencial Z

eta (mV

)

Figura 10: Diâmetro e potencial zeta das nanopartículas poliméricas de alginato/quitosana de

razão: A) 0,75, B) 1,5, em função do pH.

B. Morfologia das partículas

A morfologia das nanopartículas de alginato/quitosana com carga positiva (razão

alginato/quitosana = 0,75) foi observada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

como mostra a Figura 11. Nesta figura, observam-se partículas deformadas devido

possivelmente ao processo de secagem necessário para a análise de MEV. O processo

de secagem necessário para a realização da análise de MEV e a baixa concentração das

A B

64

nanopartículas dificulta a visualização das mesmas por esta técnica. Não foi possível a

observação destas nanopartículas por Microscopia de Força Atômica.

Figura 11: Micrografia das nanopartículas de alginato/quitosana (razão de alginato/quitosana de

0,75).

C. Citotoxicidade das nanopartículas de alginato/quitosana

O estudo de citotoxicidade da glutationa livre demonstrou que este ativo não é

tóxico para as células de fribroblastos V79 tanto para o lissosoma (ensaio de Vermelho

neutro-VN) como para a mitocondria (ensaio de MTT), como pode ser observado no

gráfico da Figura 12.

No estudo de citotoxicidade com as nanopartículas de alginato/quitosana com

carga positiva e sem ativo, observou-se toxicidade lissosomal (VN) com IC50 de

aproximadamente 16 µg/mL, e toxicidade mitocondrial (MTT) com IC50 de ~7 µg/mL,

demonstrando um maior dano à integridade mitocondrial (Figura 13 A,B). No entanto, a

citotoxicidade pode estar relacionada com o pH ácido (pH ~4) da formulação e não devido

às partículas. Entretanto, a toxicidade diminuiu quando GSH estava encapsulado nas

nanopartículas. O IC50 no ensaio de vermelho neutro foi de 16 µg/mL e de 15 µg/mL no

ensaio de MTT (Figura 13 A,B). Este resultado demonstra uma possível proteção

mitocondrial da glutationa encapsulada nas nanopartículas.

A B

65

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 800

20

40

60

80

100

120

VN MTT

% C

ontr

ole

GSH (µM)

Figura 12: Viabilidade das células V-79 na análise dos alvos celulares MTT e VN da glutationa

livre.

Figura 13: Viabilidade das células V-79 na análise dos alvos celulares MTT e VN das

nanopartículas de alginato/quitosana (barras cinza) e nanopartículas de alginato/quitosana com

GSH (barras verdes).

3. Nanopartículas de PCL e nanopartícula lipídica sólida (NLS)

GSH também foi encapsulado em nanopartículas de PCL, NLS e em NLS

revestidas com quitosana. Inicialmente foi realizado um estudo de otimização das

preparações como descritos nos item A e B descritos abaixo.

0

20

40

60

80

100

120

2017141050

MTT

% d

o C

ontr

ole

Concetração (µg/mL)

Nano Nano-GSH

0

20

40

60

80

100

120

140

201714100 5

Vermelho Neutro

% d

o C

ontr

ole

Concetração (µg/mL)

Nano Nano-GSH

A B

66

A. Nanopartículas de PCL

A reprodutibilidade da produção das nanopartículas de PCL e a estabilidade destas

partículas foram avaliadas. A Figura 14 mostra os dados de reprodutibilidade (n = 8) e de

estabilidade (n = 3) durante 51 dias em função do diâmetro e potencial zeta das

nanopartículas de PCL. Nesta Figura pode-se observar que a preparação de dupla

emulsão e evaporação de solvente modificada é reprodutível e as partículas obtidas são

estáveis durante 51 dias de armazenamento à 4 oC.

Figura 14: A e B) Reprodutibilidade em função do diâmetro e potencial zeta, C) Estabilidade das

nanopartículas de PCL preparadas pelo método de dupla emulsão e evaporação de solvente.

B. Nanopartículas de Lipídicas Sólidas (NLS)

Inicialmente foi realizada uma otimização da preparação das nanopartículas

lipídicas sólidas (NLS). O primeiro estudo realizado foi o da influência da concentração

da dispersão no diâmetro das partículas medido por espectroscopia de correlação de

1 2 3 4 5 6 7 8-1,0

-0,9

-0,8

-0,7

-0,6

-0,5

Pot

enci

al Z

eta

(mV

)

Experimetos

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

100

200

300

Experimentos

Diâ

met

ro (

nm)

0,0

0,1

0,2

0,3


dI)

A B

Dia 0 Dia 6 Dia 13 Dia 27 Dia 510

100

200

300

400

Diâ

met

ro (

nm)

0,0

0,1

0,2

0,3


dI)

C

67

fótons. Para isso as amostras foram diluídas com objetivo de evitar espalhamentos

múltiplos. As medidas foram feitas com amostras diluídas até não haver mais alteração

no diâmetro das partículas. Isto aconteceu a partir da diluição 1:10 até 1:40 (Figura 15).

Em vista deste resultado, adotou-se a diluição 1:10 em todas as análises de

nanopartículas lipídicas sólidas (NLS).

1/75 1/50 1/40 1/30 1/20 1/10 1/3 1/2 0150

200

250

300

350

400

450

500

550

Diâ

met

ro (

nm)

Diluições

Figura 15: Efeito da diluição das dispersões de NLS no diâmetro das partículas.

Outros estudos realizados foram: a influência da pressão de homogeneização no

primeiro estágio, o número de ciclos e a concentração de surfactante e de lipídio na

preparação das NLS. Nestes estudos foi utilizado o lipídio palmitato de cetila (PC) e os

surfactantes Pluronic F-68 e Epikuron 200. Utilizando uma pressão de 600 bar no primeiro

estágio e dois ciclos de homogeneização, foi verificado que a melhor proporção

lipídio:Pluronic F68:Epikuron 200 (m/m/m) foi 4:1:0 sendo que a adição de Epikuron 200

aumentou o diâmetro das partículas como mostra a Figura 16A. Em seguida, aumentou-

se a concentração de lipídio em 3x mantendo a de surfactante e observou-se que não

houve alteração significativa no diâmetro e no índice de polidispersidade. Desta forma,

otimizou-se a preparação utilizando a proporção lipídio:Pluronic F68 (m/m) de 12:1. Em

seguida, foi realizado um estudo da influência da pressão e do número de ciclos. Na

Figura 16B pode-se observar que houve um aumento no diâmetro e no índice de

polidispersidade (PdI) das partículas quando foi utilizada uma pressão de 1000 bar no

primeiro estágio. Este aumento no diâmetro está relacionado com o aumento da energia

cinética das partículas resultante do aumento da pressão, favorecendo a agregação das

mesmas após a homogeneização como demonstrado por Siekmann e col. (1994).

68

Entretanto, não foi observada diferença significativa no diâmetro e no índice de

polidispersidade das partículas quando a pressão foi alterada de 600 bar para 800 bar

(Figura 16B). Em vista deste resultado, foi utilizada uma pressão de 600 bar no primeiro

estágio de homogeneização para a continuidade do projeto. Em relação ao número de

ciclos de homogeneização foi observado que o aumento de um ciclo para dois ciclos

reduziu o diâmetro das partículas em 20 % e o índice de polidispersidade em 51 %

(Figura 16C). Esta redução está relacionada com o maior cisalhamento das partículas

com o aumento do número de ciclos. Porém não houve diferença significativa entre dois e

três ciclos de homogeneização sendo, portanto, utilizado dois ciclos de homogeneização

na continuidade deste projeto.

Figura 16: Variação do diâmetro e do índice de polidispersidade das NLS de PC em função da:

A) Proporção de Lipídio:Pluronic F-68:Epikuron 200 (m/m/m), B) Pressão de homogeneização no

primeiro estágio, C) Número de ciclos de homogeneização.

C

1 2 30

50

100

150

Número de Ciclos

Diâ

met

ro (

nm)

0,00

0,06

0,12

0,18

0,24

Índice de Polidispersidade (P

dI)

1 2 30

50

100

150

Número de Ciclos

Diâ

met

ro (

nm)

0,00

0,06

0,12

0,18

0,24


dI)

A B

2,5:1:0 3,3:1:0 5,0:1:0 5,0:1:1 10:1:0 4,0:1:0 12:1:0

120

240

360

480

600

Diâ

met

ro (

nm)

Proporção Lipídio CP:Pluronic:Epikuron (m/m)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4


dI)

69

Na segunda etapa, foi realizado um estudo do lipídio mais adequado para a

formação das NLS. Para isto foram estudados os lipídios: palmitato de cetila (PC), ésteres

cetílicos (EC), ácido esteárico (AC) e miristato de miristila (MM) e foi avaliado o diâmetro,

o índice de polidispersidade (PdI), a reprodutibilidade e a estabilidade em cada

preparação. A Figura 17 mostra os dados do diâmetro e PdI dos quatro lipídios

estudados. Observa-se nesta figura a influência do lipídio tanto no diâmetro quanto no

índice de polidispersidade sendo que as partículas com menor diâmetro foram obtidas

com o lipídio ácido esteárico. O índice de polidispersidade não variou significativamente

ficando sempre abaixo de 0,2 em todos os casos. Entretanto, no estudo de estabilidade

durante 12 dias foi observado que o diâmetro das nanopartículas preparadas com o

lipídio ácido esteárico aumentou de 119,3 nm para 438,3 nm após 24 horas, mantendo-

se, em seguida, estável por 12 dias. Já para os demais lipídios (PC, EC e MM), o

diâmetro não variou significativamente durante este mesmo período. Por este motivo, não

foi mais utilizado o lipídio ácido esteárico.

100

120

140

160

Diâ

met

ro (

nm)

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30


dI)

AC

Lipídio

PC EC MM0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

0

100

200

300

400

500

Diâ

met

ro (

nm)

Tempo (dias)

CP SS MM AC

Figura 17: A) Influência do tipo de lipídio no diâmetro e no índice de polidispersidade das NLS, B)

Estabilidade das NLS preparadas com diferentes lipídios.

O método utilizado na preparação das NLS mostrou-se reprodutível como mostra a

Figura 18A para NLS de ésteres cetílicos (EC) (n = 8). O mesmo comportamento foi

observado para os demais lipídios (PC e MM). Foi realizado um estudo de estabilidade

das NLS armazenadas à 4 ºC e à temperatura ambiente (n = 3). A Figura 18B mostra a

estabilidade de NLS de EC. Nesta figura pode-se observar que nas duas temperaturas, o

diâmetro e o índice de polidispersidade não variaram significativamente, demonstrando a

A B

70

alta estabilidade destas partículas. O mesmo comportamento foi observado para as NLS

preparadas com os lipídios PC e MM. As dispersões foram avaliadas por até 200 dias,

não havendo mudança significativa no diâmetro e no índice de polidispersidade das

partículas.

1 2 3 4 5 6 7 80

50

100

150

Experimentos

Diâ

met

ro (

nm)

0,0

0,1

0,2 Índice de Polidispersidade (P

dI)

0 10 20 30 400

50

100

150

Diâ

met

ro (

nm)


dI)

Tempo (dias)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Figura 18: Gráfico comparativo de NLS de EC em função da: A) Reprodutibilidade, B)

Estabilidade: à 4 oC (barras brancas e linha preta) e à temperatura ambiente (barras cinzas e linha

azul).

Após a otimização da preparação das nanopartículas de PCL e de NLS, o ativo

GSH foi encapsulado nestas nanoestruturas como descrito no artigo a seguir submetido

na revista Journal of Biomedical Nanotechnology em 2010.

A B

71

Artigo: Comparative study of peptide encapsulation in polymeric and in

solid lipid nanoparticles

Priscyla D. Marcato1,*, Leonardo F. Adami1, Nelson Durán1

1 Chemistry Institute, Biological Chemistry Laboratory, Universidade Estadual de

Campinas, P.O.Box 6154, Campinas-SP, CEP 13083-970, Fone: (55) 19 35213042, Fax:

(55) 19 35213023, Brazil (*[email protected])

Abstract

The application of peptides and proteins in the cosmetic and medical area has been

increasing. However, these molecules are very sensitive and need to be protected for use

in these applications. In this work glutathione (GSH) (as a peptide model) was

encapsulated in solid lipid nanoparticles (SLN) with and without chitosan and in poly(ε-

caprolactone) (PCL) nanoparticles. Several parameters were modified to improve the

encapsulation efficiency. The particles size was ~300 nm for the PCL nanoparticles, 160

nm for SLN and 346 nm for SLN/chitosan. The zeta potential was negative for the PCL

and SLN nanoparticles and positive for SLN-chitosan. SLN produced by double emulsion

increased the encapsulation efficiency from 0% to 10%. However, the best result was

obtained with SLN covered with chitosan (35%). Similar encapsulation efficiency was

obtained with PCL nanoparticles produced by double emulsion with NaCl in the internal

and external aqueous phases. The GSH release depended on particle kind. A fast release

was obtained when GSH was encapsulated in PCL nanoparticles. The results showed that

it is possible to improve the encapsulation efficiency through addition of a hydrophilic

polymer (chitosan) while with the addition of NaCl in the aqueous phases a good peptide

carrier system was obtained.

Keywords: Peptide, Glutathione, Solid lipid nanoparticles, PCL nanoparticles, Chitosan.

72

1. Introduction

Peptides and proteins have many applications in medicine and cosmetics field. In

medicine cancer, infectious diseases, autoimmune diseases, AIDS can be cited while anti-

aging treatment are important cosmetic applications. However, the clinical use of peptides

and proteins has many challenges.1,2 The chemical and physical stability of these

molecules can be compromised by environmental factors that include: pH, ionic strength,

temperature, high pressure, non-aqueous solvents, metal ions, surfactants, adsorption,

agitation and shearing.3 Furthermore, most of these molecules are hydrophilic and easily

biodegradable in the human body.4 Therefore, their life in vivo is very limited. This

characteristic can impede the use of peptides or proteins in intravenous or oral application.

