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UNIVERSIDADE REGIONAL INTEGRADA DO ALTO URUGUAI E DAS MISSÕES URI ERECHIM
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
GUILHERME DE SOUZA HASSEMER
PRODUÇÃO E RECUPERAÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO
(P(3HB)) POR Bacillus megaterium ATCC 14581 EMPREGANDO
COPRODUTOS DA AGROINDÚSTRIA
ERECHIM, RS
2021
GUILHERME DE SOUZA HASSEMER
PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO (P(3HB)) POR Bacillus
megaterium ATCC 14581 EMPREGANDO COPRODUTOS DA
AGROINDÚSTRIA E RECUPERAÇÃO DO POLÍMERO VIA TECNOLOGIA
SUPERCRÍTICA
Tese apresenta como quesito parcial
à obtenção do grau de Doutor, pelo
curso de Pós-Graduação em
Engenharia de Alimentos da
Universidade Regional Integrada do
Alto Uruguai e das Missões – Campus
Erechim.
Orientadores: Profª. Drª. Eunice Valduga
Prof. Dr. Alexander Junges
ERECHIM-RS
2021
H355p Hassemer, Guilherme de Souza
Produção e recuperação de polihidroxibutirato (P(3HB)) por Bacillus megaterim
ATCC 14581 empregando coprodutos da agroindústria / Guilherme de Souza
Hassemer. - 2021.
136 f.
Tese (doutorado) – Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das
Missões, Erechim, 2021.
“Orientação: Profa Dra Eunice Valduga; Prof. Dr. Alexander Junges.”
1. Materiais plásticos 2. Biopolímero 3. Recuperação / tecnologia 4. Fermentação
I. Título
C.D.U.: 664
Catalogação na fonte: bibliotecária Sandra Milbrath CRB 10/1278
GUILHERME DE SOUZA HASSEMER
PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO (P(3HB)) POR Bacillus
megaterium ATCC 14581 EMPREGANDO COPRODUTOS DA
AGROINDÚSTRIA E RECUPERAÇÃO DO POLÍMERO VIA TECNOLOGIA
SUPERCRÍTICA
Tese apresenta como quesito parcial
à obtenção do grau de Doutor, pelo
curso de Pós-Graduação em
Engenharia de Alimentos da
Universidade Regional Integrada do
Alto Uruguai e das Missões – Campus
Erechim.
Erechim, 04 de março de 2021.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Profª. Drª. Eunice Valduga
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões
_________________________________________
Prof. Dr. Alexander Junges
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões
_________________________________________
Prof. Dr. Yen-Han Lin
University of Saskatchewan
_________________________________________
Profª. Drª. Jamile Zeni
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões
_________________________________________
Drª. Rosicler Colet
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões
_________________________________________
Prof. Dr. Elton Franceschi
Universidade Tiradentes
_________________________________________
Profª. Drª. Helen Treichel
Universidade Federal da Fronteira Sul
Dedico ao meu pai Gerson, à
minha mãe Maria e à minha irmã
Gabriella, por todo o apoio, incentivo
e amor incondicional.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me dar perseverança, por servir como âncora
mesmo quando surgiam sentimentos de incapacidade e de desistência. Por
permitir que eu superasse todos os desafios e por me abençoar com a coragem
necessária.
Aos meus pais, pelo total apoio emocional e financeiro, pelo carinho,
preocupação e por todos os sacrifícios que fizeram por mim, desde o início desta
jornada. Por sempre estarem lá durante as dificuldades e por compreenderem
os momentos de ausência e irritabilidade. Pelo amor e doação.
Aos meus orientadores, Eunice Valduga e Alexander Junges, que me
ampararam com seus conhecimentos e os compartilharam da forma mais
genuína, guiando meus passos nesta jornada.
À Ilizandra Aparecida Fernandes e Rosicler Colet, pelo trabalho conjunto
e importantíssima participação na realização das análises e organização dos
resultados deste estudo.
À Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões, por
conceder bolsa de estudos e permitir que me dedicasse a ele de forma exclusiva,
alcançando meu objetivo.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, por
ter oportunizado doutorado sanduíche, permitindo que aprendesse com outros
profissionais e que reconhecesse ainda mais os esforços dos brasileiros na
pesquisa científica.
Ao doutor Yen-Han Lin, por ter me recebido na universidade de
Saskatchewan, abrindo meus olhos para outras realidades, e à Raíza de Almeida
Mesquita, que dividiu seu tempo comigo no Brasil e no Canadá, estendendo a
mão quando precisei, me fazendo companhia e proporcionando momentos de
descontração.
“To these memories I will hold With your blessing I will go
To turn at last to paths that lead home
And though where the road then takes me
I cannot tell We came all this way
But now comes the day To bid you farewell”
(Billy Boyd)
Resumo
O emprego de materiais plásticos na substituição de papeis e vidro tornou-se uma base da sociedade moderna. Uma possível alternativa no combate ao acúmulo de plástico e seus resíduos é a produção de biopolímeros como os polihidroxialcanoatos (PHAs). Entre os PHAs, poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) é um dos mais estudados, devido à sua aplicabilidade em uma grande gama de processos variados. Bacillus megaterium é uma bactéria produtora de P(3HB) que pode utilizar grande variedade de fontes de carbono para sintetizar P(3HB) e demonstra grande resistência à pressão osmótica e temperatura. A produção de P(3HB) ainda é dispendiosa, portanto, associar a utilização de materiais de baixo custo na sua produção possibilitaria reduzir os custos do processo e favorecer sua aplicação em larga escala. Há poucos estudos que consideram a utilização de subprodutos como água residual de confeitaria (EIB), água de cozimento arroz (APA) e água de maceração de milho (AMM) e sua viabilidade na produção de PHAs, entretanto, dados indicam que tais insumos podem ser empregados com sucesso como meios de cultura para microrganismos. A fim de testar esta hipótese, B. megaterium ATCC 14581 foi cultivado em frascos agitados e em biorreator sob diferentes condições de agitação e aeração, utilizando meio mineral adicionado de EIB, APA e AMM. Testes iniciais envolvendo o uso potencial de dióxido de carbono (CO2) supercrítico na obtenção de partículas de P(3HB) também foram realizados. O potencial de oxirredução (POR) e seu impacto sobre as culturas foi testado no laboratório de rotas metabólicas do departamento de engenharia química e biológica da Universidade de Saskatchewan (Saskatoon, SK, Canadá). Em condições maximizadas, pode-se obter 7,55 g·L-1 de biomassa total, contendo 50,07 % de P(3HB) (3,78 g·L-1). Parâmetros cinéticos foram avaliados em relação às culturas, obtendo-se maior produtividade (0,146 g·L·h-1) após 20 h de cultivo. Os resultados obtidos através dos testes sustentam a possibilidade de que EIB e APA podem ser utilizados como meio de cultura na produção de P(3HB). Os perfis de POR influenciam grandemente no metabolismo celular, podendo ser ferramentas úteis no controle e intensificação da produção de P(3HB) em diferentes condições de fermentação. Considerando a recuperação do polímero sob tecnologia supercrítica, dados preliminares indicam que tal sistema apresenta grande potencial na produção/recuperação de P(3HB), mas não de forma individual, devendo ser associado ao uso de co-solventes ou tratamento prévio, a fim de danificar adequadamente as membranas celulares, permitindo que os grânulos de P(3HB) sejam extraídos. Palavras-chave: polihidroxibutirato, biopolímero, fermentação, subprodutos, recuperação/tecnologia supercrítica.
Abstract
Plastics' use to replace materials such as paper and glass has become a staple
of modern society. Possible alternatives to combat plastic accumulation are
biopolymers' production, such as polyhydroxyalkanoates (PHAs), which tend to
be the most studied. Among the PHAs, poly(3-hydroxybutyrate) (P(3HB)) is one
of the most studied due to its applicability in a wide range of different processes.
Bacillus megaterium is a P(3HB) producing bacterium which can utilize a wide
range of carbon sources to synthesize P(3HB) and displays high resistance to
osmotic pressure and temperature. P(3HB) production is still expensive. As such,
the use of low-cost material could reduce the process's overall cost and improve
its large-scale application potential. There are few studies regarding the viability
of confectionery wastewater (EIB), rice parboiling water (APA), and corn steep
water (AMM) in PHA production. However, data suggests they might be
successfully used as culture media for microorganisms. To test this hypothesis,
cultures of B. megaterium ATCC 14581 were conducted in shake flasks and
bioreactor batches with different agitation and airflow conditions using mineral
medium added with EIB, APA, and AMM. The impact of oxygen redox potential
(POR) on the cultures was tested at the Metabolic Pathways Laboratory at the
Department of Chemical and Biological Engineering at the University of
Saskatchewan (Saskatoon, SK, Canada). Furthermore, preliminary tests
regarding the potential use of supercritical carbon dioxide (CO2) to recover
P(3HB) particles were also performed. Under maximized conditions, it was
possible to obtain 7.55 g·L-1 of dry cell biomass, with 50.07% P(3HB) content
(3.78 g·L-1). Kinetic parameters of the maximized culture were also assessed,
with the highest productivity (0.146 g·L·h-1) being found after 20 h of culture.
Results found in the tests indicate that EIB and APA can be used as culture media
in P(3HB) production; however, further studies are necessary to optimize the
process thoroughly, as well as to find alternatives to reduce the amount of
residual total organic carbon (COT) found at the end of the cultures. POR profiles
played a large role in cell metabolism, indicating that they may be a useful tool to
control and increase the P(3HB) production under different fermentation
conditions. Regarding polymer via supercritical technology, preliminary data
indicates that the system has the potential to be applied to P(3HB) recovery, but
not on its own, requiring either the use of co-solvents or preliminary treatment to
successfully damage the cell's membrane and allow for P(3HB) granules to be
extracted.
Keywords: Polyhydroxybutyrate, Biopolymer, Fermentation, Agroindustry
Byproducts, Supercritical Recovery.
Lista de Figuras
Figura 1 – Classificação de polímeros quanto à biodegradabilidade e forma
obtenção ......................................................................................................... 24
Figura 2 – Morfologia do grânulo de P(3HB) ................................................... 28
Figura 3 – Esquema de rotas metabólicas para a produção de PHAs de cadeia
curta ................................................................................................................ 29
Figura 4 – Esquema do metabolismo para produção de PHAs de cadeia média
........................................................................................................................ 29
Figura 5 – Estrutura química do polihidroxibutirato ......................................... 33
Figura 6 – Grânulos de P(3HB) em B. megaterium após 4 h (a), 12 h (b) e 21 h
(c). As setas indicam fraturas na parede celular devido ao tamanho dos grânulos
de P(3HB) ....................................................................................................... 33
Figura 7 – Comparação morfológica entre células de B. megaterium (amarelas)
e Escherichia coli (laranjas) ............................................................................ 37
Figura 8 – Coprodutos agroindustriais utilizados na produção do biopolímero 53
Figura 9 – Separação de fases de diferentes amostras. Controle negativo (A),
amostras com células (B e C) ......................................................................... 62
Figura 10 – Diagrama do sistema de extração por fluído supercrítico ............. 63
Figura 11 – Comportamento de B. megaterium após 96 h de cultivo em meio
sintético ........................................................................................................... 68
Figura 12 – Comportamento de B. megaterium em termos de pH (A),
concentração do biopolímero, biomassa e consumo de substratos (B) após 36 h
de cultivo em meio mineral acrescido de sacarose e fonte de nitrogênio ........ 69
Figura 13 – Concentração de carbono orgânico e nitrogênio total após 28 h de
cultivo para planejamento DCCR 23 utilizando coprodutos brutos (planejamento
1) .................................................................................................................... 72
Figura 14 – Diagrama de Pareto com o efeito estimado (valor absoluto) dos
diferentes coprodutos agroindustriais em relação a massa seca (A), pH (B),
P(3HB) (C) e P(3HB) % (D) (Planejamento 1) ................................................. 75
Figura 15 – Concentração de carbono orgânico e nitrogênio total após 28 h de
cultivo para planejamento DCCR 22 utilizando coprodutos tratados
(planejamento 2) ............................................................................................. 76
Figura 16 – Diagrama de Pareto com o efeito estimado (valor absoluto) dos
diferentes coprodutos agroindustriais em relação a massa seca (A), pH (B),
P(3HB) (C) e P(3HB) % (D) (Planejamento 2) ................................................. 80
Figura 17 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo
de substrato (COT e NT) (B) em meio de cultura composto por EIB (60 %) e APA
(40 %) em frascos agitados ............................................................................. 83
Figura 18 – Produtividade global de P(3HB) ao longo da bioprodução em frascos
agitados com meio mineral (A) e com meio composto por EIB (60 %) e APA
(40 %) (B) ....................................................................................................... 85
Figura 19 – Relação entre a produção de P(3HB) e a produção de células (YP/X)
ao longo da bioprodução em frascos agitados com meio mineral (A) e com meio
composto por EIB (60 %) e APA (40 %) (B). ................................................... 87
Figura 20 – Evolução da velocidade específica de crescimento (µx) e da
produtividade em célula (Px) ao longo da bioprodução em frascos agitados com
meio mineral (A) e com meio composto por EIB (60 %) e APA (40 %) (B) ...... 88
Figura 21 – Fatores de conversão de COT e NT em produto ao longo da
bioprodução em frascos agitados com meio mineral (A) e com meio composto
por EIB (60 %) e APA (40 %) (B) .................................................................... 89
Figura 22 – Fatores de conversão de COT e NT em células ao longo da
bioprodução em frascos agitados com meio mineral (A) e com meio composto
por EIB (60 %) e APA (40 %) (B) .................................................................... 90
Figura 23 – Diagrama de Pareto com os efeitos estimados (valor absoluto) de
agitação e taxa de aeração para a proporção de P(3HB) em relação a massa
seca (planejamento 3). .................................................................................... 94
Figura 24 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para a produção
de massa seca em função da agitação e taxa de aeração do sistema
(planejamento 3) ............................................................................................. 95
Figura 25 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para a produção
de P(3HB) em função da agitação e taxa de aeração do sistema (planejamento
3) .................................................................................................................... 97
Figura 26 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo
de substrato (COT e NT) (B) sob condições maximizadas de produção em
biorreator batelada simples. ............................................................................ 99
Figura 27 – Produtividade global de P(3HB) ao longo da bioprodução em
biorreator batelada simples. ...........................................................................101
Figura 28 – Relação entre a produção de P(3HB) e a produção de células (YP/X)
ao longo da bioprodução em biorreator batelada simples. .............................102
Figura 29 – Evolução da velocidade específica de crescimento (µx) e da
produtividade em célula (Px) ao longo da bioprodução em biorreator batelada
simples. ..........................................................................................................103
Figura 30 – Fatores de conversão de COT e NT em produto ao longo da
bioprodução em biorreator batelada simples ..................................................104
Figura 31 – Fatores de conversão de COT e NT em células ao longo da
bioprodução em biorreator batelada simples ..................................................105
Figura 32 – Cinética de crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo de
substrato (COT e NT) e POR em biorreator batelada simples ........................108
Figura 33 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo
de substrato (COT e NT) e POR (B) em biorreator batelada simples (0 mV POR)
.......................................................................................................................109
Figura 34 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo
de substrato (COT e NT) e POR (B) em biorreator batelada simples (-20 mV
POR) ..............................................................................................................110
Figura 35 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo
de substrato (COT e NT) e POR (B) em biorreator batelada simples (-40 mV
POR) ..............................................................................................................110
Figura 36 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo
de substrato (COT e NT) e POR (B) em biorreator batelada simples (0 mV POR,
pH mínimo 7,0) ..............................................................................................112
Figura 37 – Recuperação cumulativa de P(3HB) durante o período de
recuperação por CO2 supercrítico utilizando etanol (A) e propanol (B) como co-
solventes ........................................................................................................114
Lista de Tabelas
Tabela 1 –Visão geral de algumas estratégias de produção e recuperação de
PHAs............................................................................................................... 32
Tabela 2 – Propriedades físico-químicas da água de parboilização de arroz .. 41
Tabela 3 – Composição do meio mineral e solução de micronutrientes .......... 51
Tabela 4 – Níveis das variáveis utilizadas no planejamento DCCR 23 para
produção de P(3HB) (planejamento 1) ............................................................ 55
Tabela 5 – Níveis das variáveis utilizadas DCCR 22 para produção de P(3HB)
(planejamento 2) ............................................................................................. 55
Tabela 6 – Níveis das variáveis independentes utilizadas no planejamento
fatorial 22 para produção de P(3HB) (planejamento 3) .................................... 56
Tabela 7 – Concentração de carbono orgânico total (COT) e nitrogênio total (NT)
dos coprodutos agroindustriais ....................................................................... 65
Tabela 9 – Composição mineral (Ca, Cu, Fe, Na, Mg e Zn) dos coprodutos
agroindustriais ................................................................................................. 66
Tabela 10 – Matriz do planejamento DCCR 23 (valores reais e codificados) e
respostas em termos de massa seca, P(3HB) e pH (planejamento 1) ............ 73
Tabela 11 – Matriz do planejamento DCCR 22 (valores reais e codificados) e as
respostas em termos de massa seca, P(3HB) e pH (Planejamento 2) ............ 77
Tabela 12 – Concentração de biomassa e P(3HB) em cultivos do
planejamento DCCR 23 utilizando dois lotes de AMM tratada (Planejamento 2)
........................................................................................................................ 78
Tabela 13 – Concentração de massa seca e P(3HB) nos cultivos variando-se a
composição de EIB e APA suplementado com meio mineral .......................... 81
Tabela 14 – Concentração de massa seca, P(3HB) e pH para cultivos utilizando
diferentes proporções de EIB e APA ............................................................... 82
Tabela 15 – Máximos parâmetros cinéticos e estequiométricos da bioprodução
em frascos agitados com meio mineral e com meio composto por EIB (60 %) e
APA (40 %) ..................................................................................................... 92
Tabela 16 – Matriz do planejamento fatorial 22 (valores reais e codificados) -
planejamento 3 e as respostas em termos de massa seca e P(3HB). ............. 92
Tabela 23 – Concentração de massa seca e P(3HB) para cultivos em biorreator
a 500, 600 e 700 rpm ...................................................................................... 97
Tabela 24 – Máximos parâmetros cinéticos e estequiométricos da bioprodução
em biorreator batelada simples ......................................................................106
Tabela 18 - Recuperação de P(3HB) via extração por fluido supercrítico
utilizando etanol como co-solvente ................................................................113
Tabela 19 - Recuperação de P(3HB) via extração por fluido supercrítico
utilizando propanol como co-solvente ............................................................114
Tabela 20 – Coeficientes de regressão, erro padrão e valores t e p do
planejamento fatorial 22 em biorreator para massa seca (planejamento 3) ....135
Tabela 21 – Análise de variância do planejamento fatorial 22 em biorreator para
massa seca (planejamento 3) ........................................................................135
Tabela 22 – Coeficientes de regressão, erro padrão e valores t e p do
planejamento fatorial 22 em biorreator para concentração de P(3HB)
(planejamento 3) ............................................................................................135
Tabela 23 – Análise de variância do planejamento fatorial 22 em biorreator para
P(3HB) (planejamento 3) ...............................................................................135
Tabela 24 – Coeficientes de regressão, erro padrão e valores t e p do
planejamento fatorial 22 em biorreator para concentração de P(3HB) em função
da massa seca (planejamento 3) ...................................................................135
Tabela 25 – Análise de variância do planejamento fatorial 22 em biorreator para
massa a P(3HB) em função da massa seca (planejamento 3) .......................136
Tabela 26 – Respostas para massa seca, P(3HB) e pH para cultivos utilizando
diferentes proporções de EIB e APA ..............................................................136
Tabela 27 – Análise de variância (ANOVA) sem efeitos não significativos para a
concentração de massa seca (planejamento 3) .............................................137
Tabela 28 – Análise de variância (ANOVA) sem efeitos não significativos para a
concentração de P(3HB) (planejamento 3) ....................................................137
Tabela 29 – Análise de variância (ANOVA) para a concentração de P(3HB) em
função da massa seca (planejamento 3) ........................................................137
Lista de Abreviações
3-HP Ácido hidroxipropiônico
3HA-CoAs 3-hidroxiacil-CoAs
3HB-CoA (R)-3-hidroxibutiril coenzima A
a Área da interface líquido-gás
Acetil-CoA Acetil coenzima A
AMM Água de maceração de milho
APA Água de parboilização de arroz
C Concentração de O2 no meio de cultura
C* Solubilidade de O2 no meio de cultura
Co-A Coenzima A
𝑑𝐶
𝑑𝑡 Taxa de acúmulo de oxigênio na fase líquida
DO Oxigênio dissolvido
EIB Efluente da indústria de balas e confeitos
HA-CoAs Hidroxiacil-CoAs
kL Coeficiente de transferência de massa na fase líquida
kL, s-1 Transferência de massa da fase líquida
kLa Coeficiente volumétrico de transferência de massa
P(3HB)-co-P(3HV) Polihidroxibutirato-co-valerato
P(3HV) Polihidroxivalerato
PGA Ácido poliglicólico
PhaC PHA sintase
PLA Ácido polilático
TTO Taxa de transferência de oxigênio
rx Velocidade de crescimento de células
rn Velocidade de consumo de nitrogênio
rc Velocidade de consumo de carbono orgânico
rp Velocidade de produção de P(3HB)
YP/C Fator de conversão de carbono orgânico global em
P(3HB)
YP/N Fator de conversão de nitrogênio global em P(3HB)
YX/C Fator de conversão de carbono orgânico global em
células
YX/N Fator de conversão de nitrogênio global em células
YP/X Relação entre a produção de P(3HB) e a produção de
células global
XVII
Sumário
1 Introdução .............................................................................................. 19
2 Objetivos ................................................................................................ 22
3 Revisão Bibliográfica ............................................................................. 23
3.1 Polímeros naturais .............................................................................. 23
3.2 Polímeros biodegradáveis .................................................................. 25
3.2.1 Polihidroxialcanoatos ............................................................... 27
3.2.2 Polihidroxibutirato ..................................................................... 33
3.2.3 Bacillus megaterium na produção de P(3HB) .......................... 36
3.3 Uso de coprodutos da indústria de alimentos na síntese de PHAs ..... 39
3.4 Efeitos do oxigênio em sistemas fermentativos .................................. 41
3.4.1 Controle de POR via energia externa ....................................... 42
3.4.2 Controle de POR por via química ............................................. 43
3.4.3 Controle de POR por aspersão de gases ................................. 43
3.4.4 POR e oxigênio dissolvido ........................................................ 44
3.4.5 Efeitos do oxigênio o cultivo de Bacillus sp. .......................... 44
3.5 Recuperação de biopolímeros ............................................................ 46
3.5.1 Digestão celular ......................................................................... 46
3.5.2 Extração por solvente ............................................................... 46
3.5.3 Tratamento enzimático .............................................................. 47
3.5.4 Tratamento ácido ....................................................................... 47
3.5.5 Ação mecânica .......................................................................... 48
3.5.6 Tecnologia supercrítica ............................................................ 48
3.5.7 Tecnologia de ultrassom........................................................... 49
3.6 Considerações finais sobre o estado da arte ...................................... 49
4 Material e Métodos ................................................................................. 51
4.1 Micro-organismo ................................................................................. 51
4.2 Coprodutos Agroindustriais ................................................................ 51
4.3 Pré-tratamento dos coprodutos .......................................................... 52
4.4 Bioprodução de P(3HB) em frascos agitados ..................................... 53
4.4.1 Ativação do micro-organismo .................................................. 53
4.4.2 Elaboração do pré-inóculo para os diferentes meios de
cultura........................................................................................................53
4.4.3 Cultivo inicial em meio mineral ................................................ 54
XVIII
4.4.4 Efeitos da composição do meio à base de coprodutos
agroindustriais na produção de P(3HB) ............................................... 54
4.4.5 Maximização da bioprodução ................................................... 55
4.5 Bioprodução de P(3HB) em biorreator batelada simples .................... 56
4.6 Parâmetros cinéticos e estequiométricos da bioprodução .................. 57
4.6.1 Velocidades instantâneas e específicas globais ..................... 57
4.6.2 Fatores de conversão global .................................................... 58
4.6.3 Produtividade global ................................................................. 59
4.7 Efeito do potencial de oxirredução na produção de P(3HB) ................ 59
4.8 Metodologia Analítica ......................................................................... 60
4.8.1 Densidade .................................................................................. 60
4.8.2 Carbono orgânico e nitrogênio total ........................................ 60
4.8.3 Minerais totais e componentes minerais ................................. 60
4.8.4 Biomassa total ........................................................................... 61
4.8.5 Recuperação de P(3HB) via extração química ........................ 61
4.8.6 Recuperação de P(3HB) por tecnologia supercrítica .............. 62
4.8.7 Quantificação de P(3HB) ........................................................... 63
4.9 Avaliação estatística dos resultados ................................................... 64
5 Resultados e Discussão ........................................................................ 65
5.1 Caracterização dos coprodutos agroindustriais .................................. 65
5.2 Produção P(3HB) em frascos agitados ............................................... 68
5.2.1 Cultivos com substratos sintéticos ......................................... 68
5.2.2 Cultivos com coprodutos agroindustriais ............................... 71
5.3 Parâmetros cinéticos da bioprodução em frascos agitados ................ 84
5.4 Produção de P(3HB) em biorreator batelada simples ......................... 92
5.5 Parâmetros cinéticos da bioprodução em biorreator batelada simples 100
5.6 Avaliação do Potencial Redox na produção de P(3HB) .....................107
5.7 Recuperação de P(3HB) via fluído supercrítico .................................113
6 Conclusão .............................................................................................117
7 Referências ...........................................................................................118
8 Apêndice I ..............................................................................................135
19
1 Introdução
O emprego de polímeros derivados do petróleo para substituir
embalagens mais frágeis, como as de vidro e de papel, está extremamente
difundido atualmente. Indústrias, principalmente do ramo alimentício, detém a
maior porcentagem de utilização de embalagens plásticas, em virtude do custo
acessível, da resistência do material e da baixa interação com o produto
armazenado. Embora seja um recurso prático e barato, a problemática
envolvendo sua reutilização, reciclagem ou descarte deve ser considerada, visto
que o plástico não é facilmente decomposto e as principais vias de tratamento
destes descartes são a incineração e a reciclagem, que apresentam limitações
(ANJUM et al., 2016; LUYT; MALIK, 2019).
