Produkcja wektorów adenowirusowych pierwszej generacji – …m.pfb.info.pl/files/kwartalnik/3_2007/stopa-jazwa.pdf · 2013. 12. 1. · siê na przyk³ad na wizualnej ocenie efektu

Produkcja wektorów adenowirusowychpierwszej generacji – optymalizacjametody

Magdalena Stopa, Agnieszka JaŸwa, Katarzyna Mleczko,

Józef Dulak, Alicja Józkowicz

Zak³ad Biotechnologii Medycznej, Wydzia³ Biochemii, Biofizyki i Bio-

technologii, Uniwersytet Jagielloñski, Kraków

Production of adenoviral vectors of the first generation – optimiza-

tion of the method

S u m m a r y

The paper presents the production of adenoviral vectors (AdV) containing

�-galactosidase (Ad�-gal), from the transfer of recombinant viral DNA into pack-

ing cell line (HEK293) to the titration of viral particles. Optimisation of the

methods (preparation of DNA for transfection, adsorption time during the infec-

tion of cells, amount of serum in the medium, time-point of vector isolation) en-

ables obtaining a titer of up to 1010 IU/mL.

Ad�-gal were titrated with several methods, with �-gal in situ staining used

as a reference. We found that the most suitable titration method of the vectors

containing other than reporter genes was the Rapid Titer ELISA kit™.

Key words:

adenoviruses, adenoviral vectors, gene therapy.

1. Wstêp

Wektory adenowirusowe (AdV) to bardzo u¿yteczne i wydaj-

ne narzêdzie transferu genów do komórek, czêsto wykorzysty-

wane w eksperymentalnej terapii genowej (1-3). Choæ ogólny

schemat produkcji i wykorzystania AdV jest bardzo prosty

(rys. 1) istnieje wiele sposobów jego realizacji.

Pierwszym etapem konstrukcji wektorów AdV jest przygoto-

wanie zrekombinowanego wirusowego DNA, zawieraj¹cego ka-

P R A C E E K S P E R Y M E N T A L N E

Adres do korespondencji

Alicja Józkowicz,

Zak³ad Biotechnologii

Medycznej,

Wydzia³ Biochemii,

Biofizyki i Biotechnologii,

Uniwersytet Jagielloñski,

ul. Gronostajowa 7,

31-271 Kraków;

e-mail:

alicia@mol uj.edu.pl

3 (78) 98–122 2007

setê ekspresyjn¹ z transgenem. Mo¿na pos³u¿yæ siê tu klasycznymi metodami biolo-

gii molekularnej obejmuj¹cymi u¿ycie enzymów restrykcyjnych i ligaz, zastosowa-

nie topoizomeraz czy wykorzystanie rekombinacji przeprowadzanej w bakteriach

lub komórkach eukariotycznych (4-6).

Kolejny etap to wprowadzenie przygotowanego DNA do komórek pakuj¹cych.

Stosuje siê przy tym standardowe metody transfekcji z wykorzystaniem fosforanu

wapnia, liposomów lub oligodendrymerów (3,4). W komórkach tych dochodzi do

wytworzenia kapsydów adenowirusowych zawieraj¹cych wprowadzony DNA, czyli

do wytworzenia pierwszych wektorów adenowirusowych. Nastêpne etapy produkcji

polegaj¹ ju¿ nie na transfekcji kolejnych komórek zrekombinowanym DNA, ale na

ich infekowaniu otrzymanymi wczeœniej wektorami. Powtarzanie infekcji na coraz

wiêksz¹ skalê pozwala namna¿aæ AdV do coraz wy¿szych mian siêgaj¹cych nawet

1013 wirionów/mL (2,7).

Oprócz wysokiej wydajnoœci, metoda produkcji AdV powinna zapewniaæ odpo-

wiedni¹ jakoœæ otrzymywanych noœników, czyli przede wszystkim brak adenowiru-

sów kompetentnych replikacyjnie (RCA, ang. replication competent adenovirus). RCA

mog¹ powstaæ poprzez rekombinacjê homologiczn¹ miêdzy DNA wektora, a regio-

nem E1 komórek linii pakuj¹cej i mog¹ siê namna¿aæ w ka¿dego typu komórkach,

równie¿ tych nie posiadaj¹cych regionu E1 (4,8,9). Mo¿liwoœæ powstania RCA

w pewnym stopniu ogranicza wysokoœæ miana AdV jakie mo¿na otrzymaæ, poniewa¿

im wy¿szy pasa¿, tym wiêksze ryzyko rekombinacji (8). Dlatego te¿ infekowanie ko-

lejnych kultur komórek linii pakuj¹cej nie mo¿e siê odbywaæ w nieskoñczonoœæ.

W celu ograniczenia powstawania RCA rozwiniêto linie komórkowe takie jak

PER.C6, zmniejszaj¹ce ryzyko rekombinacji, oraz wprowadzono ró¿nego typu rearan-

¿acje do genomu wektora (4,5,8).

Jednym z niezwykle wa¿nych, choæ czêsto niedocenianych aspektów namna¿ania

AdV jest iloœciowe okreœlenie ich produkcji i bioaktywnoœci (5,7,10). W tym celu ko-

nieczne jest zdefiniowanie dwóch parametrów: liczby cz¹stek wirusowych (VP, ang.

viral particles) oraz jednostek infekcyjnych (IU, ang. infection units). Pierwszy para-

metr mo¿e zostaæ okreœlony za pomoc¹ bezpoœrednich pomiarów fizykochemicz-

nych, natomiast do ustalenia drugiego konieczna jest infekcja komórek permisyw-

nych i sprawdzenie biologicznej aktywnoœci wektora (5,7). Bardzo istotny jest wy-

bór wiarygodnych, miarodajnych i szybkich metod oznaczania obu parametrów (10).

Wœród technik stosowanych do okreœlenia liczby cz¹stek wirusowych wyró¿nia

siê metodê spektrofotometryczn¹ (7,10,11), znakowanie fluorescencyjne DNA wiru-

sowego (5,7,12), real-time PCR (13,14), mikroskopiê elektronow¹ (10,14) oraz meto-

dy chromatograficzne (15,16).

Jedn¹ z najstarszych i najpowszechniej stosowanych technik okreœlenia VP jest

metoda spektrofotometryczna, polegaj¹ca na obliczeniu ca³kowitej liczby cz¹stek

wirusowych na podstawie bezpoœredniego pomiaru absorbancji przy 260 nm, jak¹

ma oczyszczona i potraktowana SDS zawiesina wirusowa (7,11). Znacz¹cy wp³yw na

wynik tego oznaczenia ma jednak sposób oczyszczania zawiesiny, obecnoœæ niewi-

Produkcja wektorów adenowirusowych pierwszej generacji – optymalizacja metody

BIOTECHNOLOGIA 3 (78) 98-122 2007 99

rusowych kwasów nukleinowych, precypitacja bia³ek, czy rozpraszanie œwiat³a, któ-

re mog¹ zawy¿yæ lub zani¿yæ oznaczon¹ iloœæ VP (10,15). Inn¹ metod¹ jest mikro-

skopia elektronowa, bazuj¹ca na zliczaniu wirionów widocznych bezpoœrednio na

obrazie mikroskopowym (10,14). Wartoœci otrzymane na jej podstawie czêsto s¹

ni¿sze od tych otrzymanych w metodzie spektrofotometrycznej (10). Liczbê VP mo¿-

na tak¿e obliczaæ na podstawie pomiaru iloœci wirusowego DNA znakowanego flu-

orescencyjnie za pomoc¹ barwnika PicoGreen. Metoda ta jest nawet 20-krotnie czul-

sza ni¿ metoda spektrofotometryczna, a do pomiaru wystarczy mniejsza objêtoœæ

zawiesiny wirusowej (5,7,12).

Mo¿na równie¿ dokonaæ oznaczenia liczby VP poprzez identyfikacjê bia³ek kap-

sydu za pomoc¹ metod chromatograficznych (5,7). Jedn¹ z nich jest chromatografia

oparta na adsorbentach anionowymiennych, umo¿liwiaj¹ca oznaczenie VP przy jed-

noczesnym oczyszczeniu próbki (16). Mo¿na te¿ stosowaæ chromatografiê odwróco-

nych faz (RP-HPLC). Obie metody charakteryzuj¹ siê wy¿sz¹ nawet do 20 razy czu-

³oœci¹ w oznaczaniu VP w porównaniu z metod¹ spektrofotometryczn¹ (15).