It is possible to use high concentrations of proteins/peptides to obtain therapeutic efficacy,

but high doses can lead to toxic side effects.3 In cosmetic formulations the challenge is

peptide stability and skin penetration. Many peptides are used in anti-aging treatment, but

in this case the peptide needs to penetrate in the skin to the dermis. Due to the hydrophilic

properties of peptides this penetration is difficult.5 Thus, a nanocarrier system can

enhance peptide and protein applications in medicine and cosmetics by improving their

stability, increasing their life in vivo and increasing their skin penetration.6 The challenge is

their encapsulation in nanoparticles mainly when the covering material is hydrophobic,

such as synthetic polymers (e.g. poly(ε-caprolactone))7,8 or lipids (e.g. glyceryl

monostearate). Different methods have been described in the literature. Xie et al.9

encapsulated protein (insulin, bovine serum albumin (BSA) and lyzozyme) in solid lipid

nanoparticles (SLN). To improve the encapsulation efficiency poly(lactide-co-glycolide)

(PLGA) was used as polymeric emulsifier and hydrogenated castor oil was used as solid

lipid. The particles were prepared using water/oil/water (w/o/w) emulsion with the organic

solvent chloroform. This work verified that PLGA was an efficient emulsifier for preparation

of protein encapsulated in SLN, enhancing encapsulation efficiency and loading capacity.

Another example was reported by Feczkó et al.10 In this study, BSA was encapsulated in

polylactic acid (PLA) nanoparticles/microparticles and the type (polyvinyl alcohol (PVA),

poloxamer, and polyvinyl pyrrolidone (PVP)) and amount of surfactant were evaluated.

The particles were prepared by the w/o/w emulsion method using dichloromethane. The

size, polidispersity index and encapsulation efficiency (70-90%) was influenced by

73

surfactant amount. Stable particles before and after the centrifugation process and with

high encapsulation efficiency were obtained with five times more PVA and 10 times more

poloxamer than the PLGA mass. Salmaso et al.11 produced solid lipid nanoparticles by a

supercritical gas-assisted melting atomization process using DMSO. The encapsulation

efficiency using this method was 80%.

Glutathione (GSH) is a natural tripeptide formed by the aminoacids gluthamine-

cysteine-glycine (Figure 1). This tripeptide is an important biologically active responsible

for oxidative process inhibition. Furthermore, GSH exhibit metabolic, catalytic and

transport functions. In the cell GSH protects against reactive species of oxygen and

xenobiotics such as free radicals12. As all peptide when administered without protection,

GSH is quickly degraded by γ-glutamyl-transpeptidase and γ-glutamyl-cyclotransferases,

resulting in low protection against free radicals13. Therefore, GSH encapsulation can

improve its stability. Lopedota et al.1 reported the encapsulation of GSH in cyclodextrins

and Eudragit RS 100 for transmucosal routes. The encapsulation efficiency was 15-24%

and the system exhibits efficient interaction with mucin, showing it to be a good carrier

delivery for GSH along transmucosal routes. Furthermore, this system did not exhibit

cytotoxicity to the HaCaT cell line.

Figure 1: Glutathione structure.

In this work two different kinds of nanoparticles were investigated for GSH

encapsulation (using GSH as a peptide model): PCL nanoparticles and in solid lipid

nanoparticles (SLN) with and without chitosan. Several parameters were modified to

improve the encapsulation efficiency and produce a good carrier system.

2. Materials and Methods

74

2.1. Particles Preparation

A. Polymeric Nanoparticle Preparation

The peptide (glutathione) was encapsulated in nanoparticles of poly(ε-caprolactone)

(PCL) by the double emulsion and solvent evaporation method.14 For this, an aqueous

phase of peptide (5 mg) with (poly(vinyl alcohol)) PVA (1% w/v), with or without NaCl was

added to an organic phase of ethyl acetate and PCL under high agitation in an Ultra-

turrax T18. After that, the emulsion was added to an aqueous phase with PVA (1%) and

NaCl under high agitation, forming the double emulsion water/oil/water/ (w/o/w). The

organic solvent was removed under low pressure and PCL nanoparticles were obtained.

B. Solid Lipid Nanoparticles (SLN)

b.1. Hot homogenization method

SLN were produced by hot high pressure homogenization with the lipid myristyl

myristate.15 The lipid was kindly donated by Croda (Brazil). The solid lipid with or without

peptide (5-50 mg) was heated to around 10 oC above its melting point. After, the mixture

was added to a hot aqueous solution of Pluronic F68 under high agitation in an Ultra-

turrax T18 to form a pre-emulsion. The pre-emulsion was homogenized using a Panda

2k (Niro Soavi, Italy) applying two homogenization cycles at 600 bar and cooled to form

the SLNs.

b.2. Double emulsion without organic solvent and hot homogenization method

An aqueous solution of peptide (55 mg) in water with Pluronic F68 (0.5%) was

added to melted solid lipid (myristyl myristate) under high agitation in the Ultra-turrax T18

to form a water in oil (w/o) emulsion. This emulsion was added to a hot aqueous solution

of Pluronic F68 under high agitation in the Ultra-turrax T18 forming a double emulsion

(w/o/w). This emulsion was homogenized using a Panda 2k (Niro Soavi, Italy) applying

two homogenization cycles at 600 bar and cooled to form the SLNs.

b.3. Hot homogenization method with chitosan

75

The solid lipid with or without peptide (55 mg) was heated to around 10 oC above its

melting point. After, the mixture was added to a hot aqueous solution of Pluronic F68 and

chitosan (Polymar, 105 g/mol, ~81% of deacetylation degree) (1% w/v) under high

agitation in the Ultra-turrax T18 to form a pre-emulsion. The pre-emulsion was

homogenized using a Panda 2k (Niro Soavi, Italy), applying two homogenization cycles at

600 bar and cooled to form the SLNs.

2.2 Lyophilization process

The particles were dryed by lyophilization. The dispersion was frozen with and

without cryoprotector and lyophilized. Two cryoprotectors were studied: maltose and

glucose in different concentrations (0-30% m/v).

2.3 Microscopy analysis

a) Scanning Electron Microscopy (SEM)

The particles were characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM – Jeol

JSM-6360LV) at a voltage of 20 kV after prior coating with gold/palladium under vacuum

by sputtering using a BAL-TEC apparatus. Secondary electron images were obtained.

b) Atomic Force Microscopy (AFM)

The morphology of the particles was evaluated by Atomic Force Microscopy (AFM)

(SPM-9600, Shimadzu, Kyoto, Japan). The samples were prepared by depositing dilute

particles dispersions on freshly cleaved mica plates, followed by drying overnight at 25 oC.

The images were done in a dynamic mode, using commercial silicon cantilevers. The

resonance frequencies were 210–230 kHz.

2.4. Particle Size and Zeta Potential

The average particle size (number average size) and size distribution were measured

by photon correlation spectroscopy (PCS) (Nano ZS Zetasizer, Malvern Instruments Corp)

at 25 oC in polystyrene cuvettes with path length of 10 mm. The zeta potential was

76

measured in capillary cells with path lengths of 10 mm, using the Nano ZS Zetasizer.

Measurements were performed in distilled water adjusted with a solution of 0.1 mmoL/L

sodium chloride. The study of the effect of pH on the particle size and on the zeta potential

was made using a titrator (MPT-2, Malvern Instruments Corp) coupled with the NanoZS,

Zetasizer.

2.5 Encapsulation efficiency

The encapsulation efficiency of GSH encapsulated in the particles (SLN and PCL

nanoparticles) was determined by UV-VIS spectroscopy (Agilent 8453). For this the

glutathione was reacted with 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) to form 2-nitro-5-

thiobenzoic acid that exhibits a yellow color.16 The sample was measured at λ = 412 nm.

For encapsulation efficiency determination, 500 µL of particles dispersion were filtered in a

Microcon centrifugal filter device containing ultrafiltration membranes (MWCO 100,000,

Millipore). The filtrate was assayed to determine the concentration of the non-

encapsulated drug. Encapsulation efficiency (EE%) and loading capacity (LC%) were

calculated using the following equations17:

(EE%) = (mass of GSH encapsulated/mass of GSH total) x 100

(LC%) = (mass of peptide in the nanoparticles/mass of particles recovered) x100

2.6 In vitro release

In Falcon tubes, GSH or particles dispersion was added to phosphate buffer (PBS,

50 mM, pH 7.4). The peptide concentration in this study was 60 µM. The tubes were

maintained at 36.5 ± 0.5 oC and 120 rpm. At predetermined time intervals, samples (0.5

mL) were collected and analyzed through UV-VIS spectroscopy according to the method

described above. The volume removed was replaced with an equal volume of phosphate

buffer.18

2.7 Glutathione stability

77

Peptide stability under the conditions of particles production was studied. For this,

the temperature, pH and organic solvent influences on peptide stability were evaluated by

UV-VIS spectroscopy. To evaluate the temperature effect, the peptide was maintained for

10 minutes at 70 ºC (the same temperature used for SLN production). To evaluate the pH

effect, the peptide was kept at pH 4.0 for several days (the same pH as the chitosan

solution). To evaluate organic solvent influence, the peptide was maintained in ethyl

acetate for 15 minutes and after the peptide was extracted with water and analyzed by

UV-VIS spectroscopy.

3. Results and Discussion

Table 1 shows the results of SLN and PCL nanoparticles with GSH. The zeta

potential was negative for all particles without chitosan. Furthermore, NaCl addition

decreases the zeta potential of PCL nanoparticles. However, all formulations were stable

by 50 days. The zeta potential of SLN/chitosan was positive (+ 9.9) due the protonated

amino groups of the chitosan.19 This change in the charge (negative to positive) confirms

that chitosan on the surface of the particles.

The size of the particle depended on particles type and on the method used (Table

1). The PCL nanoparticles size and polydispersity index (PdI) (315 nm, 0.298) did not

change significantly with NaCl addition (306 nm, 0.262). For the solid lipid nanoparticles

the size did not change when the double emulsion method was used, but the PdI

increased two times. Probably, two stages in the emulsion formation form more

polydispersed particles than one stage. Furthermore, chitosan addition increases the

particles size and the PdI. Therefore, more polydispersed particles were obtained with

chitosan present.

Due to the lipophilic characteristics of the lipid and the polymer the interaction of

peptide with these materials is very weak, decreasing the encapsulation efficiency (EE).

For this reason, different methods and particles were studied. The encapsulation efficiency

(EE) was influenced by particles type and particle method production. In the PCL

nanoparticles produced by the water in oil in water double emulsion, the addition of NaCl

increased the EE from 0 % (without salt) to 35 % (with salt in both aqueous phases)

demonstrating the influence of NaCl. Due to the high solubility of peptide in water, the

78

addition of salt increases the ionic force changing the osmotic gradient and decreasing the

peptide migration to the external aqueous phase.20 However, the addition of NaCl only in

the external phase (without GSH) decreased the encapsulation efficiency (data not

shown). Therefore, for good EE it is necessary to add NaCl in both aqueous phases.

In the SLN the EE was 0 % when the traditional method was used, but the EE

increased to 10% when the double emulsion method without solvent was used. However

the highest EE was obtained when the SLN was covered or capped with chitosan. The

addition of chitosan in the aqueous phase before particles formation enhanced the drug-

covered material interaction, increasing its encapsulation. Furthermore, the cover of the

particles formed with chitosan was made without a second stage in the production. In this

case, the costs for this production are almost the same as without chitosan. Therefore, the

scale-up viability of this production procedure is important.

Table 1: Size, polydispersity index, zeta potential and encapsulation efficiency of PCL and

solid lipid nanoparticles with peptide.

Nanostructure Size

(nm)

Polydispersity

index

Zeta

Potential

(mV)

Encapsulation

efficiency

(%)

Loading

Capacity

(%)

PCL nanoparticles 315 0.298 -5.7 0 0

PCL nanoparticles

With NaCl

306.0 0.262 -0.634 35 3.0

SLN 156.6 0.164 -15.7 0 0

SLN (double

emulsion)

166.4 0.269 -17.2 10 0.10

SLN/Chitosan 346.0 0.528 + 9.9 35 0.32

3.1 Particles Morphology

The SEM images of the PCL nanoparticles showed spherical and homogeneous

particles. The same morphology was observed by AFM, as shown in Figure 2.

79

Figure 2: PCL nanoparticles morphology : A) SEM image x 27000, B) AFM topographic

image (Scan area was 5.00 x 5.00 µm2), C) 3D representation of the topography (Scan

area was 2.50 x 2.50 µm2).

The SEM images of the SLN were not possible to obtain due to the high vacuum

used in this technique. Therefore, the SLN morphology was evaluated only by AFM.

Figure 3 shows the SLN and SLN/chitosan with peptide. Spherical particles were observed

and the SLN/chitosan was larger than the SLN due to the chitosan around the solid lipid

nanoparticles. This size difference was confirmed by photon correlation spectroscopy as

shown above.

Figure 3: AFM topographic image of: A) SLN (Scan area was 5.00 x 5.00 µm2), B)

SLN/chitosan (Scan area was 10 x 10 µm2).

3.2 Glutathione stability

Peptide stability was evaluated using the particles preparation conditions. In the

case of PCL nanoparticles, the peptide was exposed to the organic solvent (ethyl acetate)

2.00 um 5.00 x 5.00 um

A B

C

239.59[nm]

0.005.00 um 10.00 x 10.00 um

175.09[nm]

0.002.00 um 5.00 x 5.00 um

A B

80

for 15 minutes, the time needed for particle formation. The peptide maintained its stability

as shown in Figure 4A. Ethyl acetate is less aggressive to peptides or proteins than other

solvents such as chloroform or dichloromethane.21 Thus, it is possible to encapsulate

peptides or proteins in polymeric nanoparticles maintaining their activities.

In the case of SLN, the GSH was exposed for 10 minutes to 70 ºC before coaling

the particles to room temperature. The peptide was stable in this temperature by over 10

minutes (Figure 4B). Furthermore, in the SLN/chitosan preparation the peptide is exposed

to lower pH (4.0), and this pH influenced peptide stability after 15 days (Figure 4C).

Therefore, in this case, the particles should be dried after formation or the pH needs to be

increased to 7.0 to maintain its stability.

The influence of pH on the particle size and zeta potential was also studied. The

size and zeta potential of PCL nanoparticles were not influenced significantly by pH, as

shown in Figure 5. However, the zeta potential of SLN-chitosan was influenced by pH due

to the chitosan on the particles surface. In this case, the zeta potential decreased rapidly

with the pH increase and the size increased slightly. After the pKa of chitosan (~6.5), the

zeta potential changed from positive to negative due to deprotonation of the chitosan

amino groups.22

Figure 4: Comparative graph of GSH stability in: A) ethyl acetate, B) temperature (70 ºC),

C) pH 4.