A incineração, libera compostos tóxicos na atmosfera, reduzindo a
qualidade do ar e contribuindo para o aumento do efeito estufa. A reciclagem,
embora seja a melhor alternativa, perde eficiência devido à dificuldade em se
classificar diferentes materiais, tornando o processo laborioso e limitado. Ainda,
o emprego de plásticos reciclados é muito restrito, uma vez que a incorporação
de corantes e coberturas no processo inicial de produção reduzem sua
empregabilidade (KHANNA; SRIVASTAVA, 2005; FERNANDES, 2013;
PAKALAPATI et al., 2018).
Dito isso, a produção de biopolímeros torna-se uma aliada capaz de
reduzir o impacto ambiental. Grande parte destes materiais são biodegradáveis
e podem ser classificados em três grupos principais: os parcialmente
biodegradáveis, produzidos com a adição de amido, sendo que, após o
descarte, o amido será rapidamente degradado por micro-organismos, porém
sua fração plástica permanecerá no ambiente; os fotobiodegradáveis, que
recebem aditivos sensíveis à radiação ultravioleta, tornando a embalagem
quebradiça quando exposta à luz solar por longos períodos, porém não induzem
quebra na cadeia polimérica, proporcionando apenas a fragmentação em
partículas menores e; os completamente biodegradáveis, que são capazes de
sofrer rupturas nas ligações entre as unidades monoméricas, principalmente
através da ação de micro-organismos e enzimas, garantindo a completa
degradação (KHANNA; SRIVASTAVA, 2005; MUTIARA et al., 2014;
PAKALAPATI et al., 2018).
20
Dentre os biopolímeros mais estudados estão os
polihidroxialcanoatos - PHAs. Os PHAs são poliésteres sintetizados por diversos
micro-organismos onde sua função principal é agir como reserva de energia para
as células. Em certas espécies é necessário que as células sejam submetidas a
uma situação de estresse devido a limitação de certos nutrientes (nitrogênio,
fósforo, oxigênio e outros) e excesso de carbono. Em outros casos, a síntese
dos PHAs ocorre ao longo do ciclo de crescimento das células (GRUMEZESCU;
HOLBAN, 2018; AL-BATTASHI; SIVAKUMAR, 2020).
Algumas das principais características que tornam os PHAs interessantes
são a sua completa biodegradabilidade por um grande número de bactérias
presentes no solo e na água, bem como, a semelhança de alguns PHAs com
diversos polímeros petroquímicos, como o polipropileno (muito utilizado na
indústria de alimentos) e alguns elastômeros (ISRANI; SHIVAKUMAR, 2013;
LIN; CHEN, 2017a; MOHAPATRA et al., 2017).
Dentre os PHAs, o polihidroxibutirato (P(3HB)) é um dos mais estudados,
uma vez que o mesmo é considerado um possível substituto de polímeros
petroquímicos em diversos setores industriais (PARK; CHOI; LEE, 2005).
Diversos gêneros de bactérias são capazes de produzir o P(3HB), contudo, um
dos gêneros com potencial de aplicação em larga escala são os Bacillus
(MOHAPATRA et al., 2017). Dentre os Bacillus, o Bacillus megaterium foi um
dos primeiros micro-organismos estudados na produção de P(3HB). Esta
espécie apresenta resistência a temperatura e pressão osmótica e é capaz de
utilizar diversos compostos como fonte de carbono, como sacarose, glicerol e
lactose (FACCIN, 2012; KUMAR et al., 2013; KAVITHA; RENGASAMY;
INBAKANDAN, 2017).
Na produção de P(3HB), tanto em escala industrial, quanto em escala
piloto e bancada, os substratos mais citados são melaços e xaropes,
principalmente derivados de cana-de-açúcar e beterraba (FACCIN et al., 2013;
WHITE; LAIRD; HUGHES, 2017; THOMAS; BALAKRISHNAN; SREEKALA,
2018).
Outro ponto ainda é o custo total de produção. Algo que tem sido muito
procurado é a utilização de coprodutos de processos industriais como matérias
primas. A utilização destes compostos se torna vantajoso para a indústria pois
21
permite agregar valor à materiais que muitas vezes são descartados ou tratados
como efluentes (KOSSEVA; RUSBANDI, 2018; PAVAN et al., 2019).
No processamento de amido de milho, um dos coprodutos gerados é a
água de maceração de milho. Este composto é rico em vitaminas, aminoácidos
e minerais. Sua aplicação é restrita, sendo muito utilizada como ingrediente na
alimentação animal. Contudo, devido a sua composição nutricional existe a
possibilidade de utilização da mesma em processos biotecnológicos (ARAÚJO
et al., 2015; COLET et al., 2017).
Mais um processo que gera um grande volume de coprodutos é a
parboilização de arroz. O efluente deste processo é rico em fósforo e nitrogênio,
porém, até o momento ainda existem poucos estudos sobre a utilização destes
coprodutos na produção de PHAs, porém ambos apresentam potencial de
aplicação como substrato para o cultivo de micro-organismos (ARAÚJO et al.,
2015; MUKHERJEE et al., 2016).
Outro setor cujos coprodutos poderiam ser empregados na biotecnologia
é o de candies e balas. De modo geral, o setor possui grande diversidade de
produtos e processos, com aproximadamente 25 empresas atuando no Brasil
(ABICAB, 2018). Os principais coprodutos da indústria vêm na forma de
efluentes, ricos em açúcares, pigmentos e/ou gorduras, o que faz com que eles
possam causar impactos graves ao meio ambiente, caso sejam descartados sem
tratamento adequado. Entretanto, a alta demanda química e bioquímica de
oxigênio, em conjunto com o grande volume de efluente gerado torna, na maioria
das vezes, o tratamento dos efluentes um processo dispendioso (MAQBOOL et
al., 2017; PAPADAKI et al., 2018).
Além do meio de cultura e fontes de carbono empregadas na produção de
P(3HB), outro fator a ser considerado é a recuperação do biopolímero, já que o
mesmo permanece amazenado no interior das células bacterianas. Os métodos
mais comuns de extração focam na utilização de solventes orgânicos, como
clorofórmio e o éter de petróleo. Resíduos destes solventes podem permanecer
no polímero e migrarem, quando o mesmo estiver em contato com um alimento
ou pele (KESSLER et al., 2001; POSADA et al., 2011). Em função disso, técnicas
alternativas de extração como digestão celular via química, enzimática,
maceração e tecnologias em sistemas pressurizados vem sendo estudadas
22
(KUNASUNDARI; SUDESH, 2011; DALY et al., 2018; KOSSEVA; RUSBANDI,
2018; RAZA; ABID; BANAT, 2018).
Neste sentido, o estudo buscou avaliar o potencial de utilização de
coprodutos agroindustriais de baixo valor agregado e pouco utilizados para
produzir um biopolímero biodegradável em frascos agitados e em biorreator,
sendo que o biopolímero apresenta potencial de utilização na produção de
embalagens alimentícias, reduzindo assim o impacto ambiental causado pela
ação humana, tanto em relação ao acúmulo de resíduos plásticos quanto na
contaminação de corpos de água pelo despejo de efluentes que, mesmo tratados
previamente, podem impactar a qualidade dos mesmos.
2 Objetivos
O presente trabalho tem como objetivo geral produzir polihidroxibutirato
P(3HB) por Bacillus megaterium ATCC 14581 utilizando coprodutos da indústria
de alimentos e avaliar técnicas de recuperação do polímero.
Os objetivos podem ainda ser descritos de forma mais específica, com os
alvos do trabalho sendo:
• Avaliar os efeitos da composição do meio de cultura, a base de
coprodutos da indústria (água de maceração de milho, água de
parboilização de arroz e efluente líquido de indústria de candies)
na produção de P(3HB) em frascos agitados, empregando
metodologia de planejamento de experimentos;
• Avaliar a influência do pH na síntese de P(3HB) em biorreator;
• Maximizar a produção de P(3HB) em biorreator (batelada simples)
com diferentes taxas de aeração e agitação.
• Determinar os parâmetros cinéticos e estequiométricos da
produção em frasco agitados e biorreator;
• Determinar o potencial de extração de polímero do interior das
células empregando extração química e sistema pressurizado;
• Avaliar o efeito do potencial de oxirredução sobre a produção de
P(3HB).
23
3 Revisão Bibliográfica
O polihidroxibutirato (P3HB) é um composto descoberto inicialmente na
década de 1970, sendo que diversos estudos foram realizados com o objetivo
de determinar suas características e possíveis aplicações. Assim, para melhor
compreender as características relacionadas a síntese e obtenção do P3HB é
necessário definir certos tópicos. Neste item serão abordados aspectos gerais
dos polímeros naturais, polímeros biodegradáveis, principais produtores e
substratos, formas de extração e recuperação
3.1 Polímeros naturais
Os polímeros estão entre os compostos mais abundantes no planeta,
sendo encontrados em animais, plantas e micro-organismos. A síntese dos
polímeros é realizada por reações de polimerização que ocorrem no interior das
células (FLIEGER et al., 2003).
Como estes compostos são de origem orgânica, os mesmos podem ser
degradados completamente por organismos vivos, sendo que a degradação dos
polímeros naturais ocorre, sobretudo, devido a ação de enzimas que rompem as
ligações da cadeia polimérica e libera os monômeros que são então utilizados
pelas células para realizar suas funções metabólicas gerando, água e CO2,
dentre outros compostos (FLIEGER et al., 2003; KLEMM et al., 2005).
Segundo Luvizetto (2007), os polímeros naturais podem ser distribuídos
dentro de oito grupos principais:
1. Ácidos nucleicos (Ex.: DNA & RNA);
2. Poliamidas (Ex.: proteínas);
3. Polissacarídeos (Ex.: amido, celulose);
4. Poliésteres orgânicos (Ex.: polihidroxialcanoatos);
5. Politioésteres (Ex.: polimercaptopropionato);
6. Poliésteres inorgânicos (Ex.: polifosfatos);
7. Poliisoprenóides (Ex.: borracha);
8. Polifenóis (Ex.: lignina).
24
Através do uso de processos tecnológicos, já é possível produzir diversos
polímeros que antes eram obtidos apenas de fontes não renováveis. A Figura 1
apresenta alguns dos polímeros mais comumente utilizados na indústria de
acordo com suas formas de obtenção e biodegradabilidade.
Figura 1 – Classificação de polímeros quanto à biodegradabilidade e forma obtenção (SHEN; HAUFE; PATEL, 2009).
Nos polímeros derivados de fontes naturais tem-se ainda as poliamidas,
popularmente conhecidas como nylon. As poliamidas são polímeros resistentes
e de alto valor agregado. Existe um grande interesse em encontrar fontes
renováveis para a produção de poliamidas. Nylon-11, por exemplo, pode ser
obtido através do óleo de rícino e Nylon-4 pode ser sintetizado a partir de
glutamato monossódico, o que pode permitir que micro-organismos
recombinantes sejam capazes de gerar materiais precursores para a produção
25
destes polímeros. Outro dos monômeros que podem ser obtidos de fontes
renováveis é o ácido 3-hiroxipropiônico (3-HP), que pode então ser polimerizado,
produzindo poli(3-HP) (um poliéster) ou então desidratado gerando ácido
acrílico, que, após polimerizado, dá origem ao ácido poliacrílico, um composto
utilizado na produção de tintas. (MITTAL, 2011; SUN, 2013).
Outro polímero muito utilizado é a borracha sintética (um copolímero
formado por isobutileno e isopreno) que pode ser produzida por processos
bioquímicos através de Escherichia coli recombinante (Genencor, USA),
utilizando genes de plantas que permitem a conversão de glicose em isopreno,
gerando mais de 60 g∙L-1 deste. O isobutileno, por outro lado, pode ser obtido
pela desidratação do isobutanol, que por sua vez é produto da fermentação de
amido e celulose. A utilizações destas formas de produção podem permitir a
obtenção de borracha sintética a partir de fontes naturais que pode então ser
empregada na indústria de pneus (MITTAL, 2011).
Embora, estes polímeros possam ser obtidos por fontes renováveis, os
mesmos não apresentam potencial biodegradável, o que significa que o impacto
ambiental, após o descarte, causado pelos mesmos se mantém inalterado
(HALLEY; DORGAN, 2011).
3.2 Polímeros biodegradáveis
Como mencionado anteriormente, os polímeros utilizados como plásticos
são tipicamente de origem fóssil. Suas estruturas não ocorrem naturalmente e,
em função disso, não são biodegradáveis. Através da compreensão da relação
entre a estrutura, propriedades dos polímeros e processos de degradação
biológica, novos materiais foram desenvolvidos. Estes materiais possuem as
propriedades e a capacidade de utilização similar aos plásticos, mas são
biodegradáveis (em diferentes graus) (KHANNA; SRIVASTAVA, 2005;
CHANPRATEEP, 2010).
Segundo o grau de biodegradabilidade, Khanna & Srivastava (2005) e
Pakalapati et al. (2018) apontam que os biopolímeros podem ser categorizados
em três grupos principais:
• Polímeros parcialmente biodegradáveis são polímeros produzidos
com a adição de amido. Este amido age como ligante, gerando uma
26
mistura homogênea de polímero e amido. Após o descarte, o amido
é degradado por micro-organismos, porém o restante do composto
continuará presente no meio ambiente.
• Polímeros fotobiodegradáveis possuem aditivos que aumentam a
sensibilidade do material à radiação ultravioleta, tornando-o
quebradiço quando exposto a este tipo de radiação por períodos
prolongados. Porém, os polímeros fotobiodegradávies são apenas
fragmentados em partículas menores, não havendo quebra nas
ligações entre os monômeros que compõem o polímero.
• Polímeros completamente biodegradáveis: são aqueles capazes
de sofrer degradação completa, ou seja, ruptura das ligações entre
as unidades monoméricas pela ação de enzimas, usualmente
secretadas por micro-organismos.
No caso dos polímeros biodegradáveis completos, os micro-organismos
presentes no ambiente secretam enzimas, depolimerases, que rompem as
ligações entre os monômeros, permitindo a metabolização dos mesmos
(CHANPRATEEP, 2010; KHANNA; SRIVASTAVA, 2005; OMAR et al., 2001;
SRIDEWI; BHUBALAN; SUDESH, 2006; VERLINDEN et al., 2007).
Os polímeros biodegradáveis também tendem a apresentar pouca ou
nenhuma ramificação na cadeia, uma vez que a presença delas reduz a
quantidade de grupos terminais e a massa molecular do polímero. Isto também
faz com que o grau de polimerização e, em muitos casos, a cristalinidade sejam
baixos (CHAMY; ROSENKRANZ, 2013).