Jedn¹ z najczêœciej stosowanych metod jest jednak reakcja PCR w czasie rzeczy-

wistym (qPCR), pozwalaj¹ca na fluorescencyjn¹ detekcjê namno¿onych sekwencji

DNA. Umo¿liwia ona szybkie, dok³adne i powtarzalne oznaczenie VP w minimalnej

iloœci materia³u, z wykorzystaniem krzywej standardowej dla roztworów o znanej

liczbie kopii DNA (13,14).

Wszystkie te metody maj¹ swoje wady i zalety, zw³aszcza jeœli chodzi o czu³oœæ

i ³atwoœæ wykonania. W ka¿dej z nich mo¿na te¿ otrzymaæ fa³szywie pozytywne wyni-

ki, wynikaj¹ce z obecnoœci wolnego wirusowego DNA, czy nie z³o¿onych w kapsyd

bia³ek (13,15). Przede wszystkim jednak pomiary czêsto s¹ prowadzane w ró¿nych wa-

runkach (np. po zastosowaniu odmiennych sposobów oczyszczenia zawiesiny wekto-

rów), co utrudnia porównanie wartoœci VP z ró¿nych Ÿróde³ literaturowych (10).

Trzeba równie¿ pamiêtaæ, ¿e okreœlenie VP obejmuje zarówno cz¹stki funkcjo-

nalne jak i niefunkcjonalne (10). Dlatego nale¿y oceniæ biologiczn¹ aktywnoœæ za-

wiesiny wirusowej, czyli okreœliæ liczbê jednostek infekcyjnych (5,7,10). W przypad-

ku wektorów zawieraj¹cych geny reporterowe mo¿liwe jest okreœlenie GTU (ang.

gene transfer units) poprzez zliczenie pozytywnie wybarwionych komórek za pomoc¹

mikroskopu lub cytometru, a nastêpnie przeliczenie ich na liczbê IU przypadaj¹cych

na jednostkê objêtoœci zawiesiny wirusowej, czyli na miano AdV (7,10,17). Dla wiêk-

szoœci transgenów konieczne jest jednak wykorzystanie innych metod opieraj¹cych

siê na przyk³ad na wizualnej ocenie efektu cytopatycznego (CPE, ang. cytopathic

effect), wyra¿anego w jednostkach PFU (ang. plaque formation unit). Wœród nich wy-

ró¿nia siê metodê ³ysinkow¹ (PFA, ang. plaque formation assay) oraz metodê koñ-

cowych rozcieñczeñ (EPDA, ang. end point dilution assay) (5,7). Test PFA polega na ob-

serwacji ³ysinek na pojedynczej warstwie komórek linii pakuj¹cej, ich zliczaniu,

a nastêpnie przeliczaniu na wartoœæ IU/mL (10). EPDA ró¿ni siê od PFA sposobem de-

tekcji – nie s¹ tu zliczane pojedyncze ³ysinki, a okreœlana jest proporcja hodowli

komórkowych wykazuj¹cych CPE (18).

Magdalena Stopa i inni

100 PRACE EKSPERYMENTALNE

Miano oznaczane na podstawie metod biologicznych mo¿e byæ odmienne w za-

le¿noœci od ró¿nic proceduralnych, wystêpuj¹cych bardzo czêsto miêdzy laborato-

riami, przy czym rozbie¿noœci dochodz¹ nawet do 30% (10,19). Ponadto, wartoœci te

zale¿¹ od typu konstruktu i rodzaju pakuj¹cej linii komórkowej, a dla tego samego

testu mog¹ siê ró¿niæ w zale¿noœci od próbki komórek permisywnych u¿ywanych do

oznaczeñ (5,7,10). Co wiêcej, tzw. „efekt transgenu” powoduje, ¿e oznaczenie

w ten sam sposób miana dwóch wektorów, przygotowanych tak samo, ale posia-

daj¹cych inny transgen, mo¿e siê ró¿niæ nawet dwu- lub trzykrotnie, co jest dodat-

kowym utrudnieniem przy porównywaniu mian ró¿nych wektorów (7). Celem pre-

zentowanej pracy by³a optymalizacja metod namna¿ania wektorów adenowiruso-

wych oraz wybór najlepszej metody ich mianowania.

2. Materia³y i metody

2.1. Hodowle komórkowe

Wektory adenowirusowe produkowano i namna¿ano w komórkach linii HEK293

(ludzkie embrionalne komórki nerki), otrzymanych dziêki uprzejmoœci Stefana Ko-

chanka (Ulm, Niemcy). Hodowlê prowadzono w standardowych warunkach (5% CO2,

37°C, wilgotnoœæ 90%) w butelkach 75 cm2 (Sarstedt) w medium MEM� (PAA Labora-

tories) zawieraj¹cym 10% FBS (PAA Laboratories), streptomycynê (10 �g/mL) i penicy-

linê (100 U/mL) (Sigma), a trypsynizowano przy u¿yciu 1 mL 0,05% trypsyny (Gibco).

2.2. DNA

Do produkcji wektorów u¿yto plazmidy zawieraj¹ce zrekombinowany wirusowy

DNA, otrzymane od Kazuhiro Oki (Houston, USA). W sk³ad plazmidu pAd�-gal wcho-

dzi kaseta ekspresyjna zawieraj¹ca gen reporterowy �-galaktozydazy (�-gal) pod

kontrol¹ promotora cytomegalowirusa (CMV) (rys. 1), a w analogicznym konstrukcie

AdRFP genem reporterowym jest gen bia³ka czerwonej fluorescencji (RFP, ang. red

fluorescent protein). Plazmidy zosta³y namno¿one w bakteriach DH5� (Stratagene),

a izolacjê ich z bakterii przeprowadzono przy u¿yciu zestawu Endo-Free Plasmid

Maxi Kit (Qiagen). Przygotowanie DNA do transfekcji obejmuje linearyzacjê enzy-

mem PacI (New England Biolabs) w celu ods³oniêcia sekwencji ITR oraz oczyszcze-

nie DNA (rys. 2). Do jednego doœwiadczenia linearyzowano 5 �g DNA przy u¿yciu

0,2 �L enzymu PacI. Mieszaninê inkubowano w 37°C przez 2 h. Oczyszczenie DNA

po trawieniu w celu wybrania najlepszej strategii przeprowadzano niezale¿nie dwo-

ma metodami: mieszanin¹ fenol : chloroform : alkohol izoamylowy oraz z wykorzy-

staniem kolumn oczyszczaj¹cych ze z³o¿em krzemionkowym Clean-Up (A&A Bio-

technology). Transfekcji komórek HEK293 dokonywano przy wykorzystaniu odczyn-


BIOTECHNOLOGIA 3 (78) 98-122 2007 101

nika SuperFect™ (Qiagen) wprowadzaj¹c 5 �g DNA do komórek rosn¹cych na szalce

6 cm, przy proporcji DNA : oligodendrymery wynosz¹cej 1 : 5.

2.3. Produkcja wektorów

Po transfekcji komórki inkubowano przez 7-10 dni do momentu pojawienia siê

100% CPE. Wtedy przeprowadzano izolacjê AdV. W tym celu komórki odrywano od

pod³o¿a poprzez potrz¹sanie i uderzanie w butelkê (bez u¿ycia trypsyny). Zawiesinê



Rys. 1. Ogólny schemat produkcji AdV – transfekcja komórek linii pakuj¹cej zrekombinowanym wi-

rusowym DNA zawieraj¹cym transgen, namno¿enie AdV w komórkach oraz ustalenie miana AdV umo¿li-

wiaj¹ wyprodukowanie wektorów i u¿ycie ich do transdukcji komórek linii docelowych. (http://www.clon-

tech.com/clontech/expression/adeno/images/12.gif, zmodyfikowane)

Rys. 2. Schemat przygotowania zrekombinowanego adenowirusowego DNA do transfekcji komórek

HEK293 (http://www.clontech.com/clontech/techinfo/manuals/PDF/PT3414-1.pdf, zmodyfikowane).

komórkow¹ przenoszono do probówki i wirowano (10 min, 400 g). Nads¹cz usuwa-

no, a komórki zawieszano w 0,5 mL PBS (gdy zbierano komórki z szalki 6 cm) lub

1 mL PBS (gdy zbierano komórki z butelki 75 cm2). Zawiesinê komórkow¹ poddawa-

no trzem cyklom zamra¿ania w temperaturze -20°C (mieszanina etanolu 96% i su-

chego lodu) i rozmra¿ania w 37°C (³aŸnia wodna). Natychmiast po rozmro¿eniu (tak,

by próbki nie ogrza³y siê do 37°C) komórki wytrz¹sano na mieszadle typu worteks.