Before After0

20

40

60

80

100

% o

f GS

H

BeforeSolvent contact

After15 minutes in ethyl acetate

A

0 100

20

40

60

80

100

Time (minutes)

% o

f GS

H

B

0

20

40

60

80

100

5 150

Time (days)

% o

f GS

H

C

81

Figure 5: Influence of pH on particle size (- -) and in zeta potential (-o-): A) PCL

nanoparticles, B) SLN-Chitosan.

3.3 Lyophilization process

The production of solid formulations is necessary in some applications such as oral

administration. Furthermore, solid formulations could increase the drug and/or particles

stability for long periods. This is an important characteristic when the formulation is on the

market.23 Two drying methods are most commonly used: spray-drying and

lyophilization.24,25 The first one uses high temperatures (around 150 ºC or more) and this

temperature can degrade the drug. Peptides or proteins are sensitive to high temperature.

Thus, lyophylization was used in this work. The particles were lyophilized with and without

cryoprotector (maltose or glucose). Maltose was more efficient than glucose (data not

shown). In spite of the use of cryoprotector, in all case the particles size increased, but

with 10% of maltose the size increased only 35%. Thus, the best percentage, in both

cases (PCL nanoparticles and SLN-chitosan), of maltose was 10% as shown in Figure 6.

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5

296

298

300

302

304

306

308

310

Siz

e (n

m)

pH

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

Zeta P

otential (mV

)

4 5 6 7 8 90

50

100

150

200

250

pH

Siz

e (n

m)

-9

-6

-3

0

3

6

9Z

eta Potential (m

V)

A B

82

Figure 6: Comparative graph of particle size before and after lyophilization with and

without cryoprotector (maltose).

3.4 In vitro Release

The in vitro release of GSH was influenced by the nanoparticle type. Figure 7

shows that GSH encapsulated in PCL nanoparticles was released faster than GSH

encapsulated in SLN-chitosan. Probably, the hydrophilic polymer (chitosan) controls GSH

release. Chellat et al.26 and Haidar et al.23 observed that the complexation of chitosan with

other polymers provides a protective effect for particle degradation exhibiting a longer

release of protein from the core. In 10 hours only 52% of GSH was release from SLN-

Chitosan. Furthermore, both release profile (GSH in PCL nanoparticles and in SLN-

chitosan) were different from GSH dissolution demonstrating that the GSH was inside the

particles.

Figure 7: Release profile of: Free GSH (- -), PCL-GSH (- -) and SLN-GSH (- -).

Before Without 5 % 10% 20% 30%0

200

400

600

800

1000

1200

1400 SLN/chitosan PCL nanoparticles

Siz

e (n

m)

lyophylization cryoprotector

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

20

40

60

80

100

SLN-GSH

PCL-GSH

Free GSH

% o

f GS

H r

elea

se

Time (hours)

83

4. Conclusion

The encapsulation of peptides and proteins is very important in many areas, mainly

in cosmetics and medicine. This encapsulation depends on the type of particles, the

particles production method and of hydrophobicity of the covered material. In the case of

solid lipid nanoparticles the encapsulation was 0% using the traditional method (oil/water

emulsion and homogenization). However, the encapsulation increased to 10% (0.10 of

loading capacity) (Table 1) when a double emulsion was used and increased to 35% (0.32

% of loading capacity) (Table1) when the tradition method was used in the presence of

chitosan. In the case of PCL nanoparticles the most important factor was addition of NaCl

in both the internal and external phases, resulting in 35% in encapsulation efficiency (3%

of loading capacity). The peptide was stable in all conditions of particles preparation

(temperature, solvent and pH). However, after 5 days at a lower pH a partial degradation

of GSH was observed. In this case, lyophilization was necessary to prevent this

degradation. However, to prevent particles aggregation during lyophylization a

cryoprotector (10% of maltose) was used. In the release study it was observed that GSH

release depended on the particles characteristics. GSH encapsulated in PCL

nanoparticles was released faster than GSH encapsulated in SLN-chitosan.

Peptide or protein encapsulation has many challenges, but it can be optimized with

different modifications such as the use of a hydrophilic polymer, the addition of salt in the

aqueous phase and the use of a double emulsion method. In addition, it is necessary to

study the in vivo application of these particles with peptides or proteins in order to choose

the best carrier system.

5. Acknowledgements

Supports from CAPES, FAPESP, the Brazilian Nanobiotechnology Network

(MCT/CNPq) and Brazilian Nanocosmetic Network (MCT/CNPq) are acknowledged.

6. References

84

1. A. Lopedota, A. Trapani, A. Cutrignelli, L. Chiarantini, E. Pantucci, R. Curci, E. Manuali,

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87

Capítulo 2 – Encapsulamento da Benzofenona-3

88

89

1. Quantificação de BZ3

A construção da curva analítica para determinar a eficiência de encapsulamento da

benzofenona-3 foi realizanda utilizando HPLC de acordo com o item 3.4.A. O coeficiente

de correlação foi de 0,99 ( n= 3) (Figura 19). A equação da reta obtida foi y = -813,52441

+ 15239,12116x. A partir desta curva foi calculada a eficiência de encapsulamento da

benzofenona-3 nas micropartículas de PHBV.

0 10 20 30 40 500

200000

400000

600000

800000

1000000

Are

a

Concentração (mg/L)

Figura 19: Curva de calibração de BZ3.

2. Micropartículas de PHBV

Devido à insolubilidade do polímero PHBV em acetona, foi utilizado o método de

emulsão óleo em água (o/a) e evaporação de solvente no preparo das micropartículas de

PHBV. Inicialmente foi estudada a influência da variação da concentração de PHBV na

eficiência de encapsulamento, no rendimento e no diâmetro das partículas. Para isto,

duas diferentes massas de PHBV (50 mg e 100 mg – 10 e 20 mg/mL, respectivamente)

foram avaliadas. Neste estudo observou-se que o aumento da massa de PHBV em 2

vezes aumentou a eficiência de encapsulamento em 6 %, entretanto, diminuiu o

rendimento da preparação como mostra a Tabela 2.

90

Tabela 2: Influência da variação da massa de PHBV adicionada na preparação das

micropartículas.

Massa de PHBV

(mg)

Diâmetro (µm) Eficiência de

Encapsulamento (%)

Rendimento (%)

50 3,9 82 87

100 5,9 87 83

A morfologia das micropartículas de PHBV preparadas com 50 e 100 mg de

polímero foi estuda por MEV como mostra a Figura 20. As imagens foram obtidas após a

a secagem das partículas por liofilização. Nesta figura, pode-se observar micropartículas

esféricas e homogêneas independente da massa de polímero utilizada na preparação das

partículas. Entretanto, foi observado que as micropartículas preparadas com 100 mg de

PHBV (Figura 20 C,D) apresentaram um diâmetro maior (5,9 µm) em relação as

partículas preparadas com 50 mg de PHBV (3,9 µm) (Figura 20 A,B).

Figura 20: Micrografias de micropartículas de PHBV preparadas com: A, B) 50 mg de PHBV, C,D)

100 mg de PHBV.

A B

C D

91

A. Quantificação de PVA residual

O estabilizante PVA utilizado neste estudo, apesar de ser um excelente

estabilizante para as micropartículas, apresenta toxicidade dependendo da sua

concentração, sendo a LD50 (dose letal), via oral em ratos, igual a 14,7 g/kg (Youan e col.

2003). Em função disto, as partículas foram lavadas três vezes e o PVA residual foi

quantificado após as lavagens (Wang e col. 2005). Para a quantificação do PVA residual

foi, inicialmente, construída uma curva de calibração por espectroscopia UV-Vis de

acordo com o item 3.3.G. A O coeficiente de correlação em todos os casos foi de 0,99 (n=

3) (Figura 21). A equação da reta obtida foi y = -0,001100406 + 0,03444x.

0 3 6 9 12 15 18 210,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

[ PVA ] (µg/mL)

Abs

orbâ

ncia

Figura 21: Curva de calibração do PVA.

A Tabela 3 mostra os resultados da quantificação do PVA nas diferentes preparações

das micropartículas de PHBV. Nesta tabela pode-se observar que todas as preparações

apresentaram PVA residual após as lavagens. Isto porque, independente do número de

lavagens, uma monocamada de PVA permanece nas micropartículas devido as ligações

irreversíveis do PVA com a camada de polímero na interface (Lee e col., 1999). As

partículas preparadas com 100 mg de PHBV apresentaram 50% menos PVA residual do

que as partículas preparadas com 50 mg de PHBV.

92

Tabela 3: Quantidade de PVA residual nas micropartículas produzidas com diferentes massas de

PHBV.

Partículas µµµµg de PVA/ mg de partícula

100 mg PHBV 54,0

50 mg PHBV 101,5

B. Liberação in vitro

A liberação in vitro da BZ3 encapsulada em micropartículas de PHBV preparadas

com 50 e 100 mg de PHBV foi estudada como mostra a Figura 22, sendo observada uma

rápida liberação (burst) nas primeiras 6 horas. Neste período, foram liberados 54 % de

BZ3 encapsulada em micropartículas preparadas com 50 mg de PHBV e 27 % de BZ3

das micropartículas com 100 mg de PHBV. Após o burst, o ativo encapsulado foi liberado

em uma taxa sustentada por até 50 horas. A rápida taxa inicial de liberação do ativo está

relacionada com a quantidade de ativo adsorvida na parede das partículas. Desta forma,

as partículas preparadas com 50 mg de PHBV apresentam maior quantidade de ativo

adsorvido na parede do que as partículas preparadas com 100 mg de PHBV. Além disto,

foi observado que a quantidade de polímero adicionado na preparação das partículas

influenciou na quantidade de BZ3 liberada. A BZ3 encapsulada em micropartículas

preparadas com 100 mg de PHBV foi liberada mais lentamente do que quando estava

encapsulada em micropartículas preparadas com 50 mg. Desta forma, no mesmo

intervalo de tempo, uma maior quantidade de BZ3 foi liberada das micropartículas

preparadas com 50 mg de PHBV (Figura 22). Entretanto, o perfil de liberação de BZ3 de

ambas as partículas foi diferente da dissolução da BZ3. Este resultado indica que o

fotoprotetor está ao menos parcialmente encapsulado nas micropartículas.

93

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

% d

e B

Z3

Libe

rada

Tempo (horas)

BZ3 livre Micro de PHBV(50mg)-BZ3 Micro de PHBV (100mg)-BZ3

Figura 22: Dissolução da BZ3 livre (curva preta) e liberação da BZ3 encapsulada em

micropartículas de PHBV preparadas com 50 mg de PHBV (curva vermelha) e 100 mg de PHBV

(curva verde).

C. Avaliação do bloqueio da radiação UV e determinação do Fator de

Proteção Solar (FPS)

A avaliação do bloqueio da radiação UV foi realizada em géis de carbopol puro ou

contendo BZ3 livre ou encapsulada em micropartículas de PHBV preparadas com 50 ou

100 mg de PHBV. O FPS foi calculado segundo o item 3.7 e os resultados estão

mostrados na Tabela 4. Nesta tabela observa-se que as micropartículas com 50 mg de

PHBV apresentaram FPS maior do que o da benzofenona livre, entretanto o mesmo não

aconteceu com as micropartículas com 100 mg de PHBV. Este resultado mostra a

influência do diâmetro das partículas no espalhamento da radiação UV, já que o diâmetro

médio das partículas preparadas com 50 mg foi de 3,9 µm e das preparadas com 100 mg

foi de 5,9 µm (Liu e col., 2007). Além disto, esta diferença pode ser atribuída a maior

quantidade de BZ3 adsorvida na parede das micropartículas com 50 mg de PHBV.

94

Tabela 4: Fator de proteção solar (FPS) da BZ3 livre e encapsulada em micropartículas de PHBV.

Formulação FPS

Micropartículas com 100 mg PHBV-BZ3 13,2

Micropartículas com 50 mg PHBV-BZ3 19,4

BZ3 Livre 16,0

D. Avaliação da permeação cutânea

Foram realizados ensaios in vitro de permeação cutânea da benzofenona-3 (BZ3)

livre (n=6) e encapsulada em micropartículas de PHBV preparadas com 100 mg de PHBV

(n=6). A Figura 23 mostra a quantidade de BZ-3 retida em cada parte da pele. Nesta

figura, pode-se observar que o encapsulamento da BZ3 em micropartículas de PHBV

reduziu significativamente a sua permeação na pele. Esta redução foi de ~66% na

epiderme, ~34% na derme e ~64% no fluido receptor. Este resultado demonstra a grande

vantagem do encapsulamento da benzofenona-3 por diminuir a sua permeação cutânea e

consequentemente a sua toxicidade.

Epiderme Derme Fluido Receptor0

4

8

12

16

20

BZ3 livre Micro de PHBV-BZ3

Figura 23: Distribuição da BZ3 livre e encapsulada em micropartículas de PHBV em diferentes

partes da pele.

E. Teste in vivo de alergenicidade

95

No estudo de alergenicidade in vivo, o aumento da espessura da orelha do

camundongo (edema) acima de 10% é considerado positivo, ou seja, presença de

sensibilização cutânea. O controle positivo (oxazolona) utilizado neste experimento

induziu um aumento do edema em 65,7% e 46,1% após 24 e 48 horas, respectivamente,

enquanto que as micropartículas de PHBV-BZ3 (preparadas com 100 mg de PHBV)

apresentaram aumento da espessura da orelha inferior a 10 % tanto em 24 horas como

em 48 horas (Figura 24). Este resultado indica que as formulações com as

micropartículas de PHBV-BZ3 não apresentam sensibilização cutânea podendo ser

utilizadas em formulações cosméticas.

Carbopol gel BZ3 PHBV-BZ3 oxazole0

1

2

3

4

10

20

30

40

50

60

70

24h 48h

% d

o ed

ema

Figura 24: Aumento percentual do edema das orelhas de camundongos (n =4).

