TOXICITY STUDY AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF

OLIVE MILL WASTE WATER EXTRACT OBTAINED BY

MEMBRANE ULTRAFILTRATION

RELATORE CANDIDATA

Prof. Vincenzo Pezzi Priskila Widjaja

CO-RELATORE 159380

Dott. Stefano Curcio

Dott. Sudip Chakraborty

Dipartimento di Farmacia e Scienza della Salute e della Nutrizione

Corso di Laurea Magistrale in Scienza della Nutrizione

Tesi di Laurea Sperimentale in

BIOLOGIA APPLICATA

INTRODUZIONE

Area Mediterranea offre il 97% della produzione di oliva

Fornire 95 % olio d’oliva mondiale

All’interno del processo di fressatura, quasi 80% vinacce sono

scartati come grande quantitá di Acqua Vegetazione

Composti FENOLICI e materia organica sono cosiderati come

PROBLEMATICI per la fitotossica e carracteristico

antibatterico in cui sono resistenti alla degradazione biologica

Circa 53% di FENOL che viene dal processo di molitura delle

oliva va con ACQUA VEGETAZIONE

Mentre oltra 45% va con vinacce e pietra come rifiuti solidi

Molti processi biologici e fisico sono state eseguite per trattare

AV, alcuni processi garantiscono efficienza in controllo

dell’inquinamento, ma grande quantitá di fanghi e crea altro

PROBLEMA AMBIENTALE

Separazione Membrana avuto posto importante nella tecnologia

chimica e giá stata utilizata in una vasta gamma applicazione

La membrana può definito come barriera permselective tra 2

fasi omogenee grazia alla forza pressione

I benefici sono: risparmio energetico, ambientale benigno, la

semplicitá e facile di controllare

Microfiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration sono giá stabilite

in varie applicazioni nel trattamento delle acque, industria

alimentare, farmaceutica e biotecnologia

OBIETTIVO DI RICERCA

Valutare il comportamento di differenti membrana per

purificare AV

Osservare attivitá antiossidante e fenolico totale di

permeato

Osservare la citotossicitá tra le colture cellulari e danni

al AND in cellule esposte

MATERIALE E METODO

Feed AV

(+ a.citrico)

Filtro di Cotone

Centrifugazione al 3500 rpm per 15 min

Pre-Trattamento

40C -100C

Lab Fenomena trasporti

DIMES, UNICAL

Poly ethersulphonate 30 e 100 kDa

Cellulosa acetate 30 e 100 kDa

𝐽𝑣 =𝐿𝑝

∆𝑝

𝐼𝑓 = 1 −𝐿𝑝𝑥

𝐿𝑝𝑜. 100

𝐹𝑅 =𝐿𝑝𝑜

𝐿𝑝𝑖. 100

Total Phenol : Folin-cicalteau

Attivitá antiossidante : DPPH e ABTS

[Lab Tecnologia Farmaceutica, UNICAL]

Citotossicitá del MCF-7 : MTT assay, 72 h

[Lab Biologia Applicata, UNICAL]

Citotossicitá del NCTC 929 : Resazulin colorazione, 72 h

Attivitá anti parasite : epimastigote T.cruzi, promastigote

L.infantum e L braziliensis

[Central Desarrollo Investigazione, Asuncion, Paraguay]

Genotossicitá cellular : Comet assay

[Lab Genetic Toxixidad, UCA, Paraguay]

RISULTATO E DISCUSSIONE

Tipo Membrane If FR (%)

PES 100 kDa 74.73b 71.54a

PES 30 kDa 42.9a 74.55a

Cel 100 kDa 50a 92.53b

Cel 30 kDa 56a 88.98b

Flusso del PES membrane facilmente fallo

Più grande il poro, più facile di essere blocata

Cel membrane offre più recoperazione di flusso

Fenolo totale del Feed e Permeato di Acqua Vegetazione

Temperatura Sample Fenolo (mg/g CatEq)