Mechaniczne rozbicie komórek powodowa³o uwolnienie wirusów do PBS. Zawiesi-

nê wirowano (5 min, 400 g) w celu oddzielenia resztek komórkowych. Rozporcjowa-

ny nads¹cz (zawiesinê wirusow¹) przechowywano w -80°C. W celu namno¿enia

Ad�-gal infekowano komórki HEK293 hodowane w butelkach 75 cm2, gdy osi¹gnê³y

konfluencjê 100%. Mieszaninê infekcyjn¹ (0,25 mL zawiesiny wirusowej + 5 mL me-

dium hodowlanego) podawano na komórki, a nastêpnie inkubowano przez 1,5 h

w 37°C. Po inkubacji dodawano 7 mL medium i ponownie inkubowano komórki do

momentu uzyskania CPE. Czas inkubacji zale¿a³ od miana zawiesiny wirusowej u¿y-

wanej do infekcji i wynosi³ od 1 do 7 dni. Przeprowadzano 6 etapów namno¿enia

wirusów, u¿ywaj¹c ka¿dorazowo do infekcji zawiesinê wirusow¹ z poprzedniego

etapu.

W celu ustalenia warunków infekcji komórek HEK293, wysiewano komórki na

p³ytkê 96-do³kow¹ i infekowano stosuj¹c 30 �L zawiesiny wirusowej (104 IU/do³ek).

Po inkubacji dodawano 70 �L pe³nego medium hodowlanego (10% FBS), a po 48 h

badano wydajnoœæ transdukcji barwieniem na obecnoœæ �-galaktozydazy in situ.

W tym celu komórki utrwalano 0,25% aldehydem glutarowym (AppliChem), a nastêp-

nie podawano syntetyczny substrat �-galaktozydazy – X-gal (AppliChem) na 1-3 h.

Stransdukowane komórki wykazuj¹ce ekspresjê �-galaktozydazy wybarwia³y siê na

niebiesko (tzw. komórki pozytywne).

2.4. Oznaczenie miana za pomoc¹ barwienia wykrywaj¹cego aktywnoœæ �-ga-laktozydazy in situ

24 h przed planowan¹ infekcj¹ wysiewano komórki HEK293 na p³ytkê 96-do³-

kow¹, tak by w dniu infekcji komórki mia³y 90% konfluencji. Przygotowywano roz-

cieñczenia oznaczanej zawiesiny wirusowej w medium hodowlanym, podawano je

na komórki w objêtoœci 30 �L, a po 1,5-godzinnej inkubacji dodawano kolejne 70 �L

medium. Zakres rozcieñczeñ w przeliczeniu na koñcow¹ objêtoœæ medium infekcyj-

nego (100 �L) wynosi³ 10-1-10-8. 48 h po infekcji dokonywano barwienia wykrywaja-

cego aktywnoœæ �-galaktozydazy. Wyznakowane komórki liczono w do³kach z jak

najbardziej rozcieñczonym inokulatem. Liczbê pozytywnych komórek przeliczano

na wartoœæ miana (liczbê infekcyjnych cz¹stek wirusa (IU) przypadaj¹cych na 1 mL

oznaczanej zawiesiny wirusowej) korzystaj¹c z wzoru (A):


BIOTECHNOLOGIA 3 (78) 98-122 2007 103

×

×

Badan¹ próbk¹ w reakcji PCR by³a zawiesina wirusowa wyizolowana z komórek

i rozcieñczona 1000x i 10 000x. Liczbê kopii DNA dla badanych próbek Ad�-gal wy-

znaczano na podstawie krzywej standardowej zale¿noœci Ct (cykl, przy którym flu-

orescencja osi¹gnê³a wartoœæ progow¹) od log10 (liczby kopii), uwzglêdniaj¹c wspó³-

czynnik rozcieñczenia próbki.

2.9. Analiza statystyczna

Wszystkie doœwiadczenia wykonywane by³y w duplikatach. Wyniki przedstawio-

ne s¹ jako œrednia ± SD. Istotnoœæ statystyczn¹ sprawdzano testem t-studenta (dla

dwóch próbek) lub analiz¹ wariancji ANOVA z testem Tukeya dla wielu próbek. Jako

istotne statystycznie uznawano wyniki dla p < 0,05.

3. Wyniki

3.1. Przygotowanie DNA oraz transfekcja komórek HEK293

Plazmid zawieraj¹cy zrekombinowany wirusowy DNA z genem �-galaktozydazy,

przed wprowadzeniem do komórek HEK293 i rozpoczêciem produkcji Ad�-gal nale-

¿y zlinearyzowaæ enzymem PacI, a nastêpnie oczyœciæ. Aby wybraæ najlepsz¹ metodê

oczyszczania plazmidu komórki HEK293 stransfekowano t¹ sam¹ iloœci¹ DNA (5 �g)

u¿ywaj¹c DNA zlinearyzowany i oczyszczony za pomoc¹ mieszaniny fenol : chloro-

form : alkohol izoamylowy lub DNA zlinearyzowany i oczyszczony na kolumnach

krzemionkowych. Czêœæ komórek transfekowano DNA zlinearyzowanym i nieoczysz-

czonym, a niektóre DNA nie trawionym i nie oczyszczonym. Po 48 godzinach na ka¿-



Rys. 3. Wp³yw ró¿nych metod przygotowania DNA (pAd�-gal) na wydajnoœæ transfekcji komórek

HEK293. Przyk³adowe doœwiadczenie. Ph : Ch : IA – mieszanina fenol : chloroform : alkohol izoamylo-

wy, PacI – enzym restrykcyjny.

dej z transfekowanych szalek przeprowadzono barwienie wykrywaj¹ce aktywnoœæ

�-galaktozydazy in situ i policzono wybarwione na niebiesko komórki (rys. 3).

Zaobserwowano, ¿e ominiêcie etapu oczyszczania w znacz¹cy sposób poprawia

wydajnoœæ transfekcji, bez wzglêdu na to czy plazmid wprowadzany do komórek by³

wczeœniej linearyzowany czy te¿ nie. Brak oczyszczania DNA podnosi³ oko³o

20-krotnie wydajnoœæ transfekcji. Najmniej efektywn¹ metod¹ by³o transfekowanie

komórek DNA oczyszczanym mieszanin¹ fenol : chloroform : alkohol izoamylowy

(rys. 3).

Wprowadzenie zrekombinowanego DNA pAdV do komórek HEK293 za pomoc¹

transfekcji to pierwszy krok w procesie produkcji AdV. W ci¹gu kilku dni stransfeko-

wane komórki produkuj¹ i uwalniaj¹ do po¿ywki wektory, które wnikaj¹ do kolej-

nych komórek, tak ¿e liczba komórek stransdukowanych zwiêksza siê. Naj³atwiej

zaobserwowaæ to w przypadku wektorów koduj¹cych fluorescencyjny produkt –

np. AdRFP (rys. 4A). W przypadku innych typów AdV (np. Ad�-gal), wydajnoœæ pro-

dukcji wektorów ocenia siê na podstawie postêpuj¹cego CPE hodowli, w porówna-

niu do komórek kontrolnych (rys. 4B).


BIOTECHNOLOGIA 3 (78) 98-122 2007 107

Rys. 4. (A) Produkcja AdV w komórkach stransfekowanych pAdRFP; (B) produkcja AdV w komórkach

stransfekowanych pAd�-gal oceniona na podstawie CPE (a) porównywanego do komórek kontrolnych

(b).