Os polímeros biodegradáveis ganharam espaço no mercado industrial,
com diversos investimentos realizados em pesquisa e desenvolvimento, visando
a produção em larga escala (SHEN; HAUFE; PATEL, 2009; MOŻEJKO-
CIESIELSKA; KIEWISZ, 2016; RODRIGUEZ-PEREZ et al., 2018). Os polímeros
biodegradáveis devem ser estáveis e duráveis o suficiente para possibilitar sua
utilização em uma aplicação específica, porém após o descarte a degradação
deve ser rápida (KUMAR, 2011; YEO et al., 2017). Como as ligações entre os
monômeros tendem a ser resistentes, o processo de degradação costuma se
iniciar pelos grupos terminais da cadeia polimérica (BASTIOLI, 2005). Contudo,
a taxa de degradação depende ainda do ambiente onde se encontra o polímero,
27
uma vez que pH, a concentração de enzimas, a quantidade de água, entre outros
apresentam efeitos na degradação dos polímeros (RATNER et al., 2004).
Dentre os principais polímeros biodegradáveis com aplicação industrial,
podemos citar o ácido polilático (PLA), ácido poliglicólico (PGA), e os
polihidroxialcanoatos (PHAs) (MIDDLETON; TIPTON, 2000; TANG et al., 2016;
THOMAS; BALAKRISHNAN; SREEKALA, 2018).
3.2.1 Polihidroxialcanoatos
Dentre os polímeros biodegradáveis em destaque tem-se os
polihidroxialcanoatos (PHAs). Estes poliésteres são sintetizados por mais de 90
gêneros de micro-organismos e algumas plantas, em menores concentrações.
Mais de 150 tipos diferentes de monômeros já são conhecidos, possibilitando a
copolimerização destes em diferentes compostos, gerando assim uma grande
variedade de PHAs com diferentes propriedades mecânicas, possibilitando uma
maior utilização dos mesmos (ANDERSON; DAWES, 1990; HAZER;
STEINBÜCHEL, 2007).
Raza, Abid & Banat (2018) classificam os PHAs em três classes, PHAs de
cadeia longa, média e curta, de acordo com o número de átomos de carbono
presentes nas ramificações da cadeia. Os PHAs de cadeia curta possuem menos
de 5 carbonos; os de cadeia média possuem entre 5 a 14 carbonos; já os de
cadeia longa apresentam mais de 14 carbonos, porém são menos estudados por
serem encontrados mais raramente.
Além da biodegradabilidade, os PHAs também são atóxicos e
biocompatíveis com o corpo humano, podendo apresentar também
características termoplásticas ou elastoméricas, com pontos de fusão entre 40 a
180 ºC, de acordo com os monômeros utilizados (DOI; STEINBÜCHEL, 2002;
SRIDEWI; BHUBALAN; SUDESH, 2006; VERLINDEN et al., 2007).
No que se refere a obtenção dos PHAs, a forma mais comum é através
do uso de micro-organismos, sendo que as bactérias capazes de sintetizar PHAs
são separadas em dois grupos. O primeiro grupo necessita da limitação de algum
macronutriente (nitrogênio, oxigênio, etc.) e excesso de fontes de carbono para
que ocorra a síntese de PHAs (Ex.: Cupriavidus metallidurans e Pseudomonas
oleovorans). O segundo grupo engloba as bactérias capazes de sintetizar PHAs
28
ao longo do seu ciclo de crescimento, sem que haja a necessidade de limitação
de nenhum nutriente (Ex.: Azohydromonas lata e Bacillus megaterium)
(MCCOOL et al., 1996; OMAR et al., 2001). Algo que se mantém, no entanto, é
a forma sob a qual os PHAs são armazenados. As células que acumulam PHAs
os mantém na forma de grânulos amorfos e inertes, de acordo com o modelo
apresentado na Figura 2 (BYROM, 1993; RAZA; ABID; BANAT, 2018).
Figura 2 – Morfologia do grânulo de P(3HB) (ZINN; WITHOLT; EGLI, 2001).
Os processos metabólicos que dão origem aos PHAs variam também de
acordo com o micro-organismo. As Figuras 3 e 4 apresentam um esquema
resumido das principais rotas metabólicas para a síntese de PHAs.
PHAs
Proteínas
PHA polimerase
PHA depolimerase
Camada de fosfolipídios
29
Figura 3 – Esquema de rotas metabólicas para a produção de PHAs de cadeia curta (ARAI, 2002).
Figura 4 – Esquema do metabolismo para produção de PHAs de cadeia média (ZHANG; CARLSON; SRIENC, 2006).
De acordo com as Figuras 3 e 4, a biossíntese dos PHAs ocorre em duas
etapas principais: a geração de hidroxiacil-CoAs (HA-CoAs) usando
hidroxiácidos graxos de cadeia curta e média, e vários metabólitos como
precursores e a polimerização das HA-CoAs em PHAs. As PHA sintases
30
promovem a polimerização das HA-CoAs. Estas enzimas possuem uma grande
especificidade de substrato em relação a várias HA-CoAs, dentre as quais a 3-
hidroxiacil-CoAs (3HA-CoAs) são os substratos mais favoráveis, embora 4-, 5- e
6-hidrociacil-CoAs possam ser utilizadas como substratos. A enantioseletividade
dos monômeros de PHA é decorrente do fato de que as PHA sintases aceitam
apenas (R)-HA-CoAs na cadeia polimérica se um centro assimétrico existir no
monômero (PARK et al., 2012; KIM; OH, 2013; MOŻEJKO-CIESIELSKA;
KIEWISZ, 2016).
Existem ainda duas classificações principais para os PHAs. De acordo
com os hidroxiácidos graxos utilizados para sua produção, os PHAs são então
classificados como PHAs de cadeia curta (formados pela ação das PHA sintases
(PhaC) sobre hidroxiácidos graxos com 3 a 5 átomos de carbono) ou de cadeia
média (PhaCs utilizam hidroxiácidos graxos com 6 a 14 carbonos) (ARAI, 2002;
ZHANG; CARLSON; SRIENC, 2006). PHAs de cadeia curta e média são
formados por processos metabólicos diferentes.
A principal diferença entre as espécies de PHAs está em suas
propriedades físicas. Os PHAs de cadeia curta tendem a apresentar rigidez e
cristalinidade elevadas, tornando o material quebradiço e limitando sua utilização
na indústria de embalagens ou filmes. Já os PHAs de cadeia média apresentam
maior elasticidade, assemelhando-se a borracha e demais elastômeros. No caso
dos PHAs de cadeia curta, suas propriedades podem ser melhoradas através da
biossíntese de copolímeros, onde tem-se mistura de monômeros na cadeia de
PHA permitindo obtenção de polímeros com propriedades mecânicas diferentes
(ANDERSON; DAWES, 1990; HAZER; STEINBÜCHEL, 2007; PARK et al.,
2012).
Sob o ponto de vista ambiental os PHAs são uma alternativa muito
interessante para a reduzir a utilização de polímeros de origem petroquímica.
Todavia, é preciso garantir que o produto resultante apresente características
compatíveis com as necessidades dos segmentos da indústria para qual será
destinada sua utilização (PARK; CHOI; LEE, 2005). Sendo biodegradáveis faz
com que os mesmos sejam utilizados, sobretudo, para a produção de artefatos
descartáveis, filmes e fibras (HAZER; STEINBÜCHEL, 2007). Outro ponto de
grande interesse por parte da indústria é o fato de que os PHAs apresentam
31
propriedades físicas muito similares às de vários polímeros derivados do
petróleo (polipropileno, por exemplo) o que torna possível a utilização de PHAs
em seu lugar (KHANNA; SRIVASTAVA, 2005). Raza, Abid & Banat (2018)
organizaram um compilado de estudos focados na produção de PHAs, sendo
que os dados podem ser vistos na Tabela 1.
Dentre os PHAs conhecidos, o polihidroxibutirato (P(3HB)) e o
polihidroxivalerato (P(3HV)) vem sendo muito estudados devido a suas
características favoráveis às aplicações industriais. Algo também muito comum
na indústria é a obtenção do copolímero polihidroxibutirato-co-valerato (P(3HB)-
co-P(3HV)), já utilizado como embalagens por algumas empresas (SHEN;
HAUFE; PATEL, 2009).
32
Tabela 1 –Visão geral de algumas estratégias de produção e recuperação de PHAs (RAZA; ABID; BANAT, 2018, adaptado).
Fonte de carbono Cepa bacteriana Modo de
fermentação Comprimento
de cadeia Fator
limitante
Peso seco total
(g·L-1)
Taxa de acúmulo de
PHA
Forma de extração
Rendimento (g·L-1)
Octanoato Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 Contínuo Média Carbono N/A 10,1 % N/A N/A
Hexadecano Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Contínuo Média Nitrogênio 1,0 7,5 % N/A N/A
Decanoato
Pseudomonas aeruginosa IFO 3924
Batelada Média Nitrogênio
2,2 23,0 %
Solvente N/A Pseudomonas aeruginosa PAO 1 2,0 10,0 %
Pseudomonas aeruginosa IFO 3755 3,1 22,0 %
Pseudomonas aeruginosa IFO 14164 2,8 21,0 %
Resíduo de ácido oleico Pseudomonas aeruginosa 42A2 NCIB 40045 Batelada
Média Nitrogênio
3,2 54,6 % Solvente N/A
Resíduo de óleo de soja Curta N/A 66,1 %
Ácido tereptálico
Pseudomonas putida GO 16
Batelada Média Nitrogênio 1,0
27,0 %
N/A
0,25
Pseudomonas putida GO19 23,0 % 0,25
Pseudomonas frederiksbergensis GO23 24,0 % 0,27
Óleo de palma Pseudomonas aeruginosa IFO 3924 Batelada Média Nitrogênio 1,8 – 2,7 16,4 % Solvente 0,28 – 1,06
Glicerol comercial Resíduo de glicerol
Cupriavidius necator DSM 545 Batelada
alimentada Curta Nitrogênio N/A
62,0 % Solvente
51,20
52,0 % 38,10
Acetato Lodo ativado Batelada Curta Nitrogênio
N/A 37,0 %
Solvente N/A Fósforo 59,0 %
Resíduo de óleo de cozinha
Pseuomonas sp. PS1 Batelada N/A Nitrogênio N/A N/A Solvente
2,30
Pseudomonas sp. 2,70
Ácidos graxos Pseudomonas putida BET 001 Batelada Média Nitrogênio N/A 49,7 % – 68,9 %
Solvente 10,12 – 15,45
Glicose Bacillus cereus Batelada Curta N/A 3,4 49,7 % Solvente 1,19
Melaço de cana Bacillus megaterium Batelada N/A N/A 1,46 46,2 Solvente 0,67
Melaço de cana Bacillus megaterium BA-019 Batelada
alimentada N/A N/A 72,6 42,1 Solvente 30,5
Sacarose Bacillus megaterium DSMZ 32T Batelada N/A Oxigênio 3,4 – 6,0 39 % – 62 % Solvente 1,40 – 3,40
Melaço de cana Bacillus megaterium BA-019 Batelada N/A N/A 8,78 61,62 Solvente 5,41
33
3.2.2 Polihidroxibutirato
O polihidroxibutirato (P(3HB)) é um dos principais representantes dos
PHAs. É um poliéster formado por diversos monômeros idênticos ligados um ao
outro (Figura 5). Este polímero apresenta uma densidade de 1,18 a 1,26 g·mL-1,
com ponto de fusão próximo a 175 ºC, com a transição vítrea ocorrendo na faixa
de -5,15 ºC a 14,85 ºC.
Figura 5 – Estrutura química do polihidroxibutirato (MEKONNEN et al., 2013).
O P(3HB) foi o primeiro PHA a ser descoberto, com os primeiros
registros ocorrendo próximo a 1888 com a visualização de inclusões de PHAs
no interior de células bacterianas (Figura 6), todavia, a real determinação do
P(3HB) ocorreu apenas em 1927 (VOLOVA, 2004; MOŻEJKO-CIESIELSKA;
KIEWISZ, 2016).
Figura 6 – Grânulos de P(3HB) em B. megaterium após 4 h (a), 12 h (b) e 21 h (c). As setas indicam fraturas na parede celular devido ao tamanho dos grânulos de P(3HB) (RODRÍGUEZ-CONTRERAS et al., 2013).
Em 1958 Macrae & Wilkinson desenvolveram um trabalho envolvendo
P(3HB), onde foi descoberto que culturas de Bacillus megaterium e Bacillus
cereus armazenavam grânulos de P(3HB) em meios contendo altas
concentrações de carbono e nitrogênio. Entretanto, conforme estes nutrientes
eram esgotados, os grânulos de P(3HB) eram consumidos pelas células,
34
permitindo a caracterização do P(3HB) como reserva de energia (MOŻEJKO-
CIESIELSKA; KIEWISZ, 2016).
Em 1976, empresas inglesas investigavam uma forma rentável de
produzir e extrair P(3HB) de culturas bacterianas, utilizando açúcares de plantas.
Estes estudos demonstraram que além de ser possível produzir P(3HB) através
de materiais renováveis, algumas propriedades do P(3HB) se assemelhavam às
do polipropileno (SENIOR, 1984). A partir deste ponto, um dos principais focos
foi o processo biológico de síntese de P(3HB) (VOLOVA, 2004).
Como o P(3HB) é um composto que além de biodegradável é
biocompatível com o organismo humano, o mesmo encontrou grande demanda
na área biomédica, sendo utilizado na produção de suturas, curativos,
emplastros, pinos ortopédicos, tipoias, stents cardíacos, recuperadores de
cartilagem, guias nervosas, etc (CHEN; WU, 2005; MOŻEJKO-CIESIELSKA;
KIEWISZ, 2016). Além disso, o P(3HB) ainda apresenta potencial como agente
encapsulante e pode ser utilizado em sistemas de entrega de medicamentos ou
tratamentos terapêuticos a longo prazo (BONARTSEV et al., 2006; PILLAI et al.,
2017; THOMAS; BALAKRISHNAN; SREEKALA, 2018).
Na indústria de alimentos o foco na utilização do P(3HB) está voltado para
a produção de embalagens, trabalhando com parâmetros tais como a
transparência, maleabilidade e resistência e formas de melhorar estas
propriedades (usualmente blendagem com PLA ou copolimerização com
P(3HV)) (BUCCI; TAVARES; SELL, 2005, 2007; SIRACUSA et al., 2008;
ANSARI; FATMA, 2014). Alguns estudos vem sendo feitos ainda sobre a
possibilidade da utilização de blendas de P(3HB), geralmente com PLA como
filmes para produtos vegetais (ARRIETA et al., 2014). Contudo a produção
mundial de P(3HB) ainda continua restrita, sobretudo devido ao custo do
processo (PIOTROWSKI; CARUS; CARREZ, 2018; RAZA; ABID; BANAT, 2018).
Para a produção de P(3HB) tanto em escala industrial quanto para fins de
pesquisa, os principais substratos utilizados como fontes de carbono são
açúcares e melaços, que apesar do bom rendimento aumentam o custo do
processo produtivo em função de seu alto valor. A literatura relata que o custo
do substrato para a produção de P(3HB) pode, chegar a 45 % do custo total do
35
processo (LEE; CHOI; WONG, 1999; WU et al., 2002; FACCIN et al., 2011;
POSADA et al., 2011; NARANJO et al., 2013; KANJANACHUMPOL et al., 2013).
Em relação a biodegradabilidade dos artefatos produzidos com P(3HB),
Matavulj & Molitoris (2000) avaliaram o tempo necessário para que ocorra a
degradação do polímero Biopol, uma mistura comercial de P(3HB)-co-P(3HV). O
estudo teve a duração de 50 semanas, utilizando amostras de 3x1x0,1 cm em
11 ambientes diferentes (1-Rio Danúbio; 2-Margem do rio Daúbio; 3-Floresta; 4-
Campo; 5-Estufa com grama (húmida); 6-Flotador de estação de tratamento de
esgoto; 7-Tanque de aeração de estação de tratamento de esgoto; 8-Tanque
aeróbio de estação de tratamento de esgoto; 9-Tanque anaeróbio de estação de
tratamento de esgoto; 10-Caçamba de lixo; 11-Estufa húmida com composto).
As amostras foram avaliadas em intervalos de 5 semanas, sendo que os
ambientes 1, 2, 3, 4 e 9 apresentaram, após 50 semanas, uma redução de massa
de aproximadamente 30 %, 60 %, 11 %, 16 % e 16 %, respectivamente. Já a
amostra acondicionada no ambiente 11, apresentou uma degradação de mais
de 80 % em um período de 10 semanas.
Um estudo mais antigo, realizado por Jendrossek, Schirmer & Schlegel
(1996), também testou a taxa de degradação de P(3HB)-co-P(3HV), desta vez
utilizando garrafas (600 mL) e incubadas em tanque de lodo ativado aeróbio a
20 ºC por 10 semanas, com avaliação das amostras nos tempos de 0, 2, 4, 6, 8
e 10 semanas. Os autores concluíram que nas condições utilizadas, após o
período de 10 semanas houve uma redução de mais de 30 % do peso das
amostras, uma redução considerável se comparado com os dados encontrados
por Matavulj & Molitoris (2000) utilizaram um ambiente similar em seus testes.
Apesar destes resultados, ainda existe poucos estudos que focam nas
propriedades de degradação do P(3HB), principalmente pelo grande número de
variáveis que influenciam em sua taxa de degradação. Ainda assim, é possível
visualizar que o impacto ambiental causado pelo P(3HB) após o descarte é
infinitamente menor que o causado pelos polímeros clássicos (derivados de
petróleo) (FACCIN, 2012).
36
3.2.2.1 Micro-organismos produtores de P(3HB)
A função principal do P(3HB) é a de agir como fonte de energia reserva,
sendo que ao serem consumidos, os grânulos de P(3HB) são convertidos em
ácido acetoacético ao longo de uma série de reações enzimáticas (BYROM,
1993; FACCIN, 2012). Enquanto no interior da célula, o P(3HB) se apresenta na
forma amorfa, contudo, após a extração a cristalinidade deste polímero pode
chegar a valores entre 60 a 80 % (KHANNA; SRIVASTAVA, 2005; YEO et al.,
2017).
Em algumas espécies de bactérias, a falta de nutrientes específicos e o
excesso de carbono faz com que a célula ative um caminho metabólico
específico, desviando as moléculas de acetil coenzima A (acetil-CoA) do ciclo
tricarboxílico para a produção de P(3HB), dando origem ao grânulo de PHA. Em
outras espécies, o ciclo tricarboxílico e a rota metabólica que dá origem aos
grânulos de P(3HB) são ativadas simultaneamente, através do desvio parcial das
moléculas de acetil-CoA para ambos os ciclos (CHANPRATEEP, 2010;
MOŻEJKO-CIESIELSKA; KIEWISZ, 2016; YEO et al., 2017).
Diversos tipos de micro-organismos são capazes de armazenar grânulos
de P(3HB), utilizando diferentes fontes de carbono e com variados níveis de
eficiência, contudo, os micro-organismos que mais recebem destaque na
produção comercial são Alcaligenes latus, Pseudomonas oleovorans,
Methylobacterium organophilum, dentre outras (LENZ; MARCHESSAULT, 2005;
KUNASUNDARI; SUDESH, 2011; MUTIARA et al., 2014; LIN; CHEN, 2017b).
3.2.3 Bacillus megaterium na produção de P(3HB)
O Bacillus megaterium é uma bactéria Gram-positiva, aeróbia estrita que
pode ser encontrada em diversos ambientes como o solo, água, sedimentos,
mel, pescados e alimentos desidratados (VOS et al., 2009). O B. megaterium é
também capaz de utilizar mais de 62 tipos de fontes de carbono, incluindo
glicose, lactose, frutose, maltose, trealose, glicerol, formatos e acetatos. Este
micro-organismo possui ainda resistência a temperatura e pressão osmótica
elevadas, permitindo sua utilização em diversos processos (PANDIAN et al.,
2010; LORENZINI et al., 2014; RAZA; ABID; BANAT, 2018).
37
As células de B. megaterium apresentam um comprimento próximo a
4 µm, com 1,5 µm de diâmetro, fazendo com que esta seja considerada uma das
maiores bactérias (VARY et al., 2007). A Figura 7 apresenta uma comparação
entre o tamanho das células de B. megaterium e de Escherichia coli.
Figura 7 – Comparação morfológica entre células de B. megaterium (amarelas) e Escherichia coli (laranjas) (BUNK et al., 2010).
O B. megaterium pode se desenvolver em substratos de baixo custo e não
produz endotoxinas. Além disso, ele não apresenta proteases alcalinas, que
podem vir a degradar os compostos formados ao longo do cultivo. O mesmo é
também muito utilizado na produção de proteínas para a indústria de panificação
(α- e β-amilases) e também é capaz de produzir penicilina amidase, composto
utilizado na síntese de novos antibióticos a base de β-lactama (PANBANGRED
et al., 2000).