40C Feed 3.05 ± 0.03 a

Cel 100 kDa 2.29 ± 0.05 b

Cel 30 kDa 2.02 ± 0.05 b

PES 100 kDa 2.31 ± 0.04 a

PES 30 kDa 1.89 ± 0.04 d

-100C Feed 3.77 ± 0.02 a

Cel 100 kDa 2.28 ± 0.05 b

Cel 30 kDa 2.58 ± 0.03 c

PES 100 kDa 2.34 ± 0.06 b

PES 30 kDa 2.87 ± 0.03 d

Temperatura Sample IC50 (mg)

40C Feed 19.57 ± 0.14 a

Cel 100 kDa 14.48 ± 0.17 b

Cel 30 kDa 12.47 ± 0.18 c

PES 100 kDa 12.32 ± 0.15 c

PES 30 kDa 12.55 ± 0.14 c

-100C Feed 7.43 ± 0.19 a

Cel 100 kDa 7.17 ± 0.15 b

Cel 30 kDa 6.74 ± 0.23 c

PES 100 kDa 7.15 ± 0.26 b

PES 30 kDa 6.18 ± 0.23 d

IC50 di permeato misurata con DPPH

Temperatura Sample IC50 (mg)

40C Feed 15.92 ± 0.18 a

Cel 100 kDa 12.01 ± 0.21 c

Cel 30 kDa 8.77 ± 0.19 d

PES 100 kDa 13.78 ± 0.18 b

PES 30 kDa 9.18 ± 0.21 d

-100C Feed 8.03 ± 0.31 a

Cel 100 kDa 8.16 ± 0.25 b

Cel 30 kDa 6.62 ± 0.23 d

PES 100 kDa 8.09 ± 0.26 ab

PES 30 kDa 6.92 ± 0.19 c

IC50 di permeato misurata con ABTS

Parametri Concentration unit

Fenolo 272.21 ± 2.96 (mg CatEq/g)

IC50 DPPH 0.07 ± 0.09 mg

IC50 ABTS 0.09 ± 0.09 mg

Lyophilizzato del permeato PES 30 kDa

*

* * **

*

*

*

*

**

* * *

Cell culture LD50 (mg/ml)

NCTC 929 3.14 ± 0.17

MCF 7 2.67 ± 0.15 A

Tripanosoma cruzi 2.69 ± 0.66 A

Leishmania braziliensis 2.34 ± 0.48 B

Leishmania infantum 2.55 ± 0.37 B

A = statisticamente differente (p<0.05) verso LD50 NCTC 929

B = statisticamente differente (p<0.001) verso LD50 NCTC 929

Estratto di AV statisticamente dimostrato la selettivitá di

inibire la proliferazione delle cellule tra cellule normale,

cellule tumorali e parassiti unicellulari

Control 0.5 mg/ml 1.0 mg/ml 5.0 mg/ml

TM 0.028 ± 0.049 0.039 ± 0.068 0.054 ± 0.105 0.082 ± 0.348

OTM 0.067 ± 0.011a 0.083 ± 0.124ab 0.099 ± 0.163a 0.164 ± 0.024a

% DNA 1.723 ± 2.512 1.753 ± 2.499 1.856 ± 3.040 1.848 ± 3.053

DNA single strand break by COMET ASSAY

CONCLUSIONI

• Membrane Cellulosa offre meglio recupero del flusso mentre PES

30 kDa offre meglio recupero del fenolo e antiossidante

• Esstrato di AV ha dimostrato la sua capacitá di antiossidante e la

selectivitá di inibire proliferazione tra cellular normale, tumorale

e varie tipi di parasites

• Cell espuesto con estrato di AV non ha mostrato danni sul AND

opure molto basso livello di genotossicitá

• Combinazione tra trattamento membrana e lyophilizazione avuto

buono risultato nel senso di recuperare fenolo dal materia scartati

Terima Kasih

Grazie Mille

Muchas Gracias

Thank You