PRODUCCIÓN Y SEPARACIÓN DE ÁCIDO …sistemanodalsinaloa.gob.mx/archivoscomprobatorios/_15... · Por último, se utilizó un cuarto diseño experimental para encontrar las condiciones

PRODUCCIÓN Y SEPARACIÓN DE ÁCIDO GIBERÉLICO (GA3) A PARTIR DE CALDOS DE CULTIVO DE Gibberella fujikuroi

Cristian Alarid Garcíaa, Jesús Raúl Ortiz del Castillob, Marcos Daniel González Llanesa, Eleazar Máximo

Escamilla Silvaa,*

a Departamento de Ingeniería Química, Instituto Tecnológico de Celaya, Av. Tecnológico y García Cubas S/N, Celaya, Guanajuato, C.P. 38010, México. [email protected]

b Facultad de Ciencias Químico-Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria, Ave. de las Américas y Josefa Ortiz de Domínguez, Culiacán, Sinaloa, C.P. 80010, México.

Resumen En este trabajo se desarrollaron cuatro diseños de experimentos. El primer diseño experimental se realizó para encontrar la formulación del medio de cultivo que produjera la mayor concentración de GA3. Se encontró que el medio de cultivo MC1, a un pH de 3.5, arrojó la mayor producción de GA3. El segundo diseño de experimentos se utilizó para la remoción de los sólidos gruesos del caldo de fermentación. Los resultados experimentales mostraron que todos los factores seleccionados para esta etapa fueron significativos; siendo el diámetro de poro, del medio filtrante, el de mayor efecto en la variable de respuesta. El tercer diseño de experimentos se realizó para encontrar las mejores condiciones de operación que lograrán remover la mayor cantidad de sólidos finos que permanecen después de la etapa de centrifugación. Para ello se utilizó un sistema de filtración en columna; donde se determinó que una altura de 10 cm para la cama de tierra de diatomeas, un flujo de alimentación de 30 mL/min y algodón como medio homogenizador, resultaron ser las condiciones que favorecían la máxima remoción de biomasa en esta etapa. Por último, se utilizó un cuarto diseño experimental para encontrar las condiciones óptimas de extracción de GA3 mediante una columna de platos reciprocantes tipo Karr. Se encontró que las mejores condiciones de operación fueron: 1:7 de relación caldo/solvente, pH de 3, 140 rpm de agitación de los platos y 60 minutos de extracción. Introducción Dentro de los productos microbianos de importancia industrial se encuentran las giberelinas que son productos del metabolismo secundario del hongo Gibberella fujikuroi. Las giberelinas son un grupo importante de fitohormonas que regulan los diferentes procesos de crecimiento y desarrollo en las plantas superiores, siendo su principal representante el ácido giberélico (GA3), el cual, es el producto principal de la vía biosintética de las giberelinas durante la fermentación de G. fujikuroi. El GA3 es una hormona vegetal de gran importancia en la agricultura ya que proporciona una gran variedad de beneficios como la elongación de tallos y el aumento en el tamaño de algunos frutos. En la actualidad, el GA3 es producido mediante fermentación microbiana y con el objeto de recuperarlo del medio acuoso, donde es inestable, se han utilizado diversas estrategias; entre las que destacan la extracción líquido-líquido (L-L) y resinas sintéticas de adsorción en lecho fijo para su aislamiento y posterior purificación. Una vez terminado el proceso de fermentación, la etapa siguiente es la extracción y purificación del GA3; por ello se hace necesario plantear un esquema para la recuperación de este producto, no sólo para su aplicación en plantas sino para estudios posteriores del mismo proceso de recuperación. La producción de GA3, en este proyecto, se llevará a cabo

Memorias del XXXIV Encuentro Nacional y III Congreso Internacional de la AMIDIQ7 al 10 de mayo de 2013, Mazatlán, Sinaloa, México

© 2013 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química (AMIDIQ)ISBN: 978-607-95593-1-1

