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DANIELY XAVIER SOARES
PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE PROCESSOS MULTIRESPOSTAS: TRATAMENTO QUIMIOMÉTRICO
CAMPINAS 2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
DANIELY XAVIER SOARES
PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE PROCESSOS MULTIRESPOSTAS:TRATAMENTO QUIMIOMÉTRICO
ORIENTADOR: PROF. DR. ROY EDWARD BRUNS CO-ORIENTADOR: PROFA. DRA. IEDA SPACINO SCARMINIO
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO
INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTORA EM CIÊNCIAS.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR DANIELY XAVIER SOARES, E ORIENTADA PELO PROF.DR. ROY EDWARD BRUNS.
______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2014
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vi
vii
“Que coleção de cicatrizes você tem? Nunca se
esqueça de quem lhe deu as melhores. E seja
grato. Nossas cicatrizes têm o poder de nos
fazer lembrar que o passado foi real.”
Hannibal Lecter
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AGRADECIMENTOS
Embora uma tese seja, pela sua finalidade acadêmica, um trabalho
individual, há contribuições de natureza diversa que não podem e nem devem
deixar de ser realçados. Por essa razão, desejo expressar os meus sinceros
agradecimentos:
Aos meus pais por tudo apoio e por me permitirem escolher.
Ao meu irmão pela amizade e por ser minha fonte de inspiração.
Ao Professor Dr. Roy Edward Bruns, meu orientador, pela competência
científica, correções e sugestões relevantes feitas durante a orientação.
Pela paciência e atenção.
À Professora Dra. Ieda Spacino Scarminio, minha co-orientadora, pela
competência científica e orientação, bem como pela disponibilidade.
À Professora Dra. Isabel Jardim, por toda ajuda e contribuição para o
resultado final desta tese, pela atenção e disponibilidade.
Aos Professores Dr. Ronei Poppi e Dr. Fábio Gozzo, por sempre
estarem dispostos a tirar dúvidas e pela atenção.
Ao Dr. Alexandre Ferreira Gomes: namorado, amigo e companheiro
que sempre me estimula a crescer científica e pessoalmente. Pelas
inúmeras conversas sobre assuntos diversos, pelas correções e
x
comentários na tese. Acima de tudo, pelo inestimável apoio, pela
paciência e compreensão.
Aos amigos de todas as horas: Hector Koolen, Dr. Clécio Klitzke e
Adriana Godoy.
Aos amigos que conquistei no Instituto de Química: Giovana, Aline,
Carla, Ana Carolina, Bruna Campos, Eduardo, Arnaldo, Bruna Zucoloto,
Nicolas, João, Dr. Maurício (Cabuloso), Maurício (Xanxeré), Dr. Marcelo
(P2), Luana, Jandyson, Lívia, Wagner e Klécia e aos muitos outros que
também estão em meu coração.
A Dra. Márcia Breitkreitz, IAPAR e Arnaldo pela contribuição com os
conjuntos de dados.
A todo Instituto de Química, professores, técnicos e funcionários.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pelo apoio no desenvolvimento do trabalho.
Mais uma vez, a todos os meus sinceros agradecimentos.
xi
SÚMULA CURRICULAR (2010-2014)
Daniely Xavier Soares
Data de nascimento: 24/06/1985 Endereço eletrônico: [email protected]
Formação Acadêmica
2010 – 2014 Doutorado em Ciências (Química Analítica) Título: “Planejamento e otimização de processos
multirespostas: tratamento quimiométrico”
Instituto de Química – Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP), Campinas, SP
Orientador: Prof. Dr. Roy Edward Bruns
Agência Financiadora: Capes
2008 – 2010 Mestrado em Química Título: “Comparação de procedimentos de extração
de material vegetal para otimizar o rendimento de
metabólitos secundários”
Departamento de Química – Universidade Estadual
de Londrina (UEL)
Orientador: Profa. Dra. Roy Edward Bruns
Agência Financiadora: Capes
2004 – 2007 Licenciada em Química
Universidade Estadual de Goiás (UEG)
2006 – 2007 Iniciação Científica em Química Analítica Título: “Avaliação das características físico-química
do leite ultrapasteurizado (UHT)”
Orientador: Profa. Ms. Tatiana de Oliveira Zuppa
Universidade Estadual de Goiás (UEG)
1. Produção Científica
xii
SOARES, D. X.; Scarminio, I. S.; Bruns, R. E. Mixture designs for
exploring class diversity and metabolite fingerprinting: An efficient column
chromatographic strategy. Analytica Chimica Acta, 2011.
Silva, A. F.; Soares, D. X.; Faria, S. H. D. M.; Bruns, R. E. . Basis set
selection for the calculation of the IR fundamental intensities for 1,1-
C2H2F2 and F2CO. Journal of Molecular Structure, 2011.
2. Experiência Didática
2014 - CH5 serviços em análise instrumental: Ministrou o curso de
planejamento de experimentos.
2013 - Participação no Programa de Estágio Docente (PED) do Instituto de
Química da UNICAMP, nível C, por um semestres, na disciplina QG108
(Química Geral Teórica).
2013 - Universidade Federal de Santa Maria: Ministrou o curso de
planejamento de experimentos.
2012 – Faculdade Oswaldo Cruz: Professora de quimiometria do curso de pós-
graduação em analise instrumental.
3. Apresentação de trabalhos em eventos
2014 - 37° Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. Trabalho:
Identificação dos isômeros eritrartina e 11-metoxi-erisodina através dos
espectros UV-VIS e cálculos teóricos
2013 - V Congresso da BrMass. Trabalho: Simplex centroid design
optimization for the extraction of the alkaloids in erisotrina of flowers
Erythrina speciosa Andrews.
2012 - XIII Chemometrics in Analytical Chemestry Conference.
Trabalho: Multiple criteria decision making for chromatographic and
electrophoretic separations.
2011 - 16° Encontro Nacional de Química Analítica.
Trabalhos: a) Análise multi-way dos dados CLAE-DAD da fração básica de
Erythrina speciosa Andrews. b) Análise quimiométrica e planejamento
experimental para avaliação dos espectros UV-Visível de extratos de plantas
medicinais.
2010 - 33º reunião Anual da Sociedade Brasileira de química. Trabalhos:
(a) Comparação de dois procedimentos cromatográficos de coluna aberta pata
análise de extratos das folhas de Erythrina speciosa Andrews. (b)
Planejamento estatístico de misturas em cromatografia liquida para a busca da
impressão digital de extrato de Erythrina speciosa Andrews.
xiii
RESUMO “Planejamento e otimização de processos multirespostas: tratamento
quimiométrico”
Foram estudados três parâmetros cromatográficos: tempo de retenção,
resolução e largura dos picos, em cromatogramas obtidos para uma mistura de
onze agrotóxicos. Ajustes de modelos de regressão foram construídos e
validados por ANOVA. Devido a sua simplicidade, os resultados obtidos para
tempo de retenção foram usados em um programa interativo para estudar as
separações como função de todo domínio experimental do planejamento
simplex centróide. Um planejamento de misturas envolvendo três solventes
(etanol, diclorometano e hexano) foi usado para avaliar a extração de
alcalóides em Erythrina speciosa. Resultados diferentes foram observados
para os extratos da flor, caule e folha, evidenciando que perfis de alcalóides
distintos podem ser obtidos a partir de diferentes partes da planta. Modelos de
regressão foram construídos e validados por ANOVA para dois alcalóides
(tentativamente identificados por espectrometria de massas como eritrartina e
11-metoxi-erisodina, isóbaros em m/z 330, e erisotrina em m/z 314, com base
em literatura prévia). A análise das componentes principais foi aplicada ao um
conjunto de dados de absorbância de folhas de quatro cultivares de café (IPR-
59, CAT, 027 e 083) obtidos entre 350-1100 nm por um espectroradiômetro
portátil LI_COR 1800. Esta análise somente conseguiu discriminar espectros
obtidos na face adaxial e abaxial das folhas. Como estes dados seguem um
planejamento fatorial para quatro fatores (irrigação, estratos extremos, pontos
cardeais e face) valores de efeitos foram determinados para absorbância em
três comprimentos de onda estratégicos, 520, 554 e 650 nm, que são
importantes para a quantificação de conteúdos de clorofilas e antocianinas.
xiv
xv
ABSTRACT “Design and multiresponse optimization of processes: chemometric
treatments”
Three chromatographic separation criteria were evaluated: retention time,
resolution and peak width, in chromatograms obtained from a mixture of
eleven pesticides. Regression models were constructed and validated by
ANOVA. The use of the interactive program proved to be a valuable tool for
studying peak separation behavior for the entire experimental domain of the
simplex centroid design. Three solvents (ethanol, dichloromethane and
hexane) and their binary and ternary mixtures were evaluated as extraction
media for alkaloids in Erythrina speciosa. Different results were obtained
between extracts of flowers, stems and leaves, showing that distinct alkaloid
profiles can be obtained from different sources within the plant. Regression
models were constructed and validated by ANOVA for two alkaloids
(tentatively identified by MS as erytrartine and 11-methoxy-erisodine, isobaric
ions of m/z 330, and erysothrine of m/z 314, based on previous literature).
Principal component analysis was applied to data sets of absorbance values for
leaves of four coffee cultivars (IPR-59, CAT, 027 and 083) obtained between
350 – 1100 nm by a LI_COR 1800 portable radioespectrometer. This analysis
was only able to discriminate between spectra of the abaxial and adaxial faces
of the leaves. Since the spectral data were consistent with a factorial design for
four factors (irrigated/field water, superior/inferior strata, cardinal points and
face) effect values for absorbance were calculated at four strategic
wavelengths, 520, 554 and 650 nm that are important for quantifying
chlorophyll and anthocyanin contents of coffee.
xvi
xvii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS.............................................................................................XIX
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................XXIII
LISTA DE ABREVIATURAS..............................................................................XXVII
INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................. 1
CAPITULO 1 - OTIMIZAÇÃO CROMATOGRÁFICA POR MÉTODO
COMPUTACIONAL INTERATIVO ............................................................. 13
1.1. Introdução..............................................................................................13
1.1. Parte experimental .................................................................................19
1.2. Tratamento multivariado ...................................................................... 21
1.3.1.Tempo de retenção .................................................................................21
1.3.2. Resolução.............................................................................................. 23
1.3.3. Larguras da base ...................................................................................27
1.4. Programa Computacional ......................................................................29
1.5. Conclusões 1..........................................................................................32
CAPITULO 2 – OTIMIZAÇÃO DO SOLVENTE EXTRATOR DE
ALCALÓIDES NAS FLORES, CAULE E FOLHAS DE ERYTHRINA
SPECIOSA ANDREWS .................................................................................35
2.1. Introdução .............................................................................................35
2.2. Experimental .........................................................................................41
2.2.1. Material botânico..................................................................................42
2.2.2. Preparação das amostras e extratos.......................................................43
2.2.3. Análises por UHPLC-ESI-MS..............................................................44
xviii
2.3. Resultados e Discussão..........................................................................44
2.3.1. Analise dos extratos das flores ..............................................................46
2.3.2. Analise dos extratos do caule ................................................................61
2.3.3. Analise dos extratos das folhas .............................................................71
2.4. Identificações das estruturas de alcalóides erytrinicos por cálculos
teóricos...................................................................................................85
2.5. Conclusões 2 .........................................................................................87
CAPITULO 3 - OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES PARA ABSORÇÃO
NAS FOLHAS DE CULTIVARES DE CAFÉ ..............................................91
3.1. Introdução ...............................................................................................91
3.2. Dados .......................................................................................................94
3.3. Tratamento multivariado .........................................................................96
3.4. Conclusões 3 ..........................................................................................108
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1. Tempos de retenção para os agrotóxicos analisados em cada ponto
do planejamento experimental e sua replica em minutos.................................21
Tabela 1.2. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média
quadrática dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e
media quadrática do erro puro (MQep) dos modelos de tempo de retenção....22
Tabela 1.3. Valores de resolução para os pares de picos com base no
cromatograma obtido no ponto central............................................................25
Tabela 1.4. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média
quadrática dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e
média quadrática do erro puro (MQep) para modelos de resolução................26
Tabela 1.5. Valores de largura da base para os picos cromatográficos de cada
agrotóxico estudado ........................................................................................28
Tabela 1.6. Valores de média quadrática da regressão (MQR) média
quadrática dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e
média quadrática do erro puro (MQep) para modelos de largura da bas.........29
Tabela 2.1. Planejamento simplex centróide com os valores de α, β, e π para
cada mistura.....................................................................................................45
Tabela 2.2. Valores de m/z encontrados nos extratos das flores de Erythrina
speciosa em cada uma das misturas de acordo com o planejamento simplex
centróide. Cada símbolo * representa o número de vezes que cada valor de
m/z foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos
com tempos de retenção distintos....................................................................49
Tabela 2.3. Intensidades totais dos espectros de massas dos m/z pares obtidos
com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o número de
picos com m/z par para cada cromatograma....................................................50
xx
Tabela 2.4. Análise de variância para o ajuste do modelo quadrático as
intensidades de m/z 330 para as misturas do planejamento simplex
centróide...........................................................................................................52
Tabela 2.5. Análise de variância para o ajuste do modelo quadrático as
intensidades de m/z 314 para as misturas do planejamento simplex
centróide...........................................................................................................55
Tabela 2.6. Valores de m/z encontrados nos extratos do caule de Erythrina
speciosa em cada uma das misturas de acordo com o planejamento simplex
centróide. Cada símbolo # representa o número de vezes que cada valor de
m/z foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos
com tempos de retenção distintos....................................................................62
Tabela 2.7. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides obtidos
com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o numero de
picos com massa par para cada cromatograma ...............................................63
Tabela 2.8. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides obtidos
com a extração baseada num planejamento simplex centróide com pontos
axiais e o número de picos com massa par para cada
cromatograma.................................................................................................. 64
Tabela 2.9. Valores de m/z encontrados nos extratos das folhas de Erythrina
speciosa em cada uma das misturas de acordo com o planejamento simplex
centróide. Cada símbolo ▲ representa o número de vezes que cada valor de
m/z foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos
com tempos de retenção distintos....................................................................72
Tabela 2.10. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides
obtidos com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o
número de picos com m/z par para cada cromatograma .................................73
Tabela 2.11. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides
obtidos com a extração baseada num planejamento simplex centróide com
xxi
pontos axiais e o número de picos com m/z par para cada
cromatograma...................................................................................................75
Tabela 2.12. Análise de variância para o ajuste do modelo cúbico especial as
intensidades de m/z 314 para as misturas do planejamento simplex
centróide...........................................................................................................75
Tabela 2.13. Valores de m/z encontrados em cada mistura de solvente nas
diferentes partes da planta analisadas. Múltiplos símbolos indicam mais de um
pico cromatográfico com tempos de retenção distintos para a mesma
m/z....................................................................................................................82
Tabela 2.14. Comparação entre as frequências de absorção das transições pi-
pi*, obtidas experimentalmente e teoricamente ..............................................87
Tabela 3.1. Planejamento fatorial 24 para analise das folhas dos cultivares
com a latitude variando nos pontos cardeais .................................................100
Tabela 3.2. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm e
650nm para o cultivar IPR-59, com os valores de significância e erro padrão
para cada efeito .............................................................................................101
Tabela 3.3. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm e
650nm para o cultivar CAT, com os valores de significância e erro padrão
para cada efeito .............................................................................................102
Tabela 3.4. Tabela dos efeitos das variáveis na absorção em 520nm, 554nm e
650nm para o cultivar 027, com os valores de significância e erro padrão para
cada efeito .....................................................................................................103
Tabela 3.5. Tabela dos efeitos das variáveis na absorção em 520nm, 554nm e
650nm para o cultivar 083, com os valores de significância e erro padrão para
cada efeito .....................................................................................................104
Tabela 3.6. Planejamento fatorial 24 para análise das folhas dos cultivares
com a longitude variando nos pontos cardeais ..............................................105
Tabela 3.7. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm, e
650 nm para os quatro cultivares estudados...................................................106
xxii
xxiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema da decomposição da matriz X no produto de duas
matrizes............................................................................................................. 7
Figura 1.1. Sistema de natureza desconhecida com j respostas e k fatores ...13
Figura 1.2. Esquema de otimização multi resposta para fase móvel em
cromatografia...................................................................................................17
Figura 1.3. Planejamento simplex centróide utilizado para determinação das
composições de FM a serem utilizadas. ACN = ACN:H2O 30:70 (v/v); MeOH
= MeOH:H2O 45:55 (v/v); THF = THF:H2O 30:70 (v/v) ...............................20
Figura 1.4. Cromatograma obtido na separação de onze agrotóxicos
empregando coluna SGE C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm),
volume de injeção 10 μL, FM 1/3 ACN:H2O 30:70 (v/v), 1/3 MeOH:H2O
45:55 (v/v), 1/3 THF:H2O 30:70 (v/v), totalizando uma mistura final de
ACN:MeOH:THF:H2O 10:15:10:65 (v/v), vazão 1,0 mL/min, detecção em
210 nm e temperatura ambiente. Agrotóxicos: 1 = imazetapir, 2 = simazina,
3=imazaquim, 4 = ametrina, 5 = cianazina, 6 = tiofanato, 7 = metsulfuron, 8 =
bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin ....................................24
Figura 1.5. Representação gráfica do cálculo da largura da base para os picos
cromatográficos de cada agrotóxico estudado.................................................27
Figura 1.6. ACN:H2O 30:70 (v/v) do planejamento (a), cromatograma
simulado pelo programa computacional; (b) cromatograma experimental;
(c)cromatograma simulado. Ordem de eluição: 1 = imazetapir, 2 = simazina,
3=imazaquim, 4 = ametrina, 5 = cianazina, 6 = tiofanato, 7 = metsulfuron, 8 =
bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin ....................................30
Figura 2.1. Componentes basicos de um espectrometro de massas................39
Figura 2.2. Procedimentos experimental empregado na analise da planta
Erythrina speciosa..........................................................................................42
Figura 2.3. Planejamento simplex centróide, onde as proporções x1= etanol
(Et); x2= diclorometano (Dm); x3 = hexano (Hx). (a) Representação gráfica
das misturas do planejamento simplex centróide e (b) proporção numérica das
misturas do planejamento simplex centróide...................................................43
Figura 2.4. Cromatograma total de íons das flores de Erythrina speciosa com
a mistura (etanol:diclorometano:hexano (0.33;0.33;0.33(v/v)) ......................47
xxiv
Figura 2.5. Valores de intensidade para m/z 330 de acordo com as misturas
do planejamento simplex centróide ............................................................50
Figura 2.6. Alcalóides tentativamente identificados no gênero Erythrina,
observados por ESI (+)-MS como íons em m/z 330, sendo (a) eritrartina,
previamente reportada em Erithrina speciosa como composto majoritário2 e
(b)11-metoxi-erisodina, previamente identificado em Erythrina
lysistemon26......................................................................................................51
Figura 2.7. Superfície de resposta aplicada as intensidades referentes a m/z
330 de acordo com o planejamento simplex
centróide...........................................................................................................53
Figura 2.8. Estrutura para m/z 314, tentativamente identificada em Erythrina
speciosa como erisotrina2.................................................................................54
Figura 2.9. Valores de intensidade para m/z 314 de acordo com as misturas
do planejamento simplex centróide ...........................................................54
Figura 2.10. Superfície de resposta aplicada as intensidades para os
picos.................................................................................................................57
Figura 2.11. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de íons
no tempo de retenção de nove minutos para as sete misturas do planejamento
simplex centróide das flores de Erythrina speciosa .......................................59
Figura 2.12. Perfis cromatográficos para os extratos das flores obtidos nas
diferentes misturas de solventes com base no planejamento simplex
centróide...........................................................................................................60
Figura 2.13. Gráfico dos loading das componentes principais 1 e 2 obtidos
com as flores da Erythrina speciosa ...............................................................61
Figura 2.14. Valores de intensidades para m/z 314 de acordo com o
planejamento simplex centróide ...............................................................63
Figura 2.15. Planejamento simplex centróide com valores médios de
intensidades para m/z 314 em suas respectivas misturas ................................65
Figura 2.16. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de íons
para o caule de acordo com a planejamento simplex centróide ......................66
Figura 2.17. Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 2 para os
dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa ..........................................68
Figura 2.18. Gráfico dos scores para cromatogramas totais de íons das flores e
caule de acordo com o planejamento simplex centróide .................................69
xxv
Figura 2.19. Cromatograma totais de íons para as sete misturas do
planejamento simplex centróide para o caule da planta e o cromatograma total
de íons em hexano puro para as flores em negrito ..........................................70
Figura 2.20. Cromatograma totais de íons para as sete misturas do
planejamento simplex centróide para as flores com o cromatograma em obtido
em hexano puro em negrito .............................................................................71
Figura 2.21. Valores de intensidades para m/z 314 de acordo com o
planejamento simplex centróide ...............................................................74
Figura 2.22. Superfície de resposta aplicada as intensidades para os picos com
m/z 314 ............................................................................................................76
Figura 2.23. Gráfico dos scores CP1xCP3 para os dados dos cromatogramas
totais de íons obtidos nas folhas da Erytrina speciosa ....................................78
Figura 2.24. Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 3 para os
dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa ..........................................79
Figura 2.25. Gráfico dos scores dados das flores, caule e folhas da planta na
projeção CP1xCP2xCP3 .................................................................................80
Figura 2.26. Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 3 para os
dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa .....................................81
Figura 2.27. Estrutura clássica de alcalóides eritrinicos ...........................85
Figura 2.28. Estruturas da (A) eritrartina e (B) 11-metoxi-erisodina, alcalóides
eritrínicos identificados tentativamente por MS como íons de m/z
330..................................................................................................................86
Figura 3.1. Curva de rflectância de folhas verde e saudável típica.................93
Figura 3.2. Esquema de analises para cada cultivar com as combinações
possíveis dos fatores estudadas ..................................................................95
Figura 3.3. Gráfico dos scores da CP1xCP2 para os cultivares de café com
todos os espectros irrigados e não irrigados, onde os símbolos separam as
amostras irrigadas das amostras não irrigados .........................................97
Figura 3.4. Gráfico dos escores para o conjunto de dados irrigado e não
irrigado nos quatro cultivares analisados ........................................................98
Figura 3.5. Gráfico dos 32 espectros de absorbância para os quatro cultivares
de cafés irrigados e não irrigados. Em vermelho temos os espectros obtidos na
face abaxial e em preto os espectros obtidos na face adaxial nos comprimentos
de onda de 350 até 1100nm............................................................................107
xxvi
xxvii
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA Análise de variância
ACN Acetonitrila
Am Ametrina
At Atrazina
Be Bentazona
Ca Carbaril
CAT Catuaí IAC 99
Ci Cianazina
Cx Carboxim
Dm Diclorometano
Et Etanol
FM Fase móvel
Hx Hexano
IAPAR Instituto Agronômico do Paraná
IPR-59 IAPAR 59
Im Imazetapir
In Intensidade
Iz Imazaquim
Me Metsulfuron
MeOH Metanol
MQep Media quadrática do erro puro
MQfaj Média quadrática da falta de ajuste
MQR Média quadrática da regressão
m/z Razão massa/carga
PCA Analise de Componentes Principais
Rs Resolução
Si Simazina
THF Tetrahidrofurano
TIC Cromatograma totais de íons
UPLC Cromatografia liquida de ultra eficiência
v/v Volume/volume
α Acidicidade
β Basicidade
π Dipolaridade
027 Etiópia IAPAR 027
083 Etiópia IAPAR 083
xxviii
1
1. Introdução geral
O uso de computadores para analisar dados químicos cresceu
drasticamente nos últimos vinte anos, em parte devido aos recentes avanços em
hardware e software1. Cada vez mais fica evidente nos diversos segmentos da
química o crescimento científico e também tecnológico devido ao uso de
recursos computacionais, a química analítica não foge a esta regra. Na área de
química analítica, a aquisição de dados atingiu um ponto bastante sofisticado
com interface de instrumentos aos computadores produzindo uma enorme
quantidade de informação, muitas vezes complexa e variada. Uma das
características mais interessantes dos modernos instrumentos é o número das
variáveis que podem ser medidas em uma única amostra. Diante desse cenário,
os químicos analíticos se deparam com conjuntos de dados que podem oferecer
diversos tipos de informações, sendo importante ter como alternativas algumas
ferramentas matemáticas e estatísticas que possam extrair um maior número de
informações do conjunto de dados de forma criteriosa e científica2,3,4. Tais
ferramentas matemáticas e estatísticas também podem diminuir drasticamente o
tempo necessário para extrair informações relevantes com confiabilidade a
partir de grandes conjuntos de dados.