Sobre a utilização do B. megaterium como produtor de P(3HB), existem
diversos trabalhos utilizando substratos distintos. Omar et al. (2001) por
exemplo, cultivaram uma cepa selvagem de B. megaterium, isolada do lodo de
uma estação de tratamento e cultivado em meio de sais minerais com 8 g·L-1 de
frutose e uma mistura de oxalato de amônio, nitrato de amônio, nitrato de sódio,
acetato de amônio e sulfato de amônio (0,5 g·L-1 cada).
O grupo testou também o comportamento da cepa no meio mineral
acrescido de xarope de tâmara. Os cultivos foram conduzidos tanto em frascos
agitados (150 rpm, 30 ºC e 48 h) e biorreator de 42 L (30 L de meio de sais com
38
xarope). No biorreator, a cultura foi mantida por 24 h, utilizando uma faixa de
agitação de 100 a 300 rpm e uma vazão de ar de 0,9 vvm e pH mantido em 7,0.
Como resultados para a batelada em frascos agitados, os autores
anteriormente citados, encontraram aproximadamente 3,3 g·L-1 de biomassa
(52 % de P(3HB)) usando 5 % do xarope e 2,2 g·L-1 de biomassa (17 % de
P(3HB)) ao usar frutose como fonte de carbono. No biorreator, utilizou-se 2 % de
xarope, sendo que as culturas apresentaram 3,4 g·L-1 de biomassa nas primeiras
14 h (25 % de P(3HB)). Após este ponto, a quantidade de células foi reduzida,
provavelmente devido à esporulação. Passadas as 24 h, o grupo encontrou
aproximadamente 2,8 g·L-1 de biomassa, contendo um valor de P(3HB) próximo
a 17 %.
Por outro lado, Dhangdhariya et al. (2015) cultivaram, em estufa rotatória,
uma cepa marinha de B. megaterium (JK4h) em caldo Difco Sporulation Medium
(DSM), visando otimizar o meio de cultura para propiciar o maior acúmulo
possível de P(3HB). O grupo testou o efeito da suplementação do meio com
peptona, extrato de levedura e glicose em diferentes concentrações. Os
resultados indicaram que a suplementação do caldo DSM com 0,3 g·100 mL-1
de peptona, 0,075 g·100 mL-1 de extrato de levedura e 3 g·100 mL-1 de glicose
apresentaram um acúmulo de 0,6 g·L-1 de biomassa com uma concentração de
P(3HB) de 55,97 %.
Em outro estudo, Obruca et al. (2011) utilizaram soro de leite (40 g·L-1 de
lactose) com e sem a adição de meio mineral para cultivar B. megaterium CCM
2037 (150 rpm, 30 ºC e 50 h), sendo que ao adicionar o meio mineral ao soro, a
produção de P(3HB) foi aumentada quase 10 vezes. Aplicando metodologia de
planejamento de experimentos - Tipo Placket-Burman, verificaram que a
concentração de amônio, fósforo e magnésio não apresentaram influência
significativa (p>0,05) no acúmulo de biomassa ou P(3HB) e a pressão osmótica
foi um dos fatores de inibição do crescimento celular. Assim, o soro de leite foi
diluído para uma concentração de lactose de 20 g·L-1, gerando 2,51 g·L-1 de
biomassa com 31,4 % de P(3HB) (0,79 g·L-1) após 48 h de cultivo.
Os autores ressaltam a adição de peróxido de hidrogênio e etanol à
cultura como agentes promotores de estresse, recomendando a adição do
mesmo no início da fase estacionária (25 h de cultura). Os autores (OBRUCA et
39
al. ,2011) constataram que a adição de etanol e peróxido aumentou o conteúdo
de P(3HB), ou seja, a adição de 1 % de etanol aumentou a quantidade de
polímero em 41 % em relação ao controle. A biomassa no cultivo controle foi de
2,82 g·L-1 e 37,5 % de polímero (1,05 g·L-1). No entanto, ao adicionarem 1 % de
etanol, os valores foram de 2,87 g·L-1 e 1,48 g·L-1 (51,57 %) de biomassa e
P(3HB), respectivamente.
O aumento da síntese de P(3HB) pela adição de etanol é decorrente do
metabolismo de oxidação do etanol que dá origem a Acetil-Coenzima A (Acetil-
CoA), uma das moléculas necessárias para o metabolismo de acúmulo de
P(3HB) (OBRUCA et al., 2010).
3.3 Uso de coprodutos da indústria de alimentos na síntese de PHAs
O desenvolvimento de novas formas de utilizar coprodutos e/ou
coprodutos oriundos da cadeia produtiva da indústria de alimentos auxilia no
aumento do equilíbrio entre produção e meio ambiente (NDUBUISI EZEJIOFOR;
ENEBAKU; OGUEKE, 2014; ARAÚJO et al., 2015).
O milho é um dos grãos mais consumidos mundialmente, constituindo
uma das principais bases da alimentação humana. Existem ainda diversos
processos que alteram os grãos do milho de forma a gerar diferentes produtos,
estes processos, no entanto acabam gerando coprodutos que não são
consumidos ou utilizados pela indústria. Um dos principais processos é a
moagem úmida do milho que gera como coproduto a água de maceração de
milho (AMM) (ARAÚJO et al., 2015).
A AMM é um líquido viscoso contendo grande parte dos elementos
solúveis presentes no milho, é rica em vitaminas, aminoácidos e minerais,
contendo aproximadamente 50 % (m/m) de sólidos e pH levemente ácido
(3,7 a 4,7) (SIGMA-ALDRICH, 2010). Este coproduto é oriundo da etapa de
maceração dos grãos de milho em água, sendo que o intuito deste processo é
causar alterações nas propriedades do grão pela remoção de seus compostos
solúveis. Os grãos ficam em contato com uma solução diluída de dióxido de
enxofre (SO2) por 30 a 48 h a 50 a 55 ºC, o líquido é removido e a fração insolúvel
é processada para dar origem ao germe, farelo, amido e glúten. A AMM sofre
40
então um processo de concentração via evaporação (USDA - UNITED STATES
DEPARTMENT OF AGRICULTURE., 2010).
A utilização da AMM ainda é restrita, sendo muito utilizada como
ingrediente na alimentação animal. Contudo, devido a sua composição
nutricional existe a possibilidade de utilização da mesma em processos
biotecnológicos (SIGMA-ALDRICH, 2010; USDA - UNITED STATES
DEPARTMENT OF AGRICULTURE., 2010; ARAÚJO et al., 2015).
Outro processo que gera um grande volume de coprodutos é a
parboilização de arroz. Atualmente, o Brasil é o maior produtor de arroz entre os
países da América e Europa, produzindo na safra de 2016/2017 mais de
8,38 milhões de toneladas (CHILDS; RASZAP, 2017). O processo de
parboilização é amplamente utilizado no Brasil, sendo que a parboilização
consiste na imersão do grão de arroz em água em uma temperatura superior a
58 ºC. Isso faz com que o amido presente no grão seja gelatinizado e
subsequentemente retrogradado. A parboilização é realizada em três etapas
principais (ABIAP, 2013): a) Maceração; o arroz com casca é colocado em
tanques com água aquecida por algumas horas. Neste processo, as vitaminas e
sais minerais que se encontram na película e germe penetram no grão; b)
Gelatinização: o arroz úmido é submetido a um aumento na temperatura e
pressão causando alterações na estrutura do amido. Isto faz também com que o
grão seja compactado; c) Secagem: Os grãos são secos para posterior
descascamento, polimento e seleção (ABIAP, 2013).
A água gerada neste processo (APA) é rica em fósforo e nitrogênio,
apresentando uma proporção de N/F de 2 a 5. A APA apresenta ainda uma
coloração que varia entre o amarelo claro e castanho, baixa viscosidade e pH
ácido. Mukherjee et al. (2016) avaliaram as propriedades físico-químicas da APA
de 113 moinhos da Índia, sendo que os dados encontrados por estes autores
podem ser vistos na Tabela 2.
41
Tabela 2 – Propriedades físico-químicas da água de parboilização de arroz (MUKHERJEE et al., 2016, adaptado).
Parâmetro Unidade Faixa Média
pH N/A 3,80 – 6,70 5,00 ± 0,78
EC mS·cm-1 1,10 – 3,40 2,60 ± 0,76
P mg·L-1 3,99 – 72,05 39,24 ± 16,09
NH3-N mg·L-1 51,20 -153,90 104,00 ± 19,70
NO3-N mg·L-1 1,18 – 6,74 4,11 ± 1,67
DO mg·L-1 0,60 – 66,40 10,40 ± 18,00
DBO mg·L-1 114,80 – 415,20 305,32 ± 71,19
DQO mg·L-1 218,00 – 1706,0 1130,51 ± 298,61
Sólidos solúveis mg·L-1 6050,00 – 6550,00 6258,00 ± 186,74
Açúcares redutores mg·L-1 20,68 – 570,46 184,47 ± 155,35
Lignina oxidada mg·L-1 5,00 – 40,00 18,53 ± 9,39
Cor Unidade de cor cloroplatinada
250,08 – 700,95 533,21 ± 147,81
Outra indústria que gera coprodutos que poderiam ser empregados na
biotecnologia é a de balas e confeitos. O setor apresenta grande diversidade de
produtos e processos, sendo que 25 empresas atuam no Brasil (ABICAB, 2018).
Segundo Miah et al. (2018), a indústria possui 3 setores principais, produtos à
base de açúcar (caramelos, balas, gomas de mascar), produtos à base de
chocolate e produtos de confeitaria (bolos, biscoitos recobertos com chocolate,
etc.).
Os principais coprodutos da indústria vêm na forma de efluentes, ricos
em açúcares e/ou gorduras, o que faz com que eles possam causar impactos
graves ao meio ambiente caso sejam descartados sem tratamento adequado.
Entretanto, a alta demanda química e bioquímica de O2 em conjunto com o
grande volume de efluente gerado torna o tratamento adequado dos efluentes
um processo custoso (MAQBOOL et al., 2017; PAPADAKI et al., 2018).
Até o momento ainda existem poucos estudos sobre a utilização destes
coprodutos na produção de PHAs, porém ambos apresentam potencial de
aplicação como substrato para o cultivo de micro-organismos (ARAÚJO et al.,
2015; MUKHERJEE et al., 2016).
3.4 Efeitos do oxigênio em sistemas fermentativos
O oxigênio (O2) é, usualmente, um nutriente limitado em sistemas de
cultivo microbiológicos devido sua baixa solubilidade em água. Para cultivos com
42
bactérias e leveduras, a concentração crítica de oxigênio é geralmente 10 a 50 %
de saturação de ar no meio de cultura (SUTHERLAND, 1998; JIANG et al., 2016;
ALBUQUERQUE; MALAFAIA, 2018).
Acima do valor crítico, a concentração de oxigênio não limita o
crescimento celular. Para otimizar o crescimento é importante que o nível de
oxigênio dissolvido (DO) seja mantido acima do valor crítico (20 %) através do
borbulhamento de gás pelo biorreator. A taxa de transferência de massa do
oxigênio para o líquido deve ser igual ou maior que a taxa em que as células que
estão crescendo consomem o oxigênio (LYDERSEN; D’ELIA; NELSON, 1994).
Ao longo do cultivo, o oxigênio é transferido de um gás (usualmente ar na
forma de bolhas) para um líquido, para então ser absorvido pelas células e
metabolizado. O controle preciso das condições de aeração de sistemas de
fermentação é dificultado ao se utilizar eletrodos de O2 convencionais, devido ao
limite de detecção do sensor.
Desta forma, a monitoração do potencial de oxirredução (POR), também
conhecido como potencial redox, pode ser visto como uma alternativa mais
precisa, devido a sua resposta rápida e alta sensibilidade. O potencial redox
também está diretamente ligado as rotas metabólicas dos microrganismos,
permitindo que, através do controle do POR, seja possível redistribuir o fluxo
metabólico de diferentes células para produção de moléculas específicas
(DAHOD, 1982; LIU; QIN; LIN, 2017).
Em um sistema aquoso, o potencial redox se refere capacidade de
diferentes moléculas receberem ou doarem elétrons, através da ação de agentes
oxidantes ou redutores. Altos valores de POR indicam que a solução apresenta
uma tendência a ganhar elétrons e vice-versa. O POR de um sistema é medido
em volts (V) ou milivolts (mV), utilizando um sensor específico (GUO, 2018).
Fatores ambientais também são cruciais para a manutenção do potencial redox
de um sistema, sendo que existem diferentes técnicas de controle do potencial
redox (LIU; QIN; LIN, 2017; VERHAGEN; VAN GULIK; WAHL, 2020).
3.4.1 Controle de POR via energia externa
Reatores bioelétricos são sistemas desenvolvidos para regular o POR do
meio de cultura utilizando uma fonte de energia externa. O sistema utiliza uma
43
corrente elétrica transmitida usando dois eletrodos, um eletrodo catiônico e um
aniônico, para facilitar ou reduzir a taxa de troca de elétrons. O uso de reatores
bioelétricos ainda é restrito, principalmente devido a sua alta demanda
energética e alto custo de implantação, sendo utilizado apenas na produção de
metabólitos de alto valor agregado (THRASH; COATES, 2008; HOSEINZADEH
et al., 2020).
3.4.2 Controle de POR por via química
Esta técnica consiste na adição de agentes químicos ao meio de cultura
de modo a facilitar a troca de elétrons. Dentre os reagentes mais utilizados,
podemos citar cloreto de ferro III (FeCl3), sulfeto de sódio (Na2S), ferricianeto de
potássio (K3[Fe(CN)6]), cisteína (C3H7NO2S), peróxido de hidrogênio (H2O2), e
até mesmo NADH e/ou NAD+. Diferentemente dos reatores bioelétricos, que
necessitam eletrodo específicos para controlar o POR, os reagentes químicos
podem ser empregados em qualquer sistema de cultivo de microrganismos.
Porém, esta técnica pode causar alterações indesejadas no processo caso os
reagentes sejam utilizados em concentrações muito altas ou sejam
incompatíveis com os microrganismos empregados (GIRBAL; SOUCAILLE,
1994; LIU; QIN; LIN, 2017; SHIMIZU; MATSUOKA, 2019).
3.4.3 Controle de POR por aspersão de gases
Oxigênio (O2) e nitrogênio (N2) são comumente utilizados em sistemas
fermentativos, porém os mesmos também podem ser utilizados para controlar o
POR de um sistema fermentativo. O potencial redox de uma fermentação pode
ser aumentado através da adição de O2 ou hidrogênio (H2), ou então reduzido
ao se utilizar N2 ou hélio (He). Em sistemas que utilizam o controle de POR
através da aspersão de gases, é comum que mais de um seja utilizado, pois
através do ajuste da proporção de gases bombeados para o interior do sistema,
diferentes potenciais redox podem ser alcançados (KUKEC; WONDRA, 2002;
PANSU; GAUTHEYROU, 2006).
No entanto, deve-se ressaltar que esta técnica pode aumentar
consideravelmente o custo total do processo, dificultando sua utilização em
44
processos de larga escala (LIU; QIN; LIN, 2017; VERHAGEN; VAN GULIK;
WAHL, 2020).
3.4.4 POR e oxigênio dissolvido
O controle da taxa de oxigênio dissolvido (OD) em um sistema é essencial
para maximizar a produtividade de sistemas fermentativos, incluindo a produção
de P(3HB), visto que o O2 está intimamente ligado a manutenção da membrana
celular, e contribui na ativação de diferentes rotas metabólicas. Em situações
onde há a necessidade de um controle minucioso da taxa de OD, eletrodos
tradicionais apresentam dificuldade em distinguir o valor real de O2, pois
componentes do meio de cultura podem causar interferências no sensor, além
disso, o tempo de resposta do sensor é mais um fator que dificulta o controle do
processo (PANSU; GAUTHEYROU, 2006; LIU; QIN; LIN, 2017; GUO et al.,
2021).
3.4.5 Efeitos do oxigênio no cultivo de Bacillus sp.
O suprimento de O2 é um parâmetro decisivo no cultivo de bactérias do
gênero Bacillus, embora os resultados encontrados na literatura sejam um tanto
contraditórios (FACCIN et al., 2013; MOUNSEF et al., 2015). Sarrafzadeh &
Navarro (2005), visualizaram o efeito da taxa de aeração na esporulação de B.
thuringiensis verificaram que ao remover a aeração do sistema, a esporulação
da cultura foi de 100 % e aumentando a quantidade de oxigênio, houve uma
redução na taxa de esporulação, porém ocorreu um aumento da toxidade da
cultura.
Similarmente, Sen & Swaminathan (1997) perceberam que culturas em
biorreator que utilizam baixas velocidades de agitação com alta taxa de aeração
favorece a biossíntese de surfactina por B. subtilis. Para cultivos em frascos
agitados, Jacques et al. (1999) apontam que rotações maiores também
propiciam o acúmulo de metabólitos por bactérias do gênero Bacillus.
Em relação a produção de P(3HB) e outros PHAs por Bacillus sp., ainda
existem poucos estudos que trabalham com a otimização do processo em
biorreator que considerem o efeito da oxigenação na produtividade de polímero
45
(PHILIP et al., 2009). Estes autores avaliaram o feito do pH e da velocidade de
agitação na produção de P(3HB) por Bacillus cereus e perceberam que ao utilizar
velocidades de agitação elevadas (500 rpm) não houve acúmulo de polímero ao
longo do período de cultivo (72 h), sendo que os autores atribuem a possíveis
alterações metabólicas, devido a lise ou dano das células causada pela turbina
do reator. Por outro lado, ao utilizar uma velocidade de agitação de 50 rpm, não
houve crescimento celular, o que indica que esta velocidade de agitação não foi
capaz de suprir a necessidade de O2 da cultura. A produção de P(3HB) foi
avaliada utilizando duas velocidades de agitação (125 e 250 rpm), sendo que
uma maior quantidade de polímero (34 %) foi acumulada ao se utilizar uma
agitação mais baixa, enquanto que a velocidade de agitação mais elevada gerou
menos polímero (29 %) (PHILIP et al., 2009).
Faccin et al. (2013) também testaram a influência de diferentes taxas de
agitação no acúmulo de P(3HB) por B. megaterium e perceberam que a maior
quantidade de P(3HB) (3,3 g·L-1, 62 % da biomassa total) foi obtida ao se utilizar
uma velocidade de agitação de 200 rpm, sendo que valores superiores a 300
rpm apresentaram concentrações reduzidas de polímero. Os autores também
apontam que ao se utilizar velocidades de agitação menores, a produção de
P(3HB) segue uma cinética lenta, porém constante, um comportamento diferente
do observado em velocidades superiores a 300 rpm, onde ocorre um rápido
acúmulo de P(3HB), seguido por um consumo do mesmo ao longo das etapas
finais do cultivo.
Em contrapartida, Kulpreecha et al. (2009), também cultivaram
B. megaterium e perceberam que ao aumentar a concentração de O2 dissolvido
de 60 % para 80 %, nenhuma diferença significativa na concentração de P(3HB)
foi encontrada, embora o crescimento celular tenha sido reduzido. Além disso,
os autores apontaram que ao reduzir a quantidade de O2 dissolvido de 60 % para
40 %, o tempo de cultivo foi prolongado e a produtividade, reduzida
drasticamente, algo interessante, se comparados aos resultados encontrados
nos estudos citados anteriormente.
46
3.5 Recuperação de biopolímeros
A recuperação é uma das etapas importantes na cadeia produtiva do
P(3HB) e demais PHAs, sendo que existem duas etapas principais para a
recuperação dos PHAs: digestão celular através do uso de oxidantes ou
surfactantes e extração do polímero pelo uso de solventes. A recuperação e
purificação dos polímeros contribui significativamente para o aumento do custo
do processo, principalmente se o mesmo apresentar baixo rendimento.
Atualmente, diversos processos de separação podem ser utilizados, como por
exemplo, extração com solvente, rompimento celular por ação mecânica,
digestão da biomassa, extração supercrítica e outros (KUNASUNDARI;
SUDESH, 2011; KOSSEVA; RUSBANDI, 2018).
3.5.1 Digestão celular
A degradação do material celular e conservação dos grânulos de PHA são
os objetivos principais deste método de extração. O processo tende a utilizar
ácidos, compostos alcalinos ou enzimas (LÓPEZ-ABELAIRAS et al., 2015).
Inicialmente, agentes com grande potencial oxidativo como o hipoclorito de sódio
eram aplicados, porém se a concentração não for controlada adequadamente os
PHAs podem ser degradados juntamente com o material celular, reduzindo o
potencial de recuperação, sendo que este método está sendo substituído por
tratamentos enzimáticos (POSADA et al., 2011; KOSSEVA; RUSBANDI, 2018).