3. Carreador lipídico nanoestruturado (CLN)

BZ3 também foi encapsulada em carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN)

preparados com os lipídios sólidos CP (palmitato de cetila) e EC (ésteres cetílicos)

juntamente com o lipídio líquido triglicerídeos cáprico e caprílico. Não houve diferença

significativa no diâmetro e na eficiência de encapsulamento dos CLN com as NLS

preparadas com os mesmos lipídios como mostram a Tabela 5 e a Figura 25. Entretanto,

no caso das CLN houve um aumento do índice de polidispersidade em relação às NLS.

Este aumento pode ter sido ocasionado pela formação tanto de NLS quanto de CLN. Em

relação à estabilidade, tanto as NLS quanto os CLN mostraram estabilidade física durante

20 dias de análise como mostra a Figura 26A,B (n = 3). Entretanto, um aumento discreto

no diâmetro dos CLN foi observado neste período. Devido à alta estabilidade e alta

96

eficiência de encapsulamento das duas nanoestruturas, a continuidade dos estudos com

BZ3 foi realizada apenas com as NLS.

Tabela 5: Eficiência de encapsulamento de BZ3 em diferentes NLS e CLN.

Partículas Eficiência de Encapsulamento (%)

NLS (CP) 99,9

CLN (CP-Migliol) 99,9

NLS (EC) 99,9

CLN (EC-Migliol) 99,9

CP CP-Migliol EC EC-Migliol0

20

40

60

80

100

120

140

160

Diâ

met

ro (

nm)

0,08

0,12

0,16

0,20

0,24

0,28


dI)

Figura 25: Comparação do diâmetro e do índice de polidipersidade de NLS e CLN preparados

com diferentes lipídios.

Figura 26: Estabilidade das NLS e CLN preparadas com o lipídio sólido: A) Cetil Palmitato (CP),

B) Ésteres Cetílicos (EC).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

NLS (EC) CLN (EC-Migliol)

Diâ

met

ro (

nm)

0 1 5 12 20

Dias

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

SLN (CP) CLN (CP-Migliol)

Diâ

met

ro (

nm)

Dias

2012510

A B

97

4. Nanopartículas de PCL e nanopartículas lipídicas sólidas (NLS)

BZ3 foi encapsulada em nanopartículas de PCL e em NLS como descrito no artigo

submetido para a revista Journal of Nanoscience and Nanotechnology em 2009 e no

proceeding (615) publicado na Acta Press do Congresso Nanotechnology and

Applications, Grécia, 2008.

98

99

Artigo: Nanostructured polymer and lipid carriers for sunscreen.

Biological effects and skin permeation

Marcato, PD1,*, Caverzan, J.1, Rossi-Bergmann, B2, Pinto, E.F.2, Machado, D.3, Silva,

R.A.3, Justos, G.Z.3,4, Ferreira, C.V.3, Durán N.1

1Institute of Chemistry, Biological Chemistry Laboratory, Universidade Estadual de

Campinas, P.O. Box 6154, Campinas-SP, CEP 13083-970, Phone: (55) 19 35213042,

Fax: (55) 19 3521 3023, Brazil, 2Institute of Biophysical Carlos Chagas Filho,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil, 3Institute of Biology, Universidade

Estadual de Campinas, Brazil, 4Department of Biochemistry, Universidade Federal de São

Paulo, Brazil (*[email protected])

100

Abstract

The interest in developing new sunscreens is increasing due to the harmful effects of UV

radiation on the skin such as erythema, accelerated skin ageing (photoageing) and the

induction of skin cancer. However, many molecular sunscreens penetrate into the skin

causing photoallergies, phototoxic reactions and skin irritations. Then, the aim of this work

was the preparation and characterization of polymeric and solid lipid nanoparticles as

carriers of benzophenone-3 (BZ3) aiming to improve the safety of sunscreen products by

the increase of the sun protection factor (SPF), to decrease BZ3 skin penetration and to

decrease BZ3 concentration in sunscreen formulation. BZ3 was encapsulated in poly(ε-

caprolactone) (PCL) nanoparticles by the nanoprecipitation method and in solid lipid

nanoparticles (SLN) by the hot high pressure homogenization method. The particles were

stable for 40 days. The BZ3 encapsulated in PCL nanoparticles was released faster than

BZ3 encapsulated in SLN. The sun protector factor increased when BZ3 was

encapsulated in both nanostructures. However, BZ3 encapsulated in PCL nanoparticles

decreased its skin permeation more than SLN-BZ3. Furthermore, BZ3 encapsulated in

SLN did not exhibit cytotoxic or phototoxic effects in human keratinocytes (HaCaT cells)

and BABL/c 3T3 fibroblasts, whereas PCL nanoparticles with BZ3 showed phototoxic

potential in HaCaT cells. Nevertheless, BZ3 free and encapsulated in PCL nanoparticles

or SLN did not show allergic reactions in mice. Our results suggest that these

nanostructures are interesting carriers of sunscreen.

Keywords: Sunscreen, Benzophenone-3, Solid lipid nanoparticles, PLC nanoparticles.

101

Introduction

Photoprotection is an essential topic in daily life due to the worldwide decrease of

the ozone layer and the consequent increase in skin cancer, erythema and photoageing.1

Sunscreens were initially developed to protect against UVB radiation. In the 1990s,

compounds with UVA-absorbing ability also became available. The UVB radiation (290 to

320 nm) can cause skin burn and skin cancer and the UVA (320 to 400 nm) radiation can

cause the skin to lose elasticity and interferes with the immune system. Thus, sunscreens

with broad spectrum coverage are necessary. Due to the long-term and frequent use of

sunscreen, particular attention has been given to their efficiency and safety. Some UV

filters, e.g., benzophenone-3 (BZ3), can pass through the skin and reach the circulation

system. Janjua et al.2 studied the skin penetration of three sunscreens in humans

(benzophenone-3, octyl-methoxycinnamate and 3-(4-methylbenzylidene) camphor). In this

study all these sunscreens reached the systemic circulation, being detected in plasma and

urine within two hours after the application of 10 % of them. This characteristic may leave

the skin unprotected as well as increase the risk of phototoxic and photoallergic

reactions.3,4 Berne and Ross5 verified that 7.9 % of 355 patients exhibited 42 types of

allergic reactions when using sunscreens. Most patients were allergic to benzophenone-3.

Therefore, sunscreens with reduced concentrations of chemical UV filter, but maintaining

their effectiveness have been studied.6 Another investigated strategy is penetration

reduction of the chemical UV filter. For this, the viscosity of the sunscreen formulation can

be increased or the UV filter can be incorporated in a micro or nanostructure.4 Several

nanostructures have been studied, such as cyclodextrins, polymeric nanoparticles and

solid lipid nanoparticles.7

An important chemical UV filter is benzophenone-3 (BZ3), which exhibited a broad

absorption spectrum (UVB and UVA II region) (Figure 1). This filter is used in sunscreen in

concentrations up to 10 % alone or in combination with other UV filters. However, it has

been shown that after topical application, BZ3 reaches the circulation system and is

subsequently excreted in the urine and found in breast milk.8,2 Thus, BZ3 encapsulation

can reduce its skin permeation, as demonstrated in the literature. BZ3 was encapsulated

in modified poly(vinyl alcohol) (PVA) with fatty acids (FAs). These nanoparticles

decreased percutaneous absorption of BZ3 showing to be a good sunscreen carrier.9

102

Other nanostructures such as solid lipid nanoparticles (SLN) were investigated. Wissing

and Müller10 studied the encapsulation of BZ3 in nanostructured lipid carriers (NLC)

prepared with tripalmitate and Miglyol 812. A synergistic effect in the incorporation of

sunscreen in NCL was observed verifying that the amount of molecular sunscreen could

be decreased up to 50 % while maintaining the UV protection efficacy. Similar results were

obtained with SLN and NCL with carnauba wax.10,11 Furthermore, the photodegradation of

the sunscreen (trans-2-ethylhexyl-p-methoxycinnamate) was reduced by its encapsulation

in nanostructure (ethylcellulose and poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles) as

described by Perugini et al.12. Similar results were verified by Paese et al.13 when BZ3

was encapsulated in PCL nanocapsules. Thus, these nanoparticles associated with BZ3

can increase the protection factor and decrease its concentration in sunscreen

formulations, thereby increasing the safety of these products. Therefore, the aim of this

work was to prepare and to characterize polymeric nanoparticles with polymer PCL and

SLN with lipid cetyl palmitate containing benzophenone-3 and to evaluate its in vitro

cytotoxicity and phototoxicity and its in vivo allergenicity.

Figure 1: Benzophenone-3 structure.

Methods

Solid Lipid nanoparticles (SLN) preparation

SLN were produced by hot high pressure homogenization.14 The solid lipid (cetyl

palmitate) used was kindly donated by Croda (Brazil). The solid lipid with or without

benzophenone-3 (BZ3) was heated to around 10 oC above its melting point. Afterwards,

the mixture was added to a hot aqueous solution of Pluronic F68 under high agitation in an

Ultra-turrax T18 to form a pre-emulsion. The pre-emulsion was homogenized using a

CH3O

OH O

103

Panda 2k (Niro Soavi, Italy), applying two homogenization cycles at 600 bar and cooled to

form the SLNs.

Polymeric nanoparticles preparation

Polymeric nanoparticles were prepared by the nanoprecipitation method with

poly(ε-caprolactone) (PCL) (MW 65000 g/mol) as covering material.15 The polymer (125

mg) and BZ3 were first dissolved in acetone (25 mL). The resulting organic solution was

poured into an aqueous solution of Tween 80 (0.3%) under high agitation in an Ultra-

turrax T18. Then, the acetone was removed under reduced pressure at 30 ºC and PCL

nanoparticles were obtained.

Atomic Force Microscopy (AFM)

The morphology of the SLN and PCL nanoparticles was evaluated by Atomic Force

Microscopy (AFM) (SPM-9600, Shimadzu, Kyoto, Japan). The samples were prepared by

depositing dilute particle dispersions on freshly cleaved mica plates, followed by drying

overnight at 25 oC. The images were done in a dynamic mode, using commercial silicon

cantilevers. The resonance frequencies were 210–230 kHz.

Particle Size and Zeta Potential


by photon correlation spectroscopy (PCS) (Nano ZS Zetasizer, Malvern Instruments Corp,

UK) at 25 oC in polystyrene cuvettes with path length of 10 mm. The zeta potential was

measured in capillary cells with path lengths of 10 mm, using the Nano ZS Zetasizer.


sodium chloride.

Encapsulation efficiency

104

The encapsulation efficiency of BZ3 encapsulated in SLN and in PCL nanoparticles

was determined by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) on a Shimadzu

(CBM 20A) system with a multi-wavelength UV–VIS detector Shimadzu (SPD-20AV).16

The analysis was carried out at 25 oC on a C18 column (4.6mm × 250mm i.d., Varian) with

a similar pre-filter. The mobile phase consisted of methanol–water (80:20), filtered through

a 0.45 µm membrane filter (Millipore, USA) in the isocratic flow. The mobile phase was

continuously degassed before and during the use. The flow rate was 1.0 ml/min and the

detector was set at 380 nm. For the encapsulation efficiency determination, 500 mL of

particles dispersion were filtered in a Microcon centrifugal filter device containing

ultrafiltration membranes (MWCO 100,000, Millipore). The filtrate was assayed to

determine the concentration of the non-encapsulated drug. Encapsulation efficiency (%)

and loading capacity (LC%) were calculated using the following equations17:

(%) = (mass of BZ3 encapsulated/mass of BZ3 total) x 100

(LC%) = (mass of BZ3 in the nanoparticles/mass of particles recovered) x100

Cytotoxicity and Phototoxicity assay

The BALB/c 3T3 mouse embryo fibroblast cell line, obtained from the National

Institutes of Health (Baltimore, MD) and HaCaT human keratinocyte cell line, kindly

provided by Dr. Liudmila Kodach (Academic Medical Center, Amsterdam University), were

maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 100 U/mL

penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 10 % fetal bovine serum. Cells were grown in a

monolayer at 37 oC in a humidified atmosphere containing 5 % CO2.18 Cells (7x104 HaCaT

cells/mL) were seeded in 96-well plates and incubated for 24 h, when they formed half-

confluent monolayers. For each cell type, two plates were prepared: one for determination

of cytotoxicity (-UVA), and the other for determination of phototoxicity (+UVA). The cells

were washed twice with phosphate buffered saline (PBS), and treated with different

particles dispersion concentrations for 1 h. One plate was then exposed to a dose of 5

J/cm2 UVA (+UVA), at room temperature for 50 minutes, whereas the other plate was kept

in the dark (-UVA), under the same conditions. The radiation source was a 100 W

Bellarium S UVA lamp (Wolff System Technology Corporation; Kennesaw, GA) that has

105

the majority of its energy output between 300 and 420 nm. The emitted dose was

calculated using a UVA radiometer photodetector (Cole-Parmer Instrument Co.). At the

end of the irradiation period, cells were washed twice with PBS and incubated in culture

medium for 22 h. Cell viability was then determined by the neutral red uptake (NRU) as

described by Borenfreund and Puerner19. Control cells were treated with PBS only.

Thiourea and hematoporphyrin IX were used as negative and positive controls,

respectively. Neither cytotoxicity nor phototoxicity was observed for thiourea, whereas

hematoporphyrin presented only phototoxicity, with an IC50 value of 1.16 µmol L-1.

For prediction of phototoxic potential the concentration response curves

concurrently obtained in the presence (+UVA) and in the absence (-UVA) of UVA

irradiation were compared, usually at the IC50, as described by Spielmann et al.20

Preparation of gels containing free and encapsulated BZ3 in nanostructures

Carbopol 940® gels containing free or encapsulated BZ3 in SLN or PCL

nanoparticles were developed. At first, Carbopol gel (0.1%) with propyleneglycol (5%) was

prepared. Free BZ3 (1.6% w/w) or encapsulated BZ3 was then added to the Carbopol gel.