Um novo termo foi introduzido na química e denominado quimiometria,
que é uma área especificamente destinada à análise de dados químicos de
natureza multivariada. A quimiometria pode ser definida com um ramo da
química que se utiliza da matemática e da estatística de forma a obter resultados
mais satisfatórios possíveis e fornecer conhecimentos sobre os sistemas
químicos5. Esse termo surgiu pela primeira vez em 1971, quando o Professor
Svante Wold (Umea University, Suécia) criou a palavra Kemometri das
2
combinações suecas Kemo e metri. Neste mesmo ano, sugeriu a palavra
equivalente do inglês chemometrics. Em 1972 Svante Wold criou o primeiro
grupo de quimiometria. Em 1973, o primeiro artigo com o termo chemometrics
foi publicado. Em 10 de junho de 1974 a Sociedade Internacional de
Quimiometria, do inglês International Chemometrics Society foi fundada por
Svante Wold (Umea University) e Bruce R. Kowalski (University of
Washington). Em 1975 os dois primeiros artigos contendo o termo
chemometrics em seus títulos foram publicados pelo Grupo de Pesquisa em
Quimiometria do Professor Bruce R. Kowalski, sendo que estes artigos
definiram a quimiometria como uma nova disciplina da Química. Em 1976
aconteceu o primeiro Simpósio de Quimiometria6, 7.
O avanço da quimiometria veio no século 21 pelo fato de várias empresas
de desenvolvimento de software terem promovido métodos de construção de
equipamentos hifenados e mais avançados, abrindo muitas opções para
melhoria de dados analíticos. Assim, a quimiometria passou a ter um papel
importante na química analítica. Diversas contribuições da quimiometria no
tratamento de dados analíticos estão presentes na literatura, seja em dados
espectroscópicos, cromatográficos, eletroforéticos, entre outros8.
A análise multivariada envolve a análise de dados que consiste em
númerosas variáveis medidas a partir de um número de amostras. O objetivo da
análise multivariada de dados é determinar todas as variações na matriz de
dados de estudo. Assim, ferramentas quimiométricas tentam encontrar as
relações entre as amostras e as variáveis em um determinado conjunto de
dados9.
Em sistemas multivariados, a conversão da resposta instrumental no dado
químico de interesse requer a utilização de técnicas de estatística multivariada,
álgebra matricial e análise numérica. Essas técnicas são apontadas, atualmente,
3
como a melhor alternativa para a interpretação de dados e para a aquisição do
máximo de informação sobre o sistema10.
Encontrar as melhores condições para uma dada medida requer
procedimentos de otimização e encontrar as melhores respostas pode ser um
trabalho difícil já que diversas respostas simultâneas podem ser geradas em um
grande conjunto de dados. Pode-se definir otimização como sendo um processo
baseado em instruções que permitam obter o melhor resultado de uma dada
situação. Cientificamente, estas instruções são frequentemente expressas
através de métodos matemáticos que procuram maximizar ou minimizar alguma
propriedade, e obtenção das condições de controle otimizadas11, 12.
Dentre as atividades habituais em química analítica que envolvem
otimização estão13:
a) O desenvolvimento de novos métodos de análise e o melhoramento ou
adaptação de métodos já estabelecidos, estudando-se as variáveis que exibem
efeitos significativos na resposta e que podem ser ajustadas para melhorar a
eficiência do método.
b) O melhoramento do desempenho de instrumentos analíticos
complexos, por acerto simultâneo dos vários parâmetros instrumentais até que a
resposta ótima seja obtida.
c) O ajuste do modelo matemático para os dados experimentais, de tal
modo que a equação teórica represente verdadeiramente os valores
experimentais.
Os procedimentos tradicionais de otimização consistem em estudar cada
fator separadamente. Esse tipo de otimização conduz a um grande número de
experimentos que têm que ser executados, tornando-se um processo demorado e
caro. Em tais casos, uma abordagem multivariada ao problema pode ser
utilizada. Ela baseia-se na utilização de um conjunto mínimo de experimentos
4
que permite a variação e avaliação simultânea de todos os fatores estudados. Há
vários planejamentos de experimentos que se aplicam à otimização, reduzindo o
número de experimentos e fornecendo informações que conduzem à
otimização, entre eles estão: fatorial completo e fracionado, Plackett-Burman,
composto central, Box-Behnken e o simplex centróide14,15.
Por poderem ser usados em diferentes tipos de análises, os planejamentos
mais usuais são os planejamentos fatoriais e o planejamento de misturas tipo
simplex centróide. Com o planejamento fatorial é possível o estudo simultâneo
dos efeitos que vários fatores podem ter sobre a otimização de um processo.
Sua aplicação determina quais fatores tem importância sobre a resposta e como
o efeito de um fator varia de acordo com o nível dos outros fatores16. Os efeitos
são as quantidades diferenciais expressas com uma mudança de resposta
quando o nível de um ou mais fatores são alterados. As interações são a força
motriz em muitos processos de otimização de forma que, sem o uso do
planejamento fatorial, algumas interações importantes podem permanecer
escondidas, e a otimização global não pode ser alcançada. Um dos mais simples
tipos de planejamentos fatoriais utilizados no trabalho experimental é aquele
que tem dois níveis (2k). Num planejamento fatorial 2k, a cada fator podem ser
atribuídos dois níveis: baixo (-1) e alto (+1). Se k fatores são considerados,
então um minímo de 2k medições são realizadas numa análise fatorial17.
Nos planejamentos com misturas, muito aplicados nesta tese, as
propriedades estudadas dependem da proporção dos componentes da mistura e
não da quantidade de cada componente da mistura18. Nesse caso, as variáveis
não são independentes, ou seja, se o nível de uma variável muda significa que o
nível de alguma outra variável também irá mudar, já que a proporção ente elas é
a característica de interesse e o total da mistura corresponde a 100%k. Assim
temos a seguinte restrição19:
5
(1)
de forma que Xi é a proporção dos componentes na mistura e q é o número de
componentes da mistura. Com três componentes (q=3) o espaço da mistura é
um triângulo, chamado simplex, onde os vértices correspondem à composição
dos componentes puros, ou seja, 100% de um componente simples. Nas arestas
estão as misturas binárias em mesma proporção e o centro do triângulo
corresponde à mistura na mesma proporção dos três componentes da mistura. A
mesma ideia pode ser aplicada para q=4, onde a figura geométrica seria um
tetraedro. Maiores números de componentes da mistura levam a figuras mais
difíceis de serem visualizadas, dificultando o processo de otimização já que o
planejamento de misturas explora todo o espaço da figura geométrica20.
Na etapa de avaliação dos resultados dos experimentos, técnicas como a
análise de variância (ANOVA) e a utilização de equações de regressão
encontram larga aplicação. Para estudar o efeito da composição da mistura na
variável resposta de um ensaio, podem-se utilizar modelos matemáticos, que
fazem uso da resolução de equações pelo método dos mínimos quadrados para
encontrar soluções que expressem o comportamento de uma variável
dependente em função da proporção de cada fator estudado. Em geral, utilizam-
se modelos lineares, quadráticos ou cúbicos que usam o mesmo número de
ensaios que o número de coeficientes que se quer estimar21, 22.
Em geral, os modelos usados em planejamentos de mistura são o
quadrático e o cúbico especial. O polinômio cúbico especial é uma forma
reduzida do polinômio de terceiro grau que contém informações sobre as
misturas de todos os componentes. Com q=3 componentes, por exemplo, os
modelos quadráticos e cúbicos especiais, respectivamente são23:
6
= β1X1 + β2X2 + β3X3 + β12X1X2 + β13X1X3 + β23X2X3 + (2)
= β1X1+ β2X2 + β3X3 + β12X1X2 + β13X1X3 + β23X2X3 + β123X1X2X3 + (3)
Onde y representa a função resposta dos dados experimentais; X1, X2 e
X3 são variáveis de mistura que correspondem às proporções dos componentes
estudados, e β representa os parâmetros estimados. A partir das respostas
experimentais e dada a forma do modelo estima-se o vetor dos parâmetros β, de
forma que o modelo se ajuste adequadamente aos dados. O vetor β é o resultado
da operação matricial apresentada na equação 4:
(4)
O teste mais geral de ajuste do modelo aos dados é o teste F de análise de
variância, que verifica a significância do modelo como um todo. Através do
modelo ajustado, pode-se realizar a otimização da variável de resposta de
interesse, isto é, obter a combinação de variáveis de controle que propiciará a
melhor resposta do sistema com o qual se está trabalhando com o menor custo.
Para extrair o máximo de informações dos resultados de um experimento
químico, um grande número de variáveis está envolvida24. Muitas vezes, apenas
parte dessas variáveis contém informações relevantes e a maioria das variáveis
adiciona pouco ou quase nada à interpretação dos resultados em termos
químicos. A redução de variáveis através de critérios objetivos, que permita
dizer quais são as variáveis de interesse contendo maior informação, pode ser
alcançada através da Análise de Componentes Principais (PCA), que permite
explorar os resultados obtidos por meio de análises químicas com intuito de
verificar a existência de similaridade entre as amostras.
7
A PCA é um método que tem por finalidade básica a redução de dados a
partir de combinações lineares das variáveis originais. Na PCA, a
decomposição é calculada através da diagonalização da matriz XtX ou XXt. A
matriz X (n x p), formada por n objetos e p variáveis é decomposta no produto
de duas matrizes menores, equação 5:
X = T x P’ + (5)
no qual T é a matriz dos scores das componentes principais, P é a matriz
loadings (pesos) das componentes principais, e é a matriz dos resíduos. O
sobrescrito t indica a transposta da matriz e q é um escalar que indica o número
de componentes principais que descreve a maior parte da variância dos dados.
Este procedimento está representado esquematicamente na Figura 125.
Figura 1. Esquema da decomposição da matriz X no produto de duas matrizes.
Após os cálculos, os resultados são utilizados para interpretar a
distribuição das amostras num gráfico bidimensional das componentes
principais e posteriormente identificar e julgar a importância das variáveis
originais escolhidas, pois as variáveis originais com maiores valores de
loadings na combinação linear das componentes principais são as mais
importantes do ponto de vista estatístico26.
q
.
p p
n
X
n
q
T
P t
n
p
= +
8
Os chamados dados brutos, ou seja, dados obtidos diretamente de uma
análise podem apresentar diversas fontes de variação. Isso causa irregularidades
sistemáticas na linha de base, ruídos instrumentais ou unidades e magnitudes.
Antes da realização do tratamento multivariado pode ser necessário um pré-
processamento para remover fontes indesejáveis de variações que podem afetar
as variáveis do conjunto de dados como um todo.
Essa etapa é muito importante para os resultados obtidos no tratamento
multivariado. Os principais pré-processamentos são o centrado na média, que
subtrai de cada elemento da linha a média de sua respectiva coluna; o
escalonamento, onde cada elemento fica na mesma escala fazendo com que
cada variável fique com o mesmo peso; auto-escalonamento, que centraliza os
dados na média e faz o escalonamento, deixando as variáveis com média zero e
desvio-padrão igual a um. Outros pré-processamentos vem sendo utilizados
como, por exemplo, a derivação. Essa etapa deve ser avaliada com cuidado e a
decisão de qual pré-processamento deve ser coerente com a natureza dos dados.
Para isso é muito importante ter conhecimento aprofundado sobre o sistema em
estudo27.
Tendo em vista a complexidade dos dados analíticos e a importância de
condições que levem a melhores resultados, com extração do maior número de
informações possível, ferramentas quimiométricas foram aplicadas a dados
multirespostas para estudar e otimizar os fatores que levam as melhores
respostas. Foram utilizados planejamentos fatoriais e de misturas com o
objetivo de eliminar fatores que não afetam os resultados e chegar a condições
que levem ao máximo em cada conjunto de dados.
No capítulo 1 o objetivo geral foi utilizar planejamento de misturas para
otimizar separações cromatográficas. Modelos de regressão foram construídos e
9
usados num programa computacional interativo para investigar a separação
cromatográfica em todo domínio experimental.
No capítulo 2 o objetivo geral foi a aplicação de planejamento de
misturas para otimizar o solvente extrator na planta medicinal Erythrina
speciosa e avaliar a influência de misturas de solventes na extração de
alcalóides, principais constituintes da planta, e identificar similaridades nas
extrações por PCA.
No capítulo 3 o objetivo geral foi utilizar planejamentos fatoriais para
avaliar a influência dos fatores na absorção de clorofila e antocianinas em
cultivares do café para otimizar as melhores condições de absorção. Um estudo
exploratório dos dados experimentais foi feito por PCA.
_____________________________________________________________
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não supervisionados: explorando procedimentos quimiométricos para tratamento de dados
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officinale) according to geographical origin using HPLC-DAD combined with
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combustion data: Data pre-processing and manifold sensitivity. Combustion and Flame. 160,
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12
13
Capitulo 1 - Otimização cromatográfica por método
computacional interativo
1.1. Introdução
Um dos problemas mais comuns para o experimentalista é determinar a
influência de vários fatores ou variáveis sobre as respostas ou propriedades de
um sistema. A Figura 1.1 descreve um sistema de natureza desconhecido com j
respostas ou propriedades que serão otimizadas manipulando os níveis de k
fatores ou condições experimentais.
Figura 1.1. Sistema de natureza desconhecida com j respostas e k fatores.
O grande desafio na otimização de sistemas químicos é simultaneamente
tratar muitas respostas. As condições experimentais que melhoram algumas
respostas muitas vezes resultam em piora nos valores de outras respostas.
Existem dois métodos sendo usados em química para otimizar sistemas
14
multirespostas. Ambos são baseados em modelos empíricos obtidos dos
resultados de um planejamento experimental1. Um dos métodos consiste na
sobreposição das curvas de níveis de superfícies para cada resposta investigada.
O pesquisador visualmente tenta achar regiões dentro do domínio experimental
para as quais todas as respostas têm valores aceitáveis. O segundo utiliza a
função de desejabilidade de Derringer e Suich. Esta função consiste de um
produto das desejabilidades individuais de cada resposta. Utilizando os modelos
empíricos que estão armazenados no computador, um algoritmo computacional
faz uma busca para as condições experimentais que maximiza a desejabilidade
global. Além de ser de uso difícil para o experimentalista e de exigir a escolha
dos valores de vários parâmetros abstratos, sua aplicação requer a especificação
de um alvo que nem sempre é fácil de definir 1.
A otimização em cromatografia é um grande passo para funcionamento
ótimo da técnica, porém é complicado achar uma condição cromatográfica que
atinja todos objetivos da análise. Um fator complicado é que os objetivos da
otimização cromatográfica podem variar consideravelmente de um caso para
outro. Por exemplo, pode ser necessária a separação de todos ou apenas de
alguns picos relevantes em um cromatograma complexo.
Um problema de interesse contínuo em cromatografia líquida é o
desenvolvimento de procedimentos práticos para otimizar processos de
separação2. Neste caso, a composição e valor de pH da fase móvel são de suma
importância bem como outros fatores, como tipo de coluna e química da fase
estacionária, temperatura, etc. Métodos multivariados de otimização baseados
em conceitos estatísticos tem bastante sucesso na otimização do sistema
extrator, bem como da fase móvel em cromatografia líquida de alta eficiência2,3.
Primeiro, porque as interações entre os fatores somente podem ser descobertas
usando-se estratégias multivariadas. Segundo, os parâmetros calculados para
15
modelos multivariados são mais precisos do que as medidas individuais usadas
para determinar o modelo. Terceiro, planejamentos multivariados economizam
experimentos. As otimizações são alcançadas usando menor tempo, menos
materiais e de uma maneira bem mais segura. O pesquisador pode sistematizar
seu trabalho usando métodos multivariados de forma bem mais objetiva do que
usando métodos convencionais de otimização 4,5.
O estado da arte em separações de picos em cromatografia líquida inclui
a utilização de modelos estatísticos obtidos de resultados de planejamentos de
experimentos para descrever como os sinais analíticos se comportam como
função das condições cromatográficas como composição da fase móvel, tipo e
temperatura da coluna, fluxo da fase móvel entre outras. As primeiras tentativas
nesse sentido envolveram o uso de funções objetivas que combinam
informações de vários pares de picos e tentam descrever a separação global de
um cromatograma. Mais de que uma dúzia de funções objetivas foram
propostas e revisadas na literatura na tentativa de otimizar as separações
cromatográficas6,7.
Diferentes critérios têm sido sugeridos na literatura para avaliar a
qualidade das separações cromatográficas. Os critérios de otimização que
descrevem adequadamente a qualidade da separação estão entre os fatores
essenciais que determinam a aplicabilidade dos procedimentos. A resolução é
critério o mais clássico de otimização8.
