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DOSSIER CÍTRICOS

PROBLEMÁTICA DE LA MEJORA GENÉTICA CONVENCIONAL Y NUEVOS MÉTODOS DE MEJORA EN LOS CÍTRICOS

Mejora genética de los cítricos,métodos de obtención y leyes deprotección de nuevas variedadesA pesar de los inconvenientes a los que han tenido queenfrentarse los programas de mejora, en los últimosaños ha crecido de forma importante el interés por lamejora de los cítricos, tanto en instituciones de investi-gación públicas como en empresas privadas. En este tra-

bajo se revisan brevemente las distintas tecnologíasusadas actualmente para la mejora genética de los cítri-cos y se discute la relación de estas tecnologías con lasnormas derivadas de la normativa legal para la protec-ción de variedades.

Luis Navarro.

Centro de Protección Vegetal y Biotecnología. Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA).Moncada (Valencia).

Los cítricos constituyen el primer cultivofrutal del mundo, con una producciónde unos 110 millones de toneladas yuna superficie de más de 7 millones

de hectáreas. En España también constituyenel principal cultivo frutal, con una producciónde unos 6,3 millones de toneladas y una su-perficie cercana a las 330.000 hectáreas.

Los cítricos pertenecen a la subfamilia delas Aurantioideae, que se caracteriza por pro-ducir frutos en hesperidio. El número de es-pecies del género Citrus no está consensua-do debido a la disparidad de criterios entrelos taxónomos clásicos y oscila según auto-res entre 16 y 162. No obstante, estudiosmodernos basados en taxonomía numéricay en distintos marcadores moleculares indi-can que los cítricos actuales se originaron apartir de tres especies básicas: las zamboas(Citrus máxima), los cidros (C. medica) y losmandarinos (C. reticulata). Las zamboas sonnativas de Indonesia y el archipiélago mala-

yo, los cidros del noreste de India y zonascercanas a China y Birmania y los mandari-nos de una amplia región que incluye China,Vietnam y el sur de Japón.

Las otras especies actualmente conocidasdel genero Citrus se originaron por hibridacio-nes sucesivas de estas tres especies origina-les. Las principales especies de cítricos cultiva-das comercialmente por su fruta comestibleson los naranjos dulces (C. sinensis), los man-darinos, los limoneros (C. limon), los pomelos(C. paradisi), las limas (C. aurantifolia) y laszamboas. Las mandarinas constituyen un gru-po muy diverso, entre las que se encuentransubgrupos característicos como las satsumas(C. unshiu) y las clementinas (C. clementina),que realmente son híbridos entre mandarinosy naranjos. En la figura 1 se muestra el origende estas especies, que se formaron por hibri-dación entre las especies ancestrales.

Algunas especies cultivadas son híbridosde origen muy antiguo, pero otras, como porejemplo las clementinas, son híbridos de ori-gen muy reciente, de apenas un siglo de anti-güedad. En algún momento de la evoluciónapareció el carácter apomíctico (poliembrio-nía asexual de las semillas), típico de la mayo-ría de las especies de cítricos. La apomixis y lapropagación vegetativa han contribuido almantenimiento de estas especies. La diversifi-cación de las especies cultivadas se ha reali-zado fundamentalmente por mutaciones es-pontáneas en campo, que son el origen de lamayoría de las variedades actuales. Le excep-Foto 1. Diversidad fenotípica de frutos del Banco de Germoplasma de Cítricos del IVIA.

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ción es el grupo de los mandarinos donde seha producido una importante diversificaciónmediante hibridaciones. La diversidad fenotípi-ca de los cítricos es muy alta, y se conserva enbancos de germoplasma que son la base pa-ra los programas de mejora genética (foto 1).

Los cítricos se cultivan en zonas tropica-les y subtropicales de todo el mundo entrelos 40º de latitud norte y sur, en una grandiversidad de condiciones climáticas y de ti-pos de suelos, lo que implica que están afec-tados por diversos estreses abióticos, comosalinidad, sequía, inundaciones, clorosis férri-ca o acidez. Las heladas y las temperaturasmuy altas también causan pérdidas impor-tantes en muchas zonas de producción.

Los cítricos también están afectados pornumerosas enfermedades causadas por ne-matodos, hongos, bacterias, fitoplasmas, virusy viroides. Las enfermedades “leves” simple-mente causan una reducción de la produccióny la calidad de la fruta, pero otras pueden des-truir la citricultura de las zonas afectadas. Algu-nas enfermedades están presentes en la ma-yoría de las zonas de producción, como la tris-teza o la Phytophtora, que impiden lautilización de determinados patrones con ex-celente comportamiento agronómico. Otrasenfermedades están presentes en zonas deproducción específicas, aunque algunas se es-tán diseminando rápidamente a nuevas áre-as. La cancrosis causada por la bacteria Xan-thomonas axonopodis pv. citri producía dañosimportantes en países asiáticos y latinoameri-