Sun protection factor (SFP)

Gels with free or nanoencapsulated sunscreen were dispersed in ethanol (25 mL)

to obtain a benzphenone-3 concentration of 23 µg/mL. Then, the dispersion was

homogenized in an ultrasonic bath for 5 minutes. After, the dispersion was analyzed by

UV-Vis spectroscopy (Agilent 8453). The SPF was calculated by the following equation21:

290

SPF = FC . ∑ EE (λ) . I (λ) . abs(λ)

320

where, FC = Correction factor (= 10), EE (λ) = erythematogenic effect of radiation in λ, I

(λ) = Intensity of solar light in λ, Abs (λ) = absorbance of sample in λ. The EE (λ) x I (λ)

are known and tabulated values for each wavelength.

106

Human skin permeation experiments

The studies of skin permeation were made over 24 h in a Franz diffusion cell with

human skin, donated from plastic surgery. Prior to use, the skin specimens were defrosted

and the full-thickness human skin or epidermis were then placed on Franz-type diffusion

cells, with nominal diffusion area of 2.52 cm2 and a receptor volume containing 10 mL of

phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 5% of Tween 80. Gels with BZ3 (0.5 g of

gel) of each formulation: BZ3-loaded SLN and BZ3-loaded in PCL nanoparticles, were

used. The cells were kept at 32 ºC for 24 h. After this, the BZ3 amounts were measured in

epidermis/dermis by the tapping stripping method as described in the literature15 and in

receptor fluid by HPLC.

Allergenicity assay

In this study BALB/c mice with ages between 8 and 12 weeks were used and

mouse ear swelling was evaluated (n = 4).22,13 The mice were sensitized on 3 alternating

days (D-0, D-2 and D4) by topical application of 100 µL of formulation (Carbopol gel with

free or encapsulated BZ3) on dorsal skin. The animals were challenged 5 days after the

last sensitization dose with 25 µL of formulation on each dorsum ears. Oxazolone (0.5 %)

was used as positive control. The ear thickness (ear swelling) was measured with a

micrometer (Mitutoyo, Tokyo, Japan) after 24 and 48 h of application. An increase in ear

thickness of over 10% was considered a positive result. Percent ear swelling was

calculated by the following equation:

% increase in ear thickness = [(post-treatment ear thickness - pre-treatment ear

thickness)/pre-treatment ear thickness] × 100.

Results

Table 1 shows the results of SLN and PCL nanoparticles with and without BZ3. The

preparation method of both particles (SLN and PCL nanoparticles) showed to be

reproducible. Furthermore, the polydispersity index of all particles was smaller than 0.2,

107

suggesting that these particles were homogeneous. The zeta potential of all the

preparations, was negative but SLN exhibited a superficial charge larger (-33.2 mV) than

PCL nanoparticles (-9.5 mV). This difference can be related with the surfactant type.23

However, significant changes in the size and zeta potential of both nanostructures over a

period of 40 days at 4 oC were not observed (Figure 2). This result demonstrates that

these particles are good carrier systems.

Table 1: Results of size, polydispersity index, zeta potential, encapsulation efficiency and

loading capacity of PCL and solid lipid nanoparticles.

Nanostructure Size

(nm)

Polydispersity

Index

Zeta

Potential

(mV)

Encapsulation

efficiency

(%)

Loading

Capacity

(%)

PCL

nanoparticles

Without BZ3

117.5 0.149 -9.8 - -

PCL

nanoparticles

With BZ3

137.5 0.123 -9.5 99.2 12.0

SLN

Without BZ3

133.0 0.137 -29.7 - -

SLN

With BZ3

147 0.164 -33.2 99.9 16.7

108

Figure 2: Comparative graph of particles stability at 4 ºC: PCL nanoparticles-BZ3 (white

bars and - - line) and SLN (striped bars and - - lines).

The AFM image of the PCL nanoparticles (Figure 3A) and SLN (Figure 3B) showed

homogeneous and spherical particles. The encapsulation efficiency was high (around 99

%) independent of the nanostructure. The high encapsulation efficiency is due to high

affinity between BZ3 and the covering material due to the hydrophobicity characteristic of

these materials (UV filter, lipid and polymer). The encapsulation efficiency was not

significantly altered during 40 days after the preparation. This result shows that BZ3 was

not expulsed from the particles in this period.

Figure 3: A) AFM topographic image of PCL nanoparticles (scan area 1.5 x 1.5 µm2), B)

AFM topographic image of SLN (scan area 2.50 x 2.50 µm2).

In vitro release

0 10 20 30 40 500

25

50

75

100

125

150

Time (days)

Siz

e (n

m)

0,00

0,08

0,16

0,24

0,32

Polydispersity index

13.20[nm]

0.001.00 um 2.50 x 2.50 um

B

6.13[nm]

0.00500.00 nm 1.50 x 1.50 um

A

109

In the in vitro release study it was observed that BZ3 encapsulated in PCL

nanoparticles was released faster than BZ3 encapsulated in SLN (Figure 4). This

difference can be due to differences in nanoparticle crystallinity. Low crystallinity in the

particles can lead to an enhanced rate of release due, probably, to less resistance to drug

diffusion from the nanoparticles.24,25 Furthermore, both release profiles (BZ3 in PCL

nanoparticles and in SLN) were different from BZ3 dissolution, demonstrating that the BZ3

was inside the particles.

Figure 4: Release profile of: free BZ3 (- - - -), PCL-BZ3 ( ) and SLN-BZ3 (- -).

Phototoxicity assay

The photo-irritancy factor (PIF) can be calculated only if the concentration-response

curves obtained in the presence and the absence of UV-light drop below 50% of the

controls, because only in these cases two IC50 values (-UVA and +UVA) can be

determined with a cut-off value of PIF = 5 for phototoxic potential.20

PCL nanoparticles did not show phototoxic potential in 3T3 and HaCaT cells, as

predicted by the PIF values of 1.0 and 1.3, respectively (Figures 5A,B). In 3T3 cells, no

phototoxic potential was also predicted for BZ3 encapsulated in PCL nanoparticles, as a

PIF value of 4.0 was obtained (Figure 5A). In contrast, in HaCaT cells an IC50 value for

encapsulated BZ3 was only obtained in the presence of UVA (410 µmol L-1) (Fig. 5B).

When a chemical is only cytotoxic +UVA and is not cytotoxic when tested -UVA, the PIF

cannot be calculated, although this is a result indicating phototoxic potential. In these

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

SLN-BZ3

PCL-BZ3

Free BZ3

% B

Z3

Rel

ease

Time (hours)

110

cases, the highest test concentration [Cmax (-UVA)] is used for calculation of the > PIF, and

a “> PIF” value >1 predicts phototoxic potential. This value is calculated by the following

equation:

)(

)(

50

max

UVAIC

UVACPIF

+

−=

Therefore, BZ3 encapsulated in PCL nanoparticles presented a phototoxic potential

in HaCaT cells as predicted by the “> PIF” value of 1.4.

In the case of BZ3 encapsulated in SLN, both IC50 (-UVA) and IC50 (+UVA) could

not be calculated due to the fact that the test samples did not show any cytotoxicity up to

the highest test concentrations in 3T3 and HaCaT cells (Figure 5C,D). This result shows

that SLN, with or without BZ3, can be used in cosmetic formulations without phototoxic

effects when exposed to UV radiation or cytotoxicity, as indicated by tests with the BALB/c

3T3 fibroblast and HaCaT human keratinocyte cell lines.

111

Figure 5: Cytotoxicity (gray bars) and phototoxicity (white bars) of: A) 3T3 cells treated

with PCL nanoparticles, B) HaCaT cells treated with PCL nanoparticles, C) 3T3 cells

treated with SLN, D) HaCaT cells treated with SLN.

Skin permeation

In the skin permeation study it was observed that BZ3 encapsulation decreased its

penetration into the skin. PCL nanoparticles decreased BZ3 skin permeation by 70 % in

the epidermis and dermis and 80 % in the receptor fluid. However, the skin permeation of

SLN-BZ3 was not significantly different from free BZ3 (Figure 6). This difference can be

due to particle flexibility. Borgia et al.26 verified that SLN increased the skin permeation of

nile red dye more than CLN. Bhalekar et al.27 also observed also that SLN enhanced skin

permeation of miconazole nitrate. However, the sun protector factor (SPF) was higher

when BZ3 was encapsulated in SLN than in PCL nanoparticles. The SPF of BZ3 was 16

while the SPF of BZ3 encapsulated in PCL nanoparticles and SLN were 18 and 21,

respectively. This synergistic effect is due to particle crystallinity. Particles with high

0

20

40

60

80

100

120

Cel

lula

r V

iabi

lity

(% o

f con

trol

) Phototoxicity Cytotoxicity

C 11.6 66 108.5 542.5 1085 C 6 34 56 280 560

PCL PCL-BZ3 C 11.6 66 108.5 542.5 1085 C 6 34 56 280 560

PCL PCL-BZ3

0

20

40

60

80

100

120

Cel

lula

r V

iabi

lity

(% o

f con

trol

)

Phototoxicity Cytotoxicity BA

C

0

20

40

60

80

100

120

140

SLN-BZ3 (µmol/L)SLN (µg/mL)280892 1790 56034108 179 56618C

Cel

lula

r V

iabi

lity

(% o

f con

trol

)

Phototoxicity Cytotoxicity

0

20

40

60

80

100

120

140

SLN-BZ3 (µmol/L)SLN (µg/mL)892 280 5601790108 34 56179 618C

Cel

lula

r V

iabi

lity

(% o

f con

trol

)

Phototoxicity Cytotoxicity D

112

crystallinity are able to scatter/reflect more incoming UV radiation increasing the SPF

more.11 This result is in agreement with release profile of BZ3 encapsulated as discussed

above. Therefore, it is possible to use less BZ3 while maintaining the same SPF. In this

case, a safer sunscreen formulation can be obtained.

Figure 6: Skin permeation of BZ3 free (squared bars) and encapsulated in SLN (white

bars) and in PCL nanoparticles (striped bars).

Allergenicity assays

In the study of allergenicity using mouse ear swelling it was observed that after

three topical applications in three alternate days, all formulations (Carbopol gel with BZ3

free or encapsulated in PCL nanoparticles or SLN) exhibited less than 10 % of ear

swelling after 24 hours and 48 hours, while oxazolone (as positive control) exhibited 65.7

% increased swelling after 24 hours and 46.1 % after 48 hours (Figure 7). This result

demonstrated that all formulations did not induce cutaneous sensitivity, indicating that they

can be used in cosmetic products. Similar results were described in the literature with

PCL nanocapsules with BZ3.13

Epidermis Dermis Receptor Fluid0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Ret

aine

d A

mou

nt (

µg/

cm2 )

Free BZ3 SLN-BZ3 PCL-BZ3

113

Figure 7: Increase in ear thickness at 24 h (white bars) and 48 h (striped bars) post

application of formulation (Carbopol Gel, free BZ3 in Carpobol gel (Free BZ3), BZ3

encapsulated in PCL nanoparticles or SLN, both in Carbopol gel).

Conclusion

SLN and PCL nanoparticles were homogeneous and spherical as observed by

atomic force microscopy and scanning electron microscopy. In 40 days, the SLN and PCL

nanoparticles size as well as the encapsulation efficiency changed slightly, showing the

relative long-term stability of these particles. The encapsulation efficiency of BZ3 in the

nanoparticles was high (around 99%) independent of the particle type. The BZ3

encapsulation in PCL nanostructure decreased its skin permeation more than SLN-BZ and

both nanostructures increased the sun protector factor. Therefore, BZ3 will be on the

surface of the skin for a longer time where it is intended to act with larger SPF.

BZ3 encapsulated in PCL nanoparticles showed phototoxic potential only in HaCaT

cells while BZ3 encapsulated in SLN did not exhibit any toxic effects up to the highest test

concentrations in both cell types (3T3 and HaCaT). Furthermore, the BZ3 free or

encapsulated in PCL nanoparticles or SLN did not show allergic reactions in mice.

Our results suggest that these nanoparticles are interesting carriers of sunscreen

as demonstrated by the good stability, lower toxicity, lack of phototoxic effect in cells and

no allergic reaction in mice. In addition these particles, due to their crystallinity, can

scatter/reflect incoming UV radiation, increasing the SPF.

Carbopol gel BZ3 SLN-BZ3 PCL-BZ3 oxazole0

10

20

30

40

50

60

70

% o

f sw

ellin

g ea

r

24h 48h

114

Acknowledgements

Support from CNPq, FAPESP, the Brazilian Nanobiotechnology Network

(MCT/CNPq) and Brazilian Nanocosmetic Network (MCT/CNPq) are acknowledged.

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116

117

Proceeding: Solid lipid nanoparticles as sunscreen carrier system and

its toxicity in zebrafish embryos

Marcato, P.D.1,*; Adami, L.F.1; Caverzan, J.1; Huber, S.C.1, Misset, T.2; den Hertog, J.2;

Ferreira, C.V.2; Durán, N.1

1 Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, P.O. Box 6154, Campinas-

SP, CEP 13083-970, Brazil, 2Hubrecht Institute, Uppsalalaan 8, 3584, Utrecht, The

Netherlands. 3Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Brazil,

*e-mail: [email protected]

ABSTRACT

The interest in developing the new sunscreens is been increasing in the last years due to

the harmful effects of UV radiation on the skin such as erythema, accelerated skin ageing

(photoageing) and the induction of skin cancer. In this way, nanostructures have being

used in sunscreen formulation. Submicron emulsions, nanospheres, nanocapsules,

liposomes and solid lipid nanoparticles are some of the nanostructures applied in

sunscreen. The aim of this work was preparation and characterization of the solid lipid

nanoparticles as carrier of the benzophenone-3 (sunscreen) with the main goals to reduce

the penetration of this sunscreen into the skin and its effective concentration.The

benzophenone-3 was encapsulated in solid lipid nanoparticles by hot high pressure

homogenization method. The particles were characterized in terms of morphology,

encapsulation efficiency and in vivo toxicity by Zebrafish embryos as a model.

KEY WORDS

Solid lipid nanoparticles, sunscreens, toxicity, Zebrafish embryos.