A resolução entre dois picos consecutivos é frequentemente escolhida
como um critério elementar na construção de funções de resposta. A resolução
de dois picos adjacentes é habitualmente definida como uma função da largura
de cada pico na base (ou a metade da altura) e a diferença nas distâncias de
retenção para os picos de interesse. Embora esta descrição possa ser aplicada, a
mesma não é usual quando há sobreposição e assimetria de picos, que
16
constituem perfis bastante comuns no caso da separação de misturas
complexas9.
A resolução pode ser calculada a partir da distância que separa os pontos
máximos dos picos (dR) e da média das larguras de suas respectivas bases (wb):
(1.1)
Quando a resolução é 1, os dois picos são razoavelmente separados. Um
valor de resolução de 1,25 é suficiente para fins quantitativos e acima de 1,5
têm-se separação completa10. Quando se pretende otimizar a resolução de
apenas dois picos, a expressão para a resolução entre os dois picos é bastante
simples. O problema se torna mais difícil quando se tenta descrever a resolução
global de um cromatograma de componentes múltiplos11.
A desvantagem no uso do critério resolução em sistemas cromatográficos
é que existem várias resoluções de pares de picos que precisam ser otimizadas
simultaneamente. Mais do que isto várias mudanças de ordem de eluição são
observadas complicando o processo de otimização das separações de misturas.
Idealmente seria mais conveniente utilizar tempos de retenção como critério
cromatográfico para otimização. Além de simplificar a modelagem para
amostras que apresentam inversão de picos, no caso dos tempos de retenção os
modelos estatísticos devem ser mais precisos do que aqueles para resoluções,
porque o tempo de retenção depende do comportamento de um pico só ao invés
de um par de picos. Mas para a otimização com metodologia conhecida, no
caso, para a função de desejabilidade é necessário um valor alvo para cálculo da
função, que não pode ser expresso em termos de tempos de retenção12.
17
A resolução também apresenta limitações. Trata-se de um critério não
normalizado, que restringe as possibilidades de combinações de valores
elementares e torna a interpretação mais difícil. Refere-se a par de picos, em
vez de picos individuais, o que implica em restrição quando o objetivo não é
separação de todos os componentes, mas a resolução de alguns compostos
particulares. A atribuição de valores é problemática quando a ordem de eluição
é alterada, por exemplo, com a mudança da composição da fase móvel13. A
Figura 1.2 descreve um planejamento tipo simplex centróide para a composição
da fase móvel, onde os valores das resoluções são representados por superfícies
de respostas que, quando sobrepostas, podem alcançar uma única região
otimizada, desde que os máximos individuais estejam nas mesmas regiões de
cada figura. Porém, em dados cromatográficos, isso se torna complicado, pois
nem sempre a região otimizada individualmente será a mesma para todos os
compostos analisados.
Figura 1.2. Esquema de otimização multiresposta para fase móvel em
cromatografia líquida.
Em otimização multiresposta, Figura 1.2, as variáveis são avaliadas
simultaneamente em relação a mais de uma resposta. Isso implica na
determinação do ponto na superfície de resposta onde em relação aos critérios
estabelecidos as respostas apresentem melhor desempenho ao mesmo tempo.
18
Os poucos métodos disponíveis para otimizar várias respostas
cromatográficas simultaneamente como sobreposição de superfícies de
respostas e o método de desejabilidade de Derringer e Suich que são úteis em
termos de resolução entre pares de picos e retenções relativas. Infelizmente isto
não é possível usando tempos de retenção porque as propriedades a serem
otimizadas dependem das localizações de mais do que um pico.
Devido à importância dos critérios de separação cromatográfica, foram
comparados três parâmetros: tempo de retenção, resolução e largura na base dos
picos com o objetivo de comparar as precisões de modelos obtidos de
planejamentos de experimentos. Isso permitirá avaliar a viabilidade do uso de
modelos de tempo de retenção juntamente com a computação gráfica na
otimização multiresposta de sistemas cromatográficos. Tendo em vista as
vantagens em fazer modelagem estatística usando tempos de retenção, que trata
picos individuais, o desenvolvimento de um método de otimização por
simulação dos comportamentos de picos cromatográficos com mudanças nas
condições cromatográficas foi utilizado.
A simulação foi feita com base em um programa de computação gráfica
desenvolvido na Universidade Estadual de Londrina pelo Professor Doutor
Carlos Alberto Paulinetti da Camara. Através do ponteiro do mouse escolhe-se
um conjunto de condições dentro do domínio experimental já investigado por
planejamento de experimentos. Os valores das condições cromatográficas serão
substituídos nos modelos estatísticos onde o tempo de retenção de todos os
picos cromatográficos de interesse é calculado. Esses tempos são então exibidos
graficamente na tela de computador. O usuário manipula o mouse dentro do
domínio experimental até conseguir obter um cromatograma simulado que
satisfaça os objetivos previamente definidos, como a maximização das
resoluções de todos os picos.
19
1.2. Parte experimental
O conjunto de dados cromatográficos utilizado foi obtido em
experimentos realizados no laboratório da Professora Doutora Isabel Cristina
Sales Fontes Jardim, no Instituto de Química da Universidade Estadual de
Campinas.
Uma mistura complexa envolvendo onze agrotóxicos foi analisada por
cromatografia liquida de alta eficiência com detector do tipo arranjo de diodos.
A mistura de agrotóxicos foi composta de imazetapir (Im), imazaquim (Iz),
ametrina (Am), cianazina (Ci), simazina (Si), atrazina (At), bentazona (Be),
carbaril (Ca), carboxim (Cx), tiofanato metílico (Tm) e metsulfuron (Me). Essa
mistura de agrotóxicos apresentou problemas de sobreposição de picos em
trabalhos anteriores14.
Um planejamento simplex centróide foi empregado para a fase móvel. Os
três modificadores orgânicos mais usados em cromatografia líquida em fase
reversa são acetonitrila, metanol e tetrahidrofurano, que correspondem
respectivamente aos pontos 1, 2 e 3 do planejamento, Figura 1.3. A água foi
usada para ajustar as misturas de forma que os três solventes apresentassem
mesma força cromatográfica.
As condições cromatográficas foram: temperatura ambiente, eluição
isocrática (acidificada a pH 3 com ácido fosfórico) de 1 mL/min. Foram
utilizadas duas colunas recheadas com as seguintes fases estacionárias: SGE
C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm) e Thermo Hypersil ODS
C18 (4,6 x 150 mm, partículas de 5 µm). As corridas foram realizadas
empregando-se um cromatógrafo a líquido marca Shimadzu, constituído de
auto injetor com amostragem programada de 10 µL, modelo SIL-10AF;
bombas de alta pressão, tipo recíproca, pistão duplo, modelo LC-10AT;
20
detector espectrofotométrico de arranjo por diodos, cela do injetor de 8 µL de
volume, 10 mm de caminho óptico, modelo SPD-M10AVP; sistema de
aquisição de dados: microcomputador, com software de aquisição de dados
cromatográficos Class VP; forno para coluna, modelo CTO-10AS; controlador
de sistema SCL-10 A.
Figura 1.3. Planejamento simplex centróide utilizado para determinação das
composições de FM a serem utilizadas. ACN = ACN:H2O 30:70 (v/v); MeOH
= MeOH:H2O 45:55 (v/v); THF = THF:H2O 30:70 (v/v).
Para cada coluna foram gerados dois conjuntos de dados, nos quais a
composições (v/v) de fase móvel dos vértices do planejamento simplex
centróide foram:
1) ACN:H2O (30:70); MeOH:H2O (45:55); THF:H2O (30:70).
2) ACN:H2O (55:45); MeOH:H2O (70:30); THF:H2O (50:50).
Foram gerados dois conjuntos de dados, utilizando as mesmas condições
cromatográficas com exceção da coluna, que foi variada entre a coluna SGE e
a coluna Thermo descritas acima. Porém, os experimentais não foram uteis
para fins de previsão, pois apresentaram falta de ajuste para praticamente todos
21
os agrotóxicos. Como alternativa, o conjunto de dados apresentados nos
cálculos foi gerado por Marcia Breitkreitz14 com uma coluna SGE (idêntica à
descrita acima) nas condições de fase móvel 1 demonstrada acima.
1.3. Tratamento multivariado
1.3.1. Tempo de retenção
Os tempos de retenção para cada agrotóxico analisado, em todas as
misturas do planejamento e suas réplicas, são apresentados da Tabela 1.1:
Tabela 1.1. Tempos de retenção, em minutos, para os agrotóxicos analisados
em cada mistura do planejamento experimental e sua réplica em minutos. ACN MeOH THF Im Si Iz Am Ci Tm Me At Be Ca Cx
1 0 0 9,75 10,41 11,30 11,30 13,86 14,82 17,70 18,43 20,00 6,41 22,15
0 1 0 11,97 13,60 19,60 9,53 11,97 13,60 22,28 22,25 15,73 9,46 15,17
0 0 1 9,25 9,91 13,93 10,50 18,78 7,68 15,46 15,50 9,60 5,01 12,20
0,5 0,5 0 12,20 15,45 17,81 12,20 16,20 18,35 22,76 22,75 20,20 10,07 20,20
0,5 0 0,5 8,45 7,28 10,80 9,15 14,87 8,45 15,27 14,40 11,85 5,37 13,27
0 0,5 0,5 8,94 6,89 12,89 8,94 17,37 8,34 15,83 15,13 11,21 4,97 12,48
0,33 0,33 0,33 5,74 9,17 8,10 12,60 9,17 16,02 9,67 16,04 16,02 13,27 14,02
1 0 0 9,26 9,73 10,65 10,65 12,85 13,56 18,47 17,15 18,40 6,08 20,45
0 1 0 12,20 13,25 10,03 9,95 12,72 14,02 22,20 22,16 15,92 9,51 15,40
0 0 1 9,35 6,87 14,76 10,67 19,54 7,64 15,98 15,96 9,73 4,90 12,44
0,5 0,5 0 12,45 16,10 18,69 12,45 16,79 19,22 23,66 23,68 21,08 9,84 21,08
0,5 0 0,5 8,83 7,57 11,71 9,62 15,92 9,15 14,38 15,25 12,54 5,52 14,04
0 0,5 0,5 9,22 7,06 13,89 9,22 18,26 8,60 15,13 15,79 11,67 5,03 12,97
0,33 0,33 0,33 5,63 9,26 8,09 13,01 9,26 16,51 9,75 16,53 16,51 13,59 14,42
22
Com as respostas de tempo de retenção para cada um dos agrotóxicos
foram construídos modelos de regressão para obter uma relação que nos
permitisse prever estes valores de tempo de retenção como função dos valores
de proporções dos solventes. Primeiramente foi aplicado o modelo linear,
porém a análise de variância utilizada para testar o ajuste do modelo no nível de
95% de confiança apresentou equação inadequada para representar
precisamente os dados.
O modelo quadrático foi avaliado quanto ao ajuste dos dados no nível de
95% de confiança e os resultados da ANOVA para esse teste estão apresentados
na Tabela 1.2, assim como o teste para significância da regressão.
Tabela 1.2. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média quadrática
dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e media
quadrática do erro puro (MQep) dos modelos de tempo de retenção. Agrotóxico MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*
Imazetapir 10,55 1,46 1,44 0,02 7,20 72,00
Simazina 5,40 0,65 0,61 0,04 8,24 14,36
Imazaquim 26,06 4,60 3,86 0,74 5,67 5,21
Ametrina 13,87 10,80 3,98 6,82 1,28 0,58
Cianazina 3,10 1,28 1,21 0,07 2,43 16,94
Tiofanato 13,47 1,20 0,87 0,33 11,22 2,62
Metsulfuron 38,62 7,01 6,79 0,22 5,51 30,80
Atrazina 0,40 7,90 1,21 6,69 0,05 0,18
Bentazona 27,40 2,44 2,14 0,29 11,25 7,28
Carbaril 39,85 2,32 2,02 0,30 17,20 6,76
Carboxin 32,65 2,24 1,90 0,34 14,58 5,58
*Valor de F para significância dos resultados dado por MQR/MQr e para
falta de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de
95% de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.
A razão MQfaj/MQep é usada para avaliar se o modelo está ou não bem
ajustado as observações. Valores altos dessa razão significam maior falta de
23
ajuste. O valor dessa razão é comparado com o valor de F tabelado com os
graus de liberdade correspondentes, que nesse caso é 1 e 7.
O valor de F 1,7 é 5,59 e com base na Tabela 1.2, o imazetapir, a simazina,
a cianazina e metsulfuron apresentaram falta de ajuste no nível de 95% de
confiança. A bentazona e o carbaril estão bem próximos do valor tabelado, já o
imazaquim, ametrina, tiofanato, atrazina e o carboxin apresentaram valores
menores ao valor de Ftab para o modelo quadrático.
No nível de 95% de confiança F5,8 é 3,69. Nesse caso a regressão é
estaticamente significativa se MQR/MQr > 3,69. Com base na Tabela 1.2,
apenas a ametrina, cianazina e a atrazina não apresentam significância
estatística da regressão, porém nenhuma razão tem valor altamente
significativo.
Os dados foram testados em relação ao ajuste com o modelo linear,
porém ocorreu falta de ajuste para todos os agrotóxicos. O modelo cúbico
especial também foi testado, mas não apresentou resultados mais satisfatórios
do que o modelo quadrático.
Para testar modelos mais superiores é necessário um número bem maior
de experimentos e as funções assim obtidas teriam comportamentos complexos
e dificilmente seriam representadas por polinômios de baixa ordem. Como
resultado os modelos estatísticos determinados para tempos de retenção não
representaram precisamente os resultados experimentais.
1.3.2. Resolução
Muitos problemas que assolam tradicionais funções cromatográficas de
resposta ou de critérios de separação podem ser atribuídos às sobreposições de
picos, situação em que dificilmente se obtém informações suficientes quanto ao
24
número de componentes, grau de pureza e de sobreposição de pico a partir de
uma única resposta no cromatograma16.
No caso da mistura de agrotóxicos o uso da resolução tornou-se
complicado devido à enorme inversão de picos de um ponto do planejamento
simplex centróide em relação aos outros. A ordem de eluição obtida no
cromatograma do ponto central foi tomada como base para os possíveis pares
de picos e esta ordem pode ser vista na Figura 1.4.
5 10 15 20 25
40
60
80
100
120
140
160
180
2001/3ACN:1/3MeOH:1/3THF
6+8+9
11
10
4
7
2+5
31
Inte
nsid
ade d
e a
bsorb
ância
Tempo / min
Figura 1.4. Cromatograma obtido na separação de onze agrotóxicos
empregando coluna SGE C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm),
volume de injeção 10 μL, FM 1/3 ACN:H2O 30:70 (v/v), 1/3 MeOH:H2O 45:55
(v/v), 1/3 THF:H2O 30:70 (v/v), totalizando uma mistura final de
ACN:MeOH:THF:H2O 10:15:10:65 (v/v), vazão 1,0 mL/min, detecção em 210
nm e temperatura ambiente. Agrotóxicos: 1 = imazetapir, 2 = simazina,
3=imazaquim, 4 = ametrina, 5 = cianazina, 6 = tiofanato, 7 = metsulfuron, 8 =
bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin.
25
A Tabela 1.3 agrupa os valores de resolução para cada par de picos,
calculados de acordo com a equação 1. Os pares de picos seguindo a ordem da
Figura 1.4 e seus valores de resolução estão na Tabela 1.3.
Tabela 1.3. Valores de resolução para os pares de picos usando como base a
ordem de eluição do cromatograma obtido no ponto central. ACN MeOH THF 1 e 3 3 e 2 2 e 5 5 e 7 7 e 4 4 e 10 10 e 11 11 e 6 6 e 8 8 e 9
0 1 0 9,30 -1,45 3,46 8,08 -8,08 20,08 4,96 -19,04 9,00 1,50
1 0 0 9,00 -2,54 -5,19 9,42 11,47 -7,15 -1,15 -6,23 1,38 21,46
0,5 0,5 0 4,38 5,54 2,77 -6,69 14,54 -9,92 6,00 15,23 -4,38 -3,23
0 0,5 0,5 13,15 -7,62 0 14,08 -1,15 5,54 0 -9,23 2,77 12,46
0 0 1 4,38 2,77 1,62 -1,62 5,31 2,54 3,23 3,69 2,08 -3,23
0,5 0 0,5 4,45 4,71 0 -1,25 10,39 -3,92 3,00 11,54 -2,31 -3,12
0,33 0,33 0,33 5,42 2,54 0 1,13 6,97 1,43 1,62 4,73 0 0
1 0 0 8,31 -0,92 3,00 6,92 -6,92 18,00 4,85 -17,77 8,31 1,62
0 1 0 9,46 -3,69 -5,77 9,46 13,85 -9,00 -1,15 -7,39 -2,31 21,46
0 0 1 4,62 5,77 2,77 -6,92 16,62 -11,77 6,23 16,62 -4,85 -3,46
0,5 0,5 0 13,85 -8,54 0 15,69 -1,15 5,31 0 -9,69 2,77 13,15
0,5 0 0,5 4,85 2,77 1,85 -0,92 5,77 2,08 3,23 4,38 2,08 -3,46
0 0,5 0,5 4,85 4,85 0 -1,38 12,23 -5,08 3,00 12,23 -2,54 -3,23
0,33 0,33 0,33 5,54 2,77 0 0,92 7,62 1,38 1,85 4,85 0 0
Os valores de resolução para todos os pontos do planejamento simplex
centróide foram submetidos a análise de variância ANOVA para testar o ajuste
do modelo quadrático aos dados. A Tabela 1.4 apresenta os valores para estimar
a significância da regressão e da falta de ajuste no nível de 95% de confiança.
Para testar a falta de ajuste, o valor tabelado de F 1,7 foi 5,59. Com base
na Tabela 1.4, a maioria dos pares de picos apresentou falta de ajuste. Os pares
1-3, 3-2, 2-5, 5-7 apresentaram alto valor de MQfaj/MQep indicando que o
modelo quadrático não se ajusta aos dados. Os pares 4-10, 10-11, 11-6 e 6-8
não apresentaram falta de ajuste. E os pares 7-4 e 8-9 têm valores calculados
próximos do valor tabelado podendo ser ajustados ao modelo quadrático.
26
Tabela 1.4. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média quadrática
dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e média
quadrática do erro puro (MQep) para modelos de resolução. Pares de picos MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*
1 -3 26,80 5,74 5,59 0,15 4,67 37,05
3 - 2 55,39 11,53 11,34 0,19 4,80 61,28
2 - 5 20,05 0,66 0,62 0,04 30,37 14,52
5 - 7 132,93 13,81 13,48 0,32 9,63 41,59
7 - 4 157,97 9,53 8,44 1,10 16,58 7,70
4 - 10 239,66 0,91 0,03 0,91 263,36 0,03
10 - 11 15,93 0,01 0,04 0,09 1592,55 0,48
11 - 6 363,07 1,39 0,96 0,43 261,20 2,22
6 - 8 43,54 1,59 0,57 1,03 27,38 0,55
8 - 9 225,23 0,49 0,46 0,04 459,66 10,40
*Valor de F para significância dos dados dado por MQR/MQr e para falta
de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de 95%
de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.
A regressão é estaticamente significativa se MQR/MQr > 3,69. Com base
na Tabela 1.4, todos os pares de picos apresentam significância estatística da
regressão.
As variáveis em questão, proporções de acetonitrila, metanol e
tretrahidrofurano, exercem influência sobre a resposta do cromatograma.
Mudando-se a composição da fase móvel, a separação da mistura analisada
também muda. As misturas binárias entre esses solventes também tem efeito
significativo diante da resposta cromatográfica. Um modelo mais complexo
poderia ser testado, visando melhorar a falta de ajuste e significância da
regressão, porém seria necessária uma grande quantidade de experimentos.
27
1.3.3. Largura da base
O tempo de retenção e a resolução são regularmente aplicados para
avaliar a qualidade do cromatograma obtido, já os valores referentes à largura da
base, ou seja, a distância entre as tangentes traçadas nas laterais do pico, não são
comumente usados, mas de qualquer maneira foram testados para avaliar a falta
de ajuste e a significância da regressão. Isso é importante porque além de simular
o tempo de retenção de cada pico no programa computacional também é
necessário prever a largura dos picos para se ter uma indicação da separação real
entre os picos.
A Tabela 1.5 contém os valores de largura da base dos picos
cromatográficos para cada agrotóxico presente na mistura estudada. Esses valores
foram obtidos pela subtração: X2 – X1, como representado na Figura 1.5:
Figura 1.5. Representação gráfica do cálculo da largura da base para os picos
cromatográficos de cada agrotóxico estudado.