canos, pero en los últimos años se está dise-minando sin control en Florida. La clorosis va-riegada de los cítricos, causada por la bacteriaXylella fastidiosa y la muerte Súbita, probable-mente causada por el Citrus sudden death as-sociated virus, causan daños importantes enBrasil. El Huanglongbing (ex greening), causa-do por la bacteria Candidatus Liberibacter sp.,y difundido de forma natural por el vector Dia-phorina citri, es la principal limitación para elcultivo de los cítricos en los países del sudes-te asiático donde está presente y su recientediseminación en Brasil y Florida está afectan-do a millones de árboles y amenazando seria-mente el futuro de la citricultura de estos paí-ses, y en general en toda América porque elvector y la enfermedad ya se han detectadoen diversos países, como Méjico.

La susceptibilidad de la producción citrí-cola a enfermedades emergentes invasivases muy importante, ya que la mayor parte dela producción está basada en una variabili-dad genética muy escasa, por lo que no hayresistencias y las enfermedades pueden es-tablecerse fácilmente de forma generalizaday causar daños catastróficos.

Las variedades suponen sin ninguna du-da la principal prioridad de los citricultoresde los países que dedican su producción alconsumo en fresco, ya que es imprescindibleadaptar la producción a las demandas cadavez más exigentes en calidad de los merca-dos internacionales. La competencia en es-tos mercados está aumentando de forma es-

pectacular en los últimos años debido la me-jora de calidad en la producción de muchospaíses, la mayor eficacia y rapidez de los me-dios de transporte marítimo a largas distan-cias y la apertura de los mercados como con-secuencia de los acuerdos sobre globaliza-ción y la PAC de la Unión Europea.

Las características de calidad que debereunir una variedad de cítricos para el consu-mo en fresco están determinadas fundamen-talmente por las exigencias de los mercados,que en muchas ocasiones no se correspon-den con caracteres intrínsecos de calidad.Además, los consumidores finales están per-diendo peso en la determinación de la cali-dad y están siendo sustituidos por las gran-des cadenas de distribución, que son las querealmente establecen las condiciones quedebe reunir la fruta que comercializan. Lascaracterísticas más importantes de calidadde los frutos cítricos son las siguientes: a) Ausencia de semillas. Los consumidores

de los países desarrollados no aceptanlos frutos cítricos con semillas, particu-larmente en mandarinas, naranjas y po-melos. Muchas variedades de excelentecalidad organoléptica, particularmente demandarinos, no pueden cultivarse debi-do a este rechazo, por lo que la obten-ción de variedades sin semillas es elprincipal objetivo de mejora.

b) Época de maduración. Los mercados de-mandan variedades de un determinado ti-po durante periodos de tiempo prolonga-

Mandarino Zamboa Cidro

Pomelo

Lima

Filogenia de los cítricos

Naranjo dulce

Naranjo amargo

Clementina satsuma Pomelo

Limón

C. micrantha

FIGURA 1.

Origen de las especies cultivadas de los cítricos.

Foto 2. Embrionía nucelar.Plántulas de cítricosprocedentes de una mismasemilla. Estas plantas sonnormalmente de origennucelar, ya que el embriónsexual se desarrolla en pocoscasos en los genotipospoliembriónicos.

Foto 3. Frutas procedentes de un híbrido entre clementina ynaranjo dulce. La elevada heterocigosis es responsable de lafalta de similitud del híbrido con los parentales.



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dos. La conservación en cámaras disminu-ye la calidad, por lo que es necesario dis-poner de variedades de todas las especiescon épocas de maduración escalonadas.

c) Tamaño adecuado. El tamaño se ha conver-tido en un factor muy importante que de-termina el precio de los frutos, tanto parael agricultor como para el consumidor. Eltamaño óptimo depende de cada especie.

d) Facilidad de pelado en mandarinos. Losmandarinos están asociados por el con-sumidor al pelado manual, por lo que es-te carácter es imprescindible. Además dela fácil separación de la corteza es nece-sario que el flavedo no tenga una excesi-va cantidad de aceites esenciales, queéstos no tengan un aroma desagradabley que las glándulas que los contienen nose rompan con facilidad. Ello es necesa-rio para evitar que las manos se impreg-nen con los aceites esenciales y que susabor pase a los gajos.

e) Fácil separación de los gajos. Esto evitasu ruptura y la consiguiente impregna-ción de las manos con zumo.

f) Color de corteza atractivo. El color óptimodepende de las especies. Así, el naranjaintenso es valorado para las naranjas, elnaranja rojizo para las mandarinas, elamarillo para limones, el amarillo rojizopara pomelos y el verde para limas.

g) Aroma, sabor y textura agradables. Estosaspectos son los que clásicamente deter-minan la calidad de la fruta, pero no sonuniversales y dependen de distintos gru-pos de consumidores. Por ejemplo, losconsumidores franceses o alemanes pre-fieren mandarinas con una relación aci-dez/azúcar relativamente alta, por lo quedemandan clementinas, mientras queconsumidores británicos o japoneses pre-fieren mandarinas con baja acidez, por loque prefieren las satsumas. Esta diversi-dad obliga a producir variedades adapta-das a mercados geográficos concretos.

h) Buena aptitud para la manipulación y eltransporte. Es importante que la fruta notenga pérdidas de calidad durante estosprocesos. Los datos anteriormente expuestos indi-

can que existe una gran necesidad en la citri-cultura mundial de realizar programas de me-jora genética para obtener nuevas variedadesy patrones resistentes o tolerantes a estreses

bióticos y abióticos y que produzcan fruta decalidad creciente y adaptada a las deman-das específicas de cada zona de producción.