3.5.2 Extração por solvente
A extração direta com o uso de solventes é uma das técnicas mais
utilizadas no processo de extração e recuperação dos PHAs, sobretudo devido
a afinidade destes compostos com solventes orgânicos. O método consiste na
imersão da biomassa em um ou mais solventes. O solvente permeará a parede
celular, dissolvendo os grânulos de PHA e o polímero será recuperado através
da adição de um precipitante, que fará com que os grânulos inicialmente amorfos
se cristalizem e decantem (KESSLER et al., 2001; POSADA et al., 2011).
Dentre os solventes utilizados, os mais comuns são clorofórmio,
diclorometano e éter de petróleo, embora compostos como metanol e propanol
47
possam ser aplicados com rendimento reduzido (KUNASUNDARI; SUDESH,
2011; KOSSEVA; RUSBANDI, 2018).
As principais desvantagens deste método são o impacto ambiental e a
possível toxicidade do polímero devido a presença de resíduos de solvente. Isto
faz ainda com que a utilização do PHA extraído com solvente se torne inviável
nas indústrias de alimentos e na área biomédica devido ao potencial de migração
de traços de solvente para o organismo ou alimento (KOSSEVA; RUSBANDI,
2018).
3.5.3 Tratamento enzimático
O uso de enzimas proteolíticas para a dissolução da biomassa é vantajoso
pois reduz significativamente o risco de degradação do PHA. Devido a sua
seletividade, baixo custo energético e condições brandas de operação, o que
tem popularizado o sistema nos últimos anos. A desvantagem, refere-se ao custo
para a aquisição das enzimas, o que pode inviabilizar alguns processos. Porém,
o uso de processos contínuos ou fermentações em estado sólido utilizando
fungos como Aspergillus oryzae (produtor de proteases, fosfatases, lipases e
pectinases) permitem tornar o processo mais rentável (KACHRIMANIDOU et al.,
2013; MELIKOGLU; LIN; WEBB, 2013).
3.5.4 Tratamento ácido
O uso de ácidos como o clorídrico ou sulfúrico, para executar a digestão
do material celular apresenta potencial, contudo é necessário considerar certos
parâmetros. A concentração do ácido apresenta um papel importante na taxa de
degradação dos PHAs e possível redução das propriedades mecânicas do
polímero. Além disso, concentrações de ácido elevadas tendem a causar uma
redução no peso molecular do PHA e leves mudanças na taxa de resistência a
tensão mecânica. Outro ponto importante é que este método necessita de um
pós-tratamento para remover o resíduo de ácido, que podem permanecer
presentes após a recuperação do polímero (KESSLER et al., 2001; KOSSEVA;
RUSBANDI, 2018).
48
3.5.5 Ação mecânica
Dentre os métodos de ruptura mecânica, os mais comuns tendem a ser a
moagem com esferas e homogeneização em alta pressão. Estes métodos
causam poucas alterações ao polímero e possuem baixo impacto ambiental, as
principais desvantagens, no entanto, são o custo dos equipamentos e tempo de
processo. O que pode ocorrer ainda é a utilização dos métodos de ação
mecânica em conjunto com diferentes formas de extração (KIM et al., 2003;
KOSSEVA; RUSBANDI, 2018).
3.5.6 Tecnologia supercrítica
O uso de tecnologia supercrítica tem se tornado atraente para a indústria
devido a sua atoxicidade, e potencial de recuperação. O principal fluido utilizado
é o dióxido de carbono (CO2), pois o mesmo apresenta uma grande eficiência na
extração de lipídeos e demais compostos hidrofóbicos.
Contudo existem diversas formas de conduzir o processo, Hejazi;
Vasheghani-Farahani; Yamini (2003) utilizaram uma técnica empregando CO2 a
uma pressão de 200 atm e 40 ºC por 100 min e obtiveram uma taxa de extração
de 89 % do polímero retido por células de Ralstonia eutropha. Em contrapartida,
Khosravi-Darani et al. (2004) extraíram 81 % do total de P(3HB) de células de
Cupriavidus necator utilizando CO2 a 200 bar e 30 ºC juntamente com NaOH 4 %
(m/m). Os autores definem o NaOH como sendo utilizado para auxiliar o
rompimento da parece celular e facilitar o arraste do polímero para o meio.
Porém, algo interessante sobre a tecnologia supercrítica é o potencial de
aplicação não apenas na extração dos PHAs, mas também na purificação de
polímeros já extraídos, uma vez que a extração supercrítica permite obter um
produto com alto grau de pureza, obtendo em alguns casos polímeros com de
86 a 99 % de pureza (KESSLER et al., 2001; HEJAZI; VASHEGHANI-
FARAHANI; YAMINI, 2003; KUNASUNDARI; SUDESH, 2011; RIEDEL et al.,
2013; KOSSEVA; RUSBANDI, 2018). Daly et al. (2018), utilizaram CO2
supercrítico para remover resíduo de óleo vegetal para aplicação de P(3HB) na
área biomédica. O uso de CO2 como solvente a 150 bar e 50 ºC removeu cerca
49
de 73 % dos contaminantes, enquanto ensaios adicionados de etanol como co-
solvente elevaram a taxa de remoção de resíduos para 93 %.
3.5.7 Tecnologia de ultrassom
A tecnologia de ultrassom é usualmente empregada em conjunto com a
extração por solvente, utilizando solventes menos agressivos como o metanol.
A tecnologia de ultrassom permite aumentar a taxa de transferência de massa
no sistema, fazendo com que o solvente permeie mais facilmente a membrana
das células (KOSSEVA; RUSBANDI, 2018).
Outro ponto importante é o fato de a tecnologia de ultrassom causar
alterações desprezíveis nas propriedades mecânicas, peso molecular e estrutura
da cadeia dos PHAs. A técnica no entanto, pode também ser aplicada com o
intuito de remover toxinas presentes no meio, algo imprescindível para a
utilização destes PHAs pela indústria farmacêutica e de alimentos (JACQUEL et
al., 2008; ISHAK et al., 2016; KOSSEVA; RUSBANDI, 2018).
3.6 Considerações finais sobre o estado da arte
Considerando o que foi apresentado, percebe-se que existe a
possibilidade de utilizar coprodutos originados da agroindústria como substrato
para a produção de P(3HB). O efluente da indústria de balas e confeitos é rico
em açúcares e poderia ser utilizado como fonte de carbono na produção do
polímero. A água de maceração de milho e a água de parboilização de arroz,
também, podem ser aplicadas no processo por potencialmente serem substratos
viáveis ao cultivo de micro-organismos produtores de P(3HB) e por serem
facilmente obtidas uma vez que o Brasil é um grande produtor de ambos os
grãos.
Assim, o presente trabalho torna-se relevante no sentido que a redução
do custo do processo de produção do P(3HB) através do uso de coprodutos
agroindustriais de baixo valor agregado pode facilitar a difusão do mesmo no
mercado da indústria de alimentos como componente de embalagens
(dependendo da forma de extração) reduzindo o impacto ambiental oriundo da
utilização de plásticos tradicionais, bem como reduzir o custo do tratamento de
50
efluentes das indústrias e, possivelmente, agregar valor à coprodutos oriundos
do processamento de cereais. Além disso, o emprego de tecnologia supercrítica
como alternativa a extração do biopolímero permitirão, também, compreender
melhor o comportamento do processo de extração e purificação e sua viabilidade
em escala industrial.
51
4 Material e Métodos
Neste capítulo serão descritos o material e as metodologias empregadas
ao longo da fase experimental da produção de P(3HB) por Bacillus megaterium
ATCC 14581 em frascos agitados, biorreator batelada simples e alimentada,
utilizando meio mineral e coprodutos agroindustriais como substratos, bem como
as técnicas de recuperação de polímero.
4.1 Micro-organismo
A bactéria Bacillus megaterium ATCC 14581 foi utilizada durante os
ensaios. Ela foi adquirida da Fundação André Tosello e mantida em ultra freezer
(MDF-U3086S, Sanyo Electric Co., Japão), a -80 ± 2 ºC, em solução
crioprotetora (20 % glicerol) até o momento de sua utilização.
4.2 Coprodutos Agroindustriais
Para realizar os cultivos do micro-organismo, foram empregados 3
coprodutos da agroindústria de alimentos: água de parboilização de arroz (APA),
cedida pela Indústria Nelson Wendt (Pelotas, Rio Grande do Sul); água de
maceração de milho (AMM), cedida pela Corn Products (Mogi Guaçu, São Paulo)
e; efluente da lavagem de drageadeiras da indústria de balas (EIB), cedido por
uma indústria de balas e doces da região do Alto Uruguai.
O meio mineral e sulfato de amônio (2 g·L-1) foram utilizados para
enriquecer os efluentes, seguindo os parâmetros propostos por Faccin (2012) e
Hassemer (2016). A composição do meio mineral pode ser visualizada na Tabela
3.
Tabela 3 – Composição do meio mineral.
Composto Concentração
Na2HPO4 3,6 g·L-1
KH2PO4 1,5 g·L-1
FeSO4·7H2O 0,05 g·L-1
Ácido Cítrico 0,1 g·L-1
CaCl2·2H2O 0,01 g·L-1
MgSO4·7H2O 0,008 g·L-1
Solução de micronutrientes 1 mL·L-1
52
A solução de micronutrientes adicionada ao mio mineral foi composta por
300 mg·L-1 de ácido bórico (H3BO3), 200 mg·L-1 de cloreto de cobalto (CoCl2·6H2O),
30 mg·L-1 de sulfato de zinco (ZnSO4·7H2O), 30 mg·L-1 de cloreto de manganês
(MnCl2·4H2O), 30 mg·L-1 de sulfato de níquel (NiSO4·7H2O) e 10 mg·L-1 de sulfato
de cobre (CuSO4·5H2O).
Para a reativação e averiguação do comportamento da cepa microbiana,
foram também realizados cultivos utilizando meio mineral acrescido de sacarose
(16 g·L-1) e sulfato de amônio (2 g·L-1).
4.3 Pré-tratamento dos coprodutos
O tratamento dos resíduos agroindustriais teve como objetivo remover
parte dos sólidos suspensos e corantes presentes nos efluentes (Figura 8),
empregando metodologia descrita por Valduga et al. (2007).
Para a água de maceração de milho (AMM), o processo consistiu na
adição de ácido fosfórico até o pH 3,0. A AMM permaneceu em repouso por 24 h
a 25 ºC, sendo então centrifugados (MPW 351R, Rotor 11457, MPW Medical
Instruments, Polônia) por 15 min a 3000 x g. Após a centrifugação, ajustou-se o
pH para 4,0 utilizando solução de hidróxido de sódio 2 mol L-1.
Devido a presença de corantes no efluente da indústria de balas, utilizou-
se um tratamento com carvão ativado com granulação 12x40 mesh (CD 500,
Pelegrini Carbon, Brasil) para efetuar sua remoção. O efluente contendo 4 %
(m/v) de carvão foi aquecido a 80 ºC ± 2 ºC por 1 h sob agitação. Após este
período, o mesmo foi resfriado a 25 ºC, filtrado utilizando papel filtro qualitativo
(gramatura 80, poros 44 µm, espessura 2 mm) e terra diatomácea
(Perlimor, 851), e centrifugado (MPW 351R, Rotor 11457, MPW Medical
Instruments, Polônia) por 15 min a 3000 x g para remover o residual de carvão
ativado (URNAU, 2018).
53
Figura 8 – Coprodutos agroindustriais* utilizados na produção do biopolímero. *Da esquerda para a direita: frasco contendo água de maceração de milho (AMM 1), frasco
contendo água de maceração de milho (AMM 2), frasco contendo água de parboilização de arroz (APA) e frasco contendo efluente da indústria de balas (EIB).
4.4 Bioprodução de P(3HB) em frascos agitados
4.4.1 Ativação do micro-organismo
A cepa de B. megaterium foi adquirida sob a forma de “pellet” liofilizado,
sendo necessário realizar um processo de reativação da mesma. O cultivo
utilizou meio mineral acrescido de glicose (16 g·L-1) e fonte de nitrogênio (sulfato
de amônio, 2 g·L-1) a fim de verificar o comportamento da cepa de
B. megaterium, a viabilidade de produção de biomassa e P(3HB), bem como, a
evolução do pH.
O processo de ativação foi realizado adaptando os parâmetros
empregados por Faccin (2012) e Hassemer (2016). A ativação ocorreu em estufa
rotatória (430 RDBP, Nova Ética, Brasil) utilizando frascos com volume de
250 mL, contendo 50 mL de meio. O cultivo teve duração de 96 h (30 ºC,
180 rpm), sendo que a cada 24 h, alíquotas de 1 mL da cultura eram repicadas
em novos frascos contendo meio mineral estéril. Durante os momentos de
repique, também foram colhidas amostras para avaliação de pH (pHmetro DM-
22, Digimed, Brasil), massa seca total e P(3HB).
4.4.2 Elaboração do pré-inóculo para os diferentes meios de cultura
Após a ativação do micro-organismo, o mesmo foi armazenado a -80 ºC,
fazendo com que seja necessária a realização de um pré-inóculo antes de se
54
iniciar os cultivos. O pré-inóculo consistiu na adição de 2 mL de solução
crioprotetora (B. megaterium) a meio mineral contendo sacarose e sulfato de
amônio (16 g∙L-1 e 2 g∙L-1, respectivamente), com pH inicial ainda sendo ajustado
para 7,0 com solução de HCl 0,1 M e NaOH 0,1 M.
O cultivo foi mantido a 30 ºC sob agitação (180 rpm) por 16 h. Após o
período de incubação, o mesmo foi padronizado para uma densidade ótica de
1,0 (625 nm) (Cary-8553, Agilent, Estados Unidos), utilizando meio estéril.
Terminada a padronização, adicionou-se 1 mL do mesmo aos meios de teste
(HASSEMER, 2016).
4.4.3 Cultivo inicial em meio mineral
Após a ativação da cepa, realizaram-se cultivos com meio mineral
contendo 16 g∙L-1 de sacarose e 2 g∙L-1 de fonte de nitrogênio (sulfato de
amônio) e pH inicial ajustado para 7,0 com solução de HCl 0,1 M e NaOH 0,1 M.
Os cultivos tiveram duração de 36 h e empregaram os mesmos parâmetros de
agitação e temperatura, previamente citados. Amostras foram colhidas em
intervalos de 4 h e submetidas a quantificação de carbono orgânico total (COT),
nitrogênio total (NT), massa seca, P(3HB) e pH (HASSEMER, 2016).
4.4.4 Efeitos da composição do meio à base de coprodutos agroindustriais na produção de P(3HB)
Para avaliar os efeitos da composição do meio de cultura a base de
coprodutos agroindustriais no crescimento da cultura e na produção do polímero,
empregou-se um planejamento do tipo Delineamento Composto Central
Rotacional (DCCR) 23 com 5 repetições no ponto central. Cultivos em meio
mineral foram utilizados como controle.
Os níveis das variáveis foram definidos levando em consideração os
resultados encontrados nos cultivos com meio mineral, utilizando as
concentrações finais de fonte de carbono encontradas nestes cultivos como nível
mínimo. As variáveis independentes estudadas e os respectivos níveis do
planejamento encontram-se descritos na Tabela 4.
55
Tabela 4 – Níveis das variáveis utilizadas no planejamento DCCR 23 para produção de P(3HB) (planejamento 1).
Variáveis Independentes
Códigos Unidade Níveis (fonte de carbono)
-1,68 -1 0* +1 +1,68
EIB X1 g∙L-1 11,73 29,59 55,87 82,14 100,00
AMM X2 g∙L-1 1,43 1,68 2,03 2,37 2,90
APA X3 mg∙L-1 6,40 20,00 40,00 60,00 73,60 *Repetição do ponto central
As variáveis independentes foram a temperatura (30 ºC), agitação
(180 rpm) e tempo de bioprodução (28 h) e pH inicial ajustado para 7,0 com
solução de HCl 0,1 M e NaOH 0,1 M (HASSEMER, 2016). Os experimentos
iniciais foram realizados em estufa rotatória (430 RDBP, Nova Ética, Brasil) a
30 °C, 180 rpm por, 28 h, em erlenmeyers com volume total de 250 mL. Cada
frasco contendo 50 mL de meio de cultura. As variáveis dependentes (respostas)
avaliadas foram: massa seca total, P(3HB) (g·L-1), P(3HB) em relação a massa
seca (%) e pH.
4.4.5 Maximização da bioprodução
Com base nos resultados obtidos no planejamento 1, um novo
planejamento experimental DCCR 22 (planejamento 2) foi realizado a fim de
maximizar a produção de biomassa e do polímero, sendo que os níveis das
variáveis independentes se encontram descritos na Tabela 5.
Tabela 5 – Níveis das variáveis utilizadas DCCR 22 para produção de P(3HB) (planejamento 2).
Variáveis Independentes
Códigos Unidade Níveis (fonte de carbono)
-1,68 -1 0* +1 +1,68
EIB X1 g∙L-1 6,00 10,07 20,00 29,93 55,00
AMM X2 g∙L-1 0,00 0,43 1,46 1,89 2,50 *Repetições do ponto central; APA: 40 mg·L-1.
Os cultivos tiveram duração de 28 h, com temperatura de 30 ºC e agitação
de 180 rpm. De acordo com os resultados do planejamento, também foram
realizados testes utilizando EIB e APA acrescidos de meio mineral e fonte de
nitrogênio (2 g∙L-1) em diferentes concentrações (EIB puro, EIB + APA (50 %
v/v), EIB 16 g∙L-1 de COT e EIB + APA g∙L-1 de COT). Estes ensaios utilizaram
56
os mesmos parâmetros de duração, temperatura e agitação empregados ao
longo dos cultivos do DCCR 22.
Além disso, 4 ensaios foram realizados sem a adição de AMM, de forma
a verificar a influência da mesma sobre o rendimento do processo como um todo.
O primeiro ensaio utilizou EIB puro, com uma quantidade de COT de
aproximadamente 150 g∙L-1. O segundo consistiu na utilização de EIB e APA em
uma proporção de 50 % (v/v). O terceiro e o quarto ensaio foram conduzidos com
base nos dados apresentados por Faccin (2012), Hassemer (2016) e Wang &
Lee (1997), e utilizaram EIB e APA em volume suficiente para obter uma
concentração de 16 g∙L-1 de COT.
4.5 Bioprodução de P(3HB) em biorreator batelada simples
Os cultivos batelada simples em biorreator (1,5 L) foram realizados em um
frasco fermentativo com volume total de 2 L (Biostat B, B. Braun Biotech
International Co., Alemanha). O frasco, contendo 1,5 L de meio de cultura,
permanece acoplado a uma unidade de controle que permite o monitoramento
da velocidade de agitação do meio de cultura. A aeração do sistema foi realizada
utilizando ar ambiente bombeado via compressor (Inalar Compact, NS, Brasil).
Neste conjunto de cultivos, um planejamento fatorial 22 (planejamento 3),
variando-se a aeração e agitação foi utilizado (Tabela 6), mantendo-se fixo o
tempo de bioprodução de 32 h e temperatura de 30 ºC, através da circulação de
água pelas paredes externas do fermentador. As variáveis dependentes
(respostas) avaliadas foram: massa seca total, P(3HB), porcentagem de P(3HB)
em relação a massa seca e pH.
Tabela 6 – Níveis das variáveis independentes utilizadas no planejamento fatorial 22 para produção de P(3HB) (planejamento 3).
Variáveis Independentes Códigos Unidade Níveis
-1 0* 1
Aeração X1 vvm 1 2,5 4
Agitação X2 rpm 100 300 500 *Repetições do ponto central
57
4.6 Parâmetros cinéticos e estequiométricos da bioprodução
Com o objetivo de obter parâmetros estequiométricos e verificar a cinética
de consumo de substrato (carbono e nitrogênio), produção celular e produção de
P(3HB) realizaram-se coletas em diferentes pontos do processo. Para a
bioprodução em frascos agitados e batelada simples, 10 mL de amostra foram
coletados a cada 4 h, possibilitando assim, a construção das curvas cinéticas
para cada condição de cultivo.
4.6.1 Velocidades instantâneas e específicas globais
A partir dos perfis de concentração celular global, formação de produto
global e consumo de substrato global (carbono orgânico total - COT e nitrogênio
total - NT) em relação ao tempo, foi possível determinar, através de balanço de
massa para cada componente, as velocidades de crescimento microbiano (rx),
formação de produto (rp) e consumo de substrato (rc e rn) descritas nas Equações
2, 3, 4 e 5, conforme Bailey et al. (1986).