3.2. Produkcja Ad�-gal – infekcje komórek HEK293

Produkcja wektorów AdV opiera siê na powtarzanych transdukcjach kolejnych

hodowli komórek pakuj¹cych HEK293. W tym celu, po³owê (250 �L) uzyskanej za-

wiesiny wektorów Ad�-gal wyizolowanych ze stransfekowanych optymaln¹ metod¹

komórek (Ad�-gal 1’), wykorzystywano do transdukcji kolejnej porcji komórek, wy-

sianych na szalce 6 cm. Wyizolowane wektory z drugiego namno¿enia (Ad�-gal 2’)

by³y ponownie namna¿ane, poprzez kolejn¹ transdukcjê komórek. Tym razem jed-

nak zwiêkszano skalê produkcji, infekuj¹c t¹ sam¹ objêtoœci¹ zawiesiny Ad�-gal

(250 �L) wiêksz¹ porcjê komórek HEK293 (butelkê 75 cm2). Izolowano dziêki temu

dwa razy wiêcej zawiesiny wektorowej (1 mL Ad�-gal 3’), która s³u¿y³a do transduk-

cji trzech kolejnych butelek hodowlanych (75 cm2). Zwiêkszaj¹c w ten sposób liczbê

naczyñ do produkcji wektorów z kolejnych namno¿eñ (Ad�-gal 4’, 5’, 6’) uzyskiwano

coraz wiêcej zawiesiny z Ad�-gal. Oprócz wzrostu iloœci Ad�-gal (objêtoœæ zawiesiny

wektorowej uzyskana z 6’ namno¿enia to oko³o 20 mL), przeprowadzona w ten spo-

sób produkcja prowadzi do uzyskiwania równie¿ coraz wy¿szego miana wektorów

(rys. 5).

Przyrost miana Ad�-gal dla kolejnych namno¿eñ jest znaczny (nawet stukrotny),

najwiêkszy jednak przy produkcji Ad�-gal 3’ (300 razy), które jest pierwszym

namno¿eniem wyprodukowanym po zwiêkszeniu skali hodowli (rys. 5). 2,5-krotny

wzrost miana miêdzy Ad�-gal 1’ a Ad�-gal 2’ nie jest istotny statystycznie. Ró¿nice

miêdzy koñcowymi namno¿eniami (Ad�-gal 4’, 5’ i 6’) równie¿ s¹ coraz mniejsze



Rys. 5. Wzrost wartoœci miana Ad�-gal dla kolejnych namno¿eñ wektorów; œrednia ± SD; A, B, C, D

– analiza istotnoœci statystycznej, ta sama litera oznacza brak ró¿nic.

i nie znacz¹ce statystycznie (5 razy dla Ad�-gal 4’ � Ad�-gal 5’ oraz 3 dla Ad�-gal 5’

� Ad�-gal 6’), co sugeruje zbli¿anie siê do maksymalnej zdolnoœci produkcyjnej.

3.3. Optymalizacja warunków infekcji komórek HEK293

W osi¹gniêciu du¿ych przyrostów miana miêdzy kolejnymi namno¿eniami pod-

stawowe znaczenie mia³o zoptymalizowanie warunków infekcji HEK293. W tym

celu zbadano wp³yw zawartoœci surowicy w medium infekcyjnym, czasu inkubacji

Ad�-gal z komórkami i czasu izolacji Ad�-gal z komórek na wydajnoœæ transdukcji

oraz miano wektorów.

Komórki HEK293 poddawano inkubacji z lizatem wirusowym zawieszonym

w minimalnej objêtoœci po¿ywki (30 �L/do³ek w p³ytkach 96-do³kowych), zawie-

raj¹cej ró¿ne stê¿enie FBS (0, 1, 5 i 10%). Ma³a objêtoœæ zawiesiny wirusowej zwiêk-


BIOTECHNOLOGIA 3 (78) 98-122 2007 109

Rys. 6. Wp³yw czasu inkubacji oraz iloœci FBS w medium na wydajnoœæ transdukcji komórek HEK293

(A) œrednia liczba pozytywnych komórek na pole widzenia ± SD, * p < 0,05 w porównaniu do 0 min, #

– p < 0,05 w porównaniu do 0% FBS, (B) przyk³adowe zdjêcia komórek po transdukcji Ad�-gal w skraj-

nie ró¿nych warunkach infekcji (0 min, 0% FBS oraz 180 min, 10% FBS), w warunkach uznanych za opty-

malne (90 min, 10% FBS).

sza prawdopodobieñstwo kontaktu wektora z komórk¹. Dla ka¿dego stê¿enia FBS

testowano tak¿e ró¿ne czasy adsorpcji Ad�-gal (45, 90 i 180 min) po których doda-

wano medium hodowlane do koñcowej objêtoœci 100 �L/do³ek. Badano równie¿

efektywnoœæ transdukcji komórek do których wektory podawano od razu w koñco-

wej objêtoœci (grupa 0 min). Najwy¿sz¹ wydajnoœæ transdukcji komórek HEK293

uzyskano dla 10% FBS (rys. 6). W tych warunkach czas inkubacji nie wp³ywa³ zna-

cz¹co na efektywnoœæ. Jednak¿e przy ni¿szych stê¿eniach FBS, wyd³u¿enie czasu in-

kubacji do 180 min skutkowa³o istotnym wzrostem wydajnoœci transdukcji.

Kolejny optymalizowany czynnik to czas izolacji wektorów. Porównano wyniki

uzyskane dla zawiesin wektorowych izolowanych gdy ok. 50% komórek wykazywa³o

CPE, oraz gdy wszystkie komórki by³y cytopatyczne (oderwane od dna naczynia).

Okazuje siê, ¿e przeprowadzanie izolacji przy 100% CPE daje wy¿sze miano uzyska-

nej zawiesiny wirusowej (rys. 7). Wzrost miana obserwowany by³ zarówno dla wek-

torów z namno¿enia 5’ jak i 6’, dla których wynosi³ odpowiednio 5 i 3,5 raza.

3.4. Oznaczenie miana metod¹ barwienia wykrywaj¹cego aktywnoœæ �-galak-tozydazy in situ

W celu oznaczenia miana (IU/mL) lizatu wirusowego AdV�-gal, infekowano ko-

mórki HEK293 kolejnymi rozcieñczeniami badanej zawiesiny i przeprowadzano bar-

wienie wykrywaj¹ce aktywnoœæ �-galaktozydazy in situ (rys. 8). Zak³adaj¹c, ¿e jedna

pozytywna komórka przek³ada siê na jedn¹ jednostkê infekcyjn¹ Ad�-gal, obliczono

miano korzystaj¹c z wzoru (A). Oznaczone miana badanych zawiesin Ad�-gal znaj-

duj¹ siê w zakresie od (5,5 ± 1,4) × 102 IU/mL – Ad�-gal 1’, do (2,3 ± 0,3) × 108

IU/mL dla Ad�-gal 6’. Pozwoli³o to w przypadku zawiesiny Ad�-gal 6’, po rozcieñcze-

niu 1000 razy, na osi¹gniêcie 100% efektywnoœci transdukcji (rys. 8). W kolejnych



Rys. 7. Porównanie miana jakie posiadaj¹ wektory z tego samego namno¿enia, ale izolowane

w dwóch ró¿nych momentach; œrednia wartoœæ miana ± SD, # – p < 0,05.

doœwiadczeniach maksymalne miana uzyskiwanych wirusów waha³y siê od 1 × 108

do 1 × 1010.

W wyniku produkcji Ad�-gal uda³o siê uzyskaæ wysokie miano wektora, a sama

metoda oznaczeñ okaza³a siê ³atwa do przeprowadzenia oraz miarodajna. Jej zalet¹

jest wykrywanie jedynie efektów dzia³ania w pe³ni funkcjonalnych wirionów. Wyniki

te zosta³y uznane za pomiar referencyjny, do którego porównywano wyniki ozna-

czenia miana za pomoc¹ innych metod.


BIOTECHNOLOGIA 3 (78) 98-122 2007 111

Rys. 8. Efektywnoœæ transdukcji komórek HEK293 przez kolejne dziesiêtne rozcieñczenia wektorów

Ad�-gal z ró¿nych namno¿eñ – reprezentatywne zdjêcia dla kilku wybranych rozcieñczeñ.

3.5. Oznaczenie miana metod¹ immunochemiczn¹

Jedn¹ z testowanych metod by³a immunohistochemiczna detekcja stransduko-

wanych komórek. Wykorzystano do niej komercyjnie dostêpny zestaw odczynników

Adeno-X™ Rapid Titer ELISA Kit. Metoda oparta jest na wykrywaniu bia³ek heksono-

wych kapsydów AdV za pomoc¹ odpowiednich przeciwcia³. Liczbê wybarwionych,

pozytywnych komórek przeliczano na miano wed³ug wzoru (A).

W celu porównania wyników barwienia immunohistochemicznego z testem na

aktywnoœæ �-galaktozydazy przeprowadzono oznaczenie miana tej samej zawiesiny

Ad�-gal jednoczeœnie dwoma metodami (rys. 9). Okaza³o siê, ¿e wyniki testu ELISA

(rys. 9 A) nie odbiegaj¹ znacz¹co od miana oznaczonego metod¹ barwienia wykry-

waj¹cego obecnoœæ �-galaktozydazy in situ (rys. 9 B).