Problemática de la mejora genéticaconvencional

La mejora genética tradicional de los cítri-cos tiene problemas específicos, además de loscomunes a todas las especies leñosas. Entrelos más importantes, destacan los siguientes:a) Biología reproductiva compleja: muchos

genotipos de interés presentan esterili-dad parcial o total de polen y/u óvulos,por lo que no pueden usarse en progra-mas de hibridación. Además, existen mu-chos casos de incompatibilidad entre ge-notipos y de autoincompatibilidad, lo quetambién limita enormemente la transmi-sión de caracteres deseables mediantehibridación sexual.La embrionía nucelar (apomixis parcial)es una característica muy extendida encítricos y es uno de los mayores impedi-mentos para la recombinación genética(foto 2). En estos casos, la formación deembriones nucelares impide o restringeel desarrollo de los embriones sexuales,

lo que dificulta enormemente la obten-ción de poblaciones grandes para selec-cionar genotipos recombinantes de cali-dad superior. Además, es necesario utili-zar análisis moleculares para separar lasplantas cigóticas de la nucelares. La con-secuencia es que en la práctica se usanfundamentalmente los escasos genotiposmonoembriónicos no apomícticos comoparentales femeninos para la obtenciónde poblaciones elevadas de híbridos.

b) Heterocigosis. Diversos estudios han de-mostrado la elevada heterocigosis de lamayoría de las especies. Esto ocasionauna gran segregación genética en la pro-genie, por lo que hay una baja probabili-dad de obtener descendientes con lascomplejas combinaciones genéticas de-seadas de los parentales (foto 3).

c) Desconocimiento genético básico. Hay undesconocimiento casi total sobre la he-rencia de la mayoría de los caracteresagronómicos de interés, particularmentelos relacionados con la calidad de la fru-ta, lo que impide una adecuada planifi-cación de las estrategias para elegir loscruzamientos más adecuados. Además,no existen marcadores moleculares liga-dos a estos caracteres, lo que no permi-

Foto 4. Planta juvenil de un híbrido de mandarino ynaranjo, que muestra una elevada espinosidad y ausenciade flores y frutos.

Foto 5. Fruta de la variedad Shiranui, híbrido de los manda -rinos Kiyomi y Ponkan, cultivada en invernadero en Japón.

Foto 6. Frutos de variedades de clementina del Banco deGermoplasma de cítricos del IVIA obtenidas por selecciónde mutaciones espontáneas en campo.


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te su uso en la evaluación precoz de laprogenie.

d) Juvenilidad. Los cítricos tienen un largo pe-riodo juvenil y la mayoría de las especiesrequieren entre 5 y 8 años para iniciar lafloración y fructificación (foto 4). Esto di-ficulta enormemente la evaluación de ca-racteres relacionados con las caracterís-ticas del fruto y la posibilidad de obtenersucesivas generaciones segregantes.

e) Producción de semillas. La experiencia indi-ca que la mayoría de los híbridos de cítri-cos producen frutos con un elevado núme-ro de semillas, incluso cuando los parenta-les no producen habitualmente semillas.Esto limita la mejora de variedades ya que,como se indicó anteriormente, los merca-dos rechazan los frutos con semillas.

f) Variabilidad genética. Los cítricos tienenuna amplia variabilidad que se conservaex situ en bancos de germoplasma (foto1). Los más importantes están en Japón,China, EE.UU., Francia y España. El ban-co del IVIA es el único que tiene un pro-grama de eliminación de patógenos detodos los genotipos mediante la técnicade microinjerto de ápices caulinares invitro y solo conserva plantas sanas (Na-varro et al., 2005b). Esta amplia variabilidad es útil para pro-

gramas de mejora de portainjertos esencial-mente dirigidos a obtener nuevos genotipos re-sistentes o tolerantes a estreses bióticos yabióticos. Sin embargo, pocas especies son co-mestibles, por lo que su utilización para mejo-rar la calidad de las variedades es muy difícil.Sin embargo, las especies cultivadas procedende híbridos ancestrales que se han mantenidocon una escasísima variabilidad genética gra-cias a la apomixis y la propagación vegetativa yen las que la diversificación varietal se ha pro-ducido por acumulación de mutaciones sin in-tervención de la recombinación sexual. La he-terocigosis es generalmente elevada y no seencuentra polimorfismo intervarietal. Con la ex-cepción del grupo de las mandarinas, la varia-bilidad existente para la mejora de la calidadde las otras especies cultivadas (naranjos, li-moneros, pomelos, limas) es muy escasa.