28
Tabela 1.5. Valores de largura da base para os picos cromatográficos de cada
agrotóxico estudado. ACN MeOH THF Im Si Iz Am Ci Tm Me At Be Ca Cx
1 0 0 0,44 0,66 0,6 0,76 0,76 0,76 0,75 0,69 0,81 1,11 0,92
0 1 0 0,46 0,65 0,71 1,15 0,64 0,44 0,53 0,71 1,10 1,43 1,43
0 0 1 0,3 0,91 0,48 0,84 0,66 0,68 0,54 0,78 0,82 0,94 0,53
0,5 0,5 0 0,53 0,91 1,57 1,73 0,91 1,57 1,73 1,73 1,20 1,21 1,21
0,5 0 0,5 0,30 1,14 0,44 0,56 1,20 1,10 1,14 0,62 1,08 0,66 0,54
0 0,5 0,5 0,30 0,66 0,40 0,98 0,66 0,56 0,38 0,70 0,76 0,59 0,98
0,33 0,33 0,33 0,34 1,01 0,41 1,36 1,01 1,30 1,01 1,30 1,30 1,36 0,43
1 0 0 0,50 0,47 0,50 0,78 0,78 0,63 0,69 0,65 0,86 1,09 0,71
0 1 0 0,93 0,92 0,93 1,06 0,93 0,92 0,93 1,49 1,10 1,37 1,37
0 0 1 0,51 0,87 0,44 0,75 0,76 0,81 0,47 0,87 0,78 0,87 0,51
0,5 0,5 0 0,47 0,86 1,39 2,02 0,86 1,39 2,02 2,02 1,09 1,14 1,14
0,5 0 0,5 0,35 1,19 0,37 0,47 1,19 1,20 1,19 0,65 1,20 0,70 0,56
0 0,5 0,5 0,29 0,59 0,36 0,69 0,59 0,65 0,42 0,77 0,84 0,67 0,42
0,33 0,33 0,33 0,36 1,07 0,46 1,16 1,07 1,07 1,07 1,07 1,07 1,16 0,46
Com base na Tabela 1.6, podemos observar que os valores maiores que
MQR/MQr > 3,69 são poucos e que nenhuma das medidas de largura de base
apresentou um grande valor de significância estatística no nível de 95% para o
modelo quadrático, portanto não sendo muito úteis para fins de previsão.
O valor tabelado de F 1,7 é 5,59. Com base na Tabela 1.6, a falta de ajuste
foi alta apenas para os agrotóxicos imazaquim e carbaril. Os demais
agrotóxicos apresentaram valores de MQfaj/MQep baixos, indicando o bom
ajuste ao modelo quadrático.
29
Tabela 1.6. Valores de média quadrática da regressão (MQR) média quadrática
dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e média
quadrática do erro puro (MQep) para modelos de largura da base. Agrotóxico MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*
Imazetapir 0,05 0,02 0,00 0,02 2,25 0,04
Simazina 0,11 0,02 0,01 0,01 5,11 1,39
Imazaquim 0,34 0,17 0,17 0,01 1,98 22,99
Ametrina 0,48 0,04 0,02 0,02 13,59 1,12
Cianazina 0,09 0,02 0,01 0,01 5,45 1,30
Tiofanato 0,27 0,03 0,00 0,03 10,36 0,01
Metsulfuron 0,58 0,11 0,09 0,02 5,36 4,87
Atrazina 0,07 0,02 0,02 0,01 3,19 2,65
Bentazona 0,46 0,06 0,00 0,05 8,23 0,02
Carbaril 0,14 0,35 0,35 0,00 0,38 79,25
Carboxin 0,29 0,16 0,13 0,03 1,79 5,05
*Valor de F para significância dos dados dado por MQR/MQr e para falta
de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de 95%
de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.
Portanto, independente dos critérios usados para modelos de regressão, o
sistema cromatográfico estudado mostrou-se complexo e de difícil separação.
Sendo o tempo de retenção o critério mais simples por tratar os picos de forma
individual, os resultados obtidos foram usados para simular a separação
cromatográfica no programa computacional.
1.4. Programa Computacional
A escolha e validação dos modelos que foram usados na simulação
usando o programa computacional foram definidos pelos resultados das
ANOVA das regressões para tempos de retenção. Para isso, foram utilizados os
tempos de retenção dos onze agrotóxicos analisados estatisticamente de acordo
com o planejamento simplex centróide. Após inserir os coeficientes dos
30
modelos da regressão no programa, com o ponteiro do mouse foi simulada a
separação dos 11 compostos e a separação simulada foi então comparada com
os cromatogramas reais obtidos em cromatografia liquida de alta eficiência em
fase reversa (Figura 1.6).
(a)
31
(b)
5 10 15 20 25
0
20
40
60
80
100
11
10
9
876
4+5
3
2
1
Inte
nsid
ade d
e a
bsorb
ância
Tempo / min
(c)
Figura 1.6. ACN:H2O 30:70 (v/v) do planejamento (a), cromatograma
simulado pelo programa computacional; (b) cromatograma experimental; (c)
cromatograma simulado. Ordem de eluição: 1 = imazetapir, 2 = simazina,
3=imazaquim, 4 = ametrina, 5 = cianazina, 6 = tiofanato, 7 = metsulfuron, 8 =
bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin.
Para exemplificar, observamos à similaridade do comportamento
experimental com o obtido pelo programa computacional (Figura 1.5) em
32
relação à separação e ordem de eluição dos agrotóxicos analisados no ponto
indicado pela seta que corresponde a ACN: H2O. Essa similaridade nos
permitiu avaliar todo espaço do simplex e em cada ponto obter a separação
simulada. Assim, todas as combinações possíveis de misturas de fase móvel
podem ser avaliadas.
1.5. Conclusões 1
De acordo com o estudo realizado no capitulo 1 concluímos que:
1) A resolução e tempo de retenção mostraram a mesma dificuldade em
ajustar um modelo matemático aos dados experimentais. Ambos os
parâmetros cromatográficos apresentaram falta de ajuste para vários
agrotóxicos presente na mistura.
2) A maioria dos modelos para largura dos picos não mostraram falta de
ajuste significativa e também uma branda dependência em mudanças no
domínio experimental, ou seja, não apresentaram significância na
regressão. Isto significa que podemos ter menos preocupação com a
largura dos picos em tentativas de prever informações cromatográficas.
3) Mesmo utilizando um método cromatográfico isocrático de separação,
uma boa separação cromatográfica foi obtida com o planejamento de
misturas, pois os picos que não foram separados seriam facilmente
separados com espectrometria de massas.
_____________________________________________________________
1 SNYDER, L. R.; KIRKLAND, J. J. Introduction to modern liquid chromatography, 2 ed.
New York, John Wiley & Sons, 1979. 2 GARCIA, L. M. Z.; OLIVEITA, T. F.; SOARES, P. K.; BRUNS, R. E.; SCARMINIO, I.
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33
interactions for natural product extractions. Chemometrics and Intelligent Laboratory
Systems. 103, 1 - 7, 2010, 3 SOARES P. K.; BRUNS, R. E.; SCARMINIO, I. S. Statistical mixture design—Varimax
factor optimization for selective compound extraction from plant material. Analytica
Chimica Acta. 613, 48-55, 2008. 4 ALMEIDA, A. A.; SCARMINIO, I. S. Statistical mixture design optimization of extraction
media and mobile phase compositions for the characterization of green tea. Journal of
separation science. 30, 414 - 420, 2007. 5 BERRIDGE, J. C. Unattended optimization of normal phase high-performance liquid
chromatography separations with a microcomputer controlled chromatograph.
Chromatographia, 16, 172-174, 1982. 6 SIOUFFI, A. M.; PHAN-TAN-LUU, R. Optimization methods in chromatography and
capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A, 892, 75–106, 2000, 7 VANBEL, P.F. Development of flexible and efficient strategies for optimizing
chromatographic separations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 21, 603
610, 1999. 8 DUARTE, R. M.B.O.; DUARTE, A. C. A new chromatographic response function for use
in size-exclusion chromatography optimization strategies: Application to complex organic
mixtures. Journal of Chromatography A. 1217, 7556–7563, 2010, 9 COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Fundamentos de
cromatografia. Campinas: UNICAMP, 2006. 10 DIVJAK, B.; MODER, M.; ZUPAN, J. Chemometrics approach to the optimization of ion
chromatographic analysis of transition metal cations for routine work. Analytica Chimica
Acta. 358, 305-315, 1998. 11 BOURGUIGNON, B.; MASSART, D. L. Simultaneous optimization of several
chromatographic performance goals using Derringer’s desirability functior. Journal of
Chromatography. 586, 11-20, 1991. 12 GARCIA, A. C. M. C.; TORRES, L. J. R.; BAEZA, B. J.J. Models and objective
functions for the optimization of selectivity in reversed-phase liquid chromatography.
Analytica Chimica Acta. 579, 125–145, 2006. 13 FOGLIATTO, Flávio Sanson. Otimização de experimentos com variáveis de resposta
descritas por perfis. 28, 577-595, 2008. 14 BREITKREITZ, M. C.; JARDIM, I. C. S. F.; BRUNS, R.E. Combined column–mobile
phase mixture statistical design optimization of high-performance liquid chromatographic
analysis of multicomponent systems. Journal of Chromatography A. 1216, 1439–1449,
2009. 15 BREITKREITZ, M.C. Otimização simultânea de variáveis de processo e mistura em
cromatografia líquida de alta eficiência. Dissertação de mestrado, Universidade Estadual de
Campinas, 2007.
34
16 XU, L.; TANG,L.J.; CAI,C.B.; WU,H.L.; SHEN,G.L.; QIN YU, R.; JIANG, J.H.
Chemometric methods for evaluation of chromatographic separation quality from two-way
data—A review. Analytica Chimica Acta. 613, 121–134, 2008.
35
Capitulo 2 – Otimização do solvente extrator de alcalóides nas
flores, caule e folhas de Erythrina speciosa Andrews
2.1. Introdução
O gênero Erythrina compreende mais de 100 espécies de árvores,
arbustos e plantas rasteiras que estão distribuídas por todas as regiões tropicais
do mundo. No Brasil são encontradas cerca de 11 espécies deste gênero,
destacando-se Erythrina speciosa, que se encontra amplamante distribuída
pelas regiões sul e sudeste. Extratos de Erythrina são utilizados popularmente
no combate a desinterias, asma e infecções microbianas, além de possuírem
atividades ansiolíticas. Este gênero é conhecido pela produção de alcalóides de
esqueleto do tipo eritrínico, contendo um sistema do tipo espiro único, sendo
marcadores destas espécies. Também são encontrados em espécies de Erythrina
diversos outros metabólitos secundários tais como: flavonoides, isoflavonóides
e terpenóides1-4.
As atividades biológicas de Erythrina são atribuídas aos alcalóides
eritrinicos presentes como constituintes majoritários em todas as partes da
planta. O mais abundante destes alcalóides, denominado erisotrina, apresenta
elevada atividade ansiolítica, o que desperta interesse em seus análogos
estruturais tais como derivados mais hidroxilados e metoxilados5.
Os alcalóides são continuamente estudados devido às diferentes
atividades biológicas a eles atribuídas. São conhecidos por seu acentuado efeito
no sistema nervoso, sendo muitos deles utilizados como venenos ou
alucinógenos. O estudo de espécies de Erythrina foi estimulado após a
verificação, entre os anos de 1930 e 1940, que extratos de sementes de várias
36
espécies continham alcalóides com atividade fisiológica semelhante à ação do
curare. Desde então, são vários os exemplos de alcalóides isolados de diferentes
espécies do gênero. Os interesses medicinais pelos alcalóides são muitos,
podemos destacar o uso no tratamento da leishmaniose, doença endêmica que
causa problema em torno de 88 países em 4 continentes. Brasil, Bangladesh,
Índia, Peru, Iran, Arábia Saudita e alguns países da África são os mais
atingidos6.
Em trabalhos anteriores com algumas espécies de Erythrina, em geral
foram utilizados solventes puros para a extração destes alcalóides. Entretanto,
em certas extrações solventes puros não são os melhores extratores e nestes
casos torna-se necessário a utilização de misturas de solventes, que podem
variar de simples misturas binárias até misturas multicomponentes. O
planejamento estatístico de misturas fornece uma base para um estudo
sistemático de solventes sobre produtos naturais7. Estes experimentos são ideais
não apenas para comparar os efeitos de solventes puros, como também para
determinar efeitos sinérgicos e/ou antagonísticos de misturas de solventes.
Efeitos sinérgicos entre os componentes da mistura levam a um aumento na
quantidade dos compostos extraídos.
De acordo com a literatura, planejamentos de mistura vêm apresentando
ótimos resultados para otimização do solvente extrator em plantas medicinais8.
Uma mistura de igual proporção de água, metanol, acetona e etanol apresentou
melhores rendimentos para extratos de Trichilia catigua, comumente conhecida
como catuaba9. Misturas binárias entre vários solventes extratores também
apresentaram melhores rendimentos do que os solventes puros para extração em
Mikania laevigata Sch. Bip. conhecida como guaco10. O diclorometano, etanol
e hexano puros, assim como suas misturas, apresentaram as melhores respostas
37
em termos de rendimentos da extração através do planejamento de mistura para
Erythrina speciosa11.
Os métodos modernos de classificação de solventes são baseados no
sistema de classificação introduzido por Snyder, que classificou mais de oitenta
solventes em oito grupos de acordo com as suas propriedades. Embora a
produção da maioria dos fitoterápicos inclua procedimentos de extração, pouca
atenção tem sido dada à seleção de solventes adequados ou sistemas de
solventes para a extração sólido-liquido para o isolamento ou para fins de
produção. Este pode ser o motivo por trás do fato que as extrações sólido-
líquido são geralmente baseadas em tentativa e erro. Com base nessa
classificação dos solventes, um conjunto de três parâmetros foi criado para
descrever a acidicidade (α), que descreve a habilidade do solvente para formar
ligações de hidrogênio com o soluto; basicidade (β), que mede a tendência do
solvente em doar um par de elétrons (ou aceitar um próton) em ligações de
hidrogênio com o soluto; e dipolaridade (π) que é um termo que mede a
dipolaridade/polarizabilidade do solvente, ou seja, sua capacidade para
estabilizar uma carga ou um dipolo em virtude de seu efeito dielétrico12. Os
valores destes parâmetros para diferentes solventes foram derivados da
espectroscopia (daí o nome solvatocrômico) e de outras medidas, que foram
especificamente designadas para a medida de uma única interação. Os valores
dos parâmetros solvatocrômicos são as médias de resultados obtidos com vários
solutos investigados para cada parâmetro, em contraste com os parâmetros do
triângulo de seletividade de solvente, o qual se baseia na propriedade
termodinâmica de um único soluto13.
O solvatocromismo é produzido pela diferença na solvatação do estado
fundamental e do primeiro estado excitado da molécula que absorve a luz (ou o
seu cromóforo). A solvatação das moléculas do soluto pelas do solvente resulta
38
de forças físicas intermoleculares soluto-solvente, tais como: íon-dipolo,
dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido (forças de dispersão) e ligações de
hidrogênio. Essas interações soluto-solvente alteram a diferença de energia
entre os estados fundamental e excitado do soluto14,15.
A união entre a espectrometria de massas (MS) e a ideia de análise de
perfil químico forma um dos pilares da metabolômica, área que vem crescendo
de forma vertiginosa nos diversos campos da ciência e que tem como uma de
suas propostas o entendimento mais amplo de metabolismo de um organismo16-
19.
Na espectrometria de massas o analito neutro, em fase sólida, líquida ou
gasosa, deve ser convertido em íons na fase gasosa previamente à análise. Os
métodos de ionização empregados podem ser divididos em dois tipos: os que
requerem a amostra em fase gasosa e aqueles que provocam dessorção em
amostras sólidas ou líquidas. A vantagem do último é que pode ser aplicado
para amostras não voláteis e/ou termicamente instáveis. O princípio de
funcionamento de qualquer espectrômetro de massas baseia-se na detecção de
íons selecionados de acordo com a sua razão massa/carga (m/z), sendo m a
massa em u (massa atômica unificada, chamada também de Dalton (Da)) e z a
carga formal. A sofisticação surge nos métodos que são usados para a geração
desses mesmos íons e no modo de analisá-los20.
Diversos tipos de espectrômetros de massas existem cada qual com suas
vantagens e limitações. Porém, todos apresentam os mesmos componentes
básicos: sistema de introdução de amostra, fonte de ionização, analisador de
massas e detector. A estrutura básica de um espectrômetro de massas é
apresentada na Figura 2.1. Na fonte de íons, os componentes neutros de uma
amostra são convertidos em íons positivos ou negativos e os mesmo são
imediatamente acelerados em direção ao analisador de massas. A função do
39
analisador de massas é separar tais íons de acordo com suas relações m/z e são
os tipos de analisadores que classificam as várias categorias dos espectrômetros
de massas. Por último, o detector recebe os íons que foram separados pelo
analisador, transformando a corrente de íons em sinais elétricos que são
processados, armazenados na memória de um computador e apresentados na
tela.
Figura 2.1. Componentes básicos de um espectrômetro de massas.
O surgimento da técnica de ionização denominada ionização por
eletrospray (ESI) após estudos de Yamashita e Fenn tornou a espectrometria de
massas uma das técnicas analíticas mais poderosas e amplamente utilizadas.
Dentre suas vantagens incluem a alta detectabilidade e seletividade, facilidade
do uso e pouco consumo de amostra21.
Nessa técnica, íons positivos e negativos são formados previamente em
solução mediante reações ácido-base. Em outras palavras, em solução os
analitos com caráter básico são geralmente protonados (H+) formando íons
positivos, ao passo que analitos com caráter ácido são desprotonados gerando
íons negativos. Então, a transferência dos íons de interesse para a fase gasosa
requer essencialmente dois passos: a dispersão do líquido em gotas altamente
40
carregadas à pressão atmosférica, seguida por condições que permitam a
evaporação da gota. Como resultado, são produzidos íons em fase gasosa por
um processo brando, sem fragmentação. A implementação de uma fonte de
ESI é bastante simples se comparada com outras fontes utilizadas em
espectrometria de massas. É necessária uma fonte de alta tensão que esteja em
contato com a solução contendo os analitos. Esta solução é transmitida através
do capilar, onde é aplicado um potencial positivo ou negativo forçando um
processo de oxi-redução e consequentemente a formação de algumas espécies
sem seus contra-íons. Assim, a gota sendo formada na ponta do capilar estará
enriquecida por íons positivos ou negativos dependendo do potencial aplicado.
Conforme a densidade de carga aumenta na gota presa à ponta do capilar, o
campo elétrico formado entre o capilar e o contra-eletrodo aumenta provocando
uma deformação na gota. A gota ganha forma de um cone, o qual é denominado
de cone de Taylor. Quando a densidade de carga supera a tensão superficial, a
gota se desprende do capilar subdividindo-se em uma névoa fina de gotículas.
A frequência deste último processo depende da magnitude do campo elétrico,
da tensão superficial do solvente e da condutividade da solução22,23.
Portanto, a espectrometria de massas com ionização por ESI (ESI-MS) é
uma técnica muito sensível para investigação de alcalóides por causa de sua boa
eficiência na formação de íons em fase gasosa, já que alcalóides sempre são
moléculas nitrogenadas com caráter básico e portanto fáceis de serem
protonadas, gerando íons abundantes. Durante a última década a técnica de ESI-
MS foi aplicada com êxito na análise e caracterização de alcalóides
diversos17,18,19. Além disso, a técnica de ESI-MS pode ser hifenada com
separação prévia por cromatografia líquida de alta eficiência, ampliando a
aplicabilidade da técnica.
41
Neste trabalho um planejamento simplex centróide envolvendo hexano,
diclorometano e etanol foi usado para avaliar a extração do material botânico de
Erythrina speciosa. Modelos de misturas foram usados para avaliar a
importância dos efeitos de cada solvente e suas misturas na eficiência de
extração de alcalóides de esqueleto eritrínico 11-metoxi-erisodina e erisotrina,
componentes majoritários da Erythrina speciosa. A otimização em processos de
extração é uma etapa fundamental para o estudo sobre a composição da planta.
Mais especificamente nesse caso, como se tratam de compostos químicos de
interesse para indústria farmacêutica, tornam-se de extrema importância estudos
de otimização em extrações. A análise das componentes principais foi aplicada
aos dados de cromatografia liquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria
de massas com ionização por electrospray para estudar a composição dos
alcalóides presentes nas flores, caule e folhas de Erythrina speciosa bem como
a melhor mistura para extraí-los.