Rys. 9. Porównanie wyników oznaczenia miana za pomoc¹ (A) testu na aktywnoœæ �-galaktozydazy

oraz (B) za pomoc¹ Adeno-X™ Rapid Titer Elisa Kit. Wartoœæ miana – œrednia ± SD.

3.6. Oznaczenie miana metod¹ koñcowych rozcieñczeñ (EDPA)

EPDA jest jedn¹ z tradycyjnych metod mianowania AdV, opartych na oznaczeniu

liczby IU poprzez wizualn¹ detekcjê CPE wystêpuj¹cego w zainfekowanych komór-

kach. Nie ma jednak jasnych kryteriów pozwalaj¹cych na jednoznaczne uznawanie

hodowli komórkowych za CPE pozytywne. Dlatego w prezentowanych doœwiadcze-

niach porównano wyniki oznaczeñ miana przy za³o¿eniach dwóch odmiennych kry-

teriów.

W pierwszej grupie doœwiadczeñ (eksperyment 1), za do³ek CPE pozytywny

uznawano taki, który wykaza³ jakiekolwiek naruszenie pojedynczej warstwy komó-

rek, zgodnie z wskazówkami zawartymi w oryginalnym opisie procedury (rys. 10 A)

(http://www.clontech.com/images/pt/PT3414-1.pdf). W drugiej grupie doœwiadczeñ

(eksperyment 2) – za do³ek CPE pozytywny uznawano taki w którym obserwowano

³ysinki wiêksze ni¿ kilka komórek, otoczone okr¹g³ymi, martwymi komórkami, nie

pozostawiaj¹ce ¿adnych w¹tpliwoœci do co wirusowego pochodzenia (rys. 10 B).

Im wiêksze rozcieñczenie zawiesiny Ad�-gal, tym mniejsze prawdopodobieñ-

stwo pojawienia siê ³ysinki. Reprezentatywne zdjêcia do³ków z danego rozcieñcze-

nia w pi¹tym dniu trwania eksperymentu prezentuje rysunek 11. Zgodnie z proce-

dur¹, EPDA powinien trwaæ 10-14 dni (czas wystarczaj¹cy na wyst¹pienie CPE w do³-

kach zainfekowanych nawet du¿ym rozcieñczeniem zawiesiny AdV), ale jednoczeœ-

nie pojawienie siê ³ysinek w choæ jednym do³ku kontrolnym powinno oznaczaæ na-

tychmiastowe przerwanie testu. W prezentowanych badaniach ³ysinki w komórkach

kontrolnych pojawia³y siê oko³o czwartego dnia trwania eksperymentu, jednak do-

œwiadczenie kontynuowano, dopóki nie pojawi³y siê w wiêkszoœci do³ków kontrol-

nych, zwykle w 7 lub 8 dniu eksperymentu.


BIOTECHNOLOGIA 3 (78) 98-122 2007 113

Rys. 10. Wygl¹d komórek w CPE pozytywnym do³ku w warunkach (A) pierwszego i (B) drugiego eks-

perymentu EPDA.

W ka¿dym dniu doœwiadczenia obliczano miano Ad�-gal, korzystaj¹c ze wzoru

(B). Okazuje siê, ¿e drobne ró¿nice w sposobie detekcji do³ków CPE pozytywnych

daj¹ w rezultacie ogromne rozbie¿noœci w oznaczanym mianie, siêgaj¹ce nawet

czterech rzêdów wielkoœci (rys. 12). Pomimo ¿e ostatecznie wyliczone miano nie

wykazuje a¿ takich ró¿nic (eksperyment 1 = 2,4 × 108 IU/mL, eksperyment 2 = 1,1 ×

× 108 IU/mL), nale¿y pamiêtaæ, i¿ zgodnie z oryginaln¹ procedur¹, doœwiadczenie

powinno zostaæ zakoñczone ju¿ czwartego dnia, kiedy miano wynosi³o 3,3 × 103 IU/mL

(w eksperymencie 1) lub 30 IU/mL (w eksperymencie 2). Tu ró¿nice w mianie

w zale¿noœci od sposobu detekcji s¹ ju¿ 100-krotne, a ponadto wyniki bardzo ró¿-

ni¹ siê od rzeczywistego miana zawiesiny Ad�-gal u¿ytej do infekcji, wyznaczone-

go na podstawie barwienia wykrywaj¹cego aktywnoœæ �-galaktozydazy in situ

(2,3 × 108 IU/mL). Wskazuje to te¿ na drugi czynnik o zasadniczym wp³ywie na

wartoœæ ustalonego miana, a mianowicie moment, w którym dokonano odczytu –

jak widaæ, w kolejnych dniach eksperymentu obliczone miano zwiêksza³o siê

10-100 razy.



Rys. 11. Efekt CPE po infekcji komórek HEK293, test EPDA, pi¹ty dzieñ trwania eksperymentu.

W celu sprawdzenia w jakim stopniu widoczny efekt CPE odzwierciedla fak-

tyczn¹ obecnoœæ Ad�-gal, po zakoñczeniu eksperymentów wykonywano na zainfe-

kowanych p³ytkach dodatkowe barwienie wykrywaj¹ce aktywnoœæ �-galaktozydazy

in situ. Okaza³o siê, ¿e wiêkszoœæ do³ków CPE pozytywnych zgodnie z za³o¿eniem

wykaza³a du¿¹ iloœæ pozytywnych komórek, szczególnie w najbli¿szym otoczeniu


BIOTECHNOLOGIA 3 (78) 98-122 2007 115

Rys. 12. Miano Ad�-gal obliczane w ró¿nych dniach EPDA. Przyk³adowe doœwiadczenie.

Rys. 13. Porównanie efektu CPE i barwienia �-gal jako sposobów detekcji infekcji Ad�-gal.

³ysinki. Jednak¿e by³y równie¿ takie do³ki, które mimo braku najmniejszych oznak

obecnoœci CPE, po barwieniu wykrywaj¹cym aktywnoœæ �-galaktozydazy in situ

w istocie by³y, jak siê okaza³o, zainfekowane Ad�-gal, i vice versa – mo¿na by³o zna-

leŸæ studzienki CPE pozytywne, które nie wykazywa³y obecnoœci Ad�-gal (rys. 13).

3.7. Próba oznaczenia miana metod¹ ³ysinkow¹

Podobnie jak EPDA, metoda ³ysinkowa (PFA) to sposób mianowania AdV, pole-

gaj¹cy na wizualnej detekcji CPE, a konkretnie na liczeniu ³ysinek powsta³ych po in-

fekcji komórek HEK293 i na ich podstawie wyliczaniu miana (wzór (C)). W celu za-

pewnienia zale¿noœci 1 ³ysinka – 1 wektor AdV, po infekcji komórki pokrywane s¹

roztworem agarozy, utrudniaj¹cym dyfuzjê wirionów.

Etap pokrywania komórek agaroz¹, okaza³ siê na tyle niepowtarzalny i szkodliwy

dla komórek, ¿e wiêkszoœæ wykonywanych doœwiadczeñ nie pozwala³a na oznacze-

nie miana. Nawet jeœli jakoœæ hodowli umo¿liwia³a liczenie ³ysinek, nie obserwowa-

no zale¿noœci ich liczby od stopnia rozcieñczenia zawiesiny wirusowej (rys. 14). Dla-

tego test ten uznano za niewiarygodny i niepraktyczny, rezygnuj¹c z jego wykorzy-

stywania.

3.8. Oznaczenie miana metod¹ PCR w czasie rzeczywistym

Reakcja PCR w czasie rzeczywistym, wyznacza liczbê cz¹stek wirusowych (VP)

wykrywaj¹c kopie wirusowego DNA. Reakcja przeprowadzana by³a równoczeœnie

dla roztworów dsDNA (pAAVLacZ) o znanej liczbie kopii/mL, oraz dla badanych pró-

bek Ad�-gal. Reprezentatywna krzywa standardowa oraz wzór dopasowania prostej

regresji przedstawiono na rysunku 15. Liczbê kopii wirusowego DNA/mL zawiesiny

obliczono znaj¹c wspó³czynnik rozcieñczenia oraz wartoœci Ct badanych próbek

Ad�-gal i korzystaj¹c ze wzoru prostej regresji dopasowanej do punktów krzywej

standardowej (rys. 15, tab.).