Toda esta problemática obliga a obtener ungran número de híbridos de cada combinaciónde parentales, cultivarlos durante periodos mí-nimos de diez años para iniciar una evaluacióneficaz y normalmente eliminar la gran mayoría

porque no reúnen los caracteres deseados.Debido a estas dificultades, no es de ex-

trañar que existan pocos programas de me-jora genética en el mundo y que los resulta-dos de los mismos hayan sido escasos, a pe-sar de que algunos se están realizando desdefinales del siglo XIX. El número de variedadescultivadas procedentes de programas de me-jora es muy pequeño y ninguna de ellas secultiva de forma extensiva en el mundo. Lapráctica totalidad de las variedades cultiva-das proceden de selección de mutaciones es-pontáneas que se producen con relativa fre-cuencia en los cítricos y en algunos casos dehíbridos espontáneos obtenidos por azar. Lasituación de los patrones es similar y tan so-lo los citranges Troyer y Carrizo (Poncirus trifo-liata x C. sinensis), obtenidos en 1909 porcasualidad en un programa que tenía comoobjetivo obtener variedades tolerantes a hela-das, son utilizados a gran escala. El resto delos patrones usados extensivamente son es-pecies silvestres de cítricos no mejoradas.

A pesar de estos inconvenientes, en losúltimos años ha crecido de forma importan-te el interés por la mejora de los cítricos, tan-to en instituciones de investigación públicascomo en empresas privadas, como conse-cuencia de varios factores:

◗ La disponibilidad de diversas biotecnologí-as basadas en el cultivo de tejidos in vitroy en la transformación genética que per-miten superar algunos de los problemasde la mejora tradicional y ofrecen nuevasposibilidades que no podían abordarsehasta ahora. Hay que destacar especial-mente la puesta a punto de técnicas parala obtención de híbridos triploides sin se-millas, para la fusión de protoplastos, parala transformación genética y el desarrollode numerosos marcadores moleculares. Lareciente secuenciación del genoma de ungenotipo haploide de clementino de Nulesprocedente de nuestro laboratorio aporta-rá nuevas herramientas y conocimientosque facilitarán la mejora de los cítricos.

◗ El desarrollo legislativo que da una ma-yor seguridad a los obtentores, lo que per-mite a los mismos un mejor control de lasvariedades protegidas y su explotaciónpara la obtención de regalías que com-pensen la inversión económica de los pro-gramas de mejora, e incluso produzcanbeneficios importantes en algunos casos.

◗ Las nuevas formas de explotación de va-riedades protegidas para limitar la pro-ducción de las mismas a la demanda delos mercados, lo que permite obtenerprecios de venta de fruta elevados queproducen beneficios económicos tanto aagricultores como a comercializadores.En este trabajo se revisan brevemente las

distintas tecnologías usadas actualmente pa-ra la mejora genética de los cítricos y se dis-cute la relación de estas tecnologías con lasnormas derivadas de la normativa legal parala protección de variedades.

Métodos de mejora de los cítricosMejora genética por hibridaciónconvencional

A pesar de los inconvenientes de la me-jora genética convencional por hibridaciónsexual indicados anteriormente, se sigue uti-lizando actualmente en diversos programasde mejora. En el caso de los patrones sepuede mencionar el interesante programaque se lleva a cabo el IVIA por el grupo delDr. Forner, que ha producido varios patronesque se han protegido y que se están empe-zando a propagar comercialmente.

Foto 7. Arriba: frutos de Clemenules; abajo: frutos deNulessin. Izquierda: Frutos producidos en condiciones deaislamiento; derecha: frutos producidos en condiciones depolinización cruzada muy alta.

Foto 8. Arriba: frutos de Nadorcott; abajo: frutos de Tango.Izquierda: Frutos producidos en condiciones deaislamiento; derecha: frutos producidos en condiciones depolinización cruzada.


La hibridación sexual convencional no seutiliza apenas en la actualidad para la mejo-ra de variedades porque la mayoría de los hí-bridos diploides son fértiles y en consecuen-cia producen semillas. Sin embargo, en Ja-pón siguen existiendo programas activos deobtención de mandarinos mediante hibrida-ción convencional. Estos programas estánbasados en la utilización de parentales parte-nocárpicos y con esterilidad gamética feme-nina o masculina y en un profundo conoci-miento de la biología reproductiva de los cí-tricos adquirido en más de un siglo detrabajos sobre el tema. Han obtenido varie-dades de calidad adaptadas a las caracte-rísticas del mercado japonés, como Kiyomi,Setoka y Shiranui (foto 5), que son autoin-compatibles y no producen semillas si se cul-tivan en condiciones de aislamiento o inter-caladas con plantaciones de satsuma, queno produce polen viable y que son predomi-nantes en el país. Fruta de alta calidad dealguna de estas variedades alcanza preciosastronómicos en mercados de lujo del país.