𝑟𝑥 =𝑑𝑋
𝑑𝑡 (2)
𝑟𝑝 =𝑑𝑃
𝑑𝑡 (3)
𝑟𝑐 =𝑑𝐶
𝑑𝑡 (4)
𝑟𝑛 =𝑑𝑁
𝑑𝑡 (5)
Dividindo-se o valor de rx pela concentração celular naquele instante, a
velocidade específica de crescimento (μx), foi obtida (Equação 6), conforme
Bailey et al. (1986).
𝜇𝑥 =𝑟𝑥
𝑋 (6)
A determinação das velocidades constantes (fase exponencial), foi
realizada através do coeficiente angular da melhor reta ajustada nas curvas que
representam as cinéticas de crescimento e produção de P(3HB).
58
4.6.2 Fatores de conversão global
4.6.2.1 Produto
O fator de conversão de carbono orgânico global em P(3HB), YP/C
(g P(3HB)·g COT-1), foi expresso pela Equação 7.
𝑌𝑃𝐶⁄ =
𝑟𝑝
𝑟𝑐= −
𝑑𝑃
𝑑𝐶 (7)
O fator de conversão de nitrogênio global em P(3HB), YP/N
(g P(3HB)·g NT-1), foi expresso pela Equação 8.
𝑌𝑃𝑁⁄ =
𝑟𝑝
𝑟𝑛= −
𝑑𝑃
𝑑𝑁 (8)
4.6.2.2 Fatores de conversão celular
O fator de conversão de carbono orgânico global em células, YX/C
(g células·g COT-1), foi expresso pela Equação 9.
𝑌𝑋𝐶⁄ =
𝑟𝑥
𝑟𝑐= −
𝑑𝑋
𝑑𝐶
(9)
O fator de conversão de nitrogênio global em células, YX/N (g células·g NT-
1), foi expresso pela Equação 10.
𝑌𝑋𝑁⁄ =
𝑟𝑥
𝑟𝑛= −
𝑑𝑋
𝑑𝑁
(10)
A relação entre a produção de P(3HB) e a produção de células global, YP/X
(g P(3HB)·g células-1), foi expressa pela Equação 11.
𝑌𝑃𝑋⁄ =
𝑟𝑝
𝑟𝑥= −
𝑑𝑃
𝑑𝑋 (11)
Onde: rx = velocidade de crescimento das células (g·L·h-1); rn = velocidade
de consumo de nitrogênio (g·L·h-1); rc = velocidade de consumo de carbono
orgânico (g·L·h-1); rp = velocidade de produção de P(3HB) (g·L·h-1).
59
4.6.3 Produtividade global
A produtividade global tanto para células como para P(3HB) é definida,
como as velocidades rx e rp, segundo Bailey et al. (1986).
4.7 Efeito do potencial de oxirredução na produção de P(3HB)
Os ensaios avaliando o efeito do potencial de oxirredução na produção de
P(3HB) por B. megaterium foram desenvolvidos no laboratório de Rotas
Metabólicas do departamento de Engenharia Química e Biológica da
Universidade de Saskatchewan (Saskatoon, SK, Canadá) sob a orientação do
Prof. Dr. Yen-Han Lin. A metodologia empregada seguiu o que foi proposto por
Guo (2018) com modificações.
Os ensaios foram conduzidos em um vaso fermentativo (Omni Culture,
Nova York, Estados Unidos), com um volume de trabalho de 1L. A temperatura
do sistema foi mantida em 30 ºC utilizando um banho termostatizado, com os
ensaios tendo duração de 28 h e 48 h. O fermentador possui também um sensor
POR (Pt4805-DPAS-SC-K8S, Mettler-Toledo, Billerica, Estados Unidos)
conectado ao sistema através de um transmissor multi-parâmetro (M400,
Mettler-Toledo, Billerica, Estados Unidos). Os sinais detectados pelo eletrodo
foram enviados a um controlador DAS/SSR desenvolvido pelo departamento de
engenharia química e biológica da Universidade de Saskatchewan. Os dados
coletados forma processados através do software LabView 2017 (National
Instruments, Austin, Estados Unidos).
Agitação foi mantida em 500 rpm e taxa de aeração foi controlada via uma
bomba automática (Whisper 60, Tetra, Blacksburg, Estados Unidos) baseada na
leitura do eletrodo de potencial redox. O controle de aeração foi realizado através
do software LabView, onde a bomba de ar era ativada ao passo que o valor de
POR detectado atingisse um valor mínimo (-40 mV, -20 mV, 0 mV). Foram
realizados também ensaios sem controle de POR, sendo que nestes casos a
bomba de aeração permaneceu ativa ao longo do período de cultura.
60
4.8 Metodologia Analítica
Ao longo do estudo, diversas metodologias foram empregadas para
quantificação de diferentes compostos presentes nos meios de cultura, bem
como, a presença de P(3HB). Os métodos utilizados encontram-se descritos na
sequência.
4.8.1 Densidade
O perfil de densidade dos coprodutos foi realizado utilizando um
densímetro (Baumé, Labsynth, Brasil) com escala 0/20. Os testes foram
realizados sob temperatura de 25 ºC com água destilada como controle
(INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 2008).
4.8.2 Carbono orgânico e nitrogênio total
As concentrações de carbono orgânico total (COT) e de nitrogênio total
(NT) presentes nos efluentes e nos meios de bioprodução foram determinadas
utilizando um analisador de carbono (TOC-V CSH, Shimadzu, Japão) e um
analisador de nitrogênio (TNM-1, Shimadzu, Japão) acoplados a um injetor
automático e utilizando ar sintético como gás de arraste. A interface de coleta de
dados utilizada foi o sistema TOC Control-V.
A concentração de COT foi medida pelo método indireto, ou seja,
utilizando as reações de oxidação do carbono orgânico e inorgânico presentes
na amostra para determinar o carbono orgânico total.
4.8.3 Minerais totais e componentes minerais
A caracterização do perfil mineral do EIB e de dois lotes de AMM foi
realizada utilizando o método de minerais totais (cinzas) onde as amostras foram
incineradas em forno mufla (400C, Fornos Lavoisier, Brasil) a 550 ºC por
aproximadamente 7 h, até a obtenção de cinzas claras com peso constante
(INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 2008).
Os mesmos coprodutos foram também submetidos a quantificação da
concentração dos componentes minerais específicos (Ca, Cu, Fe, Mg, Na e Zn).
61
Esta análise foi realizada por espectrometria de absorção atômica em chama
FAAS (AA-55, Varian Inc., Estados Unidos), empregando como fonte de
radiação, lâmpadas de cátodo oco específicas para cada um dos minerais e
chama de ar/acetileno e óxido nitroso/acetileno. As leituras de Mg e Fe foram
realizadas no FAAS, no modo absorção. Para eliminar possíveis interferências
foi adicionado cloreto de lantânio 1 % na determinação de Mg e Ca, solução de
Ca a 1000 ppm, para determinação do elemento Fe. Os cálculos dos teores dos
minerais nas amostras foram baseados em curvas de calibração obtida com as
soluções padrão de cálcio (0,5 a 50 mg·L-1), cobre (0,2 a 2 mg·L-1), ferro (0,5 a
4 mg·L-1), magnésio (0,5 a 50 mg·L-1), sódio (1 a 100 mg·L-1) e zinco (0,2 a
3 mg·L-1).
4.8.4 Biomassa total
A determinação de biomassa total nos ensaios de bioprodução foi
realizada através da metodologia utilizada por Hassemer (2016), para isto, as
amostras foram centrifugadas (MPW 351R, Rotor 11457, MPW Medical
Instruments, Polônia) 3 vezes a 3000 x g por 15 min, com o sobrenadante sendo
removido e o precipitado lavado com água destilada entre as centrifugações. A
biomassa precipitada foi então mantida em estufa (NV-1.3, Nevo, Brasil) a 50°C,
até atingir peso constante.
4.8.5 Recuperação de P(3HB) via extração química
A quantidade de polímero produzida ao longo dos cultivos foi extraída
utilizando e quantificada adaptando a metodologia empregada por Faccin (2012)
e Hassemer (2016).
Para realizar a extração, 10 a 40 mg de biomassa seca foram pesadas
em tubos de ensaio com rolha e tampa de rosca. Adicionou-se 2 mL de 1,2-
dicloroetano, 2 mL de n-propanol acidificado (20 % HCl) e 200 μL de controle
interno (50 mL de n-propanol com 2 g de ácido benzoico).
Os tubos com amostra foram então aquecidos em banho termostatizado
(521/30 Nova Ética, Brasil) a 80 ºC por 3 h com agitação a cada 20 min para
acelerar a permeação dos solventes. Ao fim do aquecimento, os tubos foram
62
mantidos em repouso até atingirem temperatura ambiente, recebendo então
4 mL de água destilada e agitação para promover a separação dos solventes
(Figura 9).
Figura 9 – Separação de fases de diferentes amostras. Controle negativo (A), amostras com células (B e C).
4.8.6 Recuperação de P(3HB) por tecnologia supercrítica
A recuperação de P(3HB), por fluído supercrítico utilizou dióxido de
carbono (CO2) como o fluído pressurizado. Foi também avaliado o efeito da
adição de co-solventes (propanol e etanol) na taxa de recuperação do polímero.
O sistema de extração supercrítica consistiu em uma bomba de CO2 de alta
pressão (260D Syringe pump, Teledyne, Estados Unidos); um banho
termostatizado (TE 184, Tecnal, Brasil); Bomba de deslocamento positivo para
adição do co-solvente (Lab Alliance Série III, Estados Unidos); um vaso de
extração encamisado com 145 cm3 de volume (30,7 cm de comprimento com
diâmetro interno de 2,45 cm). A temperatura de extração foi controlada utilizando
um banho termostatizado (MA-184, Marconi, Brasil). As válvulas, termopar,
manômetro e indicadores de temperatura e pressão estão também presentes na
unidade (Figura 10).
A recuperação de P(3HB) foi conduzida de acordo com a metodologia
proposta por Daly et al. (2018). Para isto, 2 g de biomassa seca foram
adicionadas ao cilindro de extração, juntamente com 50 mL de co-solvente. Na
sequência, CO2 é adicionado ao sistema até ele atingir uma pressão de 150 bar.
Após a estabilização da pressão, inicia-se o aquecimento do sistema até que
atingir uma temperatura de 50 ºC. Com pressão e temperatura estabilizadas, dá-
se início ao processo de recuperação do polímero. O extrato obtido ao longo
A B C
63
desta etapa é seco em estufa a vácuo (Q819V2, Quimis, Brasil) para a remoção
de resíduos de solvente. Por fim, o extrato bruto é então resuspendido em 2 mL
de 1,2-dicloroetano contendo 200 μL de controle interno (50 mL de n-propanol
com 2 g de ácido benzoico) e quantificado via cromatografia gasosa. Testes
preliminares buscaram avaliar a cinética de recuperação de P(3HB), o período
de extração de 5 min a 60 min, e o efeito da adição de etanol (Tratamento 1) e
propanol (Tratamento 2) foram avaliados.
Figura 10 – Diagrama do sistema de extração por fluído supercrítico. V-1, V-2, V-3
e V-4: válvula macrométrica de agulha; V-5: válvula micrométrica de agulha; R-1: cilindro de CO2; R-2: reservatório de co-solvente; R-3: coletor do extrato; P-1: bomba de seringa; P-2: bomba do co-solvente; E-1 vaso de extração; B-1, B-2: banho termostatizado; T-1: termopar; M-1:
manômetro (SANTOS et al., 2017, adaptado).
4.8.7 Quantificação de P(3HB)
Para a quantificação de P(3HB) foi utilizada a metodologia proposta por
Faccin (2012), utilizando um cromatógrafo gasoso (CG-2010, Shimadzu, Japão)
com amostrador e injetor automático (AOC-20i e AOC-20s, respectivamente) e
detector de ionização de chama (FID). O gás de arraste utilizado foi N2 com uma
vazão de 2 mL∙L-1. A coluna utilizada foi Rtx-Wax (30 m x 0,25 mm) com uma
64
temperatura inicial de 120 ºC com aumento de 10 ºC por minuto até 190 ºC. A
temperatura do injetor e do detector permanecem em 250 ºC ao longo da corrida.
Para cada experimento foi utilizada uma curva de calibração (de 0,005 g
a 0,040 g) com P(3HB) padrão (Sigma-Aldrich) a fim de diminuir a margem de
erro decorrente de possíveis variações na temperatura do processo de extração.
4.9 Avaliação estatística dos resultados
Os resultados foram tratados estatisticamente mediante metodologia de
planejamento de experimentos e pela análise de variância - ANOVA,
comparação de médias pelo teste de Tukey, com auxílio do software
STATISTICA versão 5.0 (StatSoft/Dell, USA), com 95% de confiança.
65
5 Resultados e Discussão
Neste item serão apresentados os resultados e discussões referentes a
caracterização dos diferentes agroindustriais e da bioprodução de P(3HB) em
frascos agitados e biorreator batelada simples, bem como, da recuperação do
polímero.
5.1 Caracterização dos coprodutos agroindustriais
A Tabela 7 apresenta a densidade dos coprodutos da agroindústria (água
de parboilização de arroz - APA, água de maceração de milho – AMM e efluente
da indústria de balas - EIB), bem como a composição dos coprodutos
agroindustriais, em termos de carbono e nitrogênio total.
Tabela 7 – Concentração de carbono orgânico total (COT) e nitrogênio total (NT) dos coprodutos agroindustriais.
Coprodutos NT
(g∙L-1) COT (g∙L-1)
Densidade (g∙cm-3)
APA 0,160e ± 0,025 0,434g ± 0,195 1,002d ± 0,012 EIB (Lote 1) 0,009f ± 0,001 249,50a ± 3,50 1,245a ± 0,016 EIB (Lote 2) 0,002g ± 0,0002 171,75b ± 0,650 1,210a ± 0,010
AMM Bruta (Lote 1) 40,34d ± 0,787 1,69e ± 0,067 1,025c ± 0,004 AMM Bruta (Lote 2) 56,14a ± 0,710 1,32f ± 0,054 1,040b ± 0,006
AMM Tratada (Lote 1) 6,29b ± 0,685 18,47d ± 0,390 - AMM Tratada (Lote 2) 4,23c ± 0,296 24,87c ± 0,225 -
*Média ± desvio padrão seguida de letras iguais/colunas indicam não haver diferença significativa á nível de 95% de confiança (Teste de Tukey).
De modo geral, os coprodutos apresentaram valores de densidade
similares, exceto ambos os lotes de AMM bruta que apresentaram maior
densidade média (p<0,05). Isto se dá devido a este composto se tratar de uma
mistura heterogênea e apresentar grande quantidade de sólidos em suspensão.
Os dados obtidos para AMM estão de acordo com o que é apresentado pela
literatura, que aponta a densidade média na faixa de 1,2 a 1,4 g∙cm-3 (HOFER et
al., 2018; USDA - UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE, 2010).
Em relação aos valores de NT e COT, torna-se evidente que dentre todos
os coprodutos, a AMM Bruta (Lote 2) apresentou a maior (p<0,05) concentração
de nitrogênio total e a menor (p<0,05) quantidade de carbono orgânico. Em
66
contrapartida, a EIB (Lote 1) teve um comportamento inverso, com alta
concentração de carbono orgânico e menor de nitrogênio total.
Outro ponto importante é o fato de que o pré-tratamento da AMM reduziu
significativamente (p<0,05) a concentração de nitrogênio e aumentou a
concentração de carbono, sendo que os lotes 1 e 2 apresentaram uma redução
de 84,39 e 92,45 % no teor de nitrogênio. Em ambos os lotes, no entanto, a
concentração de carbono aumentou em aproximadamente 10 vezes. Urnau
(2018) verificou um comportamento similar, onde após o tratamento da AMM, a
concentração de nitrogênio diminuiu cerca de 83,16 %, enquanto a concentração
de carbono orgânico aumentou 334,19 %.
Em relação a APA, nota-se que ela apresenta teores baixos de nitrogênio
e de carbono, diferindo significativamente (p<0,05) dos demais coprodutos. A
caracterização de carbono e nitrogênio é importante, para definir a composição
destes nutrientes no meio de cultivo.
A quantificação do teor de carbono e nitrogênio é necessária para garantir
que o meio de cultura irá suprir as necessidades do micro-organismo ao longo
do período de cultivo. Outro ponto a ser ressaltado é que a AMM foi submetida
ainda a um pré-tratamento (conforme item 4.3) de modo a verificar se ele
causaria alterações na quantidade de carbono e nitrogênio presentes.
Após a determinação das concentrações de nitrogênio total e carbono
orgânico, avaliou-se os componentes minerais (Ca, Cu, Fe, Na, Mg e Zn) dos
coprodutos brutos (Tabela 8).
Tabela 8 – Composição mineral (Ca, Cu, Fe, Na, Mg e Zn) dos coprodutos agroindustriais.
Coprodutos (Brutos)
Componentes minerais (mg∙L-1)
Ca Cu Fe Na Mg Zn
APA 36,5a ± 3,5 N/D N/D 75,5a ± 4,5 36,5a ± 6,5 N/D EIB (Lote 1) 4,8b ± 0,2 N/D N/D 5,5b ± 1,5 0,8d ± 1,5 N/D EIB (Lote 2) 2,0c ± 0,5 N/D N/D 4,0b ± 1,0 N/D N/D
AMM (Lote 1) 0,8d ± 0,2 0,5b ± 0,1 0,9b ± 0,3 2,7bc ± 0,5 4,6c ± 0,2 0,7a ± 0,1 AMM (Lote 2) 0,9d ± 0,3 1,5a ± 0,3 1,4a ± 0,2 2,0c ± 0,4 5,7b ± 0,3 0,9a ± 0,2
*Média ± desvio padrão seguida de letras iguais/colunas indicam não haver diferença significativa á nível de 95% de confiança (Teste de Tukey). N/D – Não detectado
67
Em relação ao teor de minerais totais da AMM do Lote 1 (4,052 ± 0,37 g)
difere estatisticamente (p<0,05) do Lote 2 (2,031 ± 0,23 g), uma vez que o Lote
1, também, apresentou uma densidade levemente superior que o Lote 2.
Os dados encontrados mostram que dentre os componentes avaliados,
as maiores concentrações de cálcio, sódio e magnésio foram encontradas na
amostra de APA. As amostras de EIB apresentam valores intermediários para
cálcio e sódio, contudo a concentração de cálcio do lote 2 foi significativamente
menor (p<0,05) que o valor encontrado nas amostras do lote 1 de EIB. Para os
índices de cobre, ferro e zinco, ambos permaneceram abaixo do limite de
detecção do método em ambos os lotes.
Os lotes de AMM em contrapartida, possuíram os menores valores de
cálcio e foram os únicos coprodutos que apresentaram traços de cobre, ferro e
zinco, com AMM Lote 2 sendo significativamente (p>0,05) mais rica nestes
componentes. Para o sódio, os valores encontrados foram os mais baixos,
contudo não foi notada diferença significativa (p<0,05) entre os lotes de AMM.
Focando na concentração de magnésio presente, neste caso houve uma
diferença significativa (p>0,05) entre os lotes de AMM, com o Lote 1
apresentando uma concentração maior que o Lote 2.
Observando os valores que se referem a concentração de minerais
presentes nas diferentes amostras, é possível perceber que os valores obtidos
para AMM foram maiores do que os dados encontrados por Hofer et al. (2018),
com valores de cobre, cálcio e zinco consideravelmente mais elevados
(0,005 mg∙g-1, 0,361 mg∙g-1, 0,105 mg∙g-1 respectivamente). Em contrapartida, a
concentração de magnésio foi menor do que o reportado pelos mesmos autores
(6,4 mg∙g-1).
O perfil mineral da APA em contrapartida, permaneceu consideravelmente
abaixo dos valores encontrados por Colet et al. (2017), sobretudo no que se
refere a quantidade de sódio e cálcio. Os dados encontrados apontam também
que o EIB apresenta baixo teor de minerais, com os maiores sendo cálcio e
sódio, algo previsível, uma vez que este efluente é oriundo da lavagem das
drageadeiras utilizados na produção de balas e confeitos. Além disso, é possível
68
perceber ainda que o EIB de modo geral, apresenta baixa quantidades de
minerais, com valores de Cu, Fe e Zn abaixo do limite de detecção do método.
Isto indica que a utilização do EIB, como único componente do meio de cultura,
que acarretará em deficiência de componentes minerais necessários para a
manutenção do metabolismo celular (MUTIARA et al., 2014; GRUMEZESCU;
HOLBAN, 2018).
5.2 Produção P(3HB) em frascos agitados
O cultivo de B. megaterium para a produção de P(3HB) foi realizado
utilizando substratos sintéticos, como controle, bem como meio de cultura
elaborados com diferentes concentrações de coprodutos industriais.