1662

en un biorreactor de tanque agitado (Applikon, de capacidad de 7 L), utilizando glucosa como fuente de carbono; mientras que la recuperación de GA3 de los caldos de cultivo de Gibberella fujikuroi se realizará mediante una extracción L-L en una columna de platos reciprocantes tipo Karr. En la presente investigación, principalmente se establecerá una estrategia de separación de GA3 de los caldos de fermentación producidos por Gibberella fujikuroi. Es importante señalar que existen pocos estudios reportados, hasta la fecha, respecto a este tema; lo cual resulta muy interesante y novedoso. Metodología Para la producción de ácido giberélico se utilizó la cepa Gibberella fujikuroi CDBB H-984, obtenida de la Colección Nacional de Cultivos Microbianos del CINVESTAV-IPN, México. El hongo se conservó en tubo inclinado de agar papa dextrosa (PDA) a 4 °C y se resembró cada dos meses. Se propagó el hongo G. fujikuroi en matraz erlenmeyer de 500 mL [1]. La incubación se llevó a cabo durante 38 h a 280 rpm y 29 °C con micelio aéreo resuspendido [2], en una agitadora con control automático de temperatura y velocidad de agitación CRODE. Para el medio de fermentación, se utilizó glucosa como fuente de carbono; variando el pH y las concentraciones de los componentes para encontrar el medio de cultivo en el que se obtuviera una mayor concentración de GA3 al final de la fermentación. Se compararon dos diferentes medios de cultivo: MC1 [3] y MC2 [4]. Para los experimentos se utilizó un biorreactor de tanque agitado (Applikon, de capacidad de 7 L). El equipo que se utilizó para la cuantificación de GA3 fue un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (HPLC) marca Varian con detector Uv-Vis de longitud de onda variable modelo 9050, bomba modelo 9012 y automuestrador modelo 9100. La columna que se empleó fue una C18 de 15 cm de longitud. La centrifugación y la filtración son las operaciones unitarias que se utilizaron para la remoción de biomasa de los caldos de cultivo de Gibberella fujikuroi. Para la centrifugación se utilizó una centrífuga de canasta Blue Point, modelo SCBP16005, carga máxima de 6.1 kg y una velocidad angular de 3000 rpm: las dimensiones de la centrífuga son 57 cm de longitud y 32 cm de diámetro. Para la remoción de sólidos finos se usó una columna de vidrio tipo Pyrex de 60 cm de altura y 5 cm de diámetro interno, empacada con un medio filtrante. El medio filtrante que se seleccionó fue un material llamado diatomita o mejor conocido como tierra de diatomeas. Finalmente, el equipo que se utilizó para extraer selectivamente el GA3, es una columna de extracción L-L de platos reciprocantes tipo Karr, que se encuentra en el Laboratorio de Química Pesada del Instituto Tecnológico de Celaya. La columna está construida de vidrio tipo Pyrex, altura total 5 m y diámetro interno de 2.54 cm. Dentro de la columna hay platos perforados de acero inoxidable, montados sobre un eje central el cual puede ser oscilado por medio de un mecanismo localizado en la parte superior de la columna.



1663

La Figura 1 resume el esquema seguido para la producción de GA3; desde el mantenimiento de la cepa hasta el proceso de fermentación. Mientras que la Figura 2 representa la estrategia seguida para la separación de GA3 de los caldos de cultivo de Gibberella fujikuroi; donde MC es el medio de cultivo, C es la etapa de centrifugación, F es la filtración en columna, E es la etapa de extracción y S es el solvente (acetato de etilo) utilizado para la extracción.

Figura 1. Representación esquemática para la producción de ácido giberélico.