118

1. Introduction

Sunscreen products are widely used to protect the skin against the harmful effects of

exposure to UV radiation. Sunscreen with broad spectrum against UVA (320–400 nm) and

UVB (290–320 nm) irradiation and with high protection factor (more than 15) are protective

against many of the acute and chronic effects of UV irradiation, including erythema,

photoageing and skin cancer [1]. Due to the long-term and frequent use, particular

attention has being given to their efficiency and safety. Some UV filters, e.g.

benzophenone-3, could pass through the skin and reach the systemic circulation. This

characteristic may leave the skin unprotected as well as increase the risk of phototoxic

and photoallergic reactions [2,3]. Benzophenone-3 is an UV filter used in sunscreen in

concentrations of up to 10 % alone or in combination with other UV filters [4]. In human

volunteers, it has demonstrated that the benzophenone-3 is systemically absorbed after

topical application and subsequently excreted in the urine and breast milk. Several

strategies have been investigated to reduce the skin penetration of this UV filter, for

instance, an increase of the formulation viscosity, incorporation of the UV filter in

nanoparticles or complexation with cyclodextrins [3]. Benzophenone-3 was encapsulated

in modified poly(vinyl alcohol) (PVA) with fatty acids (FAs). These nanoparticles

decreased percutaneous absorption of benzophenone-3 by the skin, showing to be a good

system to carry sunscreen [5]. Other nanostructures investigated were the solid lipid

nanoparticles (SLN). In addition, these nanoparticles are being investigated as physical

filters to sunscreen due to their crystalline properties and their ability of

scattering/reflecting UV radiation. Wissing and Müller [6] studied the encapsulation of

benzophenone-3 in nanostructured lipid carriers (NLC) prepared with tripalmitate and

Miglyol 812. A synergistic effect in the incorporation of sunscreen in NCL was observed,

verifying that the amount of molecular sunscreen could be decreased up to 50 % while

maintaining the UV protection efficacy. Similar results were obtained with SLN [7].

Furthermore, the photodegradation of the sunscreen was also reduced by its

encapsulation in nanostructure as described by Perugini et al. [8]. Thus, these

nanoparticles associated with benzophenone-3 (BZ) can increase the protection factor

and decrease the benzophenone-3 concentration in sunscreen formulation and increase

the safety of these products. Therefore, the aim of this work was to prepare and to

119

characterize SLNs with cetyl esters containing benzophenone-3 and to evaluate its in vivo

toxicity in zebrafish embryos.

2. Methods

Solid Lipid nanoparticles (SLNs) preparation

SLNs were produced by hot high pressure homogenization. The solid lipid (cetyl

esters) used was kindly donated by Croda (Brazil). The solid lipid cetyl esters with or

without benzophenone-3 (BZ) was heated to around 10 oC above its melting point (47 oC).

After, the mixture was added in the hot aqueous solution of Pluronic F68 under high

agitation (6.000 rpm) to form a pre-emulsion. The pre-emulsion was homogenized using a

Panda 2k (Niro Soavi, Italy), applying two homogenization cycles at 600 bar and cooled to

form the SLNs.

Nanoparticles Characterization

Atomic force microscopy (AFM)

The morphology of the SLN was evaluated by Atomic Force Microscopy (AFM) (SPM-

9600, Shimadzu, Kyoto, Japan). The samples were prepared by depositing diluted SLN

dispersion on freshly cleaved mica plates, followed by drying overnight at 25 oC. The

images were done in a dynamic mode, using commercial silicon cantilevers and the

resonance frequencies were 210–230 kHz.

Particle Size and Zeta Potential


by photon correlation spectroscopy (PCS) (Nano ZS Zetasizer, Malvern Instruments Corp,

UK) at 25 oC in polystyrene cuvettes with path length of 10 mm. The Zeta Potential was

measured in capillary cells with path length of 10 mm, using the Nano ZS Zetasizer.

120


sodium chloride.

Differential Scanning Calorimetry (DSC)

Differential scanning calorimetry (DSC) was performed on DSC-Q10 (TA instruments).

A heating rate of 10oC/min in the temperature range from -20 oC to +70 oC was employed.

An empty aluminum pan was used as reference standard. Analysis was carried out under

nitrogen purge. The recrystallization index (RI) was calculated as describe by Liu et al. [9]:

RI (%) = EnthalpySLN dispersion × 100

Enthalpybulk materials ×Concentrationlipid phase

Encapsulation efficiency

The encapsulation efficiency of benzophenone-3 encapsulated in SLN was determined

by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) on Shimadzu (CBM 20A) with multi-

wavelength UV–VIS detector Shimadzu (SPD-20AV). The analysis was carried out at 25 oC on a C18 column (4.6mm × 250mm i.d., Varian) with a pre-filter. The mobile phase

consisted of methanol–water (80:20), filtered through a 0.45 µm membrane filter (Millipore,

USA) in isocratic flow. The mobile phase was continuously degassed before and during

the use. The flow rate was 1.0 ml/min and the detector was set at 380 nm. SLN was

filtrated in a Microcon centrifugal filter device containing ultrafiltration membranes (MWCO

100,000, Millipore). An aliquot of the above suspension was added to the sample reservoir

and centrifuged during 10 min at 7.300 rpm. The filtrate was assayed to determine the

concentration of the non-encapsulated drug.

Toxicity Assay

The toxicity of SLN and SLN-BZ was evaluated in vivo by using zebrafish embryos as

a model. In this experiment zebrafish embryos were collected and arrayed by pipette, five

embryos per well, in 12-well plates containing 2 mL embryo medium (60 mg/L sea salt).

121

Test compounds (BZ and SLNs) were added to the embryo medium from 6 to 48 h post

fertilization (hpf) (42 h exposure). The effects of SLN and SLN-BZ on the zebrafish were

followed by observation under the microscope and the phenotype evaluation was carried

out after dechorionating by forceps.

3. Result and Discussion

The SLN and SLN-BZ sizes were 149 nm and 155 nm, respectively. The polydispersity

index was smaller than 0.2 in the both cases, suggesting that these particles were

homogeneous. There was no significant change in the particle surface charge when we

compared SLN (-37.2 mV) with SLN-BZ (-41.1 mV). The effect of storage time on the size

distribution of the SLNs was studied over a period of 50 days at 4 oC. The Figure 1 shows

the mean PCS particles diameter. The slight change with storage time was observed in

this Figure. This result showed that the SLN produced with cetyl esters were stable and

homogeneous, demonstrating to be a good carrier system.

Comparing to SLNs, we observed an increase in the SLN-BZ particle size. This result

confirms the presence of benzophenone-3 in these particles. The encapsulation efficiency,

measured by HPLC, was 98%. This efficiency was no significantly altered during 50 days

after the preparation.

0 10 20 30 40 500

40

80

120

160

Siz

e (n

m)

Days

SLN SLN-BZ

Figure 1: Stability of SLN and benzophenone-3 loaded SLN on particle diameter at 0, 5,

25, 30 and 50 days.

Homogeneous and spherical particles were observed in the AFM analysis as shown in

the Figure 2.

122

Figure 2: AFM images of SLN-Benzophenone-3: A) topographic image and B) 3D

representation of the topography (Scan area was 1.25 x 1.25 µm2).

DSC analysis showed that the crystallization behaviour of SLN differs from the bulk

lipid. The DSC heating curves of the SLN were broadened and the melting point was

smaller compared to the lipid bulk (Figure 3, Table 1). This reduction can be explained by

the colloidal dimensions of the particles in the nanometer range, by their high specific

surface area, known as Kelvin effect, and by the presence of surfactant [10]. The

broadening of the heating peak and the reduction of the melting point indicate an

increased number of lattice defects [11].

Table 1: Melting parameters and recrystallization index (RI) of lipid and SLN.

Material Enthalpy

(J/g)

Melting

Point (oC)

RI (%)

Lipid 137,6 50,2 100

SLN 84,51 49,3 76,8

18.83[nm]

0.00500.00 nm 1.25 x 1.25 um

A B

123

20 40 60 80

Temperature (oC)

Endo

SLN

Lipid

Figure 3: Differential Scanning Calorimetry curves of bulk lipid and solid lipid

nanoparticles (SLN).

The zebrafish is emerging as a versatile model system for analyzing the a broad

spectrum of substances including nanoparticles [12,13]. Toxicity study indicated the death

of all embryos when benzophenone-3 was tested in the concentrations of 30, 50 and 500

µM. Importantly the SLN-BZ did not exhibit any toxic effect even when benzophenone-3

concentration was 550 µM, and no developmental alterations of zebrafish were observed.

These results indicated a reduction of the potential for skin damage induced by

encapsulated benzophenone-3 in SLN.

Figure 4: Representative micrograph of zebrafish embryo, after dechorionating, used in

the toxicity assays.

4. Conclusions

SLNs produced with cetyl esters were homogeneous and spherical as observed by

atomic force microscopy. In 50 days, the SLN size and encapsulation efficiency changed

slightly showing relative long-term stability of these particles. The encapsulation efficiency

124

of benzophenone-3 in the nanoparticles was high (98 %) and the SLN size increased

when benzophenone-3 was encapsulated. DSC measurements suggested that

triglycerides are in the β form in SLN and an increased number of lattice defects were

indicated by the alteration in the heating peak and in the melting point. Furthermore, this

nanostructure decreases the risks of skin damage provoked by benzophenone-3 as

suggested by the toxicity assays in zebrafish embryos. Our results suggest that these

nanoparticles are interesting carriers of sunscreen as demonstrated by the good stability

and lower toxicity. In addition the fact that these SNLs can be produced in large scale and

the crystalline of the nanoparticles can scatter/reflect incoming UV radiation, also indicated

the potential of these nanoparticles in the cosmetic area.

Acknowledgements

Thanks to CNPq, FAPES and Nanocosmetics Network MCT/CNPq for financial

supports.

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125

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126

5. Análise de Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC)

Foi realizada uma análise de DSC de todos os lipídios estudos neste trabalho e do

estabilizante como mostra a Tabela 6. A partir dos dados de fusão dos lipídios foram

selecionadas as temperaturas de preparação das NLS sendo utilizado 10 oC acima da

temperatura de fusão do lipídio.

Tabela 6: Temperatura de fusão e de cristalização dos lipídios e do estabilizante utilizado

na preparação das nanopartículas lipídicas sólidas.

Material Tf (oC) Tc (

oC)

Palmitato de cetila 55,3 44,5

Ésteres cetílicos 50,2 40,2

Ácido Esteárico 61,5 49,8

Pluronic F68 54,8 34,6

A analise de calorimetria diferencial de varredura também foi realizada com as NLS

preparadas com o lipídio palmitato de cetila (PC). A Figura 27 mostra os termogramas

obtidos neste estudo. Os valores de temperatura de fusão dos materiais utilizados na

preparação das NLS assim como de entalpia e o índice de recristalização (IR) estão

descritos na Tabela 7. Nesta tabela observa-se que houve uma redução da temperatura

de fusão das NLS comparado com o lipídio puro. Esta redução pode ser explicada pelo

reduzido diâmetro das partículas na faixa nanométrica, pela alta área superficial e pela

presença de estabilizantes (Suresh e col., 2007). Kelvin verificou que pequenas partículas

isoladas apresentam uma redução da temperatura de fusão em relação ao material puro.

Isto é conhecido como pré-fusão. De acordo com a equação de Gibbs-Thomson, a

diminuição do ponto de fusão é proporcional a curvatura 1/r da nanopartículas esférica e

ao calor latente de fusão ∆Hm (Jesser e col., 2004, Suresh e col., 2007). Além disso,

observa-se na Tabela 6 uma redução do índice de recristalização (IR) das NLS em

relação ao lipídio puro indicando que uma fração do lipídio não está completamente

cristalizada. O índice de recristalização (IR) tem efeito na estabilidade das dispersões de

NLS (Liu e col., 2007). Em geral, dispersões com alto IR mostraram acelerado

crescimento do diâmetro das partículas com o tempo (baixa estabilidade). Enquanto que

127

dispersões de NLS com baixo IR apresentaram alta estabilidade física (Freitas e Müller,

1999). Desta forma, quanto menor o IR maior será a estabilidade das partículas.

O pico endotérmico da BZ3 não apareceu no termograma das NLS. A ausência

deste pico pode estar relacionada com a modificação polimórfica da BZ3 vista que este

ativo pode estar nas formas polimórfica mais estável α ou menos estável β e

adicionalmente pode existir na forma vítrea X (Davydova e col., 2000). Duas rampas de

aquecimento e resfriamento da BZ3 livre foram realizadas. Neste estudo foi observado

um pico endotérmico em ~ 64 ºC apenas na primeira rampa de aquecimento sendo que

na segunda rampa de aquecimento não foi verificado nenhum pico endotérmico. Desta

forma a ausência do pico endotérmico da BZ3 no termograma das NLS não pode ser

atribuída a BZ3 monodispersa nas NLS, mas sim devido a suas formas polimórficas.

Figura 27: Termogramas do: A) lipídio palmitato de cetila (curva preta), Pluronic F68 (curva

vermelha) e benzofenonana-3 (BZ3) (curva azul), B) NLS com BZ3 (curva laranja) e do lipídio

palmitato de cetila (curva preta).

20 30 40 50 60 70 80

T (oC)

Endo

Lipídio puro

NLS-BZ3

20 30 40 50 60 70 80

T (ºC)

Endo

BZ3

Pluronic F68

Lipídio puro

A B

128

Tabela 7: Valores de temperatura de fusão, entalpia e índice de recristalização (IR) dos materiais

utilizados na preparação das NLS.

Material Tf (oC) Entalpia (J/g) IR (%)

Palmitato de cetila 55,3 182,7 100

Pluronic F68 54,8 - -

BZ3 64,2 - -

NLS-BZ3 54,0 114,6 78,4

6. Citotoxicidade em fibroblastos V-79

O encapsulamento da BZ3 em NLS de palmiltato de cetila diminuiu tanto a sua

citotoxicidade lisossomal (ensaio de vermelho neutro-VN) como a mitocondrial (ensaio de

MTT). O IC50 da BZ3 livre foi de 107 µM e 580 µM para os ensaios de MTT e VN,

respectivamente. Entretanto, a BZ3 encapsulada em NLS exibiu IC50 de 1000 µM para o

ensaio de MTT e de 970 µM para o ensaio de VN. Portanto, o encapsulameto da BZ3 em

NLS reduziu a citotoxicidade lisossomal da BZ3 em ~40% e a mitocondrial em ~90%

demonstrando uma grande vantagem deste encapsulamento.