Rys. 14. Efekt CPE komórek zainfekowanych ró¿nymi rozcieñczeniami Ad�-gal – trzeci dzieñ trwa-

nia testu PFA.

T a b e l a

Miano wektorów Ad�-gal obliczone za pomoc¹ reakcji PCR w czasie rzeczywistym

PróbkaŒrednia wartoœæ

Ct ± SD

Liczba kopii próbki

rozcieñczonej

(kopie/mL)

Liczba kopii próbki

nierozcieñczonej

(kopie/mL)

Œrednia liczba

VP/mL ± SD

AdV�-gal 10-3 26,52 ± 0,22 2,17 × 106 2,17 × 109(1,82 ± 0,49) × 109

AdV�-gal 10-4 30,98 ± 0,33 1,48 × 105 1,48 × 109

Miano zawiesiny Ad�-gal mierzone na podstawie reakcji PCR w czasie rzeczywi-

stym wynosi³o 1,82 × 109. Miano tej samej zawiesiny oznaczone za pomoc¹ barwie-

nia �-gal in situ, okreœlono jako 1 × 108 IU/mL. Ró¿nica w mianie oznaczonym te-

stem biologicznym i przy wykorzystaniu reakcji PCR jest wiêc dziesiêciokrotna.

Mimo to test oparty na reakcji PCR w czasie rzeczywistym okaza³ siê dobrym sposo-

bem szybkiego i powtarzalnego szacowania miana wektorów adenowirusowych.

4. Dyskusja

Z prezentowanej pracy wynika, ¿e optymalizacja warunków produkcji AdV mo¿e

w istotny sposób podnieœæ wydajnoœæ ca³ego procesu, co poœwiadczaj¹ uzyskane

wyniki. Ulepszeñ mo¿na dokonaæ ju¿ na pierwszym etapie, podczas przygotowywa-

nia zrekombinowanego wirusowego DNA do transfekcji (rys. 3). Na podstawie

przedstawionych wyników widzimy, ¿e linearyzacja pAdV nie wp³ywa znacz¹co na

wydajnoœæ transfekcji. Linearyzacja mo¿e natomiast, jak siê wydaje, zwiêkszaæ po-

ziom produkcji wektorów, dziêki u³atwieniu replikacji DNA poprzez ods³oniêcie se-


BIOTECHNOLOGIA 3 (78) 98-122 2007 117

Rys. 15. Krzywa standardowa reakcji real-time PCR – zale¿noœæ wartoœci Ct od liczby kopii

dsDNA/mL standardu.

kwencji ITR (6,20). Dlatego w naszym protokole pos³ugiwaliœmy siê DNA zlinearyzo-

wanym. Co zaskakuj¹ce, pominiêcie sugerowanego przez producenta kroku oczysz-

czania DNA plazmidowego w mieszaninie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy,

dawa³o 80-krotny wzrost wydajnoœci transfekcji. Jest to zapewne spowodowane

stratami w iloœci DNA, jakie pojawiaj¹ siê podczas oczyszczania i/lub zanieczysz-

czeniem DNA fenolem, które mo¿e mieæ negatywny wp³yw na transfekcjê (21). Za-

stosowanie kolumn krzemionkowych, pozwoli³o na uzyskanie 6-krotnie lepszej

wydajnoœci ni¿ oczyszczanie mieszanin¹ fenolow¹, jednak wci¹¿ by³a ona 14 razy

gorsza ni¿ w przypadku DNA ciêtego, nie oczyszczonego. Sugerujemy zatem

opuszczenie tego etapu. Dziêki temu nie tylko wzrasta skutecznoœæ procedury, ale

tak¿e zmniejsza siê pracoch³onnoœæ i skraca siê czas niezbêdny do jej przeprowa-

dzenia.

Dalszy etap produkcji AdV polega ju¿ nie na transfekcji, ale na kolejnych

transdukcjach komórek linii pakuj¹cej, wektorami wyizolowanymi z poprzedniego

namno¿enia (2,7). Istniej¹ co najmniej dwa sposoby uzyskiwania AdV z hodowli ko-

mórek pakuj¹cych – albo poprzez zbieranie wektorów z medium po lizie komórek,

albo poprzez zbieranie zainfekowanych komórek i przeprowadzanie chemicznej lub

mechanicznej lizy w celu uwolnienia AdV (8). W prezentowanej pracy nie porówny-

waliœmy wyników stosowania obu tych metod, lecz wykorzystywaliœmy jedynie pro-

cedurê opart¹ na lizie mechanicznej, polegaj¹c¹ na trzykrotnym zamra¿aniu i roz-

mra¿aniu komórek. Wykazaliœmy natomiast, ¿e ustalenie odpowiedniego momentu

izolacji wektorów, mo¿e znacznie poprawiæ miano otrzymywanej zawiesiny (rys. 7).

Izolacja przy 100% CPE da³a wzrost wartoœci miana w porównaniu z izolacj¹ prze-

prowadzan¹ przy zalecanym 50% CPE. Wejœcie wszystkich komórek w stan cytopa-

tycznoœci i oderwanie ich od dna naczynia, zachodzi³o zwykle oko³o 48 h po infek-

cji, co jest zgodne z wczeœniejszymi badaniami pokazuj¹cymi, ¿e w tym czasie ma

miejsce najwy¿sza produkcja AdV (5,22). Czas ten powinien byæ na bie¿¹co monito-

rowany, gdy¿ ³atwo ulega zmianie w zale¿noœci od wieku (liczby pasa¿y) i kondycji

komórek oraz miana wektorów wykorzystywanych do transdukcji. Moment izolacji

zale¿y ponadto od takich czynników jak cytotoksycznoœæ transgenu oraz rodzaj pa-

kuj¹cej linii komórkowej, co potwierdza koniecznoœæ optymalizacji tego czynnika

(5,22).

Znaczny przyrost miana wektorów z kolejnych namno¿eñ (Ad�-gal 1’ – Ad�-gal 6’,

rys. 5,8) potwierdza, ¿e podczas produkcji ³atwo jest uzyskaæ wysokie stê¿enia AdV.

Przyrosty spowodowane s¹ przede wszystkim coraz wiêksz¹ liczb¹ wektorów u¿y-

wan¹ do kolejnych infekcji oraz zwiêkszeniem skali hodowli (5,22). Poniewa¿ efek-

tywnoœæ infekcji zale¿y od dyfuzji wirusów w po¿ywce hodowlanej (5,10), zasadne

jest u¿ywanie do produkcji komórek znajduj¹cych siê w 100% konfluencji, co zwiêk-

sza prawdopodobieñstwo kontaktu AdV z komórk¹. Temu samemu celowi s³u¿y

zminimalizowanie objêtoœci medium w pierwszej fazie infekcji wirusowej (fazie ad-

sorpcji) (10). Prezentowane dane pokazuj¹ jednak (rys. 6), ¿e wyd³u¿enie czasu ad-

sorpcji, w przypadku produkcji zachodz¹cej w komórkach HEK293, nie ma a¿ tak



du¿ego znaczenia, o ile infekcja przebiega w medium bogatym w sk³adniki od¿yw-

cze (10% FBS). W dotychczasowych badaniach potwierdza siê podstawow¹ rolê bo-

gatego w sk³adniki od¿ywcze medium stosowanego do produkcji AdV (5), oraz po-

kazuje siê, ¿e wyd³u¿enie czasu adsorpcji (do 6 h) mo¿e znacz¹co wp³ywaæ na

zwiêkszenie miana AdV (10). Z naszych doœwiadczeñ wynika, ¿e te dwa czynniki

wspó³dzia³aj¹ ze sob¹ – nisk¹ wydajnoœæ transdukcji w ubogim w sk³adniki od¿yw-

cze medium mo¿na podwy¿szyæ, stosuj¹c d³u¿sze czasy adsorpcji, a z kolei stoso-

wanie krótszych czasów adsorpcji mo¿e byæ zrekompensowane poprzez wysoko

od¿ywcze medium.

Okazuje siê jednak, ¿e w ustalonych warunkach hodowli, miano wektora w ko-

lejnych namno¿eniach mo¿e siê zwiêkszyæ jedynie do pewnego poziomu (rys. 5).