Figura 2. Estrategia utilizada para la separación de ácido giberélico. Se utilizó el software Statistica Versión 5.5 para realizar el análisis estadístico de todos los diseños de experimentos planteados en este trabajo. Resultados El crecimiento se siguió por la determinación de peso seco de la muestra tomada cada 24 h. Se construyeron las curvas de crecimiento de G. fujikuroi que se presentan en la Figura 3, obtenidas durante los cuatro experimentos realizados aleatoriamente; empleando glucosa como fuente de carbono. Se puede observar que ninguna curva presentó la fase de adaptación, debido a que el medio de cultivo empleado estuvo limitado por nitrógeno. La máxima producción de biomasa se obtuvo en el experimento 2 con 30.02 g/L. Por otro lado,

S

MC

C F

E



1664

se puede apreciar que los experimentos 2 y 3 finalizaron el proceso de fermentación con aproximadamente 16 g/L de biomasa; mientras que los experimentos 1 y 4 finalizaron con una biomasa muy similar (5-8 g/L). La producción de GA3, de los cuatro experimentos realizados, se muestra en la Tabla 1. Se determinó que el Experimento 1 (MC1, pH = 3.5) fue donde se obtuvo la mayor concentración de GA3 (842.418 ppm), mientras que el Experimento 3 resultó ser la fermentación con menor concentración (425.654 ppm).

Figura 3. Cinética de crecimiento de G. fujikuroi. De acuerdo con los resultados obtenidos, se decidió realizar las demás fermentaciones con las mismas condiciones del Experimento 1, ya que fue la fermentación con mayor producción de GA3. Es importante mencionar que los caldos de fermentación resultan ser fluidos no-newtonianos, por lo cual suelen ser altamente compresibles, y por ello difíciles de filtrar. Por tal motivo, se utilizó la centrifugación como un primer tratamiento para la remoción de biomasa, antes de pasar a la etapa de filtración. En la Figura 4 se muestra la superficie de respuesta para la remoción de biomasa en función del tiempo y del diámetro de poro. Se observó que la región de mayor remoción de biomasa se encuentra en el nivel medio del factor tiempo y en los niveles medios y bajos del factor diámetro de poro. En la Figura 5 se muestra la superficie de respuesta para la remoción de biomasa en función del flujo de alimentación y del diámetro de poro. Se observó que la región de mayor remoción de biomasa se encuentra en los niveles bajos de ambos factores. Las mejores condiciones de operación para esta etapa fueron: 20 minutos de centrifugación, 350 mL/min como flujo de alimentación, 1 m para el diámetro de poro del medio filtrante y 0.2% para la relación tierra/caldo. Bajo estas condiciones se logró remover el 69.6% de la cantidad de biomasa inicial que contenía el caldo de fermentación. En la Tabla 2 y en la Tabla 3 se muestra el análisis de varianza para las etapas de centrifugación y filtración en columna, respectivamente. El factor de mayor influencia, en la etapa de centrifugación, fue el diámetro de poro; mientras que el medio homogenizador fue el de mayor influencia en la etapa de filtración.

Tabla 1. Efecto del medio de cultivo/pH sobre la producción de GA3.



1665

Figura 4. Superficie de respuesta para la remoción de biomasa en función del tiempo (A) y del diámetro de poro (C).

Figura 5. Superficie de respuesta para la remoción de biomasa en función del flujo de alimentación (B) y del diámetro de poro (C).

Tabla 2. Análisis de varianza para la remoción de biomasa en la etapa de centrifugación (diseño L9).

Tabla 3. Análisis de varianza para la remoción de biomasa en la etapa de filtración en columna.