2.2. Experimental
Os aspectos relacionados às análises da planta Erythrina speciosa serão
abordados nesse capitulo. Um resumo de procedimento experimental está
representado na Figura 2.2.
42
Figura 2.2. Procedimentos experimentais empregados na análise da planta
Erythrina speciosa.
Todos os solventes orgânicos utilizados foram de grau HPLC
(Mallinckrodt, Philipsburg, USA). A água pura utilizada para as separações
cromatográficas foi obtida de um sistema de purificação Milli-Q (Millipore,
Billerica, USA).
2.2.1. Material botânico
As flores, caule e folhas da Erythrina speciosa foram coletadas na
Universidade Estadual de Campinas, seguindo os mesmos padrões: livres de
qualquer perfuração provocada por insetos ou queimaduras do sol. A coleta foi
no ano de 2012, sempre na parte da manhã para evitar qualquer oscilação de
componentes químicos que podem ocorrer nas plantas ao longo do dia. A
exsicata desta planta está depositada no herbário da Universidade Estadual de
Campinas, e foi classificada por N. D. Cruz, sob o número UEC060665.
Planta
Extrato
UHPLC-ESI-MS
Análise exploratória multivariada dos dados
43
2.2.2. Preparação das amostras e extratos
As três partes da planta foram cortadas em pedaços para facilitar a
secagem, que ocorreu em aproximadamente onze dias. Durante esse período as
flores, caule e folhas ficaram ao ar livre longe do calor e da umidade. Quando
secas, ou seja, com peso constante, foram trituradas em liquidificador, e o pó
resultante submetido a extração.
Pesaram-se 2 g de pó das folhas, flores ou caule de Erythrina speciosa
em um erlenmeyer para cada um dos extratos, acrescentaram-se 60 mL de
solvente nas proporções determinadas de acordo com o planejamento simplex
centróide da Figura 2.3. Depois o erlenmeyer foi levado ao banho ultrassom por
30 minutos. Em seguida filtrou-se com funil comum e algodão e reservou-se o
extrato filtrado. Esse processo foi repetido por três vezes, combinando-se os
filtrados. Os extratos combinados foram então filtrados em filtro Millipore
(0,22 µm) e analisados por UHPLC-ESI-MS.
(a) (b)
Figura 2.3. Planejamento simplex centróide, onde as proporções x1= etanol
(Et); x2= diclorometano (Dm); x3 = hexano (Hx). (a) Representação gráfica das
misturas do planejamento simplex centróide e (b) proporção numérica das
misturas do planejamento simplex centróide.
Misturas Planejamento
(Et, Dm, Hx)
Et 1:0:0
Dm 0:1:0
Hx 0:0:1
EtDm 0,5:0,5:0
DmHx 0:0,5:0,5
EtHx 0,5:0:0,5
EtDmHx 0,33:0,33:0,33
EtDmHx 0,33:0,33:0,33
44
2.2.3. Análises por UHPLC-ESI-MS
As separações cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo
Acquity UPLC (Waters®) equipado com um sistema de bombas binárias. As
análises foram realizadas utilizando-se uma coluna BEH Acquity UPLC (C18)
com dimensões 50 mm × 2,1 mm, 1,7 µm de partícula. Os solventes utilizados
como fases móveis foram H2O com 0,1% de ácido fórmico v/v (A) e ACN (B).
O método cromatográfico empregado consistiu de um gradiente crescente como
segue: 0-3,5 min, 40-65% de B; 3,5-6,5 min, 65-80% de B; 6,5-7,5 min, 80-
100% de B; 7,5-8,5 min, isocrático 100% de B; de 8,5 - 9 min de 100-40% de
B. O sistema de UPLC está acoplado a um espectrômetro de massas do tipo
triplo-quadrupolo modelo Quatro Micro API (Waters®). Foi utilizada uma
fonte de eletrospray (ESI) do tipo Z-spray. As análises de MS foram adquiridas
no modo positivo de polaridade devido à natureza básica dos compostos alvo.
Os dados foram obtidos no modo varredura (MS Scan) usando uma faixa de
m/z de 200 a 400. As condições de ionização da fonte foram: voltagem no
capilar 3 kV; temperatura da fonte 150 °C, vazão de gás no cone 80 L/h, vazão
de gás de dessolvatação 800 L/h, temperatura de dessolvatação 350 °C. Gás
nitrogênio (pureza >99%) foi utilizado como gás de nebulização. Os dados
obtidos foram processados no software MassLynx v4.1.
2.3. Resultados e Discussão
Para estudos de otimização de solventes extratores, espera-se que a
escolha dos solventes utilizados tenha valores de parâmetros solvatocrômicos
45
distintos para que se tenha maior seletividade. A Tabela 2. 1 apresenta os
valores de α, β, e π para as misturas do planejamento simplex centróide.
Tabela 2.1. Planejamento simplex centróide com os valores de α, β, e π para
cada mistura.
Mistura Planejamento
(Et, Dm, Hx)
α β π
Et 1:0:0 0,39 0,36 0,25
Dm 0:1:0 0,27 0,00 0,73
Hx 0:0:1 0,00 0,00 0,00
EtDm 0,5:0,5:0 0,33 0,18 0,49
DmHx 0:0,5:0,5 0,14 0,00 0,37
EtHx 0,5:0:0,5 0,20 0,18 0,13
EtDmHx 0,33:0,33:0,33 0,20 0,11 0,30
Os valores desses parâmetros solvatocrômicos para cada solvente puro
são tabelados e para as misturas de solventes, foram calculados de acordo com
as equações 2.1, 2.2 e 2.3 abaixo.
(2.1)
(2.2)
(2.3)
Onde n é o número de solventes, αi, βi e πi, são os valores dos solventes puros e
i são as proporções das misturas.
46
Com base na Tabela 2.1 percebemos que os valores variam de mistura
para mistura e que as combinações binárias e a ternárias contribuem para
aumentos da seletividade em relação à acidicidade, basicidade e dipolaridade,
permitindo uma avaliação mais eficaz da influência do solvente no processo de
extração.
2.3.1. Análise dos extratos das flores
Primeiramente, os extratos das flores da Erythrina speciosa foram
submetidos a análises por UHPLC-ESI-MS. Parte dos dados obtidos geraram
cromatogramas totais de íons (TIC’s) com perfis semelhantes onde foram
identificados tentativamente alguns dos constituintes majoritários de esqueleto
eritrínico, tais como a erisotramidina (1), eritrartina (2), N-oxido-erisotrina (3),
erisotrina (4) e 11- metoxi-erisodina (5) (Figura 2. 4), com base em resultados
prévios descritos na literatura. Para a maioria das misturas analisadas foram
encontrados os principais constituintes com estruturas derivadas da erisotrina,
sendo a eritrartina (Rt 2,68) um dos principais alcalóides previamente
reportados nas análises de Erythrina speciosa 2.
47
Figura 2.4. Cromatograma total de íons das flores de Erythrina speciosa com a
mistura (etanol:diclorometano:hexano (0,33:0,33:0,33 (v/v/v))).
O conjunto de dados obtidos dos extratos das flores de Erythrina
speciosa foi analisado levando em conta apenas os picos correspondentes a íons
de moléculas protonadas com m/z par, uma vez que o interesse estava na busca
de alcalóides com esqueleto do tipo eritrínico. Como o esqueleto eritrínico
possui apenas um átomo de nitrogênio, a massa da molécula resultante será
sempre ímpar (considerando que os demais átomos são sempre C, H ou O) e
dessa forma, os íons monoprotonados ([M+H]+) dos alcalóides observados em
ESI(+)-MS possuirão m/z par. Picos referentes a íons de moléculas
monoprotonadas em m/z 288, 312, 314, 316, 328, 330, 342, 344 e 346 foram
encontrados nos extratos preparados nas diferentes proporções das misturas
indicadas no planejamento, Tabela 2.2. Todos esses íons foram encontrados em
48
pelo menos um dos extratos preparados de acordo com o planejamento, já os
íons referentes a m/z 330 e 314 são os únicos presentes em todos os extratos. Os
extratos das misturas onde foram encontrados valores de m/z 288, 316 e 330
mostram mais de um pico cromatográfico correspondente aos mesmos valores
de m/z, devido à existência de compostos isóbaros presentes na planta estudada.
Com base na Tabela 2.2, observamos que o solvente extrator exerce
grande influência no resultado. Por exemplo, etanol não é recomendado para
extração do alcalóide de m/z 288, em virtude da ausência desse íon no
cromatograma de UHPLC-MS obtido para esse solvente. Apesar de o hexano
puro ter os menores valores de intensidades totais ele é importante para
extração desses alcalóide e pode ser usado para futuros estudos de identificação
e isolamento do mesmo.
Apenas o extrato preparado em etanol puro mostrou a presença do
possível alcalóide em m/z 312. Para m/z 314 todas as misturas de solventes
foram eficazes para a extração. Para m/z 316 o etanol não é indicado já que não
extraiu esse alcalóide e para estudar os isóbaros desse metabólito o hexano puro
e misturas envolvendo o hexano são indicadas por conseguir extrair o alcalóide
de m/z 316. No caso do alcalóide de m/z 328 o hexano puro não foi eficiente,
mas as misturas de solventes envolvendo o hexano foram eficientes na
extração. O etanol extraiu dois compostos fornecendo picos com essa m/z. Para
m/z 330 todas as misturas de solventes foram eficientes para extração.
É possível observar que para alcalóides com m/z 342, m/z 344 e m/z 346 a
escolha do solvente é um passo importante para estudá-los, uma vez que
somente algumas misturas de solventes foram eficientes para extração destes
metabólitos. Nenhum solvente puro extraiu o alcalóide com m/z 342.
49
Tabela 2.2. Valores de m/z encontrados nos extratos das flores de Erythrina
speciosa em cada uma das misturas de acordo com o planejamento simplex
centróide. Cada símbolo * representa o número de vezes que cada valor de m/z
foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos com
tempos de retenção distintos.
Mistura m/z
288
m/z
312
m/z
314
m/z
316
m/z
328
m/z
330
m/z
342
m/z
344
m/z
346
Et
*
*
** ** * *
Dm **
*
**
* **
Hx ****
*
***
* *
EtDm **
*
*
* **
*
DmHx ***
*
***
* **
EtHx ***
*
***
*
**
* * *
EtDmHx ***
*
***
* **
* *
Foi feito um somatório das intensidades observadas nos espectros de
massas para cada pico com m/z par, gerando uma intensidade total de alcalóides
para cada mistura do planejamento. O alcalóide de m/z 330, de maior
intensidade, e m/z 314 ganharam destaque por serem os únicos a serem
encontrados em todas as misturas do planejamento e por já terem sido
reportados como possíveis marcadores da Erythrina speciosa, Tabela 2.3.
O menor valor de intensidade total de alcalóides identificado nas flores
foi com o extrato obtido em hexano puro, fato que pode ser atribuído à baixa
polaridade do hexano. Este solvente tem maior afinidade para extração de
compostos apolares presentes na planta tais como terpenóides e ácidos graxos24.
50
Tabela 2.3. Intensidades totais dos espectros de massas dos m/z pares obtidos
com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o número de
picos com m/z par para cada cromatograma.
Pontos Planejamento
(Et, Dm, Hx)*
Intensidade
total (In)
(x107)
Número
de
picos**
Intensidade
m/z 314 (x107)
Intensidade
m/z 330 (x107)
Et 1:0:0 21,69 8 2,57 4,39
Dm 0:1:0 26,48 8 4,26 9,20
Hx 0:0:1 7,70 10 2,58 0,38
EtDm 0,5:0,5:0 24,24 8 4,21 7,79
DmHx 0:0,5:0,5 13,51 13 1,96 2,47
EtHx 0,5:0:0,5 49,27 10 7,09 13,80
EtDmHx 0,33:0,33:0,33 55,39 12 7,95 10,20
EtDmHx 0,33:0,33:0,33 50,91 12 6,29 9,45
* Solventes usados: Et (etanol), Dm (diclorometano), Hx (hexano) ** Apenas m/z pares
A Figura 2.5 apresenta as intensidades (In) dos espectros de massas para
o pico cromatográfico mais intenso (alcalóide de m/z 330) para cada mistura do
planejamento simplex centróide.
In
1;0;0
0;1;0
0;0;1
0.5;0.5;0
0;0.5;0.5
0.5;0;0.5
0.3;.0.3;0.3
0.3;.0.3;0.3
Et Dm Hx EtDm EtHx DmHx EtDmHx EtDmHx
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Figura 2.5. Valores de intensidade para m/z 330 de acordo com as misturas do
planejamento simplex centróide.
51
Os isóbaros com m/z 330 diferenciam-se durante seu processo de
biossíntese, onde são observados diferentes padrões de metilação para as
hidroxilas do anel eritrínico, Figura 2.6 25.
Figura 2.6. Alcalóides tentativamente identificados no gênero Erythrina,
observados por ESI (+) -MS como íons em m/z 330, sendo (a) eritrartina,
previamente reportada em Erithrina speciosa como composto majoritário2 e
(b)11-metoxi-erisodina, previamente identificado em Erythrina lysistemon26.
Os modelos de regressão foram construídos para se obter uma relação
que permitisse prever a resposta correspondente a qualquer valor de
composição de solventes. Aos dados da Tabela 2.3 para m/z 330 foi aplicado o
modelo linear e quadrático. O modelo linear aplicado às intensidades de m/z
330 apresentou falta de ajuste no nível de 95% de confiança. O modelo
quadrático foi testado e a equação para esse modelo é dada por:
In = (2.4)
(±0,58) (±0,58) (±0,58) (±2,61) (±2,61) (±2,61)
Neste modelo vemos que a mistura binária (etanol:hexano 0,5:0,5(v/v))
apresenta coeficiente binário altamente significativo. Com esse modelo de
regressão todo o espaço do simplex, ou seja, todas as combinações possíveis
52
dos três solventes podem ser avaliadas para prever a melhor mistura para obter
maiores valores de intensidades contribuindo na obtenção das condições
otimizadas para extração.
A análise de variância (ANOVA), Tabela 2.4, foi utilizada para testar a
significância do modelo e validação do modelo quadrático apresentado.
Tabela 2.4. Análise de variância para o ajuste do modelo quadrático às
intensidades de m/z 330 para as misturas do planejamento simplex centróide.
Fonte de variação Soma quadrática Graus de liberdade Média quadrática
Modelo 138,06 5 27,61
Erro total 0,69 2 0,35
Falta de ajuste 0,41 1 0,41
Erro puro 0,28 1 0,28
Total ajustado 138,75 7 19,82
O valor de F para falta de ajuste do modelo, que é dado pela média
quadrática da falta de ajuste (MQfaj) dividida pela média quadrática do erro
puro (MQep), , é inferior ao valor tabelado de F1,1 (161,4)
no nível de 95% de confiança, indicando que não há evidência de falta de ajuste
no modelo.
Para avaliar a significância da regressão usou-se o valor da média
quadrática da regressão (MQR) dividida pela média quadrática residual (MQr)
que foi obtida pela média ponderada da falta de ajuste e do erro puro:
. Comparando esse valor com o valor de F5,2 = 19,30 com
95% de confiança, a regressão é estatisticamente significativa já que o valor
calculado é maior que o tabelado.
Foi feita uma medida experimental com uma mistura ternária de
etanol:diclorometano:hexano (0,6:0,2:0,2 (v/v/v)). A intensidade de m/z 330
53
para essa mistura foi de 10,58 (107) que está bem próximo do valor previsto
pela equação validada do modelo quadrático que é de 10,44(107).
A superfície de resposta para o modelo quadrático aplicado à soma das
intensidades de m/z 330 pode ser vista na Figura 2.7. Nesta figura, observamos
que a mistura binária (etanol:hexano 0,5:0,5(v/v)) permite obter maior
intensidade de alcalóides referentes à m/z 330, além de confirmar que hexano
puro é a pior opção para estas extrações. Apesar desses solventes quando puros
não serem eficazes na extração, a mistura binária entre eles mostrou-se
satisfatória em relação às demais proporções utilizadas nos diferentes pontos do
planejamento na extração de alcalóides.
Figura 2.7. Superfície de resposta aplicada às intensidades referentes à m/z 330
de acordo com o planejamento simplex centróide.
O mesmo tratamento foi realizado para as intensidades dos picos
identificados em m/z 314. Este íon foi observado como apenas um pico em cada
cromatograma e, possivelmente, se trata da erisotrina (Figura 2.8), que pode ser
considerada um dos marcadores do gênero Erythrina.
54
Figura 2.8. Estrutura para m/z 314, tentativamente identificada em Erythrina
speciosa como erisotrina2.
Os menores valores de intensidades encontrados para m/z 314 (Figura
2.9) foram para os extratos preparados em etanol e hexano puros e na mistura
binária (diclorometano:hexano 0,5:0,5(v/v)), já a mistura binária (etanol:hexano
0,5:0,5(v/v)) apresentou alto valor de intensidade para a m/z referente a
erisotrina. A mistura ternária (etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33
(v/v/v)) também apresentou alto valor de intensidade para m/z 314, sendo
assim, essas composições poderão ser recomendadas para a extração otimizada
deste metabólito em Erythrina speciosa.
In
1;0;0
0;1;0
0;0;1
0.5;0.5;0
0;0.5;0.5
0.5;0;0.5
0.3;.0.3;0.3
0.3;.0.3;0.3
Et Dm Hx EtDm EtHx DmHx EtDmHx EtDmHx0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Figura 2.9. Valores de intensidade para m/z 314 de acordo com as misturas do
planejamento simplex centróide.
55
Para m/z 314 também foram construídos modelos de regressão para
obter uma relação que permitisse prever a resposta correspondente a qualquer
composição dos três solventes.
Aos dados da Tabela 2.3 para m/z 314, foi aplicado o modelo linear que
apresentou falta de ajuste no nível de 95% de confiança. O modelo quadrático
foi testado e a análise de variância (ANOVA), Tabela 2.5, foi utilizada para
testar a falta de ajuste na validação do modelo. Para obter uma equação com
ajuste dos dados, os efeitos de interação dos solventes não significativos foram
retirados dos cálculos e a equação simplificada para o modelo quadrático é dada
por:
In = (2.5)
(±1,71) (±1,71) (±1,71) (±7,63)
Nesse caso também foi obtido um modelo de regressão validado e que
representa de forma eficaz o conjunto de dados, possibilitando prever valores
de intensidades para as diferentes misturas de solventes possíveis de acordo
com o simplex centróide utilizado.
Tabela 2.5. Análise de variância para o ajuste do modelo quadrático as
intensidades de m/z 314 para as misturas do planejamento simplex centróide.
Fonte de variação Soma quadrática Graus de liberdade Média quadrática
Modelo 26,67 3 8,89
Erro total 8,98 4 2,25
Falta de ajuste 7,57 3 2,52
Erro puro 1,41 1 1,41
Total ajustado 35,65 7 5,09
56
O valor de F para falta de ajuste do modelo é dado por
que é inferior ao valor tabelado de F3,1 = (215,7) no nível
de 95% de confiança, indicando que não há evidência de falta de ajuste no
modelo.
Para avaliar a significância da regressão, .
Comparando esse valor com o valor de F3,4= 6,59 com 95% de confiança, a
regressão não é estatisticamente significativa já que o valor calculado é menor
que o tabelado.
Avaliando os valores previstos pela equação em relação aos valores
experimentais é possível perceber a proximidade entre os resultados. Neste
caso, a extração usando a mistura ternária (etanol:diclorometano:hexano
0,6:0,2:0,2 (v/v/v)) a equação para o modelo quadrático, equação 2.5, prevê um
valor de intensidade de 5,9 (107) que está próximo do valor de 6,25 (107) obtido
em um experimento confirmatório. No gráfico de superfície de resposta, Figura
2.10, a mistura binária entre etanol e hexano fica visualmente identificada como
região para melhor extração de alcalóides do tipo eritrínico.
57
Figura 2.10. Superfície de resposta aplicada às intensidades para os picos com
m/z 314.
O ponto central do planejamento simplex centróide,
(etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33(v/v/v)) também pode ser indicado
com uma das melhores misturas para extração de alcalóides, pois altos valores
de intensidades foram obtidos nesse ponto. Os altos valores de intensidade no
ponto central podem indicar que um modelo superior descreveria de forma mais
significativa os resultados, porém seria necessário um número maior de
misturas no planejamento para que os graus de liberdade permitissem o teste
para falta de ajuste.