7. Estudo de AFM da pele

Foi realizado um estudo preliminar com a pele humana antes e após e experimento

de permeação cutânea em célula de difusão de Franz. Este estudo foi realizado com as

NLS-BZ3 para verificar a distribuição das partículas sobre a pele após 24 horas de

experimento. As Figuras 28 e 29 mostram as imagens de AFM da pele antes e após o

experimento de permeação cutânea, respectivamente.

Na Figura 28 observa-se que a pele humana é irregular e com a presença de

poros como mostrado na imagem de contraste de fase (Figura 28C). Na Figura 29

129

observa-se que as NLS não estão homogeneamente distribuídas na pele devido,

provavelmente a maneira de passar o creme com NLS no experimento de célula de

difusão de Franz. Além disso, observa-se que estas se aglomeraram formando um filme

sobre a pele (Figura 29 E,F). A formação deste filme é importante na minimização da

perda de água transepidermal aumentando dessa forma a hidratação da pele e

consequentemente minimizando o envelhecimento precoce (Wissing e Müller, 2003).

Figura 28: Imagem de AFM: A) e B) Representação em 3D da topografia de pele humana, C)

Imagem de contraste de fase da pele humana.

2.41[V]

-2.481.00 um 3.00 x 3.00 um

Pele Humana

A B

C

130

Figura 29: Imagem de AFM: A), C) e E) Representação em 3D da topografia de pele humana

após experimento de permeação cutânea com NLS-BZ3, B) D) e F) Imagem de contraste de fase

da pele humana após experimento de permeação cutânea com NLS-BZ3.

-0.51[V]

-5.352.00 um 5.00 x 5.00 um

Pele Humana com SLN 22/09/07

A B

-1.38[V]

-5.361.00 um 2.50 x 2.50 um


CD

E

2.01[V]

-2.29500.00 nm 1.25 x 1.25 um


F

131

Capítulo 3 – Nanopartículas de Prata

132

133

1. Produção de Nanopartículas de Prata

A produção das nanopartículas de prata foi realizada pelo método biossíntético

utilizando o fungo Fusarium oxysporum. A Figura 30 mostra a imagem de uma cultura do

fungo F. oxysporum (cepa 07D) em placa de petri.

Figura 30: Imagem fungo do F. oxysporum (cepa 07D) em meio sólido.

Os resultados iniciais de produção e impregnação das nanopartículas de prata em

tecidos estão descritos no artigo publicado na revista Journal of Biomedical

Nanotechnology em 2007.

134

135

Artigo

136

137

138

139

140

141

Na continuação do trabalho, duas concentrações de nitrato de prata foram

estudadas: 10-2 e 10-3 M. Nos dois casos houve a formação das nanopartículas de prata

sendo que a banda de absorção de plasmon (~440 nm) foi mais intensa nas preparações

com 10-2 M. Além disto, a reprodutibilidade da formação das partículas foi maior no caso

das preparações com 10-2 M. Por este motivo, foi utilizado a concentração de 10-2 M de

nitrato de prata.

O diâmetro médio, medido por TEM, para as nanopartículas de prata preparadas

com 10-3 M de nitrato de prata foi de 9,0 ± 2,2 nm e para as partículas preparadas com

10-2 M foi de 7,3 ± 3,0 nm. A Figura 31 abaixo mostra as imagens de microscopia de

transmissão das nanopartículas de prata preparadas com as diferentes concentrações de

nitrato de prata. Nesta Figura pode-se observar que as partículas são esféricas e

homogêneas, independente da concentração de nitrato de prata utilizada.

O diâmetro e o potencial zeta das nanopartículas de prata preparadas com 10-2 M

de nitrato de prata foi avaliado por espectroscopia de espalhamento dinâmico de luz

(DLS). Nesta análise, o diâmetro das nanopartículas foi de 41,7 nm e o índice de

polidispersidade foi de 0,42. O diâmetro medido por DLS foi maior que o diâmetro medido

por TEM, pois na técnica de DLS o diâmetro medido é o raio hidrodinâmico. Este raio

inclui as partículas e a capa de estabilização das mesmas que, no caso das

nanopartículas de prata, se refere à capa protéica (Durán e col, 2007). Desta forma, o

diâmetro medido é maior que o diâmetro real das partículas. O potencial zeta foi negativo

com valor de -20 mV. A presença de carga na superfície da partícula, juntamente com a

presença de proteína ao redor das mesmas, confere a estas partículas uma alta

estabilidade por até 1 ano (período que foi analisado).

142

Figura 31: Imagem de TEM das nanopartículas de prata preparadas com: A) e B) 10-2 M de nitrato

de prata, C) e D) 10-3 M de nitrato de prata.

2. Concentração Inibitória Mínima (CIM)

O efeito antimicrobiano das partículas preparadas pelo método biossintético (nano

de Ag biológica) foi comparado com nanopartículas de prata de 4 nm de diâmetro

preparadas pelo método químico (borohidreto de sódio) (nano de Ag química). A Tabela 8

mostra os valores da CIM dos dois tipos de partículas de prata. Nesta tabela pode ser

observado que as nano de Ag biológicas apresentaram baixa CIM frente a todas as

bactérias, inclusive contra as cepas resistentes de S. aureus. Além disto, as CIMs das

nano de Ag química foram mais altas que as CIMs das nano de Ag biológicas. Este

resultado demonstra a alta eficiência antimicrobiana das nanopartículas de prata

produzidas pelo método biológico. Como ambas as partículas (nano Ag biológica e

química) possuem o mesmo formato (esférico) e diâmetros similares, esta diferença na

atividade antimicrobiana pode estar relacionada com a capa de estabilização das

A B

C D

143

partículas. As nano de Ag biológicas possuem uma capa de estabilização de proteínas do

fungo, enquanto que as nano de Ag química possuem uma capa de polivinil pirrolidona.

Kora e col. (2009) demonstrou a influência da capa de estabilização nas nanopartículas

de prata na atividade antimicrobiana. Os autores verificaram que as nanopartículas de

prata estabilizadas com SDS apresentaram maior efeito antimicrobiano contra a bactéria

P. aeruginosa comparadas às outras nanopartículas de prata estabilizadas por outros

agentes estabilizantes como o citrato. Entretanto, o efeito das proteínas do fungo na

atividade antimicrobiana precisa ser investigado com mais detalhes.

Tabela 8: Valores de concentração inibitória mínima (CIM) de nanopartículas de prata produzidas

pelo método biológico e químico frente a diversas bactérias.

Bactéria CIM de Nano Ag

biológica (µg/mL)

CIM de Nano Ag

química (µg/mL)

S. aureus (ATCC 05923) 1,87 15

S. aureus (ATCC 29213) 3,75 15

S. aureus (HC562) 3,75 30

S. aureus (Rib1) 3,75 30

S. aureus (BEC 9393) 1,87 15

S. epidermidis (ATCC 12228) 0,94 7,5

Bacillus subtilis

(ATCC 6633) 1,87 30

E. coli (ATCC 25923) 1,87 30

Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) 0,94 7,5

Salmonella enterica (LT2) 3,75 15

3. Curva tempo-morte

A curva tempo-morte foi realizada inicialmente com uma concentração 2 vezes

maior que a CIM. Entretanto, esta concentração não foi suficiente para manter o efeito

antibacteriano. Inicialmente, houve significativa inibição do crescimento bacteriano,

porém, em 10 horas, as bactérias voltaram a crescer, e em 24 horas o número de

colônias foi igual ao do controle. Este resultado demonstra que em 24 horas não havia

144

mais efeito antimicrobiano das nanopartículas de prata. Em vista desse resultado, foi

utilizada uma concentração de nanopartículas de prata 8 vezes maior que a CIM. A

Figura 32 mostra as curvas tempo-morte para as diferentes bactérias. Nesta figura,

observa-se que para todas as bactérias testadas houve uma diminuição expressiva no

número de colônias ao se utilizar as nanopartículas de prata. Entretanto, algumas

bactérias apresentaram particularidades quando se analisou a curva. No experimento

com nanopartículas de prata frente a bactéria S. Epidermidis, foi observado inibição do

crescimento bacteriano no começo mas, em 24 horas, o número de colônias começou a

aumentar. Porém, o número de colônias foi menor que o controle, demonstrando

atividade antimicrobiana. No caso das bactérias E. coli e Salmonella tythimurium, foi

observado um leve crescimento bacteriano após 10 horas, porém ainda foi observada

atividade bacteriana. Entretanto, com a bactéria S. aureus foi observado inibição durante

todo o período do experimento demonstrando maior eficiência frente a esta bactéria

(Figura 32). Provavelmente, no caso das bactérias S. epidermis, E. coli e Salmonella

tythimurium uma concentração maior de prata inibiria o crescimento bacteriano com o

tempo.

145

Figura 32: Curva de tempo-morte de: A) S. aureus, B) S. epidermidis,C) E. coli, D) Salmonella

tythimurium.

4. Impregnação de nanopartículas de prata em diferentes tecidos

A impregnação de nanopartículas de prata foi realizada em três tipos diferentes de

tecidos: algodão, poliéster e tecido para curativo da 3M.

A Figura 33 mostra o espectro de EDS e uma imagem de elétrons retroespalhados

do tecido de algodão contendo nanopartículas de prata. Nesta figura, observa-se a

presença do pico de prata confirmando a impregnação das partículas na fibra dos tecidos.

Além disto, observa-se na imagem de MEV um aglomerado de nanopartículas de prata na

fibra do algodão (regiões mais claras).

0

2

4

6

8

10

12

14 Nano de Ag Controle

2414107520

log

de U

FC

Tempo de incubação (h)

A

0

2

4

6

8

10

12

14

log

de U

FC

2414107520


Nano de Ag Controle

B

0

2

4

6

8

10

12

14

2414107520


log

de U

FC

Nano de Ag Controle

C

0

2

4

6

8

10

12

14

2414107520


log

de U

FC

Nano de Ag Controle

D

146

Figura 33: A) Espectro de EDS, B) Imagem de elétrons retroespalhados do tecido de algodão

contendo nanopartículas de prata.

A Figura 34 mostra as imagens de elétrons retroespalhados dos diferentes tecidos

impregnados 2 e 4 vezes com nanopartículas de prata. Nestas imagens, as regiões claras

referem-se aos aglomerados de nanopartículas de prata que estão distribuídos sobre a

fibra. Em todos os tecidos foi observada a presença de prata aderida nas fibras

independente do número de passagens (2 ou 4x) como mostra a Figura 34. Entretanto,

no caso do tecido de algodão, uma maior quantidade de nanopartículas de prata foi

observada quando este tecido foi impregnado por 4 vezes. Esta diferença pode estar

relacionada com a estrutura da fibra do tecido de algodão que favoreceu a impregnação

das partículas com o aumento do número de passagens.

Após a impregnação e secagem dos tecidos, foi observado diferença na coloração

entre a parte central e as extremidades dos mesmos indicando uma possível

heterogeneidade na distribuição das partículas impregnadas. Para avaliar

microscopicamente esta diferença, a parte central e as extremidades dos tecidos foram

avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A Figura 35 mostra as imagens

de elétrons retroespalhados dos tecidos impregnados 2 x com nanopartículas de prata.

Nesta figura, pode-se observar que não há diferença significativa na quantidade de prata

na região central e nas extremidades dos tecidos. O mesmo resultado foi observado com

os tecidos impregnados 4 x. Este resultado demonstra que o método padding

proporcionou uma distribuição homogênea das nanopartículas nos diferentes tecidos.

A B

147

Figura 34: Imagens de elétrons retroespalhados dos tecidos de: A) Algodão (2 passagens), B)

Algodão (4 passagens), C) Poliéster (2 passagens), D) Poliéster (4 passagens), E) 3M (2

passagens), F) 3M (4 passagens).

A B

C D

E F

148

Figura 35 Imagens de elétrons retroespalhados dos tecidos de: A) Algodão (parte central), B)

Algodão (extremidade), C) Poliéster (parte central), D) Poliéster (extremidade), E) 3M (parte

central), F) 3M (extremidade).

5. Avaliação das propriedades antimicrobianas em diferentes tecidos

A B

C D

E F

149

Inicialmente, foi realizado o estudo antimicrobiano com os tecidos impregnados 2 e

4 vezes com nanopartículas de prata. Neste ensaio foi avaliada a parte central dos

tecidos (clara) e a parte terminal (escura) para avaliar a homogeneidade das partículas

nos tecidos. A Tabela 9 mostra os resultados deste estudo. Nesta tabela pode-se

observar que, exceto para o tecido para curativo da 3M testado com S. aureus, não houve

diferença significativa no halo de inibição entre 2 e 4 passagens. Além disto, não foi

verificada diferença significativa nos halos de inibição entre as porções centrais e

terminais dos tecidos. Este resultado demonstra a homogeneidade das partículas no

tecido como verificado por MEV. Em vista disso, não houve mais a necessidade de

separar estas porções para a realização dos testes microbiológicos.

A Figura 36 mostra imagens das placas de Petri contendo os tecidos impregnados

com nanopartículas de prata após os ensaios antimicrobianos. Nesta figura pode-se

observar que todos os tecidos impregnados com prata ocasionaram a formação do halo.

Entretanto, nas placas contendo os tecidos sem prata não foi observado halo de inibição,

mas um completo recobrimento dos tecidos pelas bactérias como mostra a Figura 34F

dos tecidos de algodão sem prata após o ensaio da atividade antimicrobiana. O mesmo

resultado foi observado para os demais tecidos frente às demais bactérias. Estes

resultados confirmam a obtenção de materiais antimicrobianos.

150

Tabela 9: Tamanho do halo de inibição dos tecidos impregnados 2 ou 4 vezes com

nanopartículas de prata frente a diferentes bactérias. Parte clara = central do tecido, parte

escura= extremidade do tecido.

S.

aureus

S.

epidermidis

Salmonella

tythimurium

E. coli P. aeruginosa

3M (2x) 36 mm 19 mm 18 mm 19 mm 22 mm

3M (4x) 42 mm 19 mm 18 mm 21 mm 22 mm

Algodão (2x)

Parte clara 35 mm 16 mm 14 mm 17 mm 17 mm

Algodão (2x)

Parte escura 35 mm 18 mm 20 mm 22 mm 21 mm

Algodão (4x)


Algodão (4x)


Poliéster (2x)


Poliéster (2x)


Poliester (4x)


Poliester (4x)


151

Figura 36: Fotos dos halos de inibição produzidos pelos tecidos de algodão impregnados com

nanopartículas de prata frente a diferentes bactérias. A) S. aureus, B) S. epidemidis, C) E. coli, D)

P. Aeruginosa, E) Salmonella tythimurium, F) tecido de algodão sem prata frente à bactéria E.

coli.