Selección de mutaciones espontáneasLos cítricos tienen cierta inestabilidad ge-

nética y producen mutaciones espontáneascon cierta frecuencia. La selección de estasmutaciones espontáneas en campo es elmétodo más antiguo y con mayor éxito parala obtención de nuevas variedades. Por ejem-plo, la totalidad de las variedades cultivadasde naranjos Navel o Valencia, de satsumas ode clementinas (foto 6) se han producidopor este procedimiento. Las mutaciones tie-

nen las características generales de las va-riedades de origen y cambian aspectos pun-tuales relacionados fundamentalmente conla época de maduración, el tamaño y otrascaracterísticas de calidad de los frutos. Aun-que muchas mutaciones pueden diferenciar-se con cierta facilidad por caracteres morfo-lógicos, la variabilidad genética entre las mis-mas es muy baja, razón por la quenormalmente no pueden identificarse me-diante marcadores moleculares.

Mutación artificialLa utilización de agentes físicos o quími-

cos para inducir mutaciones en el ADN de lasplantas en un procedimiento clásico de me-jora que se ha usado en muchas especiespara producir variabilidad. Los agentes másusados son los rayos gamma y X y las radia-ciones ultravioleta. Las mutaciones inducidasafectan generalmente a uno o pocos genes yse realizan al azar.

En cítricos la mutación artificial se utilizapara intentar modificar caracteres específi-cos puntuales de variedades existentes. Fun-damentalmente se dirige a reducir el númerode semillas debido a que la irradiación afec-ta ocasionalmente a genes relacionados conla reproducción, lo que disminuye la produc-ción de semillas. El procedimiento más usa-do es muy sencillo, ya que consiste en irra-diar varetas con rayos gamma procedentesde una fuente de cobalto con una irradiacióntotal de 30-50 Grays (unidad de medida dela radiación) con dosis de 10 a 50Grays/minuto (Roose y Williams, 2007). Exis-

ten empresas que realizan este tipo de trata-mientos a precios relativamente bajos. Lasyemas irradiadas se propagan por injerto ylos árboles resultantes se evalúan en condi-ciones de campo. Obviamente y dado que lasmutaciones se producen al azar, sólo en al-gunas ocasiones se obtienen resultados de-seados y se obtiene una variedad derivadade la original con sus mismas característicasy con menos semillas. Ello implica que hayque evaluar muchos árboles. Además, enocasiones las mutaciones no son estables yhay reversión a la variedad original, por lo quees necesario comprobar las característicasno solo en el árbol original, sino en variaspropagaciones del mismo.

Actualmente existen algunas variedadesproducidas por irradiación que tienen interéscomercial. Por ejemplo, la variedad Nulessin,obtenida por nuestro grupo mediante irradia-ción de ápices caulinares de la variedad Cle-menules (Asins et al., 2002) o la variedad Tan-go (Roose y Williams, 2006), producida en laUniversidad de California por irradiación de ye-mas de la variedad Nadorcott. En condicionesde cultivo aisladas no existen diferencias entrelas variedades originales y las obtenidas porirradiación, ya que ninguna produce semillas.Sin embargo, en condiciones de polinizacióncruzada las variedades originales producenmuchas más semillas que las irradiadas (fo-tos 7 y 8). Tampoco existen diferencias entrelos frutos producidos por las variedades origi-nales en condiciones de aislamiento y los fru-tos producidos por las variedades irradiadasen cualquier situación de cultivo.


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Foto 9. Brote transgénico que contiene el gen gfp que produce una proteína que emitefluorescencia verde cuando se observa con luz azul. Las zonas rojas de la foto correspondena células y brotes no transformados. Foto 10. Inicio de la fusión de un protoplasto de hoja y un protoplasto de callo.


Transformación genéticaLa transformación genética de plantas

ofrece enormes posibilidades de mejora, yaque permite introducir caracteres únicos engenotipos de élite sin alterar su fondo gené-tico. De hecho, la superficie de cultivo deplantas transgénicas está aumentando deforma continua y en 2010 se alcanzaron 148millones de hectáreas en el mundo, tan soloquince años después del primer cultivo co-mercial en 1996. El incremento anual de su-perficie cultivada con plantas transgénicas essuperior al 10% en los últimos años y estáaumentando tanto el número de países quecultivan estas plantas, como las especies cul-tivadas y los caracteres de mejora introduci-dos. Los principales caracteres introducidosmediante transformación genética son la re-sistencia a herbicidas y a insectos, pero estáaumentando la liberación de plantas resis-tentes a virus y a corto plazo se prevé la libe-ración de plantas resistentes a sequía y concaracteres relacionados con la salud, comola soja con altos contenidos de Omega-3 o el

arroz dorado con provitamina A. Los princi-pales cultivos transgénicos son las plantasde gran cultivo (soja, maíz, algodón, colza),pero en EE.UU. y China ya se están comer-cializando papayas y calabacines transgéni-cos resistentes a virus.