Las condiciones bajo las que se logró la mayor remoción de sólidos finos mediante filtración fueron: 10 cm de altura de la cama de tierra de diatomeas, 30 mL/min de flujo de alimentación y algodón como medio homogenizador. Bajo estas condiciones se logró remover el 95.4% de la cantidad de biomasa que contenía el caldo de cultivo utilizado para esta etapa. La última etapa de separación utilizada en este trabajo fue la extracción de GA3 mediante una columna tipo Karr. El análisis de varianza, para los datos de eficiencias de extracción en esta etapa, arrojó que los cuatro factores estudiados fueron significativos en la extracción (confianza del 95%). El factor D (tiempo de extracción) resultó el más significativo en el proceso; la siguiente variable en importancia fue el factor A (relación caldo/solvente), seguida del factor B (pH); mientras que la variable con menor peso, pero significativa, fue el factor C (velocidad de agitación). En la Figura 6 se muestra la superficie de respuesta para la extracción de GA3 en función de la relación caldo/solvente y del tiempo de extracción. Se observó que la región de mayor eficiencia de extracción se encuentra en el nivel alto de la relación caldo/solvente, y en el nivel medio del tiempo de extracción. En la Figura 7 se muestra la superficie de respuesta para la extracción de GA3 en función del pH y del tiempo de extracción. Se observó que la región de mayor eficiencia de extracción se encuentra en el nivel alto de pH y en el nivel medio del tiempo de extracción.



1666

Figura 6. Superficie de respuesta para la eficiencia de extracción en función de la relación caldo/solvente (A) y del tiempo de extracción (D).

Figura 7. Superficie de respuesta para la eficiencia de extracción en función del pH (B) y del tiempo de extracción (D).

Las mejores condiciones de operación fueron: 1:7 de relación caldo/solvente, pH de 3, 140 rpm de agitación de los platos y 60 minutos de extracción. Bajo estas condiciones de operación, se logró una eficiencia de extracción de 95.2% de la cantidad total de GA3 presente inicialmente en el caldo de fermentación, transfiriéndose el GA3 de esta manera a la fase orgánica. Conclusiones Se diseñó un esquema de separación altamente selectivo y específico para la recuperación de GA3 a partir caldos de cultivo de Gibberella fujikuroi. Se encontró que el medio de cultivo MC1, a un pH de 3.5, produjo 842 ppm. Una concentración más alta comparada con el resultado de Ríos-Iribe (2011), la cual fue 136 ppm. Bajo las condiciones óptimas de operación se logró remover el 69.6% de la cantidad total de biomasa del caldo de fermentación, en la etapa de centrifugación. Se removió el 95.4% de la cantidad de biomasa que contenía el caldo de cultivo utilizado para la etapa de filtración en la columna. Finalmente, bajo las condiciones óptimas se logró una eficiencia de extracción del 95.2% de la cantidad total de GA3 presente inicialmente en el caldo de fermentación. Referencias [1] Escamilla E.M., Dendooven L., Magaña I.P., Parra R., De la Torre M., Optimization of Gibberellic acid production by inmobilized Gibberella fujikuroi mycelium in fluidized bioreactors, J. Biotechnology, 76: 147-155, 2000. [2] Escamilla E.M., Dendooven L., Uscanga-Reynell J.A., Monroy-Ramirez A.I., González-Alatorre G., De la Torre M. Morphological development and gibberellin production by different Straits of Gibberella fujikuroi in shake flasks and bioreactor, World Journal of Microbiology & Biotechnology, 15: 753-755, 1999. [3] Ríos-Iribe E.Y. Tesis de Doctorado: Efecto inductivo que ejerce una fuente de carbono mixta en la producción de ácido giberélico por Gibberella fujikuroi, Universidad Autónoma de Querétaro-Instituto Tecnológico de Celaya, México, 2011. [4] Solorza-Salas, F. Tesis de Licenciatura en Ingeniería Química, Mejoramiento de parámetros de proceso para la obtención de ácido giberélico en un birreactor mecánicamente agitado utilizando al hongo Gibberella fujikuroi, Instituto Tecnológico de Celaya, México, 1999.



1667

Documents

PRODUCCIÓN Y SEPARACIÓN DE ÁCIDO …sistemanodalsinaloa.gob.mx/archivoscomprobatorios/_15... · Por último, se utilizó un cuarto diseño experimental para encontrar las condiciones