Os cromatogramas foram usados para originar uma matriz 894x7 que foi
submetida à análise das componentes principais. Essa matriz foi composta por
894 linhas referentes aos tempos de retenção até nove minutos e sete colunas
com os valores de intensidades provenientes das sete misturas do planejamento
simplex centróide. Os dados foram primeiramente pré-processados por
58
comprimento de vetor e área unitária. Com estes processamentos, não houve
diferença quanto ao resultado das componentes principais, provavelmente por
serem dados obtidos de uma técnica muito sensível, então foram usados os
dados originais dos cromatogramas totais de íons, sem nenhum pré-
processamento.
Juntos, os gráficos dos scores CP1 e CP2, Figura 2.11, explicam
aproximadamente 75% da variância total dos dados. Nessa projeção, o extrato
obtido em etanol puro (I) e mistura EtHx (II), ficaram separados na região
positiva da CP2. O etanol foi importante na extração dos alcalóides das flores,
já que apenas esse solvente extraiu o metabólito com m/z 312. Esse fato é
importante para isolar e identificar esse alcalóide, uma vez que não há relatos
na literatura sobre esse estudo. Já a mistura binária entre EtHx (II) apresentou
três picos cromatográficos, tanto para m/z 316 quanto para m/z 288. Esses
isóbaros aparecem três vezes juntos para essa mistura. A mistura binária DmHx
(IV) forneceu o extrato grande número de picos cromatográficos, ou seja, maior
variação de alcalóides encontrados.
59
Et
Dm
Hx
EtDm
DmHx
EtHx
EtDmHx
EtDmHx
-0,22 -0,20 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,10 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0,00
CP1(59,7%)
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
CP
2(1
4,7
%)
I
II
III
V
IV
Figura 2.11. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de íons no
tempo de retenção de nove minutos para as sete misturas do planejamento
simplex centróide das flores de Erythrina speciosa.
O grupo (V) contém o extrato preparado com as misturas Dm e EtDmHx,
nesse grupo os sinais com valores de m/z iguais possuem tempos de retenção
bem similares. Os oito picos obtidos com a mistura Dm são os mesmos obtidos
para EtDmHx, porém a mistura ternária apresentou doze picos cromatográficos,
mas os quatro picos que diferenciam essa mistura da Dm são de baixa
intensidade. Essas diferenças podem ser vistas na Figura 2.12.
60
Figura 2.12. Perfis cromatográficos para os extratos das flores obtidos nas
diferentes misturas de solventes com base no planejamento simplex centróide.
Os cromatogramas estão identificados de acordo com a separação obtida na
PCA.
Os loadings das componentes principais 1 e 2 podem ser visualizados na
Figura 2.13. O gráfico dos loadings analisados juntamente com o gráfico dos
scores mostra que o extrato obtido em etanol puro (I) e mistura binária
(etanol:hexano 0,5:0,5(v/v)) (II), que ficaram separados na região positiva da
CP2, são caracterizados pelos valores de m/z encontrados nos tempos de
retenção 2,67; 3,49; 3,74; 4,04 min, que são m/z 328, m/z 330, m/z 346 e m/z
330 respectivamente. E que o tempo de retenção 7,22 min, que corresponde a
m/z 288, foi responsável pela separação do extrato obtido em hexano puro na
região negativa da CP2.
61
0 2 4 6 8 10
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
7,22
2,68
4,04
3,74
3,492,67
Loadin
gs
Tempo de retenção(min)
CP1
CP2
Figura 2.13. Gráfico dos loading das componentes principais 1 e 2
obtido com as flores da Erythrina speciosa.
Essa separação evidencia a importância do solvente na extração de
alcalóides, uma vez que o hexano apresentou baixos valores de intensidades,
não sendo recomendado para extração de alcalóides em flores de Erythrina
speciosa, porém quando o hexano está combinado com o etanol os valores de
intensidades já estão muito maiores como apresentados na Tabela 2. 3.
2.3.2. Análise dos extratos do caule
Nos extratos preparados com o caule foram encontrados alcalóides com
valores referentes a íons monoprotonados em m/z 288, 312, 314 e 316. A
Tabela 2.6 esclarece o fato que no caule da Erythrina a quantidade de
alcalóides encontrada é menor que nas flores. Os valores de diferentes m/z
presentes nas flores são mais que o dobro que os valores de m/z presentes no
62
caule e a presença de íons isóbaros com m/z 288 e m/z 316 destaca-se nessa
parte da planta.
Tabela 2.6. Valores de m/z encontrados nos extratos do caule de Erythrina
speciosa em cada uma das misturas de acordo com o planejamento simplex
centróide. Cada símbolo # representa o número de vezes que cada valor de m/z
foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos com
tempos de retenção distintos.
Mistura m/z
288
m/z
312
m/z
314
m/z
316
Et ### #
#
###
Dm ####
#
#
###
Hx ##
#
#
##
EtDm ###
#
#
###
DmHx ###
#
#
###
EtHx #
#
###
EtDmHx ###
#
#
###
Nesse caso, apenas o alcalóide com m/z 314 foi comparado com os
resultados anteriores, pois m/z 330 não foi observado no extrato do caule, e
também por m/z 314 já ter sido reportado como possível marcador da espécie.
Os valores de intensidade totais foram obtidos somando as intensidades dos
espectros de massas, da mesma forma como feito para os extratos de flores
(picos correspondentes a íons de moléculas monoprotonadas com m/z par)
Tabela 2.7.
Os menores valores de intensidades totais foram obtidos para os extratos
em diclorometano puro e a mistura binária (diclorometano:etanol 0,5:0,5(v/v)).
Para a melhor extração de alcalóides utilizando o caule da planta, a mistura
ternária (etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33 (v/v/v)) é recomendada,
uma vez que nessa mistura os maiores valores para intensidades totais e
63
também para intensidade do composto com m/z 314 foram obtidos, como
mostra a Figura 2.14.
Tabela 2.7. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides obtidos
com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o número de
picos com massa par para cada cromatograma.
Pontos Planejamento
(Et, Dm, Hx)*
Intensidade total
(x107)
Número de
picos**
Intensidade m/z
314 (x107)
Et 1:0:0 20,02 8 8,28
Dm 0:1:0 10,60 9 4,07
Hx 0:0:1 16,70 6 11,40
EtDm 0,5:0,5:0 13,20 8 5,23
DmHx 0:0,5:0,5 14,10 8 7,16
EtHx 0,5:0:0,5 23,90 5 11,40
EtDmHx 0,33:0,33:0,33 36,00 8 15,60
EtDmHx 0,33:0,33:0,33 34,90 8 15,70
* Solventes usados: Et (etanol), Dm (diclorometano), Hx (hexano) ** Apenas m/z pares
In
1;0;0
0;1;0
0;0;1
0.5;0.5;0
0;0.5;0.5
0.5;0;0.5
0.3;.0.3;0.30.3;.0.3;0.3
Et Dm Hx EtDm EtHx DmHx EtDmHx EtDmHx0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Figura 2.14. Valores de intensidades para m/z 314 de acordo com o
planejamento simplex centróide.
64
Modelos de regressão foram construídos para obter uma relação que nos
permitisse prever a resposta correspondente aos valores de proporções dos
solventes. Aos dados da Tabela 2.7 para m/z 314 foi aplicado o modelo linear e
quadrático e a análise de variância (ANOVA) foi utilizada para testar a
significância do modelo e validação dos modelos ajustados. Os modelos linear
e quadrático aplicados às intensidades de m/z 314 apresentaram falta de ajuste
no nível de 95% de confiança.
Para testar um modelo superior foram acrescentados pontos axiais em
réplicas ao planejamento simplex centróide, Figura 2.15. Esses pontos
correspondem a misturas ternárias em diferentes proporções de etanol,
diclorometano e hexano que estão apresentados na Tabela 2.8.
Tabela 2.8. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides obtidos
com a extração baseada num planejamento simplex centróide com pontos axiais
e o número de picos com massa par para cada cromatograma.
Mistura Planejamento
(Et, Dm, Hx)
Intensidade total
(In) (x107)
Número de
picos **
Intensidade m/z
314 (x107)
Et*DmHx 0,6:0,2:0,2 15,50 4 12,00
Et*DmHx 0,6:0,2:0,2 18,10 4 12,30
EtDm*Hx 0,2:0,6:0,2 24,40 7 13,00
EtDm*Hx 0,2:0,6:0,2 25,50 7 14,00
EtDmHx* 0,2:0,2:0,6 22,10 7 12,30
EtDmHx* 0,2:0,2:0,6 22,70 7 12,20
* Solventes usados: Et (etanol), Dm (diclorometano), Hx (hexano) em maior
proporção ** Apenas m/z pares
O modelo cúbico especial também apresentou falta de ajuste, não sendo
possível validar um modelo matemático para descrever o conjunto de dados.
65
Para testar modelos superiores seria necessário um número bem maior de
experimentos, o que geraria equações matemáticas muito complexas.
Observando a figura geométrica que representa o planejamento simplex
centróide com os valores de intensidades para m/z 314, Figura 2.15, podemos
ter uma ideia da região que os melhores resultados de extração desses
alcalóides são obtidos.
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
11.40
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
8.28
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
4.075.23
7.1611.40
15.70
13.512.2
12.3
Et Dm
Hx
Fi
gura 2.15. Planejamento simplex centróide com valores médios de intensidades
para m/z 314 em suas respectivas misturas.
A região da mistura ternária (etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33
(v/v/v)) apresentou altos valores de intensidades para m/z 314 e provavelmente
com esta mistura é possível obter uma extração mais otimizada desse
metabólito, Figura 2.15. O hexano puro também apresenta alto valor de
66
intensidade, fato importante já que para as flores esse solvente apresentou
valores bem mais baixos de intensidades.
Os dados dos cromatogramas do caule foram submetidos à análise das
componentes principais. Essa matriz foi composta por 894 linhas referentes ao
tempo de retenção até nove minutos e dez colunas com os valores de
intensidades provenientes das sete misturas do planejamento simplex centróide
com os pontos axiais. Os dados foram primeiramente pré-processados por
comprimento de vetor e área unitária. O gráfico ficou visualmente com
resultados mais perceptíveis sem as réplicas, Figura 2.16.
Et
Dm
Hx
EtDm
DmHxEtHx
EtDmHx
Et*DmHx
EtDm*HxEtDmHx*
-0,108 -0,107 -0,106 -0,105 -0,104 -0,103 -0,102 -0,101 -0,100 -0,099 -0,098
CP1(93%)
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
CP
2(4
%)
I
II
III
IV
VI
V
Figura 2.16. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de
íons para o caule de acordo com o planejamento simplex centróide.
A CP1xCP2 explica aproximadamente 97% da variância total dos dados.
Nessa separação, as misturas Dm (I) e EtDm (II) representam os menores
valores de intensidades totais do conjunto e foram separadas na região mais
positiva da CP2. O grupo III, com as misturas Et, DmHx e EtHx, representa os
67
valores intermediários de intensidades totais, que ficaram separados na região
mais próxima de zero da CP2 e o grupo IV, na região menos negativa da CP2,
com as misturas axiais EtDm*Hx, EtDmHx* e a mistura ternária
(etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33(v/v/v)) apresentara os maiores
valores de intensidades totais. A mistura Hx (V) e a mistura axial Et*DmHx
(VI) apresentaram valores de intensidades totais muito próximas, como pode
ser observado na Tabela 2.7 e 2.8.
No caule, as intensidades dos picos cromatográficos influenciaram na
separação, pois os perfis observados nos cromatogramas são bem semelhantes.
Constatamos a influência do solvente na separação dos gráficos dos scores, e
nesse caso as misturas ternárias foram muito satisfatórias na extração de
alcalóides. As misturas ternárias são pouco utilizadas para esse tipo de
extração, sendo mais encontrados os solventes puros ou combinações binárias.
A Figura 2.17 apresenta o gráfico dos loadings da CP1 e CP2 que,
quando analisadas em conjunto com o gráfico dos scores, Figura 2.16 mostra
que os tempos de retenção responsáveis pela separação na região mais positiva
da CP2 são: 7,19; 7,45 e 8,38 min, que correspondem a m/z 288, m/z 288 e m/z
316 para o Dm (I) e EtDm (II). O tempo de retenção que influencia na
separação do Hx (V) e Et*DmHx (VI) foi 2,94 min, que corresponde a m/z 314
na região mais negativa da CP2.
68
0 2 4 6 8 10
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
8,387,45
7,19
2,94
Loadin
gs
Tempo de retenção(min)
CP1
CP2
Figura 2.17. Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 2 para os
dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa.
Com o intuito de comparar os extratos das flores com o caule, os dados
dos cromatogramas totais de íons das flores e do caule foram agrupados em
uma única matriz e submetidos à análise das componentes principais. Essa
matriz foi composta pelo tempo de retenção até nove minutos, totalizando 894
linhas e os valores de intensidade para cada uma das misturas do planejamento
totalizando dezessete colunas: sete cromatogramas obtidos com o planejamento
simplex centróide para as flores e dez cromatogramas obtidos com o
planejamento simplex centróide com os pontos axiais para o caule. Quando
comparamos as flores e o caule da planta, Figura 2.18, observamos que existe
uma diferença entre as partes da planta analisada. O caule ficou separado na
região negativa de CP2, juntamente com extrato obtido em hexano puro das
flores.
69
Flores
Caule
Et
Dm
Hx
EtDm
DmHx
EtHx
EtDmHx
Et
Dm
Hx
EtDmDmHx
EtHxEtDmHx
Et*DmHx
EtDm*HxEtDmHx*
-0,09 -0,08 -0,07 -0,06 -0,05 -0,04 -0,03 -0,02 -0,01 0,00 0,01
CP1(66%)
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
CP
2(1
3,8
%)
Figura 2.18. Gráfico dos scores para cromatogramas totais de íons das flores e
caule de acordo com o planejamento simplex centróide.
Observando os cromatogramas do extrato obtido em hexano puro para as
flores, que está em negrito na Figura 2.19 e os cromatogramas para o caule de
todas as dez misturas do planejamento simplex centróide, podemos notar que a
diferença está na intensidade dos picos. Todos os cromatogramas totais de íons
obtidos para o caule seguem o mesmo perfil, assim como o cromatograma total
de íons obtido com hexano puro nas flores. Os picos cromatográficos para o
caule apresentaram tempos de retenção bem similares, com mesmo valor de m/z
nos picos mais intensos. Apesar das flores e do caule terem apresentados
características diferentes, os extratos obtidos com solvente hexano puro não
mostraram-se diferentes entre as duas partes da planta.
70
2 4 6 8
0,00E+000
2,00E+007
4,00E+007
6,00E+007
8,00E+007
1,00E+008
1,20E+008
1,40E+008
1,60E+008
m/z 316
m/z 288
m/z 314
Inte
nsid
ade
Tempo de retenção
Figura
2.19. Cromatograma totais de íons para as sete misturas do planejamento
simplex centróide para o caule da planta. O cromatograma total de íons em
hexano puro para as flores em negrito.
Os cromatogramas totais de íons obtidos para as flores de acordo com o
planejamento simplex centróide não seguem o padrão do caule e apresentam
diferença tanto do perfil do cromatograma quanto no tempo de retenção e
valores de m/z. Nesse caso, observou-se que o cromatograma total de íons
obtido em hexano puro, que está em negrito, Figura 2.20, tem intensidade bem
mais baixa em todos os picos do cromatograma. Isso mostra que as duas partes
da planta se comportam de maneira diferente na obtenção de alcalóides e que a
influência do solvente na otimização da extração é um fator importante e que
interfere eficazmente no resultado.
71
2 4 6 8
0,00E+000
5,00E+007
1,00E+008
1,50E+008
Inte
nsid
ade
Tempo de rentenção
Figura 2.20. Cromatograma totais de íons para as sete misturas do
planejamento simplex centróide para as flores. O cromatograma obtido em
hexano puro está em negrito.
2.3.3. Análise dos extratos das folhas
Para os dados obtidos dos extratos das folhas de Erythrina speciosa
levando em conta apenas os picos correspondentes a íons de moléculas
protonadas pares, como descrito na parte experimental, foram encontrados os
valores referentes a íons de moléculas protonadas em m/z 288, 312, 314, 316,
330 e 332 para diferentes proporções de misturas indicada no planejamento,
Tabela 2. 9.
72
As misturas que mais extraíram alcalóides foram diclorometano puro, a
mistura binária (diclorometano:hexano 0,5:0,5(v/v)) e a mistura binária
(etanol:hexano 0,5:0,5(v/v)). O hexano foi importante para extração dos
isóbaros de m/z 288 e m/z 316.
Tabela 2.9. Valores de m/z encontrados nos extratos das folhas de Erythrina
speciosa em cada uma das misturas de acordo com o planejamento simplex
centróide. Cada símbolo ▲ representa o número de vezes que cada valor de m/z
foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos com
tempos de retenção distintos.
Mistura m/z
288
m/z
312
m/z
314
m/z
316
m/z
330
m/z
332
Et
▲
▲▲
▲
Dm
▲▲▲
▲
▲
▲▲
▲
▲
Hx
▲▲▲▲
▲
▲
▲▲▲▲
EtDm
▲▲
▲
▲
▲
DmHx
▲▲▲▲
▲
▲
▲▲▲
▲
▲
EtHx
▲▲
▲
▲
▲▲
▲
▲
EtDmHx
▲▲▲
▲
▲
▲▲▲
▲
O valor de m/z 330 não foi encontrado no extrato de etanol e hexano
puro, nas demais misturas m/z 330 foi encontrado em apenas um tempo de
retenção, não apresentando isóbaros. O m/z 314 foi encontrado em todas as
misturas e será usado para comparação com as flores e o caule da planta.
Os valores de intensidades totais foram obtidos somando as intensidades
dos espectros de massas dos íons de moléculas protonadas pares como para
73
flores e caules. Essa valores totais juntamente com os valores de intensidades
para m/z 314 estão apresentados na Tabela 2.10.
Tabela 2.10. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides obtidos
com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o número de
picos com m/z par para cada cromatograma.
Mistura Planejamento
(Et, Dm, Hx)*
Intensidade total
(x107)
Número de picos
**
Intensidade m/z
314 (x107)
Et 1:0:0 12,01 4 3,53
Dm 0:1:0 8,70 9 3,31
Hx 0:0:1 2,25 10 0,69
EtDm 0,5:0,5:0 5,99 6 3,96
DmHx 0:0,5:0,5 7,07 11 1,78
EtHx 0,5:0:0,5 6,56 8 3,57
EtDmHx 0,33:0,33:0,33 12,13 9 4,69
EtDmHx 0,33:0,33:0,33 12,81 9 5,29 * Solventes usados: Et (etanol), Dm (diclorometano), Hx (hexano) ** Apenas m/z pares
De acordo com a Figura 2.21, que representa graficamente os valores de
intensidades para m/z 314, observamos que o menor valor de intensidade foi
obtido para o extrato em hexano puro. A mistura ternária
(etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33 (v/v/v)) apresentou maiores
valores de intensidade, evidenciando a importância do uso de misturas de
solventes na obtenção de alcalóides da Erythrina speciosa.
74
In
1;0;00;1;0
0;0;1
0.5;0.5;0
0;0.5;0.5
0.5;0;0.5
0.3;.0.3;0.3
0.3;.0.3;0.3
Et Dm Hx EtDm DmHx EtHx EtDmHx EtDmHx0
1
2
3
4
5
6
Figura 2.21. Valores de intensidades para m/z 314 de acordo com o
planejamento simplex centróide.
A fim de prever a resposta correspondente aos valores das misturas do
solvente, modelos de regressão foram construídos. Aos dados da Tabela 2.10
para m/z 314 foi aplicado o modelo linear e quadrático e a análise de variância
(ANOVA) foi utilizada para testar a significância dos modelos e validação dos
modelos ajustados. Os modelos linear e quadrático apresentaram falta de ajuste
no nível de 95% de confiança.
Para testar o modelo cúbico especial foram adicionadas misturas axiais
em réplica ao planejamento inicial. A Tabela 2.11 apresenta os valores de
intensidades totais, números de picos e intensidade para m/z 314 encontrados
nas misturas adicionadas.
75
Tabela 2.11. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides obtidos
com a extração baseada num planejamento simplex centróide com pontos axiais
e o número de picos com m/z par para cada cromatograma.