W przypadku nastêpnych namno¿eñ, przyrosty miana nie s¹ ju¿ tak znacz¹ce jak

wczeœniej, co sugeruje osi¹gniêcie plateau w produkcji AdV. Jest to zgodne z wczeœ-

niejszymi doniesieniami, pokazuj¹cymi, ¿e zwiêkszona wartoœæ MOI u¿ywanego do

infekcji komórek HEK293 jedynie do pewnego stopnia poprawia wielkoœæ miana

(22). Jednoczeœnie nale¿y pamiêtaæ, ¿e im wiêcej etapów namno¿eñ wektora, tym

wiêksze prawdopodobieñstwo pojawienia siê RCA (8), wirusów kompetentnych re-

plikacyjnie, ³atwo przerastaj¹cych formy replikacyjnie defektywne (4,7). Wszystko

to sprawia, ze optymalna liczba pasa¿y do jakiej powinno siê namna¿aæ produkowa-

ne wektory otrzymuj¹c wysok¹ wartoœæ miana, to 6 (rys. 5,8).

Niezwykle wa¿nym, a czêsto niedocenianym aspektem namna¿ania AdV, jest

okreœlenie iloœci i bioaktywnoœci wyprodukowanych wektorów, czyli zmierzenie ich

miana. Istnieje wiele ró¿nych metod pozwalaj¹cych na mianowanie wektorów,

a ka¿da z nich wystêpuje w wielu wariantach (5,7,19). Dodatkowym utrudnieniem

jest brak standaryzacji stosowanych testów (10). Jednoczeœnie nale¿y pamiêtaæ, ¿e

wiele z niepo¿¹danych efektów infekcji AdV (cytotoksycznoœæ, immunogennoœæ)

w du¿ym stopniu zale¿y od dawki wektora, tote¿ poprawne okreœlenie miana jest

zatem niezwykle wa¿ne (1,23,24). Dlatego zdecydowaliœmy siê na porównanie kilku

ze znanych sposobów mianowania.

Jedn¹ z naj³atwiejszych metod jest detekcja produkcji transgenicznego bia³ka.

Jest to bezpoœredni dowód na funkcjonalnoœæ cz¹stki wektora, a dziêki wysokie-

mu poziomowi ekspresji, jaki zapewniaj¹ AdV jest to równie¿ efekt ³atwy do ob-

serwowania. Okreœlanie liczby komórek produkuj¹cych bia³ko kodowane przez

transgen mo¿na zatem z powodzeniem wykorzystaæ do oznaczenia miana zawiesi-

ny AdV (7,10,17). Stosowana przez nas metoda polega na infekcji komórek HEK293

zawiesin¹ wirusow¹, a nastêpnie na badaniu ekspresji transgenu poprzez barwie-

nie wykrywaj¹ce aktywnoœæ �-galaktozydazy in situ. Zak³adaj¹c, ¿e jeden wirion

przypada na jedn¹ zainfekowan¹ komórkê, mo¿emy obliczyæ liczbê IU/mL zawiesi-

ny (10). Niestety, strategiê tak¹ mo¿na stosowaæ jedynie w przypadku genów re-

porterowych, do których nale¿y �-galaktozydaza czy RFP. W celu okreœlenia miana

wektorów zawieraj¹cych inne transgeny, konieczne jest u¿ycie bardziej uniwersal-

nej metody.


BIOTECHNOLOGIA 3 (78) 98-122 2007 119

Podstawowe znaczenie podczas oznaczania miana metodami biologicznymi ma-

j¹ warunki infekcji. W zale¿noœci od czasu adsorpcji wektora, objêtoœci medium,

kondycji komórek oraz sposobu przygotowania i podania rozcieñczeñ zawiesiny wi-

rusowej na komórki, wyniki oznaczania miana mog¹ siê diametralnie zmieniæ (10).

Dlatego w prezentowanych badaniach, starano siê (o ile specyfika metody na to po-

zwala³a) utrzymaæ takie same warunki infekcji, jak podczas testów barwienia wykry-

waj¹cego aktywnoœæ �-galaktozydazy. Stosowano zatem ten sam czas adsorpcji

wektora w minimalnej objêtoœci medium (1,5 h) tak¹ sam¹ 48 h inkubacjê w wiêk-

szej objêtoœci medium.

Spoœród porównywanych technik, najbardziej podobn¹ do oznaczania miana za

pomoc¹ barwienia wykrywaj¹cego aktywnoœæ �-galaktozydazy in situ jest metoda

polegaj¹ca na immunohistochemicznej detekcji kapsydów wirusowych, a konkret-

nie jednego z bia³ek kapsydu – heksonu. Mo¿na j¹ przeprowadzaæ stosuj¹c zestaw

odczynników dostêpny pod komercyjn¹ nazw¹ Adeno-X™ Rapid Titer ELISA Kit.

Opiera siê ona na za³o¿eniu, ¿e zainfekowana komórka (wykazuj¹ca obecnoœæ kap-

sydu wirusowego), jest dowodem na funkcjonalnoœæ wirionu. Nale¿y jednak braæ

pod uwagê mo¿liwoœæ wejœcia do komórki równie¿ wirionów defektywnych, sk³a-

daj¹cych siê z pustych kapsydów, a tym samym – zawy¿enia miana zawiesiny AdV.

Jednak¿e na podstawie uzyskanych przez nas danych wynika (rys. 9), ¿e istnieje bar-

dzo dobra korelacja miêdzy metod¹ immunohistochemiczn¹ a barwieniem wykry-

waj¹cym aktywnoœæ �-galaktozydazy in situ. Nie zaobserwowaliœmy zawy¿ania war-

toœci miana z powodu pustych wirionów, a równoczesne oznaczanie miana tej sa-

mej zawiesiny wirusowej dwoma omówionymi metodami da³o prawie identyczne

wyniki (np. barwienia �-gal in situ: 5,7 × 106; ELISA: 3,7 × 106).

Próby oznaczenia miana za pomoc¹ tradycyjnych testów, bazuj¹cych na obser-

wacji efektu cytopatycznego (5,7,10) nie przynosi³y ju¿ tak zgodnych wartoœci.

W przypadku PFA, etap pokrywania komórek roztworem agarozy, niezbêdny do

ograniczenia dyfuzji namno¿onych wirionów, jest na tyle k³opotliwy, a wyniki tak

trudne do interpretacji, ¿e praktycznie uniemo¿liwi³o to stosowanie tej metody

(rys. 14). Druga z tradycyjnych metod, EPDA, okaza³a siê przede wszystkim testem

niezwykle subiektywnym. Replikacja AdV w komórkach HEK293 podczas oznaczania

miana powoduje ich œmieræ i uwolnienie wirionów, a powtarzalne rundy tych wyda-

rzeñ daj¹ w efekcie widoczn¹ ³ysinkê, bêd¹ca dowodem na pojawienie siê efektu

CPE (10). W zale¿noœci od tego, czym dla osoby oznaczaj¹cej miano jest stwierdze-

nie „komórki maj¹ce efekt CPE” (por. rys. 10), wyniki oznaczania tej samej zawiesiny

wektorowej mog¹ byæ odmienne (rys. 12). Jednoczeœnie trudno jest okreœliæ, które

z kryteriów rozpoznania CPE w do³kach jest lepsze – czy to zgodne z procedur¹

i nakazuj¹ce zliczanie ka¿dej ³ysinki, czy to, które bazuje jedynie na tych do³kach,

gdzie wygl¹d ³ysinki nie pozostawia w¹tpliwoœci co do jej wirusowego pocho-

dzenia.

Trudno jest ponadto spe³niæ kolejne kryterium wymagane do prawid³owego

przeprowadzenia testu EPDA, a mianowicie 10-dniowy czas trwania eksperymentu,



konieczny do w³aœciwego oznaczenia miana. Wczeœniej bowiem pojawia siê efekt

cytopatyczny w do³kach kontrolnych, spowodowany przegêszczeniem komórek.

Dlatego nasze wyniki s¹ zani¿one w porównaniu z oznaczeniem miana za pomoc¹

barwienia wykrywaj¹cego aktywnoœæ �-galaktozydazy in situ. Jednoczeœnie pokazuj¹

jednak, jak bardzo zwiêkszaj¹ siê oznaczane wartoœci w trakcie trwania ekspery-

mentu, na skutek drugorzêdowych infekcji AdV wyprodukowanymi podczas samego

oznaczania miana, co potwierdza dotychczasowe doniesienia na ten temat (10).