Os tecidos de algodão e poliéster foram submetidos a sucessivos processos de

lavagens e, em seguida, a atividade antimicrobiana foi avaliada. Inicialmente, foi avaliada

a influência do número de impregnações (2 ou 4 vezes) dos tecidos com nanopartículas

de prata na perda da atividade antimicrobiana após sucessivos ciclos de lavagens. Para

A B

C D

E F

152

isto os tecidos impregnados 2 e 4 vezes foram submetidos a 3 ciclos de lavagens. As

Figuras 37 e 38 mostram os resultados da atividade antimicrobiana dos tecidos de

algodão e poliéster impregnados 2 e 4 vezes com nanopartículas de prata após

sucessivos ciclos de lavagens. Nestas figuras, observa-se que após 3 ciclos de lavagens

a atividade antimicrobiana foi mantida, apresentando apenas uma discreta diminuição. A

atividade foi mantida independente do número de impregnação e do tipo de tecido. O

mesmo perfil foi observado nos testes frentes as bactérias S. epidermis e Salmonella

tythimurium. Este resultado demonstra que apenas dois processos de impregnação são

suficientes para fixar e manter a atividade antimicrobiana mesmo após três ciclos de

lavagens. Em vista disso, o estudo da atividade antimicrobiana após 10 ciclos de lavagem

foi realizado apenas com os tecidos impregnados 2 vezes com nanopartículas de prata.

Figura 37: Atividade antimicrobiana frente à bactéria Gram-positiva S. aures dos tecidos com

nanopartículas de prata após sucessivas lavagens: A) Algodão e B) poliéster, impregnados 2x

(colunas brancas) e 4 x (colunas cinzas).

0 1 2 30

10

20

30

40

50

Diâ

met

ro m

édio

do

halo

de

inib

ição

(m

m)

Número de lavagens

A

0 1 2 30

10

20

30

40

50

Diâ

met

ro m

édio

do

halo

de

inib

ição

(m

m)

Número de lavagens

B

153

Figura 38: Atividade antimicrobiana frente à bactéria Gram-negativa E. coli dos tecidos com

nanopartículas de prata após sucessivas lavagens: A) Algodão e B) poliéster, impregnados 2x

(colunas brancas) e 4 x (colunas cinzas).

A Figura 39 mostra a atividade antimicrobiana dos tecidos de algodão e poliéster

impregnados 2 vezes com nanopartículas de prata após 0 e 10 ciclos de lavagens frente

as bactérias S. aureus e E. coli. A atividade antimicrobiana foi reduzida principalmente

frente a bactéria Gram-positiva S. aureus. Entretanto, em todos os casos houve a

formação de um halo de inibição indicando atividade antimicrobiana mesmo após 10

ciclos de lavagens, demonstrando a alta adesão das partículas nas fibras dos tecidos.

Esta alta adesão pode ser explicada pela presença da capa protéica ao redor das

nanopartículas de prata como descrito por Durán e col. (2005, 2007). Benn e Westerhoff

(2008) estudaram a liberação de nanopartículas de prata de 7 tipos de meias comerciais.

Dentre as 7 meias avaliadas, uma delas não tinha a presença de nanopartículas de prata.

Das demais meias, apenas duas liberaram cerca de 1% após 4 ciclos de lavagens

enquanto as outras 4 meias liberaram 100% das partículas com o mesmo número de

lavagens. Este estudo demonstra a fraca adesão das nanopartículas de prata nesses

produtos comerciais, que pode estar relacionada com o uso de nanopartículas químicas

que não possuem a capa protéica como as nanopartículas produzidas pelo método

biológico.

Os resultados do estudo de lavagens dos tecidos impregnados com nanopartículas

de prata biológicas demonstram a possibilidade da produção de produtos têxteis

antimicrobianos com elevada adesão das nanopartículas e consequentemente com alta

0 1 2 30

5

10

15

20

25

30

35

Diâ

met

ro m

édio

do

halo

de

inib

ição

(m

m)

Número de lavagens

A

0 1 2 30

5

10

15

20

25

30

35

Diâ

met

ro m

édio

do

halo

de

inib

ição

(m

m)

Número de lavagens

B

154

atividade antimicrobiana mesmo após sucessivas lavagens. Além disto, a elevada adesão

e a baixa perda de nanopartículas de prata nos processos de lavagem diminuem os

impactos ambientais. Entretanto, estes impactos são inevitáveis quando se produz

produtos com nanopartículas de prata. Em vista disso, os estudos de filtros eficientes e de

tratamento de efluentes de nanopartículas de prata são extremamente importantes. Uma

possibilidade é o uso da bactéria Chromobacterium violaceum na captura destas

partículas como descrito por Durán et al. (2007,2009).

0

10

20

30

40

50

Diâ

met

ro m

édio

do

halo

de

inib

ição

(m

m)

Poliéster

E. coliS. aureus

Algodão Algodão Poliéster

Figura 39: A) Atividade antimicrobiana dos tecidos de algodão e poliéster impregnados 2 vezes

com nanopartículas de prata antes do processo de lavagem (barras brancas) e após 10 ciclos de

lavagens (barras cinzas), B) Fotos dos halos de inibição produzidos pelos tecidos de algodão

após 10 ciclos de lavagem frente à bactéria E. coli.

6. Permeação cutânea das nanopartículas de prata em célula de difusão de

Franz

A eficiência das nanopartículas de prata em feridas, como as de queimadura, está

descrita na literatura (Tian e col., 2007, Schaller e col., 2004). Além de promoverem o

aumento da re-epitelização, acelerando o processo de cicatrização, as nanopartículas de

prata tem efeito nas citocinas, auxiliando eficientemente no processo de cicatrização.

Outra aplicação tópica destas partículas ocorre em cosméticos e produtos de higiene

pessoal como, por exemplo, em desodorantes, pastas de dente, enxaguatório bucal,

shampoo etc. Em vista dessas aplicações das nanopartículas de prata, o estudo da sua

A B

155

penetração na pele é muito importante. Por este motivo, a penetração das nanopartículas

de prata biológicas foi avaliada em célula de difusão de Franz. A Figura 40 mostra os

resultados deste estudo realizado com géis de Carbopol contendo 50% de nanopartículas

de prata. Nesta Figura pode-se observar que quanto maior a quantidade de prata

adicionada, maior foi o poder de penetração, chegando até ao fluido receptor. Entretanto,

quando foi utilizado 0,3 g de gel com nanopartículas de prata, a prata não permeou

profundamente na pele ficando apenas na epiderme. Este resultado mostra a

possibilidade do uso tópico destas nanopartículas de prata no tratamento de feridas sem

a sua penetração até a corrente sanguínea. Entretanto, a análise de todas as partes da

pele por outras técnicas é fundamental para a comprovação deste resultado.

epiderme derme fluido0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

AB

S

0,3 g de gel 0,5 g de gel 1,0 g de gel

Figura 40: Gráfico da absorbância das nanopartículas de prata presentes nas diferentes regiões

da pele humana.

7. Atividade anti-leishimaniose

A Figura 41 mostra os resultados obtidos no tratamento in vivo de leishimaniose

com nanopartículas de prata produzidas pelo fungo F. oxysporum (nano de Ag biológica)

e com nanopartículas de prata produzidas pelo método químico (nano de Ag química).

Tanto as nano de Ag biológica como as nano de Ag química promoveram uma diminuição

no crescimento da lesão como observado na Figura 41A. Entretanto, a dose de nano

química administrada foi ~3,3 vezes maior que a dose de Ag biológica (21,6 µg/kg e 6,5

µg/kg respectivamente), demonstrando a maior eficiência das nano de Ag biológica no

tratamento da leishimaniose. Este resultado foi confirmado pela carga parasitária como

156

mostra a Figura 41B. Nesta figura observa-se que as nano de Ag biológica promoveram

uma diminuição significativa da fluorescência quando comparada com o grupo tratado

com placebo (tampão PBS). Esta redução foi maior que a observada para as nano de Ag

químicas. Além disso, pode-se verificar que não há diferença estatística na redução de

carga parasitária entre as nano de Ag biológicas e a anfotericina B. Entretanto, a segunda

(anfotericina B) foi administrada numa concentração 300 vezes maior, confirmando a alta

eficiência das nano de Ag biológicas.

Figura 41: A) Aumento da lesão na orelha de camundongos após a administração de tampão

PBS (curva preta), anfotericina B (2 mg/kg) (curva vermelha), nano de Ag química (21,6 µg/Kg)

(curva azul) e nano de Ag biológica (6,5 µg/Kg) (curva verde). (B) Carga parasitária medida por

unidades de fluorescência específica, obtida 42 dias após a infecção.

Na Figura 42 observa-se que as lesões das orelhas dos camundongos tratados

com nano de Ag biológicas, químicas e com anfotericina B estão diminuídas e menos

inflamadas que as do grupo tratado com tampão PBS.

Nano de Ag biológica (6,5 µg/Kg)

Nano de Ag química (21,6µg/Kg)

Anfotericina B (2 mg/Kg) PBS

Nano Agquímica

Nano Agbiológica

PBS Antofericina B

******

A B

157

Figura 42: Fotografia das orelhas dos camundongos infectadas, o halo vermelho indica o local de

infecção.

5. CONCLUSÕES

Cinco diferentes micro e nanoestruturas foram estudadas e otimizadas para o

encapsulamento dos princípios ativos glutationa (GSH) (hidrofílico) e benzofenona-3 (BZ-

3) (hidrofóbico). Todos os métodos de preparação otimizados neste projeto foram

reprodutíveis e as micro e nanoestruturas foram estáveis por no mínimo 35 dias. Devido

às características hidrofílicas da glutationa e às características hidrofóbicas dos materiais

de cobertura das micro e nanoestruturas, a eficiência de encapsulamento foi no máximo

de 35%. Este valor pode ser considerado elevado para um ativo hidrofílico, sendo que,

para ativos lipofílicos, é possível obter até 100% de eficiência de encapsulamento. Dois

fatores foram fundamentais para aumentar a eficiência de encapsulamento do GSH: o

uso de um polímero hidrofílico com carga positiva (quitosana) na preparação das

nanopartículas lipídicas sólidas e a adição de NaCl no método de emulsão e evaporação

de solvente. Estes dois fatores aumentaram a interação GSH-polímero aumentando a

eficiência de encapsulamento.

No caso do ativo lipofílico benzofenona-3 foi obtida uma alta eficiência de

encapsulamento (acima de 95 %) tanto nas nanopartículas de PCL quanto nas NLS e os

CLN. Nas micropartículas de PHBV, a eficiência de encapsulamento foi um pouco menor

Anfotericina PBS

Nano de Ag química

Nano de Ag biológica

158

variando de acordo com a quantidade de polímero adicionada, sendo que, o aumento de

duas vezes na massa de polímero adicionado à preparação, aumentou a eficiência de

82,2 para 87 %. No estudo de permeação cutânea foi observado que as NLS

apresentaram maior penetração em pele do que as micropartículas de PHBV e

nanopartículas de PCL devido, provavelmente, ao reduzido diâmetro destas partículas e a

sua maior interação com a pele. Porém, a BZ3 encapsulada em NLS apresentou maior

fator de proteção solar (FPS 21) em relação a BZ3 livre (FPS 16), a microencapsulada em

PHBV (FPS 19) e a nanoencapsulada em PCL (FPS 18), demonstrando ser mais eficiente

no bloqueio da radiação UV. Desta forma, é possível o uso dessa micro e nanoestruturas

para reduzir a concentração do fotoprotetor químico em produtos de proteção solar,

diminuindo assim a sua toxicidade.

Todas as partículas com BZ3 não apresentaram sensibilização cutânea em

camundongos, indicando que estas partículas podem ser utilizadas em formulações

cosméticas. Além disso, as NLS-BZ3 não apresentaram nenhum efeito citotóxico ou

fototóxico in células de queratinócitos humanos e em células de fibroblastos de embrião

de camundongo BALB/c 3T3. Entretanto, as nanopartículas de PCL-BZ3 exibiram um

potencial fototóxico em células de queratinócitos humanos.

Em relação às nanopartículas de prata, é possível concluir que utilizando o fungo

F. oxysporum foi possível obter nanopartículas de prata esféricas e homogêneas. O

método foi reprodutível e em 28 horas os íons prata foram reduzidos à prata zero

formando as nanopartículas. Estas partículas apresentaram concentração inibitória

mínima menor que nanopartículas de prata produzidas pelo método químico frente a 10

diferentes tipos de bactéria, inclusive as cepas de S. aures resistentes. Este resultado

demonstra o alto efeito antimicrobiano das nanopartículas de prata biológicas.

Os tecidos (algodão, poliéster e tecido para curativos da 3M) foram impregnados

eficientemente com nanopartículas de prata pelo método padding como verificado por

MEV e pela atividade antimicrobiana frente a 5 diferentes tipos de bactérias. Além disto,

não houve diferença entre os tecidos impregnados duas e quatros vezes com as

nanopartículas de prata, demonstrando que apenas dois processos de impregnações são

suficientes para obter uma alta eficiência de adesão das partículas nas fibras dos tecidos.

Mesmo após 10 ciclos de lavagens, os tecidos impregnados (2x) com as nanopartículas

de prata exibiram atividade antimicrobiana demonstrando a alta adesão destas partículas

159

na fibra dos tecidos. Esta alta adesão esta relacionada com a capa protéica ao redor das

partículas como verificado por TEM. Além do efeito antimicrobiano destas partículas, alta

eficiência no tratamento de leishimaniose foi verificada quando as nanopartículas de prata

biológicas foram administradas em camundongos em uma dose 300 vezes menor que

anfotericina B e 3,3 vezes menor que as nanopartículas de prata química. Este resultado

demonstra um grande potencial das nanopartículas de prata no tratamento desta doença.

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