En cítricos se han desarrollado métodosmuy eficientes de transformación, fundamen-talmente en el IVIA, para la mayoría de lasespecies cultivadas (Peña et. al., 2008). Pa-ra la transformación de cítricos se usa la bac-teria del suelo Agrobacterium tumefaciens,la cual infecta a las plantas en lugares don-de hay heridas produciéndoles agallas. En lanaturaleza, Agrobacterium transfiere un seg-mento de su ADN a las células vegetales y lointegra en su genoma, es decir, transformaestas células. Actualmente mediante técni-cas de ingeniería genética es posible modifi-car esta bacteria para que introduzca en elADN de las células vegetales los genes de-seados en lugar de los genes de la propiabacteria. Se usan técnicas de cultivo de teji-dos para la regeneración de brotes transgéni-

cos (foto 9), que se injertan para la produc-ción de plantas.

La transformación genética se vislumbracomo una de las técnicas de mejora más im-portantes para la mejora de los cítricos. Ac-tualmente se están realizando importantesproyectos relacionados con la introducciónde resistencia o tolerancia al virus de la tris-teza y a cancrosis, para controlar el tamañode los árboles, para inducir una floración pre-coz que puede producir aumentos de la pro-ducción, y para incrementar el contenido decompuestos relacionados con la salud, co-mo carotenoides (ß-caroteno y licopeno).También se están realizando grandes esfuer-zos de investigación para intentar introducirresistencia al Huanglongbing, ya que la trans-formación genética es posiblemente la úni-ca técnica capaz de conseguir este objetivo.

Para la mejora genética mediante estatecnología se pueden usar genes proceden-tes de los propios cítricos, pero también deotras plantas y organismos. La reciente se-cuenciación del genoma del clementino con-



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tribuirá sin duda a localizar genes de interéspara la mejora mediante transformación.

Para la transformación genética se usanpatrones o variedades ya existentes a los quese les realiza una modificación puntual, deforma que el genotipo original y el transfor-mado solo se diferencian en el carácter in-troducido. Por ejemplo, la fruta de una hipo-tética variedad resistente a Huanglongbingobtenida por esta técnica sería exactamenteigual a la de la variedad original.

Hibridación somáticaLa hibridación somática es una de las

aproximaciones de la biotecnología vegetal queen la actualidad permite mejorar genéticamen-te los cítricos. Esta técnica se basa, al igual quela hibridación sexual, en la unión de dos célu-las y la consiguiente regeneración de una nue-va planta híbrida con propiedades distintas alas de los parentales. La principal diferenciaentre la hibridación somática y la hibridaciónsexual es que en esta última se unen dos célu-las sexuales, una masculina y una femenina,mientras que en la hibridación somática seunen dos células no sexuales de la planta. Lascélulas no sexuales de una planta se denomi-nan somáticas. Además, en la hibridación se-xual entre dos parentales diploides hay una re-combinación de los genomas de ambos paren-tales para producir un híbrido diploide,mientras que en la hibridación somática hayuna adición de los genomas de ambos paren-tales para producir un híbrido tetraploide.

En la hibridación somática se aíslan en ellaboratorio dos células no sexuales de una

planta, se fusionan, y en unas condicionesde cultivo in vitro determinadas se dividen yregeneran los tejidos y órganos de una nue-va planta. Esta nueva planta se aclimata des-pués a las condiciones de cultivo del inverna-dero y finalmente se cultiva en campo parasu evaluación agronómica.

Las células empleadas habitualmente enla hibridación somática de cítricos son de dostipos (Olivares et al., 2005). Por un lado, seaíslan células de hoja, y por otro lado célulasprocedentes de callo nucelar (proliferación ce-lular) originado por cultivo in vitro de la nuce-la que se encuentra en las semillas de los fru-tos inmaduros de los cítricos. La obtención delas células de hojas es sencilla, pues dispo-nemos de plantas en los invernaderos que nosproporcionan el tipo de hoja adecuado paraaislarlas. La obtención de callos nucelares re-quiere un proceso mucho más laborioso, quedura al menos un año de cultivo in vitro y re-quiere muchos recursos para su conservación.

Antes de fusionar las células somáticas esnecesario eliminar su pared celular medianteenzimas (celulasas, hemicelulasas, pectina-sas) capaces de degradar la pared celular, ais-lando células “desnudas” que se denominanprotoplastos. La fusión de los protoplastos seconsigue mediante métodos químicos o eléc-tricos (foto 10). La nueva célula procedentede la fusión, denominada heterocarionte, secultiva in vitro para que se regenere la paredcelular, se divida y formen embriones que pro-ducen una nueva planta híbrida.