Mistura Planejamento
(Et, Dm, Hx)
Intensidade total
(In) (x107)
Número de
picos **
Intensidade m/z
314 (x107)
Et*DmHx 0,6:0,2:0,2 6,53 6 4,40
Et*DmHx 0,6:0,2:0,2 7,23 6 4,89
EtDm*Hx 0,2:0,6:0,2 7,90 8 3,41
EtDm*Hx 0,2:0,6:0,2 8,81 8 3,60
EtDmHx* 0,2:0,2:0,6 7,66 9 3,52
EtDmHx* 0,2:0,2:0,6 8,90 9 4,37 * Solventes usados: Et (etanol), Dm (diclorometano), Hx (hexano) em maior
porcentagem ** Apenas m/z pares
O modelo cúbico especial no nível de 95% apresentou ajuste aos dados
de acordo com a Tabela 2.12 com os dados da ANOVA, e a equação que
descreve o modelo cúbico especial para esse conjunto de dados é dada pela
equação 2.6:
In=
(±0,53) (±0,53) (±0,53) (±2,71)
(±2,71) (±2,71) (±15,78) (2.6)
Tabela 2.12. Análise de variância para o ajuste do modelo cúbico especial as
intensidades de m/z 314 para as misturas do planejamento simplex centróide.
Fonte de variação Soma quadrática Graus de liberdade Média quadrática
Modelo 16,76 6 2,79
Erro total 2,20 7 0,31
Falta de ajuste 1,52 3 0,50
Erro puro 0,68 4 0,17
Total ajustado 18,95 13 1,46
76
A equação mostra que as misturas ternárias, com coeficiente bem maior
que o das outras misturas, indicam extração otimizada.
O valor de F para falta de ajuste do modelo é dado por
que é inferior ao valor tabelado de F3,4 (6,59) no nível de
95% de confiança, indicando que não há evidência de falta de ajuste no modelo.
Avaliando o significado da regressão, e comparando
esse valor com o valor tabelado de F6,7 =3,87 com 95% de confiança, a
regressão é estatisticamente significativa já que o valor calculado é maior que o
tabelado.
No gráfico de superfície de resposta, Figura 2.22, fica evidente que o
ponto central do planejamento simplex centróide foi onde os melhores
resultados foram obtidos para a extração do alcalóide erisotrina nas folhas da
Erythrina speciosa e que o etanol também tem influência positiva na extração,
sendo assim eficaz.
5
4
3
2
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Hx
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Et
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Dm
Figura 2.22. Superfície de resposta aplicada as intensidades para os picos com
m/z 314.
77
Os cromatogramas totais de íons de todas as misturas do planejamento
original e pontos axiais foram agrupados em forma de matriz, originando uma
matriz 894x14, correspondente a 894 linhas vindas dos nove minutos de tempo
de retenção e dez colunas das misturas do planejamento original e pontos
axiais.
A CP1 e a CP3 juntas explicam aproximadamente 89% da variância total
dos dados. Com base no gráfico dos scores, Figura 2.23, observamos a
separação de quatro grupos. A CP1 não explica nada em relação à mistura Et
(I) que se encontra no zero dessa CP, e que ficou separada na região positiva da
CP3. Nessa mistura o menor número de picos cromatográficos foi encontrado e
esses picos têm valores altos de intensidades. Hx e DmHx (II), que ficaram
separadas dos demais grupos na região mais positiva da CP3, são as únicas
misturas que apresentaram quatro isóbaros de m/z 288 e possuem valores
baixos de intensidades totais de alcalóides. A mistura Et*DmHx (IV), separada
na região mais negativa da CP3, tem os menores valores de intensidades totais
de alcalóides e menor número de picos dentre as misturas axiais. O grupo III
agrupa as demais misturas do planejamento, que apresentam valores de tempo
de retenção bem similares para os valores de m/z iguais entre todas as misturas.
78
Et
Dm
Hx
EtDm
DmHx
EtHxEtDmHx
Et*DmHx
EtDm*Hx
EtDmHx*
-0,14 -0,12 -0,10 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0,00 0,02
CP1(78,5%)
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
CP
3(1
0,4
%)
I
II
III
IV
Figura 2.23. Gráfico dos scores CP1xCP3 para os dados dos cromatogramas
totais de íons obtidos nas folhas da Erytrina speciosa.
O gráfico dos loadings, Figura 2.24, analisados juntamente com o
gráfico dos scores indica quais valores de m/z estão nos grupos formados no
gráfico dos scores de acordo com seu tempo de retenção. O tempo de retenção
2,96 min, observado na região negativa da CP3, corresponde a m/z 314 para a
mistura Et*DmHx (IV) e foi importante para a separação dessa mistura das
demais. Na região positiva da CP3, que separou as misturas Et (I), Hx e DmHx
(II), os metabólitos com tempos de retenção 7,23; 7,46 e 8,43 min foram
importantes para essa discriminação. Esses tempos de retenção correspondem
aos metabólitos com m/z 288, 288 e 316 respectivamente.
79
0 2 4 6 8 10
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
8,437,48
7,23
2,94
Loadin
gs
Tempo de retenção (min)
CP1
CP3
Figura 2.24. Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 3 para os
dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa.
Os dados dos cromatogramas totais de íons para as flores, caule e folhas
foram agrupados em uma única matriz 894x27, sendo 894 linhas provenientes
do tempo de retenção de nove minutos e 27 colunas referentes às sete misturas
do planejamento simplex centróide para as três partes da planta analisadas e os
três pontos axiais para a extração no caule e nas folhas. Essa matriz foi
submetida à análise das componentes principais. A CP1 e CP2, Figura 2. 25,
juntas explicam em torno de 82% da variância total dos dados. Nessa separação
fica evidente a influência do solvente na extração dos alcalóides e também
como a planta se comporta de maneira diferente em cada uma de suas partes
analisadas. A discriminação dos extratos obtidos com o caule mostrou que
nessa parte da planta, a extração de alcalóides foi similar independente da
mistura de solventes que foi utilizada e que poucos valores de m/z foram
80
encontrados. O extrato obtido em hexano puro nas flores se distinguiu dos
demais extratos da mesma por apresentar menores valores de intensidade. O
extrato em etanol puro das folhas apresentou menor número de picos, porém
com altos valores de intensidades, comparado com os resultados obtidos nas
outras misturas de solventes para essa parte da planta.
flores
caule
folhas
Et
Dm
Hx
EtDm
DmHx
EtHx
EtDmHx
Et
Dm
Hx
EtDm
DmHx
EtHxEtDmHx
Et*DmHx
EtDm*HxEtDmHx*
Et
Dm
Hx
EtDm
DmHx
EtHx
EtDmHx
Et*DmHxEtDm*HxEtDmHx*
-0,05 -0,04 -0,03 -0,02 -0,01 0,00 0,01
CP1(75,7%)
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
CP
2 (
6,1
%)
Figura 2.25. Gráfico dos scores dados das flores, caule e folhas da planta na
projeção CP1xCP2xCP3.
O gráfico dos loadings, Figura 2.26, analisado em conjunto com o gráfico
dos scores, indica que o tempo de retenção responsável pela discriminação dos
extratos em EtHx nas flores e Et nas folhas na região positiva da CP2 é 2,27
mim. Nesse tempo de retenção encontra-se o metabólito com m/z 314. O extrato
obtido em etanol puro nas folhas foi o que apresentou menor número de picos
entre todas as misturas analisadas nas três partes da planta e ainda assim, por ter
81
a presença da m/z 314 foi discriminado das demais misturas, isso indica que
esse alcalóide é importante na planta.
0 2 4 6 8 10
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
2,27Loadin
gs
Tempo de retenção(min)
CP1
CP2
Figura 2.26. Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 3 para os
dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa.
As três partes de planta apresentaram composições diferentes e para cada
mistura de solvente utilizada houve variação das m/z. A flor mostrou-se mais
eficaz para obtenção de diferentes tipos de alcalóides, já que nove diferentes
valores de m/z foram encontrados e enquanto para o caule foram encontrados
cinco e para as folhas seis valores de m/z.
Em cada coluna da Tabela 2.13 temos todos os valores de m/z
encontrados nas análises feitas. Em cada linha da Tabela 2.13 temos uma
mistura do planejamento simplex centróide. As partes da planta serão
apresentadas com os símbolos: “*” para as flores, “#” para o caule e “▲” para
as folhas. Cada repetição do símbolo representa os isóbaros encontrados para
82
cada valor de m/z, por exemplo, para o etanol puro o caule apresentou três
vezes o valor de m/z 288 nos extratos do caule.
Tabela 2.13. Valores de m/z encontrados em cada mistura de solvente nas
diferentes partes da planta analisadas. Múltiplos símbolos indicam mais de um
pico cromatográfico com tempos de retenção distintos para a mesma m/z.
Mistura m/z
288
m/z
312
m/z
314
m/z
316
m/z
328
m/z
330
m/z
332
m/z
342
m/z
344
m/z
346
Et
###
*
#
▲
*
#
▲▲
###
** **
▲
* *
Dm
**
####
▲▲▲
#
▲
*
#
▲
**
###
▲▲
*
**
▲
▲
Hx
****
##
▲▲▲▲
#
▲
*
#
▲
***
##
▲▲▲▲
* *
EtDm
**
###
▲▲
#
*
#
▲
*
###
▲
*
**
▲
*
DmHx
***
###
▲▲▲▲
#
▲
*
#
▲
***
###
▲▲▲
*
**
▲
▲
EtHx
***
#
▲▲
▲
*
#
▲
***
###
▲▲
*
**
▲
▲
* * *
EtDmHx
***
###
▲▲▲
#
▲
*
#
▲
***
###
▲▲▲
*
**
▲
* *
* m/z encontrados nas flores
# m/z encontrados no caule
▲ m/z encontrados nas folhas
83
Para m/z 288 observamos a presença de isóbaros para as flores, para o
caule e folhas. Para o extrato em etanol o caule apresentou três isóbaros
enquanto que as flores e folhas não contém esse alcalóide. Para as demais
misturas tanto as flores quanto caule e folhas apresentaram isóbaros para m/z
288.
Apenas um pico cromatográfico foi obtido com valor m/z 312 nas
diferentes partes da planta e o solvente etanol foi importante por ter sido o
único a extrair esse alcalóide nas flores. No m/z 314 não houve presença de
isóbaros nos extratos das flores e caule, mas o etanol extraiu um isóbaro nas
folhas desse alcalóide.
Vários isóbaros foram encontrados para m/z 316 para as três partes da
planta analisada, porém o etanol puro não extraiu esse alcalóide nas flores e
folhas. Nem todas as misturas de solventes extraíram o alcalóide com m/z 328 e
a mistura binária (etanol:hexano 0,5:0,5 (v/v)) foi importante na extração de
isóbaros de m/z 328 no caule, sendo que nas folhas não foi encontrado esse
alcalóide. Os extratos do caule não apresentaram alcalóides com m/z 330 e
apenas as folhas contém alcalóides com m/z 332. Os valores de m/z 342, 344 e
346 foram encontrados apenas nas flores.
Tendo em vista as diferenças apresentadas para as flores, caule e folhas e
também o efeito do solvente na extração de alcalóides na Erytrina speciosa,
fica evidente a importância da otimização no processo de extração e que com o
uso do planejamento de misturas podemos direcionar a extração para o
composto de interesse, o que nem sempre é possível com a utilização apenas de
solventes puros.
No que diz respeito a moléculas pequenas (massa < 1000 Da), a MS é de
grande valia em fornecer informações a respeito de fórmula molecular mediante
medidas de m/z. Somada a essa capacidade, a realização de experimentos de
84
espectro de íons fragmentos (MS/MS) por técnicas como dissociação induzida
por colisão (CID) permite ainda obter informações estruturais a respeito da
molécula em questão através do padrão de fragmentação observado. Entretanto,
a elucidação estrutural de uma molécula pequena não pode ser alcançada
apenas por experimentos de MS e MS/MS, uma vez que moléculas muito
similares, como isômeros posicionais, frequentemente apresentam espectros de
íons fragmentos (MS/MS) virtualmente idênticos, dificultando sua distinção 27.
A elucidação estrutural completa de uma molécula pequena, que compreende a
identificação e atribuição de conectividades entre átomos e estereoquímica, é
sempre realizada por meio de técnicas independentes como a espectroscopia de
ressonância magnética nuclear (NMR) mono- (1D) e bidimensional (2D) e a
difração de raios-X (XRD)28. Embora esforços tenham sido feitos no sentido de
se expandir as capacidades de elucidação estrutural baseada em MS com
abordagens alternativas 27 e ferramentas de predição de espectros 28, a
elucidação estrutural completa de compostos orgânicos desconhecidos, sem
nenhum conhecimento prévio a respeito da estrutura, ainda é parte do domínio
da espectroscopia de NMR.
Pelas razões explicadas acima, não há garantia que os vários íons
isóbaros observados ao longo das análises por UHPLC-ESI-MS poderiam ser
diferenciados por experimentos de espectros de íons fragmentos (MS/MS) pois,
em muitos casos, como o de isômeros posicionais que constituem o par
eritrartina e 11-metoxi-erisodina, os espectros de fragmentação obtidos
possivelmente seriam muito parecidos, inviabilizando a diferenciação.
85
2.4. Identificações das estruturas de alcalóides eritrínicos por
cálculos teóricos
Os principais alcalóides eritrínicos apresentam como esqueleto clássico a
estrutura apresentada na Figura 2.27. Esses alcalóides se diferenciam uns dos
outros pela presença e posição de substituintes ao longo da estrutura29.
Figura 2.27. Estrutura clássica do esqueleto de alcalóides eritrínicos.
Os extratos das flores de Erythrina, preparados em hexano, etanol e
diclorometano puros, de acordo com o descrito na parte experimental foram
analisados por espectroscopia de absorção molecular na região UV-Vis (Cary
50, Varian/Agilent). Os espectros foram analisados e identificados nos pontos
de absorção máxima.
Adicionalmente aos procedimentos experimentais, os espectros UV-Vis
de alguns compostos com estrutura eritrínica foram calculados. Primeiramente
a geometria de equilíbrio foi obtida através de otimizações no funcional B3LYP
e a função base 6-311+G(d,p). Neste nível os resultados podem ser obtidos
rapidamente em uma estação de trabalho AMD 64 através do GAUSSIAN03 30.
Uma vez que as extrações utilizaram solventes com diferentes
polaridades foi utilizado o modelo de PCM implementado no GAUSSIAN03.
86
Para a obtenção das energias verticais de excitação foi empregada a Teoria do
Funcional de Densidade Dependente do Tempo (TDDFT) no mesmo nível das
otimizações geométricas. O protocolo teórico aplicado nesta tese foi discutido
anteriormente em outro trabalho31 como um método de reprodução dos
espectros UV-Vis de diversos cromóforos com excelente acordo com os dados
experimentais. As geometrias de dois alcalóides, eritrartina e 11-metoxi-
erisodina, identificados tentativamente por ESI-MS como íons isóbaros de m/z
330, Figura 2.28, foram otimizadas através do funcional hibrido B3LYP com a
função de base 6-311+G(d,p) .
Figura 2.28. Estruturas da (A) eritrartina e (B) 11-metoxi-erisodina, alcalóides
eritrínicos identificados tentativamente por MS como íons de m/z 330.
A Tabela 2.14 mostra a comparação entre as frequências de absorção
experimentais e as obtidas teoricamente. Quando se avalia a Tabela 2.14,
observamos que apesar do fato da medida experimental ser feita na presença de
diversas substâncias, existe um acordo muito bom do pico de absorbância com
os valores calculados para a eritrartina e a 11-metoxi-erisodina. É possível notar
que os solventes afetam muito pouco a frequência de absorção de ambos os
compostos. Independentemente do solvente utilizado a frequência de absorção
não varia mais de 1 nm.
87
Tabela 2.14. Comparação entre as frequências de absorção das transições pi-
pi*, obtidas experimentalmente e teoricamente.
Solvente Teórico
Eritrartina
Teórico
11-metoxi-erisodina Experimental
Etanol 282,7 273,2 271
Clorofórmio 282,2 273,4 282
Hexano 281,5 272,6 270
As medidas teóricas foram capazes de representar os valores
experimentais muito bem. Pela comparação entre os espectros teóricos e
experimentais, é possível afirmar que apenas quando o clorofórmio é utilizado
como solvente a 11-metoxi-erisodina é extraída em maior quantidade.
2.5. Conclusão 2:
De acordo com o estudo realizado no capitulo 2 concluímos que:
1) As misturas de solventes foram eficazes para extração da maior
quantidade de alcaloides considerados como marcadores da planta
Erythrina speciosa Andrews.
2) Apesar das folhas serem mais utilizadas popularmente como sendo a
mais rica em alcaloides, as flores apresentaram maior diversidade de
alcaloides encontrados.
3) Modelos matemáticos foram validados aos conjuntos de dados obtidos
para os extratos das flores e folhas, podendo ser previsto qualquer valor
de intensidade para os picos dos alcaloides estudados dentro do domínio
experimental do planejamento simplex centróide.
88
4) Cálculos usando a Teoria do Funcional de Densidade Dependente do
Tempo (TDDFT) com a funcional B3LYP e o conjunto de base 6-
311+G(d,p) forneceram informações uteis para fazer atribuições de
bandas no UV.
____________________________________________________________
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corallodendron seeds. Phytochemistry. 27, 1297-300, 1988. 2 FARIA, T. J, CAFEU, M. C.; AKIYOSHI, G.; FERREIRA, D. T.; GALÃO, O.F.;
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91
Capitulo 3 - Otimização das condições para absorção nas folhas
de cultivares de café
3.1. Introdução
O café é uma das bebidas mais consumidas no mundo. Umas das
variedades de café mais comercializadas é o café arábico por ter qualidade
superior devido as suas propriedades sensoriais2,3. Diversas propriedades são
atribuídas ao café e diversos estudos envolvem o mesmo4.
O Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR), localizado na cidade de
Londrina, foi criado em 1974 e possui um banco de genes do café arábico. Essa
coleção de genes foi usada para melhoramento genético como, por exemplo, a
resistência a ferrugem5.
Atualmente, o sensoriamento remoto tem sido bastante utilizado para
estudos onde é necessário o monitoramento da planta em seu lugar de
crescimento. Os equipamentos para sensoriamento remoto podem ser definido
como aqueles que processam dados, com a finalidade de estudar o ambiente
terrestre por meio do registro das interações entre a radiação eletromagnética e
as diversas coberturas que compõem a superfície terrestre, estando, portanto
relacionados a medidas de radiação eletromagnética6.
A aquisição de dados de sensoriamento remoto envolve quatro partes
básicas: a fonte de energia eletromagnética, a atmosfera, o alvo e o sensor. Em
sensoriamento remoto, a principal fonte de energia eletromagnética é o Sol. A
energia eletromagnética, ao se propagar pela atmosfera, sofre modificações em
sua intensidade e em sua distribuição espectral. Ao atingir a superfície terrestre,
a energia interage com os objetos, podendo ser refletida, transmitida e/ou
92
absorvida7. A quantidade de energia refletida (R) por um objeto é função de três
fatores: a energia eletromagnética incidente (I), proveniente do sol ou uma
lâmpada, a quantidade de energia absorvida (A) e a quantidade de energia
transmitida (T). Podemos expressar essa relação como R = I – (T + A). A razão
entre a quantidade de energia refletida e a quantidade de energia irradiada sobre
os objetos na superfície terrestre fornece a medida de refletância captada por
sensores, denominados espectroradiômetros.
A espectroradiometria permite a eliminação do efeito da atmosfera na
coleta dos dados, pois a distância entre o sensor e o alvo é mínima e é possível
controlar o ângulo de iluminação, isso elimina as fontes de variação na
obtenção dos dados de sensoriamento remoto. As folhas são o órgão mais
importante das plantas para sensoriamento remoto, pois elas têm grande
importância na interação do fluxo radiante com a vegetação devido a sua
constituição com estruturas fotossintetizantes. As folhas são responsáveis pela
absorção de energia eletromagnética necessária para realização da fotossíntese.
A parte mais importante do ponto de vista fisiológico e bioquímico para a
produtividade da planta é a parte absorvida da radiação, mas devido à
capacidade de muitos sensores a reflectância tem sido muito usual na
literatura8. Os valores de reflectância e transmitância variam de forma muito
semelhante ao longo do espectro eletromagnético, mas a produção de biomassa
é altamente relacionada com a quantidade total de energia absorvida pelas
folhas. Como os valores de absorbância são praticamente inversos aos de
reflectância e considerando a capacidade de medir reflectância pelos sensores, é
viável estabelecer relações entre a reflectância e os parâmetros de biomassa. A
Figura 3.1 apresenta a curva de reflectância de folhas verdes e saudáveis com
variações dos comprimentos de onda:
93
Figura 3.1. Curva de reflectância de folha verde e saudável típica9.