5.2.1 Cultivos com substratos sintéticos
Por se tratar de uma cepa microbiana liofilizada, inicialmente um cultivo
de 96 h (30º C, 180 rpm) foi realizado utilizando meio mineral acrescido de
glicose e fonte de nitrogênio a fim de reativar o microrganismo e verificar o
comportamento da cepa de B. megaterium, observando também a viabilidade de
produção de biomassa e P(3HB) (Figura 11).
Figura 11 – Comportamento de B. megaterium após 96 h de cultivo em meio sintético.
69
Observando a Figura 11, percebe-se que a máxima produção de P(3HB)
ocorre próximo a 24 h. Após este período é possível visualizar uma queda
considerável na concentração de P(3HB) e na concentração de biomassa total,
indicando que após 24 h ocorre um consumo de produto por parte das células,
devido à ausência de algum nutriente ou excesso de metabólitos secundários
secretados pelas próprias células (MCCOOL et al., 1996; VALAPPIL et al., 2007).
A partir dos resultados obtidos, na sequência realizou-se experimentos
utilizando meio mineral acrescido de sacarose (16 g·L-1) e sulfato de amônio
(2 g·L-1), por um período de 36 h, cultivo a 30 ºC, 180 rpm. Os resultados da
produção do biopolímero, evolução do pH, biomassa e consumo de substratos
(COT e NT) estão apresentados na Figura 12.
Figura 12 – Comportamento de B. megaterium em termos de pH (A), concentração do biopolímero, biomassa e consumo de substratos (B) após 36 h de cultivo em meio mineral acrescido de sacarose e fonte de nitrogênio.
A
B
70
De acordo com a Figura 12, a fase de crescimento exponencial da cultura
ocorreu no período de 6 a 24 h, estando de acordo com o que é reportado em
outros estudos (KULPREECHA et al., 2009; LUNA et al., 2014; HASSEMER,
2016). O comportamento do pH, também, ficou dentro do que foi descrito na
literatura, com acidificação moderada do meio ao longo do período, sobretudo
entre 12 e 16 h, seguido de gradual estabilização na faixa próxima a 4,5.
Em relação ao consumo de COT, nota-se que houve uma redução gradual
até aproximadamente 12 h de cultivo. Após este período a concentração de COT
apresentou um período de estabilização (aproximadamente 12 g·L-1), seguindo
com pequenas oscilações até 28 h, seguido de uma considerável queda em 36
h (9 g·L-1). Para NT, no entanto, o comportamento apresentou maiores níveis de
oscilação, com uma redução entre 4 e 8 h (de 2,2 para 1,6 9 g·L-1), seguido e
aumento da concentração durante o período de 12 a 20 h (1,7 a 1,8 g·L-1) e
subsequente estabilização (ao considerar os desvios padrão) até o final do
cultivo (aproximadamente 1,6 g·L-1).
A máxima produção do biopolímero ocorreu entre 24 e 28 h de cultivo,
sendo que após este período ocorreu uma redução na concentração de P(3HB),
possivelmente, oriunda de alterações no metabolismo celular, que promovem o
consumo dos grânulos de polímero pelas células. Assim sendo, os ensaios
subsequentes realizados em frascos agitados foram mantidos por 28 h, com o
intuito de maximizar a produção de P(3HB) por B. megaterium ATCC 14581.
Todavia, algo que deve ser considerado em relação a concentração de
biomassa obtida, quando comparada a estudos da literatura (Hassemer, 2016),
que utilizou meio mineral acrescido de sacarose e condições de cultivo similares
com a B. megaterium DSMZ 32T, no qual obteve 4,48 g·L-1 de biomassa. Este
comportamento está relacionado a diferenças metabólicas entre as cepas. Pillai
et al. (2017), em contrapartida, cultivaram B. aryabhattai em meio basal com
glicose e obtiveram, após 48 h, 4,36 g·L-1 de biomassa, com 74,89 % de P(3HB)
(3,26 g·L-1). Comparando os resultados encontrados neste estudo, há similares
aos apresentados na literatura, percebe-se a viabilidade da utilização da cepa
B. megaterium ATCC 14581 para produção de P(3HB).
71
5.2.2 Cultivos com coprodutos agroindustriais
A partir dos resultados obtidos em frascos agitados com meio sintético,
avaliou-se os efeitos da composição do meio de cultivo a base de coprodutos
agroindustriais brutos (EIB, AMM e APA), utilizando um planejamento DCCR 23.
A matriz do planejamento DCCR 23 (valores reais e codificados) e as respostas
em termos de biomassa total (massa seca), P(3HB) e pH encontram-se descritos
na Figura 13 e Tabela 9.
Os dados obtidos durante este planejamento apontam que a maior
concentração de massa seca foi de 17,70 g·L-1 (Ensaio 8), enquanto a maior
concentração de P(3HB) encontrada foi de 9,92 g·L-1 (Ensaio 12). Um fator
interessante encontrado ao longo destes ensaios foi a baixa variação no pH entre
os mesmos, com o menor valor encontrado sendo de 3,96 (Ensaio 7) e o máximo
4,19 (Ensaio 16), isto sugere um possível efeito tamponante da água de
maceração de milho em função da alta quantidade de sólidos presentes no
mesmo (USDA - UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE., 2010;
ARAÚJO et al., 2015; HOFER et al., 2018).
72
Figura 13 – Concentração de carbono orgânico e nitrogênio total após 28 h de cultivo para planejamento DCCR 23 utilizando coprodutos brutos (planejamento 1).
73
Tabela 9 – Matriz do planejamento DCCR 23 (valores reais e codificados) e respostas em termos de massa seca, P(3HB) e pH (planejamento 1).
Ensaio
Variáveis Independentes (g∙L-1 de COT)*
Respostas
Massa Seca (g∙L-1)
P(3HB) (g∙L-1)
P(3HB) (%)
pH X1 X2 X3
1 -1 (29,6) -1 (1,68) -1 (0,02) 8,21 ± 0,47 3,80 ± 0,87 45,76 ± 3,81 4,05 ± 0,12
2 -1 (29,6) -1 (1,68) 1 (0,06) 8,38 ± 0,08 0,49 ± 1,40 5,79 ± 1,45 4,10 ± 0,34
3 -1 (29,6) 1 (2,37) -1 (0,02) 17,00 ± 0,86 5,98 ± 2,23 35,20 ± 2,36 3,99 ± 0,31
4 -1 (29,6) 1 (2,37) 1 (0,06) 13,65 ± 0,33 6,96 ± 2,13 52,26 ± 2,54 4,09 ± 0,28
5 1 (82,14) -1 (1,68) -1 (0,02) 8,43 ± 0,035 4,76 ± 0,13 56,44 ± 3,68 4,08 ± 0,18
6 1 (82,14) -1 (1,68) 1 (0,06) 8,36 ± 0,26 5,44 ± 1,06 63,09 ± 4,18 4,06 ± 0,41
7 1 (82,14) 1 (2,37) -1 (0,02) 12,51 ± 1,57 7,51 ± 3,28 53,33 ± 4,36 3,96 ± 0,33
8 1 (82,14) 1 (2,37) 1 (0,06) 17,70 ± 2,05 5,54 ± 0,10 31,33 ± 3,69 4,03 ± 0,18
9 -1,68 (11,73) 0 (2,03) 0 (0,04) 9,64 ± 1,60 4,71 ± 1,54 47,58 ± 2,24 4,16 ± 0,26
10 1,68 (100) 0 (2,03) 0 (0,04) 10,08 ± 1,94 6,39 ± 1,06 53,20 ± 3,35 4,08 ± 0,42
11 0 (55,87) -1,68 (1,43) 0 (0,04) 7,39 ± 0,010 3,92 ± 1,66 53,02 ± 1,98 4,12 ± 0,30
12 0 (55,87) 1,68 (2,90) 0 (0,04) 17,19 ± 0,39 9,92 ± 1,79 56,42 ± 2,15 4,17 ± 0,55
13 0 (55,87) 0 (2,03) -1,68 (0,006) 9,66 ± 0,940 5,36 ± 1,87 50,55 ± 2,57 4,11 ± 0,24
14 0 (55,87) 0 (2,03) 1,68 (0,07) 10,37 ± 1,47 8,02 ± 2,55 67,70 ± 3,35 4,10 ± 0,29
15 0 (55,87) 0 (2,03) 0 (0,04) 12,02 ± 0,80 6,69 ± 0,15 56,02 ± 1,41 4,12 ± 0,30
16 0 (55,87) 0 (2,03) 0 (0,04) 12,07 ± 0,71 5,02 ± 0,92 40,34 ± 2,16 4,19 ± 0,26
17 0 (55,87) 0 (2,03) 0 (0,04) 11,87 ± 0,75 4,64 ± 0,20 37,18 ± 2,33 4,09 ± 0,25
18 0 (55,87) 0 (2,03) 0 (0,04) 11,94 ± 1,16 5,24 ± 1,56 42,84 ± 2,87 4,14 ± 0,31
19 0 (55,87) 0 (2,03) 0 (0,04) 11,91 ± 0,49 6,65 ± 6,65 53,57 ± 2,64 4,14 ± 0,36
* X1 = EIB; X2 = AMM; X3 = APA. Variáveis independentes fixas: 30 ºC, 180 rpm e 28 h de cultivo.
74
Os resultados da Tabela 9 foram tratados estatisticamente e os dados
podem ser visualizados em gráficos de Pareto (Figura 14), que apresentam os
efeitos estimados das variáveis independentes para a massa seca (A), pH (B),
P(3HB) (C) e P(3HB) % (D), respectivamente.
Os diagramas de Pareto indicam que a AMM foi um dos principais
contribuintes para o aumento da massa seca das amostras. Isso se deve
sobretudo a grande quantidade de sólidos suspensos na mesma e sua baixa
concentração de COT, o que sugere que estes sólidos não estão sendo
consumidos pelas células e permanecem suspensos no meio, mesmo após 28 h
de cultivo. Além disso, a AMM em sua forma bruta não possui grande
aplicabilidade como meio de cultura para B. megaterium.
No que se refere ao pH, nenhum dos coprodutos mostraram efeitos
significativos (p>0,05) na alteração do pH do meio. De modo semelhante, a
concentração de nitrogênio presente parece não ter afetado o crescimento da
cultura. A literatura traz que a limitação de nitrogênio pode causar impactos
negativos ao metabolismo das células de B. megaterium, contudo não existem
dados aprofundados em relação ao efeito de excesso do mesmo no meio de
cultura (SHAHID et al., 2013; GETACHEW; WOLDESENBET, 2016; KOLLER et
al., 2017; RAZA; ABID; BANAT, 2018).
Em relação a concentração de P(3HB) (Figura 14 C-D), a AMM e o EIB
foram as variáveis que influenciaram na concentração do biopolímero. Ainda
assim, apesar do efeito consideravelmente menor do EIB na massa total de
P(3HB), ele apresentou um efeito positivo na quantidade de produto acumulada
pelas células em relação ao peso de massa seca total. Tal comportamento se
deve, sobretudo, a necessidade de haver excesso de carbono disponível para a
produção e P(3HB) por B. megaterium (LEE, 1996; OMAR et al., 2001).
75
Figura 14 – Diagrama de Pareto com o efeito estimado (valor absoluto) dos diferentes coprodutos agroindustriais em relação a massa seca (A), pH (B), P(3HB) (C) e P(3HB) % (D) (Planejamento 1).
76
Baseado, nos resultados obtidos do DCCR 23, um novo planejamento foi
elaborado (DCCR 22). O objetivo deste novo conjunto de experimentos foi o de
visualizar o efeito que o pré-tratamento da AMM teria sobre as variáveis
dependentes. Neste planejamento a APA foi mantida fixa na concentração de
0,04 g∙L-1 de COT, uma vez que a mesma apresentou menor efeito na
bioprodução. A concentração dos demais coprodutos foram deslocados
(AMM Tratada: 0 a 2,5 g∙L-1 de COT e EIB: 6 a 55 de g∙L-1 de COT) e manteve-
se fixo o tempo de cultivo de 28 h, a 30 ºC, 180 rpm e pH inicial ajustado para
7,0. A matriz do planejamento DCCR 22 (valores reais e codificados) e as
respostas em termos de massa seca, P(3HB), pH, consumo de COT e consumo
de NT encontram-se descritos na Figura 15 e Tabela 10.
Figura 15 – Concentração de carbono orgânico e nitrogênio total após 28 h de cultivo para planejamento DCCR 22 utilizando coprodutos tratados (planejamento 2).
77
Tabela 10 – Matriz do planejamento DCCR 22 (valores reais e codificados) e as respostas em termos de massa seca, P(3HB) e pH (Planejamento 2).
Ensaio
Variáveis Independentes (g∙L-1 de COT) *
Respostas
X1 X2
Massa Seca
P(3HB) P(3HB) pH
(g∙L-1) (g∙L-1) (%)
1 -1 (10,07) -1 (0,43) 2,70 ± 0,326
0,024 ± 0,002
0,875 ± 0,124
4,46 ± 0,151
2 1 (29,93) -1 (0,43) 3,30 ± 0,557
0,040 ± 0,033
1,201 ± 0,202
3,87 ± 0,193
3 -1 (10,07) 1 (1,89) 8,99 ± 0,458
0,065 ± 0,015
0,718 ± 0,039
3,77 ± 0,236
4 1 (29,93) 1 (1,89) 8,20 ± 0,415
0,052 ± 0,040
0,635 ± 0,057
3,67 ± 0,122
5 -1,41 (6,00)
0 (1,46) 6,99 ± 0,678
0,049 ± 0,021
0,693 ± 0,035
3,79 ± 0,081
6 1,41
(55,00) 0 (1,46)
7,89 ± 0,469
0,052 ± 0,028
0,657 ± 0,089
3,61 ± 0,276
7 0 (20,00) -1,41 (0,00)
0,30 ± 0,743
N/D N/D 2,72 ± 0,150
8 0 (20,00) 1,41 (2,5) 6,09 ± 0,358
0,040 ± 0,018
0,657 ± 0,096
3,63 ± 0,214
9 0 (20,00) 0 (1,46) 6,39 ± 0,455
0,045 ± 0,026
0,740 ± 0,103
3,76 ± 0,043
10 0 (20,00) 0 (1,46) 7,40 ± 0,496
0,049 ± 0,030
0,659 ± 0,075
3,75 ± 0,109
11 0 (20,00) 0 (1,46) 8,10 ± 0,419
0,048 ± 0,044
0,594 ± 0,086
3,76 ± 0,011
*X1 = EIB; X2 = AMM; variáveis independentes fixas: APA (0,04 g∙L-1 de COT) N/D - Não detectado.
Com base nos valores obtidos, o principal ponto a ser notado é a redução
da produção de P(3HB), onde o máximo valor encontrado foi de 0,065 g∙L-1
(0,71 % da massa seca total). Este comportamento não foi esperado, e uma
redução tão drástica na concentração de P(3HB) dificilmente estaria associada
apenas ao pré-tratamento da AMM. De modo a compreender melhor o efeito do
pré-tratamento, o ensaio 12 do planejamento DCCR 23 foi repetido, desta vez
utilizando ambos os lotes de AMM tratada (Tabela 11). Esta composição foi
selecionada, pois foi a que gerou a maior concentração de produtos.
78
Tabela 11 – Concentração de biomassa e P(3HB) em cultivos do planejamento DCCR 23 utilizando dois lotes de AMM tratada (Planejamento 2).
Coprodutos* Massa seca
(g·L-1) P(3HB) (g·L-1)
P(3HB) (%)
AMM (Lote 1) 11,32b ± 0,779 0,121a ± 0,016 1,14a ± 0,015
AMM (Lote 2) 18,90a ± 0,844 0,119a ± 0,022 0,294b ± 0,059 Média ± desvio padrão; letras iguais nas colunas indicam não haver diferença significativa em nível de significância de 5% (Teste de Tukey). *Meio de cultura (Ensaio 12 – Tabela 10): 55,87 g·L-1 de EIB, 2,9 g·L-1 de AMM e 0,04 g·L-1 de APA
Observando a Tabela 11, é possível perceber que os resultados
encontrados não condizem com os dados obtidos anteriormente (Tabela 9), isto
sugere que a AMM bruta possui compostos que causam interferências na
metodologia de quantificação de P(3HB). Esta interferência se deu devido a
presença de compostos com tempo de retenção idênticos ao do P(3HB), o que
fez com que o pico cromatográfico obtido fosse diversas vezes maior.
Embora os valores de massa seca apresentassem uma diferença
significativa (p<0,05) entre os lotes de AMM, a concentração de P(3HB)
encontrada nas amostras não foram estatisticamente relevantes (>0,05). Além
disso, o tratamento estatístico dos dados encontrados nos ensaios do
planejamento 22 (Figura 16) indicaram que a AMM apresenta um impacto
negativo sobre as culturas em relação todas as variáveis testadas. A presença
da AMM em nível quadrático apresentou uma influência negativa na quantidade
de massa seca obtida, enquanto as demais variáveis e interações não foram
estatisticamente relevantes.
No que se refere ao pH das culturas, todas as variáveis apresentaram-se
significativas (p<0,05), com a AMM sendo a responsável pelo maior efeito
negativo sobre a acidez do meio. Já no que diz respeito a formação de produto,
há influência negativa da AMM na produção de P(3HB), enquanto o EIB em nível
quadrático apresentou um efeito positivo para este parâmetro. Em contrapartida,
na proporção de P(3HB) em relação a massa seca total, as variáveis não foram
estatisticamente significativas (p<0,05), com exceção da AMM em nível linear
que, mais uma vez, apresentou um efeito negativo.
É possível que este comportamento esteja associado a densidade da
AMM e a grande quantidade de sólidos não consumíveis pelas células. A
combinação destes fatores faz com que a transferência de massa seja reduzida,
79
dificultando a respiração celular e a absorção de nutrientes e, por consequência,
reduzindo o rendimento total, uma vez que B. megaterium é um micro-organismo
estritamente aeróbio (VALAPPIL et al., 2007; VOS et al., 2009; PANDIAN et al.,
2010).
O EIB apresentou uma influência positiva (p<0,05) no processo, visto que
o excesso de fonte de carbono é essencial para o acúmulo de P(3HB) por B.
megaterium. Quantidades excessivas, no entanto, podem prejudicar a cultura
devido ao aumento da pressão osmótica do meio, levando a morte da cultura
(BEAULIEU et al., 1995; WU et al., 2001; PANDIAN et al., 2010).
80
Figura 16 – Diagrama de Pareto com o efeito estimado (valor absoluto) dos diferentes coprodutos agroindustriais em relação a massa seca (A), pH (B), P(3HB) (C) e P(3HB) % (D) (Planejamento 2).
81
Considerando os resultados obtidos nos planejamentos fatoriais (Tabelas
9 e 10), e em função do efeito negativo da AMM sobre a cultura, novos
experimentos foram realizados, removendo a AMM da composição do meio de
cultivo. Neste sentido, buscou-se testar o comportamento de B. megaterium em
quatro meios de cultura distintos. Os resultados obtidos nestes ensaios estão
descritos na Tabela 12.
Tabela 12 – Concentração de massa seca e P(3HB) nos cultivos variando-se a composição de EIB e APA suplementado com meio mineral.
Ensaio Composição do meio** Massa Seca* P(3HB) * P(3HB) *
(g∙L-1) (g∙L-1) (%)
1 EIB concentrado 1,43c ± 0,047 0,403c ± 0,058 27,69b ± 3,058 2 EIB + APA (50 %, v/v) 3,15a ± 0,087 1,30a ± 0,301 30,87a ± 3,431 3 EIB (16 g∙L-1) 2,47b ± 0,170 0,350d ± 0,039 14,95c ± 1,974 4 EIB + APA (16 g∙L-1) 2,25b ± 0,250 0,831b ± 0,172 36,51a ± 3,605
*Média ± desvio padrão; letras iguais nas colunas indicam não haver diferença significativa em nível de significância de 5% (Teste de Tukey); ** Suplementação mineral: 3.6 g·L-1 Na2HPO4, 1.5 g·L-1 KH2PO4, 0.05 g·L-1 FeSO4∙7H2O, 0.1 g·L-1 ácido cítrico, 0.01 g·L-1 CaCl2∙2 H2O, 8 mg·L-1 MgSO4∙7H2O, 0.3 mg·L-1 H3BO3, 0.2 mg·L-1 CoCl2∙6H2O, 0.03 mg·L-1 ZnSO4∙7H2O, 0.03 mg·L-1 MnCl2∙4H2O, 0.03 mg·L-1 (NH4)6Mo7O24∙4H2O, 0.03 mg·L-1 NiSO4∙7H2O, 0.01 mg·L-1 CuSO4∙5H2O), 2 g·L-1 (NH4)2SO4.