Mediante este proceso se producen hí-bridos somáticos que contienen toda la in-

formación genética nuclear de cada uno delos dos parentales utilizados para el aisla-miento de protoplastos, es decir, son híbri-dos que resultan de sumar los dos genomascompletos. Los híbridos somáticos tienenpues la particularidad de expresar las carac-terísticas de los dos parentales en una únicaplanta con escasa o nula recombinación. Deesta forma se supera el problema de la hete-rocigosis mencionado en la introducción y sesimplifica enormemente el proceso de eva-luación, ya que todas las plantas proceden-tes de una única hibridación son práctica-mente iguales y en consecuencia hay queevaluar un pequeño número de las mismas.

Esta técnica tiene su principal aplicaciónen la obtención de nuevos patrones ya quese generan genotipos nuevos que expresancaracteres de ambos parentales. Por ejem-plo, un híbrido somático entre citrange Carri-zo y Citrus macrophylla podría tener la tole-rancia a tristeza y la buena calidad de la fru-ta del citrange y la tolerancia a salinidad ycaliza, y la elevada productividad del C. ma-crophylla. Otra aplicación de la fusión de pro-toplastos es la obtención de parentales te-traploides para la producción de híbridos tri-ploides.

Obtención de híbridos triploides La obtención de variedades sin semillas

es el único objetivo de mejora de la calidadque se puede abordar de forma dirigida conla tecnología y conocimientos contrastadosen cítricos actualmente existentes. La parte-nocarpia es necesaria para la formación de

Foto 11. Mandarino Safor, híbrido triploide entre Fortune y Kara. Foto 12. Mandarino Garbí, híbrido triploide entre Fortune y Murcott.


frutos sin semillas, pero este carácter está ampliamente presenteen el germoplasma de cítricos.

La gran mayoría de los cultivares de cítricos son diploides(2n=2x=18), aunque variantes poliploides, particularmente triploi-des y tetraploides, se encuentran de forma espontánea. A nivel di-ploide la ausencia de semillas en los cítricos está asociada a carac-teres de esterilidad masculina y femenina y de autoincompatibili-dad. La esterilidad masculina se produce por aberracionescromosómicas, por aborto de anteras o por degeneración de losgranos de polen. La esterilidad femenina es heredable y en algunosgenotipos como las satsumas parece que esté controlada por másde dos genes principales. La autoincompatibilidad en cítricos es detipo gametofítica y está presente en la mayoría de los genotipos depummelo, de clementino y en muchos híbridos.

La producción de fruta sin semillas de forma regular en las plan-taciones de cítricos sólo está garantizada en los casos en que simul-táneamente una variedad tenga esterilidad masculina y femenina, co-mo sucede con los naranjos del grupo navel y con las satsumas. Lasvariedades con un solo tipo de incompatibilidad o con autoincompa-tibilidad pueden causar problemas de formación de semillas por po-linización cruzada cuando se cultivan en plantaciones cercanas a otrascon variedades compatibles. En la práctica, es muy difícil realizar pro-gramas de mejora dirigidos a la obtención de variedades que incorpo-ren esterilizad masculina y femenina, ya que no existen suficientes co-nocimientos ni fuentes de variabilidad para estos caracteres.

Los híbridos triploides (3x=27) son la mejor solución al proble-ma de la formación de semillas en los cítricos. Las plantas triploi-des están asociadas a esterilidad masculina y femenina y tienenmuy baja fertilidad, debido a que en la meiosis se originan asocia-ciones multivalentes y como consecuencia se producen gametos,tanto femeninos como masculinos, con distintas dotaciones cro-mosómicas que reducen la viabilidad de los mismos. Por ello nor-malmente no producen semillas ni inducen la formación de semi-llas en otras variedades por polinización cruzada.

Se conoce desde los años setenta del pasado siglo que los híbri-dos triploides de cítricos (3x=27) se pueden obtener mediante hibri-dación sexual entre parentales diploides y tetraploides y de forma es-pontánea en cruzamientos entre parentales diploides como conse-cuencia de la formación de gametos femeninos no reducidos. En todoslos casos se usan parentales femeninos monoembriónicos para evitarlos efectos desfavorables de la apomixis indicados anteriormente.

Hasta hace poco tiempo estos conocimientos no tenían aplicacio-nes prácticas debido a tres grandes problemas para obtener poblacio-nes elevadas de híbridos triploides. Los embriones triploides se en-cuentran normalmente en semillas pequeñas o en semillas de tamañonormal pero parcialmente abortadas, que raramente germinan inclusoen las mejores condiciones de invernadero. El análisis del nivel de ploi-día de plantas de cítricos por métodos histológicos clásicos es extrema-damente lento y poco eficaz, por lo que no puede aplicarse a grandespoblaciones. Finalmente, existen muy pocos genotipos tetraploides decalidad que puedan usarse para las hibridaciones interploides. Por es-tas razones se ha tardado mucho tiempo en incorporar los conocimien-tos sobre obtención de triploides en programas de mejora amplios.