Najwiêksz¹ wad¹ testu EDPA jest jednak pojawianie siê licznych fa³szywie pozy-

tywnych i fa³szywie negatywnych wyników (rys. 13). W dotychczasowych doniesie-

niach na ten temat sugeruje siê, ¿e mo¿liwa jest ekspresja transgenu w zainfekowa-

nej komórce, przy jednoczesnym braku efektu cytopatycznego w postaci ³ysinki

(25). W prezentowanych badaniach w pe³ni potwierdza siê tak¹ mo¿liwoœæ. Dodat-

kowe barwienie na �-galaktozydazê po zakoñczeniu testu ujawni³o liczne przypadki

CPE negatywnych studzienek, wykazuj¹cych ekspresjê �-galaktozydazy oraz nawet

liczniejsze przypadki, gdzie obserwowane naruszenie warstwy komórek, okreœlane

jako CPE, mia³o niewirusowe pochodzenie (brak ekspresji �-gal). Wszystko to po-

twierdza, ¿e metoda EPDA jest nie tylko niezwykle subiektywna, ale równie¿ nie-

miarodajna, dlatego trudno j¹ u¿ywaæ jako metodê z wyboru do mianowania AdV.

Podobne wnioski by³y formu³owane tak¿e we wczeœniejszych pracach (18).

Oprócz metod mierz¹cych biologiczn¹ aktywnoœæ AdV istnieje wiele sposobów

oznaczania liczby cz¹stek wirusowych bez okreœlania jaki jej procent to wektory

w pe³ni funkcjonalne (10-12,14). Jednym z najpopularniejszych i najdok³adniejszych

testów tego typu jest oznaczenie liczby kopii DNA wektora za pomoc¹ reakcji qPCR

(13,14). W prezentowanych przez nas doœwiadczeniach potwierdzono wczeœniejsze

doniesienia na temat czu³oœci, precyzji i szybkoœci tej metody. Niestety, pokazuj¹

one tak¿e, ¿e wyniki otrzymane na podstawie reakcji PCR (tu: 1,8 × 109 VP/mL)

mog¹ nie byæ w pe³ni zgodne z mianem zawiesiny wirusowej oznaczonym za po-

moc¹ testów biologicznych (tu: 1 × 108 IU/mL). Podobne rozbie¿noœci miêdzy war-

toœciami IU a VP by³y obserwowane tak¿e przez innych badaczy (14). Przyczyn¹ nie-

zgodnoœci s¹ zapewne kopie wirusowego DNA niezapakowane w funkcjonalne kap-

sydy. Mimo to metoda PCR w czasie rzeczywistym posiada kilka niezaprzeczalnych

zalet – krótki czas trwania (ok. 3 h, podczas gdy inne metody wymagaj¹ od 2 do 14

dni), brak koniecznoœci specjalnego przygotowywania próbki oraz brak etapu infek-

cji komórek. Oznaczaj¹c miano t¹ metod¹ nale¿y jednak zwracaæ uwagê na sposób

w jaki zosta³a przygotowana próbka zawiesiny AdV, a zw³aszcza czy zosta³a ona

wczeœniej oczyszczona i w jaki sposób inaktywowano bia³ka komórkowe i wiruso-

we. Mo¿e to bowiem mieæ du¿y wp³yw na wynik reakcji (14).

Podsumowuj¹c, w przedstawionych doœwiadczeniach nad optymalizacj¹ produk-

cji wektorów AdV pokazano, ¿e nawet poprzez proste modyfikacje poszczególnych

etapów mo¿na znacz¹co zwiêkszyæ wydajnoœæ metody i uzyskaæ wysokie miano

wektorów. W przeprowadzonych badaniach porównawczych mogliœmy tak¿e wy-

braæ wiarygodne i szybkie testy do oznaczania miana wektorów w otrzymanej za-


BIOTECHNOLOGIA 3 (78) 98-122 2007 121

wiesinie. Wektory takie mog¹ byæ nastêpnie z powodzeniem u¿ywane do uzyskiwa-

nia wysokiej ekspresji transgenu w hodowlach komórkowych, a po dodatkowym

oczyszczeniu mog¹ byæ równie¿ wykorzystywane w doœwiadczeniach in vivo.

Praca finansowana z projektów 2 P04 016 26, PBZ-KBN 107 P04 2004 i PBZ-KBN 105 P05 2004 (Mini-

sterstwo Nauki i Szkolnictwa Wy¿szego). Magdalena Stopa otrzymuje stypendium Sapere Auso z Ma³o-

polskiej Fundacji Stypendialnej, a Agnieszka JaŸwa jest stypendystk¹ Funduszu im. Stanis³awa Estrei-

chera. Alicja Józkowicz jest beneficjentem Wellcome Trust (International Senior Research Fellowship).

Literatura

1. Amalfitano A., Parks R. J., (2002), Curr. Gene Ther., 2, 111-133.

2. Amafiltano A., (2004), Methods, 33, 173-178.

3. Wang Y., Huang S., (2000), Drug Discov. Today, 5, 10-16.

4. Danthinne X., Imepriale M. J., (2000), Gene Ther., 7, 1707-1714.

5. Nadeau I., Kamen A., (2003), Biotechnol. Adv., 20, 475-489.

6. Mizuguchi H., Kay M.A., Hayakawa T., (2001), Adv. Drug Deliv. Rev., 52, 165-176.

7. Kamen A., Henry O., (2004), J. Gene Med., 6, S184-S192.

8. Hehir K. M., Armentano D., Cardoza L. M., Choquette T. L., Berthelette P. B., White G. A., Couture L.

A., Everton M. B., Keegan J., Martin J. M., Pratt D. A., Smith M. P., Smith A. E., Wadsworth S. C.,

(1996), J. Virol., 70, 8459-8467.

9. Murakami P., Havenga M., Fawaz F., Vogels R., Marzio G., Pungor E., Files J., Do L., Goudsmit J., Mc-

Caman M., (2004), J. Virol., 78, 6200-6208.

10. Mittereder N., March K. L., Trapnell B. C., (1996), J. Virol., 70, 7498-7509.

11. Maizel J. V., White D. O., Scharff M. D., (1968), Viriology, 36, 115-125.

12. Murakami P., McCaman M. T., (1999), Anal. Biochem., 274, 283-288.

13. Ma L., Bluyssen H. A. R., de Raeymaeker M., Laurysens V., van der Beek N., Pavliska H., van Zon-

neveld A.-J., Tomme P., van Es H. H. G., (2001), J. Virol. Methods, 93, 181-188.

14. Wang F., Puddy A. C., Mathis B. C., Montalvo A. G., Louis A. A., McMackin J. L., Xu J., Zhang Y., Tan

C. Y., Schofield T. L., Wolf J. J., Lewis J. A., (2005), Vaccine, 23, 4500-4508.

15. Lehmberg E., Traina J. A., Chakel J. A., Chang R.-J., Parkman M., McCaman M. T., Murakami P. K., La-

hidji V., Nelson J. W., Hancock W. S., Nestaas E., Pungor Jr. E., (1999), J. Chromatogr. B Biomed. Sci.

Appl., 732, 411-423.

16. Blanche F., Cameron B., Barbot A., Ferrero L., Guillemin T., Guyot S., Somarriba S., Bisch D., (2000),

Gene Ther., 7, 1055-1062.

17. Park M. T., Lee G. M., (2000), Bioprocess Eng., 22, 403-406.

18. Nyberg-Hoffman C., Shabram P., Li W., Giroux D., Aguilar-Cordova E., (1997), Nat. Med., 3, 808-811.

19. Hutchins B., Sajjadi N., Seaver S., Shepherd A., Bauer S. R., Simek S., Carson K., Aguilar-Cordova E.,

(2000), Mol. Ther., 2, 532-534.

20. Tamanoi F., Stillman B. W., (1982), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 79, 2221-2225.

21. Józkowicz A., Dulak J., Guevera I., Wybrañska I., Dembiñska-Kieæ A., (1999), Clin. Chim. Acta, 288,

1-19.

22. Park M. T., Lee M. S., Kim S. H., Jo E.-C., Lee G. M., (2004), Appl. Microbiol. Biotechnol., 65,

553-558.

23. Yang Y., Li Q., Ertl H. C., Wilson J. M., (1995), J. Virol., 69, 2004-2015.

24. Muruve D. A., Barnes M. J., Stillmann I. E., Libermann T. A., (1997), Hum. Gene Ther., 10, 965-976.

25. Kremer E. J., (2004), J. Gene Med., 6, S139-S151.



Documents

Produkcja wektorów adenowirusowych pierwszej generacji – …m.pfb.info.pl/files/kwartalnik/3_2007/stopa-jazwa.pdf · 2013. 12. 1. · siê na przyk³ad na wizualnej ocenie efektu