Na região do visível a resposta obtida espectralmente da planta é
dominada pela ação de pigmentos como clorofila e antocianinas, sendo que as
concentrações desses pigmentos variam de forma intensa dependendo da
espécie7.
A análise das folhas é o método mais eficiente para monitorar a
composição química dos cultivares de café. Por exemplo, a deficiência de
nitrogênio provoca folhas amareladas e velhas, sendo necessária análise
química para determinação de nitrogênio, que pode ser feita com base na
clorofila presente nas folhas para controlar sua qualidade nutricional7,10.
Além da clorofila, outro pigmento importante nos cultivares são as
antocianinas11, um corante natural que aumenta o valor estético do produto. Nas
folhas com clorofila e antocianinas, a refletância é baixa em toda a faixa do
visível em razão da absorção diferenciada desses dois pigmentos na região do
visível. Na região do infravermelho próximo, a reflectância aumenta em
94
consequência da mudança nas estruturas internas das folhas. Na região do
infravermelho médio ocorre forte absorção principalmente da água. Se a
quantidade de água no interior da planta diminui, a reflectância aumenta.
Tendo em vista a importância da espécie arábica na produção do café,
medidas espectroradiômetricas foram realizadas em quatro cultivares de café no
IAPAR, para otimizar as variáveis que influenciam na absorção das folhas dos
cultivares na faixa de 350-1100 nm e para os comprimentos de onda referentes
à clorofila e antocianinas.
3.2. Dados
As análises foram realizadas pelo CEPAGRI - Centro de Pesquisas
Meteorológicas e Climáticas Aplicadas à Agricultura da Universidade Estadual
de Campinas, por Gustavo Coral. As medições foram realizadas com um
espectroradiômetro portátil LI_COR 1800 equipado com um adaptador
hemisférico para esta finalidade. A esfera integradora usava luz unidirecional,
na precisão de 2 nm e faixa de 350-1000 nm. As mudas de dois cultivares de
café IAPAR 59 (IPR-59) e Catuaí IAC 99 (CAT) e dois acessos da coleção de
Etiópia IAPAR intituladas E083 e E027 foram plantadas em 2009, no campo
experimental do IAPAR, em Londrina (-23 ° 18 '37'' S, 51 ° 09 '46'' W, 585 m
de altitude), Brasil. As plantas foram cultivadas sob dois regimes de
abastecimento de água - condições de campo e de irrigação. Cada observação
foi realizada três vezes, em agosto de 2012.
As condições de análise estão representadas na Figura 3.2, totalizando 16
diferentes medidas para cada cultivar, todas as medidas realizadas em triplicata.
95
Figura 3.2. Esquema de análises para cada cultivar com as combinações
possíveis dos fatores estudadas.
96
Para as folhas de quatro cultivares diferentes: IPR-59, CAT, 083 e 027,
as variáveis foram: duas faces: abaxial e adaxial; dois estratos extremos de cada
cultivar: superior e inferior e quatro pontos cardeais: norte e sul (latitude) e
leste e oeste (longitude) para cultivar com sistema irrigado e não irrigado.
Para cada cultivar 96 espectros de absorbância foram obtidos devido às
triplicatas. Essas respostas foram dispostas em forma de uma matriz 96x376,
que corresponde a 96 linhas referentes aos 32 espectros de absorbância em
triplicata e 376 colunas correspondentes aos comprimentos de onda de 350 até
1100 nm.
Os dados foram pré-processados por comprimento de vetor, área unitária,
centrados na média e segunda derivada. Essa etapa de pré-processamento é a
transformação matemática dos dados antes da aplicação de tratamentos
multivariados que visa remover ou reduzir fontes de variação aleatória nos
dados, que pode estar ligada a variação do equipamento ou da própria amostra.
Porém os pré-processamentos não mudaram e nem contribuíram para melhor
visualização a discriminação dos grupos, portanto os resultados apresentados
são com os dados brutos.
3.3. Tratamento multivariado
As duas primeiras componentes principais para os quatro cultivares
estudados explicam em torno de 90% da variação total dos dados. Os diferentes
cultivares apresentaram discriminação nos gráficos dos scores muito similares,
como pode ser observado na Figura 3.3. O gráfico dos scores da CP1xCP2,
onde a legenda permite identificar as amostras irrigadas e não irrigadas, dois
grupos foram formados, que representam os espectros com face abaxial e
97
adaxial. O tipo de irrigação não foi importante para discriminação dos grupos
de acordo com a análise de componentes principais.
Figura 3.3. Gráfico dos scores da CP1xCP2 para os cultivares de café com
todos os espectros irrigados e não irrigados, onde os símbolos identificam as
amostras irrigadas e as amostras não irrigadas.
Os gráficos dos scores para o conjunto de dados irrigado e o gráfico dos
scores para o conjunto de dados não irrigado, Figura 3.4, para os quatro
cultivares analisados, também apresentou discriminação apenas em relação às
faces adaxial (AD) e abaxial (AB). De acordo com os símbolos usados para
cada fator estudado, fica visualmente notável à similaridade entre os espectros,
já que nenhum grupo foi discriminado em relação aos extremos inferior e
superior.
Adaxial
Abaxial
Adaxial Abaxial
Adaxial Abaxial
Abaxial
Adaxial
98
Figura 3.4. Gráfico dos scores para o conjunto de dados irrigado e não
irrigado nos quatro cultivares analisados.
99
Os pontos cardeais não foram discriminados pela análise de componentes
principais. Levando em conta os gráficos dos scores para todos os fatores
estudados, apenas a face abaxial e adaxial foi importante para discriminação
dos grupos. Esse fato já era esperado devido à incidência de radiação, de forma
geral, ser maior na face adaxial das folhas, e por isso as respostas podem ser
observadas como maior facilidade.
Para estudar a influência das variáveis na absorção das antocianinas com
comprimento de onda em 520 nm12, da clorofila com comprimento de onda 650
nm13 e no comprimento de onda de 554 nm, onde foi encontrada a menor
absorção nas folhas dos cultivares, foram realizados planejamentos fatoriais
completos 24.
Cada um dos efeitos calculados é uma combinação linear dos valores das
respostas (y) e foi determinado de acordo com a equação 3.1:
(+) - (-) (3.1)
onde (+) é a média de todas as respostas com fator k no nível mais alto e
(-) é a média de todas as respostas com fator k no nível mais baixo. As
respostas são as absorbâncias nos comprimentos de onda mencionados acima
que podem ser afetadas ou não por modificações provocadas dos fatores.
Para avaliar a significância estatística dos efeitos das variáveis nas
absorções em questão, foram construídos intervalos de confiança, usando a
distribuição t de student. O erro padrão foi estimado devido a triplicata dos
pontos do planejamento fatorial.
São estatisticamente significativos os efeitos cujas estimativas (obtidos
no experimento) forem superiores em valor absoluto ao produto do erro padrão
pelo ponto crítico da distribuição de t student, porque só assim o intervalo de
100
confiança não incluirá o valor zero. A Tabela 3.1 apresenta os fatores e os
níveis que esses fatores foram estudados nos diferentes cultivares.
Tabela 3.1. Planejamento fatorial 24 para análise das folhas dos cultivares com
a latitude variando nos pontos cardeais. Variáveis Níveis
+1 -1
Irrigação Irrigado Não irrigado
Estratos extremos Superior Inferior
Latitude Norte Sul
Face Abaxial Adaxial
No total 48 experimentos foram realizados, com t para 32 graus de
liberdade devido a triplicata do planejamento 24 para cada um dos quatro
cultivares estudados.
Para o cálculo dos efeitos, foi necessário alinhar os espectros. A Tabela
3.2 apresenta os valores dos efeitos das variáveis calculados para o cultivar
IPR-59 nos comprimentos de onda de 520 nm, 554 nm e 650 nm, a
significância no nível de 95% de confiança e o erro padrão.
Consideraremos estatisticamente significativos, com 95% de confiança,
efeitos cujo valor absoluto for superior a para 520 nm, para
554 nm e para 650 nm. Aplicando esse critério aos valores da Tabela
3.2, observamos que apenas a variável face foi significativa, ou seja, a face
abaxial e adaxial interfere na absorção dos comprimentos de onda estudados.
Os valores abaixo de 0,05 de significância indicam que os efeitos são
significativos no nível de 95% de confiança, evidenciando que apenas o fator
face é importante para absorção nos comprimentos de onda 520 nm, 554 nm e
650 nm.
101
Tabela 3.2. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm e
650nm para o cultivar IPR-59, com os valores de significância e erro padrão
para cada efeito. Para 520 nm:
IPR-59 Significância Erro padrão
Irrigação -0,0071 0,299306 0,007
Estratos extremos 0,0011 0,862760 0,007
Latitude 0,0016 0,812112 0,007
Face -0,0415 0,000001 0,007
Para 554 nm:
IPR-59 Significância Erro padrão
Irrigação 0,0106 0,349978 0,011
Estratos extremos 0,0058 0,603845 0,011
Latitude 0,0034 0,763385 0,011
Face -0,0703 0,000000 0,011
Para 650 nm:
IPR-59 Significância Erro padrão
Irrigação -0,0043 0,613436 0,008
Estratos extremos 0,0046 0,592501 0,008
Latitude 0,0005 0,945139 0,008
Face -0,0370 0,000130 0,008
O fato do valor calculado do efeito da face ser negativo indica que as
absorbâncias na face adaxial foram maiores do que na face abaxial. Isso indica
que têm maiores abundâncias de clorofilas e antocianinas na face recebendo
diretamente iluminação solar.
A Tabela 3.3 apresenta os valores dos efeitos dos fatores calculados para
o cultivar CAT nos comprimentos de onda de 520 nm, 554 nm e 650 nm, a
significância no nível de 95% de confiança e o erro padrão.
Foi considerado estatisticamente significativo, com 95% de confiança,
um efeito cujo valor absoluto foi superior para 520nm, para
554nm e para 650nm. De acordo com os valores da Tabela 3.3,
observamos que a variável face e irrigação foram significativas em todos os
comprimentos de onda. Isso indica que a face abaxial e adaxial e que se o
102
cultivar foi irrigado ou não afetam a absorção nos comprimentos de onda
estudados. A latitude também foi significativa para a absorção em 520 e
554nm. Os valores de significância também mostrou a importância dessas
variáveis em 95% de confiança.
Tabela 3.3. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm e
650nm para o cultivar CAT, com os valores de significância e erro padrão para
cada efeito. Para 520 nm:
CAT Significância Erro padrão
Irrigação -0,00929 0,021532 0,004
Estratos extremos 0,0066 0,091572 0,004
Latitude 0,0116 0,004912 0,004
Face -0,0504 0,000000 0,004
Para 554 nm:
CAT Significância Erro padrão
Irrigação -0,0168 0,006451 0,006
Estratos extremos 0,0086 0,141833 0,006
Latitude 0,0169 0,006063 0,006
Face -0,0740 0,000000 0,006
Para 650 nm:
CAT Significância Erro padrão
Irrigação -0,0029 0,013829 0,001
Estratos extremos -0,0002 0,841585 0,001
Latitude 0,0017 0,145008 0,001
Face -0,0170 0,000000 0,001
*A interação entre estratos extremos e latitude foi significativa para os três comprimentos de
onda e a interação irrigação e face foi significativa para 650nm.
Os valores dos efeitos para irrigação e para a face foram negativos,
portanto os níveis mais baixos desses fatores (não irrigado e adaxial) obtiveram
maiores valores de absorção indicando maiores abundâncias de antocianinas e
clorofilas nesse cultivar. Para o fator latitude o nível mais alto foi o responsável
pela menor absorção do conjunto de dados para o cultivar CAT.
103
A Tabela 3.4 apresenta os valores dos efeitos calculados para o cultivar
27 nos comprimentos de onda de 520 nm, 554 nm e 650 nm, a significância no
nível de 95% de confiança e o erro padrão.
Tabela 3.4. Tabela dos efeitos das variáveis na absorção em 520 nm, 554 nm e
650 nm para o cultivar 027, com os valores de significância e erro padrão para
cada efeito. Para 520 nm:
027 Significância Erro padrão
Irrigação 0,0135 0,001210 0,004
Estratos extremos 0,0046 0,231210 0,004
Latitude -0,0049 0,203182 0,004
Face -0,0518 0,000000 0,004
Para 554 nm:
027 Significância Erro padrão
Irrigação 0,0242 0,001366 0,007
Estratos extremos 0,0034 0,618205 0,007
Latitude -0,0193 0,008622 0,007
Face -0,0832 0,000000 0,007
Para 650 nm:
027 Significância Erro padrão
Irrigação 0,00568 0,041147 0,003
Estratos extremos 0,0004 0,860341 0,003
Latitude -0,0063 0,023831 0,003
Face -0,0249 0,000000 0,003
Consideramos significativos os efeitos com valores superiores
para 520 nm, para 554 nm e para 650 nm. Portanto,
observamos que os fatores face e irrigação foram significativos nos três
comprimentos de onda, o que indica que as variáveis face abaxial e adaxial, e se
o cultivar foi irrigado ou não, afetam a absorção nos comprimentos de onda
estudados. Diferentemente do resultado obtido para o cultivar CAT, o fator
irrigação foi positivo, evidenciando que as maiores absorções da clorofilas e
antocianinas são obtidas para plantas sujeitas a irrigação. O efeito de latitude,
ou seja, a folha no norte e no sul também foi significativa para a absorção em
104
554 e 650 nm. Isso pode indicar maiores abundâncias de clorofilas nas folhas
localizadas no sul da planta.
A Tabela 3.5 apresenta os valores dos efeitos das variáveis calculados
para o cultivar 83 nos comprimentos de onda de 520 nm, 554 nm e 650 nm, a
significância no nível de 95% de confiança e o erro padrão. São significativos
os efeitos com valor superior para 520 nm, para 554 nm e
para 650 nm. Portanto, os fatores face e irrigação são significativos
para os três comprimentos de onda estudados. Para o fator irrigação o nível
mais alto e para a face o nível mais baixo são as condições otimizadas para
maior absorbância de clorofilas e antocianinas. Esses resultados são similares
aos obtidos para o cultivar 027. Essa similaridade pode ser devido ao fato
desses cultivares serem dois acessos da coleção de Etiópia IAPAR.
Tabela 3.5. Tabela dos efeitos das variáveis na absorção em 520nm, 554nm e
650nm para o cultivar 083, com os valores de significância e erro padrão para
cada efeito. Para 520nm:
083 Significância Erro padrão
Irrigação 0,023322 0,000167 0,005
Estratos extremos 0,005190 0,350112 0,005
Latitude 0,005619 0,312355 0,005
Face -0,038104 0,000000 0,005
Para 554 nm:
083 Significância Erro padrão
Irrigação 0,054669 0,000658 0,014
Estratos extremos 0,005522 0,705534 0,014
Latitude 0,007939 0,587431 0,014
Face -0,062177 0,000153 0,014
Para 650 nm:
083 Significância Erro padrão
Irrigação 0,0302 0,001664 0,008
Estratos extremos 0,0014 0,867833 0,008
Latitude 0,0045 0,609451 0,008
Face -0,0253 0,007084 0,008
105
Um segundo planejamento fatorial 24 foi realizado com outra variável
dos pontos cardeais, a longitude. A Tabela 3.6 apresenta as variáveis e os níveis
das variáveis para os quatro cultivares estudados.
Tabela 3.6. Planejamento fatorial 24 para análise das folhas dos cultivares com
a longitude variando nos pontos cardeais. Variáveis Níveis
+1 -1
Irrigação Irrigado Não irrigado
Estratos extremos Superior Inferior
Longitude Leste Oeste
Face Abaxial Adaxial
Os resultados obtidos para esse planejamento, com 95% de confiança
estão apresentados na Tabela 3.7. Com base nesta tabela evidenciamos que a
troca do fator latitude pelo fator longitude manteve a face como o fator
associado com as maiores variações de absorção de clorofilas e antocianinas
para todos os cultivares, porém existem diferenças para os outros fatores.
Alguns efeitos que são significativos no planejamento com longitude, não são
significativos no planejamento com latitude. Existem duas possíveis
explicações para este comportamento: efeitos de interação entre estes fatores
podem ser significativos resultando em efeitos significativos nos dois
planejamentos e o modelo obtido do planejamento fatorial é linear e não levam
em conta possíveis curvaturas no comportamento de absorbância como função
dos níveis dos fatores.
106
Tabela 3.7. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520 nm, 554 nm, e
650 nm para os quatro cultivares estudados. IPR-59 520 nm 554 nm 650 nm
Efeito Erro padrão Efeito Erro padrão Efeito Erro padrão
Irrigação -0,0150 0,0048 0,0106 0,0112 -0,0032 0,0028
Estratos
extremos 0,0178 0,0048 0,0059 0,0112 0,0076 0,0028
Longitude -0,0041 0,0048 0,0034 0,0112 -0,0022 0,0028
Face -0,0438 0,0048 -0,0703 0,0112 -0,0207 0,0028
CAT 520 nm 554 nm 650 nm
Irrigação -0,0030 0,0080 0,0020 0,0015 0,0004 0,0041
Estratos
extremos 0,0090 0,0080 -0,0004 0,0015 0,0105 0,0041
Longitude -0,0027 0,0080 0,0009 0,0015 -0,0030 0,0041
Face -0,0792 0,0080 -0,0173 0,0015 -0,0558 0,0041
027 520 nm 554 nm 650 nm
Irrigação 0,0004 0,0069 -0,0062 0,0105 -0,0026 0,0037
Estratos
extremos 0,0150 0,0069 0,0211 0,0105 0,0046 0,0037
Longitude 0,0031 0,0069 0,0108 0,0105 0,0030 0,0037
Face -0,0346 0,0069 -0,0532 0,0105 -0,0162 0,0037
083 520 nm 554 nm 650 nm
Irrigação 0,0177 0,0080 0,0356 0,0166 0,0272 0,0103
Estratos
extremos -0,0072 0,0080 -0,0078 0,0166 -0,0067 0,0103
Longitude -0,0035 0,0080 -0,0047 0,0166 -0,0114 0,0103
Face -0,0330 0,0080 -0,0543 0,0166 -0,0215 0,0103
Analisando os resultados obtidos, foi de grande importância à face
adaxial para estudar a absorção das folhas dos cultivares. Com base nesses
resultados, a absorção das clorofilas e das antocianinas na parte adaxial pode
ser usada para controle da saúde dos cultivares.
Na Figura 3.5 temos os 32 espectros para cada cultivar de café que está
dividido em dois conjuntos: 16 espectros de absorção para cultivares irrigados e
16 espectros de absorção para cultivares não irrigados.
107
Figura 3.5. Gráfico dos 32 espectros de absorbância para os quatro cultivares
de cafés irrigados e não irrigados. Em vermelho temos os espectros obtidos na
face abaxial e em preto os espectros obtidos na face adaxial nos comprimentos
de onda de 350 até 1100nm.
108
Como pode ser observado na Figura 3.2, cada conjunto apresenta os
espectros nos demais fatores estudados: irrigado com face, estratos extremos e
pontos cardeais e não irrigado com face, estratos extremos e pontos cardeais
nos comprimentos de onda de 350 até 1100 nm. Os perfis dos espectros
apresentam diferenças bem sutis quando observados a olho nu, porém os perfis
dos espectros obtidos com a face adaxial e abaxial ficam separados nos
conjuntos de dados dos quatro cultivares.
O uso do planejamento experimental foi de grande importância para
identificar fatores que afetam na absorção e que não foram discriminados pela
análise das componentes principais. A influência dos quatro fatores mostra a
importância da face nesse estudo, independente se os dados usados forem de
absorbância, transmitância ou reflectância. Estudos envolvendo planejamentos
de experimentos não são muito usuais para dados de sensoriamento remoto
agrícola, sendo a primeira vez que foi usado para cultivares de café. Vários
fatores são importantes como, por exemplo, localidade, idade das plantas, tipo
de solo e quantidade de chuva.
3.4. Conclusões 3
De acordo com o estudo realizado no capitulo 3 concluímos que:
1) Planejamento fatorial conseguiu discriminar amostras com diferentes
níveis de irrigação, estratos extremos, pontos cardeais e face. A análise
de componentes principais somente discriminou amostras com faces
diferentes.
109
2) Planejamentos experimentais não são muito utilizados para esse tipo de
estudo, porém sua abordagem foi essencial para avaliar a influência dos
fatores nas absorção de compostos importantes para os cultivares de café.
3) Futuramente o uso de planejamentos de experimentos podem ser testados
com polinômios de ordem superior, inclusive superfícies de respostas,
para explorar mais o ambiente agrícola no geral, trazendo informações
importantes contribuindo para estudos mais avançados na agricultura.
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