Estos problemas se han podido resolver mediante biotecnologías



DOSSIER CÍTRICOS

basadas en el cultivo in vitro para la germina-ción de embriones y la obtención de parentalestetraploides y en el análisis de ploidía median-te citometría de flujo, lo que ha permitido anuestro grupo el establecimiento de un amplioprograma de mejora para la obtención de man-darinos triploides sin semillas que se inició en1996 (Navarro et al, 2007). Hasta el momen-to se han obtenido más de 4.600 triploidesmediante cruzamientos 2x X 2x, más de 4.300triploides de cruzamientos 2x X 4x y más de4.700 triploides de cruzamientos 4x X 2x deun total de 300 combinaciones de parentalesdiferentes. La evaluación de las poblaciones detriploides ha permitido hasta el momento la se-lección de 14 variedades que se han protegidoy dos de ellas, Safor (foto 11) (Cuenca et al.,2010) y Garbí (foto 12) (Aleza et al., 2010) yase están propagando comercialmente. Son va-riedades tardías de elevada calidad organolép-tica que no producen semillas.

Relaciones entre lasleyes de protección devariedades y losmétodos de obtención

El régimen jurídico de protección de las ob-tenciones vegetales está regulado en la UniónEuropea por el Reglamento (CE) 2100/94 delConsejo de 27 de julio y en España por la Ley3/2000 de 7 de enero y modificaciones poste-riores, que armoniza la legislación sobre el te-ma. La Ley tiene como objetivo fundamental elreforzamiento de los derechos de los obtento-res y define con precisión las facultades de losmismos relativas a la explotación de sus varie-dades protegidas. También define con claridadlas limitaciones al derecho del obtentor, entrelas que se encuentra la denominada “excep-ción del agricultor” (que no afecta a los fruta-les) y la utilización de variedades protegidaspara la creación de nuevas variedades.

Este último aspecto es el más relacionadocon el presente artículo. La Ley permite la utili-zación de variedades protegidas para la crea-ción de nuevas variedades sin el permiso delobtentor con el fin de evitar limitaciones a la in-vestigación en este campo. Sin embargo, en elcaso de que las nuevas variedades sean esen-cialmente derivadas de la original, se requiere laautorización del obtentor de la variedad originalpara todos los aspectos relacionados con la co-mercialización de la variedad derivada. En este

sentido se considera que una variedad es esen-cialmente derivada de otra variedad inicial,cuando tenga las siguientes características:a) Se deriva principalmente de la variedad ini-

cial, o de una variedad que a su vez deri-va principalmente de la variedad inicial,conservando al mismo tiempo las expre-siones de los caracteres esenciales queresulten del genotipo o de la combinaciónde genotipos de la variedad inicial.

b) Se distingue claramente de la variedad ini-cial.

c) Se distingue claramente de la variedad ini-cial y, salvo por lo que respecta a las di-ferencias resultantes de la derivación, esconforme a la variedad inicial en la ex-presión de los caracteres esenciales queresulten del genotipo o de la combina-ción de genotipos de la variedad inicial.En otras palabras, se considera que una

variedad es esencialmente derivada de otracuando mantiene todos sus caracteres y so-lo se diferencia de la misma por el carácterdiferencial introducido.

Los métodos de mejora descritos se pue-den dividir en dos grupos. Por una parte estánlos que permiten crear una nueva variedadpor recombinación o expresión de los caracte-res de los parentales usados para su crea-ción. En este grupo se encuadran la hibrida-ción convencional, la hibridación somática yla hibridación a nivel triploide. Las plantas ob-tenidas por estos procedimientos presentansolo algunas de las características de los pa-rentales, por lo que no son esencialmente de-rivadas. Ello implica que para la obtención denuevas variedades por estos métodos se pue-den usar variedades protegidas como paren-tales sin la autorización sus obtentores y quelas nuevas variedades obtenidas también sepueden comercializar sin su autorización.

El otro grupo de métodos incluye la muta-ción espontánea, la mutación artificial y latransformación genética. La esencia de estosmétodos es la utilización de una variedad pre-viamente existente y modificarla puntualmen-te para eliminar algún defecto o añadir algu-na propiedad de interés, pero manteniendoesencialmente las características de la varie-dad inicial. Esto implica que la mayoría de lasnuevas variedades obtenidas por estos méto-dos se pueden considerar variedades esen-cialmente derivadas y no pueden comerciali-zarse sin la autorización del obtentor de la va-

riedad inicial. Algunos ejemplos mencionadosanteriormente, como mutaciones espontáne-as de clementinas, las variedades irradiadasNulessin y Tango, o una hipotética variedadresistente a Huanglongbing obtenida portransformación genética, serían variedadesesencialmente derivadas. Obviamente, parala aplicación de estas técnicas de mejora esrecomendable la utilización de variedades ini-ciales de dominio público o la autorizaciónprevia de los obtentores de las variedades ini-ciales para evitar problemas en la comerciali-zación de las variedades obtenidas. ●

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