De acordo com os dados, no cultivo utilizando EIB concentrado foi o que
apresentou menor formação de biomassa (1,43 g∙L-1), sugerindo uma possível
inibição por excesso de substrato. Nos cultivos utilizando EIB e APA (50 % v/v)
apresentaram as maiores concentrações, tanto para biomassa quanto para
P(3HB).
Lorenzini et al. (2014) e Raza, Abid & Banat (2018) apontam que esse
comportamento pode estar ligado a elevada pressão osmótica do meio, que
favorece a rota metabólica de produção de P(3HB) devido ao estresse aplicado
sobre a cultura, uma vez que situações de estresse e o excesso de fonte de
carbono são necessários para a produção de P(3HB) por esta espécie de micro-
organismo. Hassemer (2016) e Faccin et al. (2013) observaram um
comportamento similar a cepa B. megaterium DSMZ 32T em meio mineral
acrescido de diferentes fontes de carbono em biorreator, sendo que ao reduzir a
taxa de aeração, a cultura apresentou uma concentração significativamente
(p<0,05) menor de biomassa total, enquanto que a concentração de polímero
aumentava.
82
Considerando então os encontrados, é possível afirmar que o meio de
cultura contendo EIB + APA 50 % (v/v) juntamente com suplementação mineral
proporcionam condições de crescimento favoráveis às células de B. megaterium,
dando origem aos maiores valores de massa seca total e produto dentre os
demais.
Com base nestes resultados, uma nova série de cultivos foi realizada
variando a concentração de EIB e APA. Os resultados deste conjunto de ensaios
podem ser observados na Tabela 13. O ensaio 1 foi o que apresentou o maior
rendimento (57,50%) e concentração (1,92 g∙L-1) em P(3HB) e diferiu
significativamente (p<0,05) dos demais ensaios. Em relação, a quantidade de
massa seca observa-se que nos cultivos com 60, 70 e 80 % de EIB (Ensaios 1,
2 e 3) a concentração média foi de 4 g∙L-1 e não apresentaram diferenças
significativas (p>0,05) entre si.
Evidenciou-se ainda uma tendência onde ao aumentar a concentração de
EIB no meio, há uma redução na concentração de P(3HB) em relação a massa
seca, um comportamento causado pela elevação da pressão osmótica do meio
(WU et al., 2001; RAZA; ABID; BANAT, 2018). Contudo, no que se refere ao
perfil de pH dos cultivos, nenhum deles apresentou diferenças significativas
(p>0,05) no pH do meio, permanecendo na faixa de 5,4 a 5,5.
Tabela 13 – Concentração de massa seca, P(3HB) e pH para cultivos utilizando diferentes proporções de EIB e APA.
Ensaio
Coprodutos (%)
Respostas
EIB APA Massa seca
(g∙L-1) P(3HB) (g∙L-1)
P(3HB) (%)
pH
1 60 40 4,13a ± 0,243 1,92a ± 0,170 57,50a ± 0,987 5,50a ± 0,082 2 70 30 3,77a ± 0,217 1,54b ± 0,127 44,15b ± 0,815 5,52a ± 0,107 3 80 20 3,50a ± 0,218 1,30b ± 0,161 40,82c ± 0,360 5,44a ± 0,129 4 90 10 2,50b ± 0,251 0,841c ± 0,111 34,21d ± 0,272 5,45a ± 0,101 5 100 0 1,46c ± 0,185 0,450d ± 0,105 30,82e ± 0,583 5,50a ± 0,113
Média ± desvio padrão; letras iguais nas colunas indicam não haver diferença significativa em nível de significância de 5% (Teste de Tukey)
Na sequência, da condição maximizada avaliou-se a cinética da
bioprodução, concentração de biomassa e evolução do pH por um período de
48 h de cultivo. Os resultados obtidos durante a cinética de crescimento e da
bioprodução estão apresentados na Figura 17 e Tabelas 20 a 26 (Apêndice I).
83
De acordo com os valores encontrados durante a cinética de crescimento
(Figura 17), é possível visualizar que a maior concentração de massa seca foi
encontrada no tempo de 48 h (5,37 g∙L-1). O perfil de pH das culturas apresentou
uma diminuição gradual até 12 h, seguida de estabilização em aproximadamente
4,5.
Figura 17 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo de substrato (COT e NT) (B) em meio de cultura composto por EIB (60 %) e APA (40 %) em frascos agitados.
Para P(3HB), verifica-se que a concentração aumenta de forma
exponencial até 26 h, havendo uma queda na concentração, seguida de
oscilações e estabilização próximo a 46 h. Em relação a concentração, nota-se
que em 48 h de cultivo, a quantidade de P(3HB) foi de 2,55 g∙L-1, porém próximo
o que foi obtido em 26 h (2,405 g∙L-1). Os valores da relação produto e biomassa
obtidos em 26 h (45,28 %) e 48 h (45,18 %) de cultivo também foram similares.
A
B
84
Reddy et al. (2019) realizaram um estudo similar, cultivando Bacillus sp.
em frascos agitados e utilizando efluentes da indústria de queijo como meio de
cultivo (107,25 g∙L-1 de COT). Após 48 h (30 C, 100 rpm), os autores obtiveram
0,071 g∙L-1 de P(3HB), um valor quase 3.000 vezes menor que o obtido no
presente estudo. Em contrapartida, Yustinah et al. (2019), cultivaram
Bacillus cereus suaeda B-001 em bagaço de dendê hidrolisado (14,3 g∙L-1 de
COT), onde, após 96 h (30 ºC, 150 rpm) os autores obtiveram 2,5 g∙L-1 de
biomassa total e contendo 0,99 g∙L-1 de P(3HB), aproximadamente 40 % do valor
de biomassa. Os autores sugerem que o processo de hidrólise ácida pelo qual o
bagaço de dendê foi submetido, pode causar inibição no crescimento
microbiano, devido a formação de compostos acéticos e furfurados.
5.3 Parâmetros cinéticos da bioprodução em frascos agitados
Com base nas cinéticas de produção de B. megaterium em meio
mineral (Figura 12) e meio composto por EIB (60 %) e APA (40 %) (Figura 17),
parâmetros cinéticos e estequiométricos foram obtidos. A Figura 18 apresenta a
produtividade global de P(3HB) dos sistemas.
Observando o comportamento entre os cultivos, observa-se que no cultivo
em meio mineral, a produtividade permanece próxima a 0 por quase 12 h,
aumentando então exponencialmente até atingir o ponto máximo de
produtividade de 0,040 g·L·h-1 em 20 h de cultivo, sofrendo então uma redução
gradual na produtividade, até atingir um ponto de equilíbrio próximo a 36 h.
Para os ensaios em meio de cultura composto por EIB e APA (Figura
18 B), a fase de adaptação do micro-organismo teve uma duração
significativamente menor do que foi observado em meio sintético (Figura 18 A),
sendo que um aumento exponencial da produtividade já era observado após 4 h
de incubação. O crescimento exponencial seguiu até 10 h (0,061 g·L·h-1), com
queda em 12 h (0,057 g·L·h-1) e subsequente aumento até 18h (0,087 g·L·h-1).
Após 18 h o mesmo comportamento foi observado, com uma queda na
produtividade até 22 h (0,074 g·L·h-1) e subsequente aumento, atingindo
0,094 g·L·h-1em 24 h. O mesmo comportamento é expresso novamente em 34 h,
85
onde após uma redução gradual da velocidade de produção a mesma aumenta
brevemente, se estabiliza e volta a cair.
Figura 18 – Produtividade global de P(3HB) ao longo da bioprodução em frascos agitados com meio mineral (A) e com meio composto por EIB (60 %) e APA (40 %) (B).
O comportamento observado está associado a função do P(3HB) no
interior da célula. Como o mesmo é produzido e armazenado como uma reserva
de energia, o metabolismo celular pode optar por consumir o mesmo no
momento que a célula vegetativa se sentir em posição de desvantagem, seja
pela falta de substratos viáveis, presença de compostos tóxicos ou alterações na
A
B
86
temperatura e oxigenação do meio (HONG; LIN; LIN, 2008; SUAREZ et al., 2012;
KOSSEVA; RUSBANDI, 2018; THOMAS; BALAKRISHNAN; SREEKALA, 2018).
Algo que corrobora com esta hipótese, é o fato de que ao se comparar os dados
da Figura 18 B com os valores expressos na Figura 17, um comportamento
similar é observado no que se refere ao acúmulo de P(3HB), indicando que a
redução na produtividade se deve ao consumo do polímero pelo metabolismo
celular.
Além da produtividade, a relação entre a produção de P(3HB) e o aumento
na quantidade de células também foi avaliada (Figura 19). O máximo fator YP/X
no cultivo em meio mineral foi de 0,790 g·g-1 após 24 h e no cultivo utilizando os
coprodutos agroindustriais, o ponto máximo foi de 0,650 g·g-1, também
encontrado após 24 h de incubação.
Comparando o comportamento dos cultivos, novamente observa-se que
o início do aumento exponencial foi lento no meio mineral (cerca de 12 h),
quando comparado ao meio composto por EIB e APA (4 h). Ambos os cultivos
exibiram um comportamento similar, com aumento gradual seguido de queda e
subsequente aumento, embora para o cultivo contendo os coprodutos
agroindustriais as oscilações se tornam mais visíveis devido a maior duração do
cultivo e velocidade de produção.
Este comportamento é indicativo de alterações no rendimento específico
do produto e está relacionado, possivelmente, a alterações no metabolismo
celular, uma vez que a rota metabólica da produção de P(3HB) age de forma
simultânea com o ciclo tricarboxílico e compete ativamente pelas moléculas de
Acetil-CoA (CHANPRATEEP, 2010; COLET, 2016; MOŻEJKO-CIESIELSKA;
KIEWISZ, 2016; YEO et al., 2017).
87
Figura 19 – Relação entre a produção de P(3HB) e a produção de células (YP/X) ao longo da bioprodução em frascos agitados com meio mineral (A) e com meio composto por EIB (60 %) e APA (40 %) (B).
A evolução da velocidade específica de crescimento global (μx) e da
produtividade global em células (Px) durante a bioprodução foram avaliadas na
sequência, com os resultados apresentados na Figura 20.
Os dados mostram que a velocidade específica máxima de crescimento
(µmax) para os cultivos foi de 0,308 e 0,347 h-1 para meio mineral e coprodutos,
respectivamente. Em relação a produtividade de células (Px) o máximo para o
A
B
88
cultivo com meio mineral foi de 0,079 g·L·h-1 em 16 h, enquanto a cultura
utilizando EIB e APA obteve 0,172 g·L·h-1 em 18 h.
Figura 20 – Evolução da velocidade específica de crescimento (µx) e da produtividade em célula (Px) ao longo da bioprodução em frascos agitados com meio mineral (A) e com meio composto por EIB (60 %) e APA (40 %) (B).
O aumento considerável no valor de µmax entre os cultivos se deve
principalmente à concentração de substrato presente, uma vez que a
abundância do mesmo incentiva a duplicação celular, até que conforme a
quantidade de substrato disponível se esgota, a velocidade de crescimento
reduz gradualmente até se aproximar a zero. Em contrapartida, uma quantidade
excessiva de substrato, também, pode impactar negativamente na velocidade de
A
B
89
crescimento e causar uma redução do µmax, muitas vezes devido à elevação da
pressão osmótica ou redução na transferência de massa e oxigenação da cultura
(COLET, 2016). Ainda em relação a quantidade de substrato presente no meio,
a Figura 21 descreve os fatores de conversão de COT e NT em produto ao longo
dos cultivos.
O maior fator de conversão de COT em produto para o cultivo em meio
mineral foi de 0,244 g·g-1 em 24 h, enquanto que para NT, o ponto máximo
ocorreu em 20 h (3,07 g·g-1). No ensaio com EIB e APA o máximo para COT foi
de 0,074 g·g-1 e 1,36 g·g-1 em 28 h, respectivamente.
Figura 21 – Fatores de conversão de COT e NT em produto ao longo da bioprodução em frascos agitados com meio mineral (A) e com meio composto por EIB (60 %) e APA (40 %) (B).
B
A
90
Observando as tendências entre os cultivos, novamente observa-se que
após uma fase estacionária inicial, a conversão aumenta exponencialmente, com
quedas periódicas e aumento durante a duração da cultura. Estas quedas,
novamente, ressaltam os períodos em que houve o consumo de P(3HB) pelas
células, possivelmente relacionado a alterações no metabolismo da cultura.
Em relação a conversão de substratos (COT e NT) em células, o
comportamento ao longo do cultivo está descrito na Figura 22.
Figura 22 – Fatores de conversão de COT e NT em células ao longo da bioprodução em frascos agitados com meio mineral (A) e com meio composto por EIB (60 %) e APA (40 %) (B).
B
A
91
O comportamento da cultura em meio mineral, observa-se que para o
COT, o máximo da conversão (0,388 g·g-1) ocorre em 6 h de cultivo, , após isso
a conversão volta a subir, atingindo 0,379 g·g-1 em 20 h. Após 20 h observa-se
novamente uma queda na conversão, embora de modo mais gradativo até 28 h,
onde então novamente ocorre um aumento na conversão, seguido de uma
brusca redução em 36 h. Para NT, a conversão máxima de 3,069 g·g-1 foi
atingida em 20 h, com uma queda acentuada até 24 h, seguida de gradual
aumento.
Em contrapartida, o comportamento para o meio de cultivo utilizando
coprodutos agroindustriais se mostrou mais diversificado ao longo do tempo de
incubação. Para COT, a taxa de conversão aumenta de forma exponencial até o
máximo de 0,206 g·g-1 em 8 h de incubação, após isso diminui para 0,091 g·g-1
em 12 h. Na sequência, observa-se novamente um aumento na taxa de
conversão, uma leve estabilização entre 16 e 24 h e pequenas alterações,
sugerindo uma possível estabilização, até o fim do período de incubação. No
caso da conversão de NT em células, o comportamento exibido foi similar ao
encontrado pelo fator YP/S, com oscilações consideráveis ao longo do período,
sendo que o máximo de conversão foi de 2,46 g·g-1 em 34 h.
A Tabela 14 lista os valores máximos encontrados para cada um dos
parâmetros cinéticos avaliados para os cultivos em frascos agitados com meio
mineral e com coprodutos agroindustriais. De modo geral, o cultivo em meio
mineral apresentou os maiores fatores de conversão YP/S e YX/S, tanto em base
COT quanto para NT, com estas máximas sendo obtidas em tempo menor do
que os dados encontrados ao se utilizar o meio composto por EIB e APA. Um
comportamento inverso foi observado para os fatores Px e µx. Em contrapartida,
a relação de células em produto (YP/X) foi maior no cultivo em meio mineral do
que no cultivo com EIB e APA, ambos em 24 h de cultivo.
92
Tabela 14 – Máximos parâmetros cinéticos e estequiométricos da bioprodução em frascos agitados com meio mineral e com meio composto por EIB (60 %) e APA (40 %).
Parâmetro Meio Mineral EIB (60 %) e APA (40%)
Máximo Tempo (h) Máximo Tempo (h)
YP/S (g·g-1) Base COT 0,244 24 0,074 28 YX/S (g·g-1) Base COT 0,388 06 0,206 08 YP/S (g·g-1) Base NT 3,07 20 1,36 28 YX/S (g·g-1) Base NT 6,51 16 2,46 34
YP/X (g·g-1) 0,709 24 0,650 24 Px (g·L·h-1) 0,079 16 0,176 10
µx (h-1) 0,308 08 0,347 06
Na sequência, os parâmetros cinéticos calculados para os cultivos em
frascos agitados serão comparados com os dados referentes aos cultivos em
biorreator, de modo a verificar se as mesmas tendências são observadas e
auxiliar na melhor compreensão do metabolismo de B. megaterium ATCC 14581
de modo a maximizar a produção de P(3HB).
5.4 Produção de P(3HB) em biorreator batelada simples
Após a determinação da melhor composição do meio de cultura e uma
visão geral do comportamento do B. megaterium ATCC 14581 em frascos
agitados, um planejamento fatorial 22 foi realizado variando-se a taxa de aeração
e agitação em biorreator batelada simples. A matriz do planejamento (valores
reais e codificados) e as respostas em termos de massa seca e, P(3HB) são
apresentados na Tabela 15.
Tabela 15 – Matriz do planejamento fatorial 22 (valores reais e codificados) - planejamento 3 e as respostas em termos de massa seca e P(3HB).
Ensaio
Variáveis Independentes* Respostas
X1 X2 Massa Seca
(g∙L-1) P(3HB) (g∙L-1)
P(3HB) %
1 -1 (1) -1 (100) 0,950 ± 0,150 0,032 ± 0,011 3,92 ± 0,179 2 1 (4) -1 (100) 2,97 ± 0,047 1,29 ± 0,080 43,46 ± 2,44 3 -1 (1) 1 (500) 6,20 ± 0,141 2,87 ± 0,025 47,03 ± 0,414
4 1 (4) 1 (500) 7,10 ± 0,200 3,57 ± 0,031 50,43 ± 0,804
5 0 (2,5) 0 (300) 4,97 ± 0,125 3,01 ± 0,051 57,87 ± 2,830 6 0 (2,5) 0 (300) 5,03 ± 0,125 2,85 ± 0,147 57,59 ± 3,540 7 0 (2,5) 0 (300) 5,07 ± 0,170 2,85 ± 0,153 55,35 ± 1,350
*X1 = Aeração (vvm); X2 = Agitação (rpm)
93
A máxima concentração de P(3HB) foi de 3,57 g∙L-1 (7,10 g∙L-1 de
biomassa total), com 4 vvm de O2 e agitação de 500 rpm (Ensaio 4). No entanto,
o ensaio 1, utilizando ambas a variáveis em nível baixo, foi o que apresentou a
menor massa seca (0,950 g∙L-1) e somente 3,92 % de P(3HB). Este
comportamento, está relacionado a baixa velocidade de agitação, pois segundo
Kumar et al. (2013) & Suarez et al. (2012), a velocidade reduzida da turbina não
permite a dispersão adequada de O2 no meio, criando zonas mortas.
De modo similar, Faccin et al. (2013) cultivaram B. megaterium DSM 32T
em bateladas de 4 L, utilizando meio mineral com sacarose (18 g∙L-1) por 12 h
(30 ºC, 500 rpm, 4 vvm de O2). Após 8 h a cultura já atingia o início da fase
estacionária, com o máximo de biomassa obtido sendo de aproximadamente
4 g∙L-1 e cerca de 0,4 g∙L-1 de P(3HB), um comportamento significativamente
distinto do que foi observado no presente estudo. Omar et al. (2001) realizaram
cultivos em larga escala (bateladas de 42 L) utilizando uma cepa de B.
megaterium isolada de uma unidade de tratamento de esgoto da Arábia Saudita.
Ao cultivar a cepa por 20 h em meio mineral acrescido de 2 % de xarope de
tâmaras, os autores obtiveram após 14 h de cultivo aproximadamente 3,4 g∙L-1
de biomassa, com uma proporção de 25 % de P(3HB) (0,85 g∙L-1). Valores
inferiores aos obtidos no presente estudo.
A avaliação estatística dos resultados do planejamento demonstrou que a
agitação apresentou efeito significativo (p<0,05) sobre a massa seca e P(3HB).
Os coeficientes de regressão e análise de variância (ANOVA) para massa seca
e P(3HB) estão descritos nas Tabelas 20 a 25 (Apêndice I), respectivamente.
A Figura 23 apresenta o diagrama de Pareto para a proporção de P(3HB)
em relação a massa seca. Observando a Figura 23, nota-se que nenhuma das
variáveis apresentou efeito significativo. Contudo, algo interessante a ser
considerado é o fato de que quando avaliadas individualmente, tanto a agitação
quanto a aeração apresentaram efeitos positivos, enquanto quando avaliadas
em conjunto o efeito foi negativo.
94
Figura 23 – Diagrama de Pareto com os efeitos estimados (valor absoluto) de agitação e taxa de aeração para a proporção de P(3HB) em relação a massa seca (planejamento 3).
As Equações 15 e 16, descrevem o modelo codificado de primeira ordem
para massa seca e P(3HB), respectivamente.
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎 (𝑔 ∙ 𝐿−1) = 4,61 + 2,34 × 𝑋2 (15)
𝑃(3𝐻𝐵)(𝑔 ∙ 𝐿−1) = 2,35 + 1,28 × 𝑋2 (16)
Os modelos foram validados pela análise de variância, com coeficientes
de correlação de 0,932 para massa seca e 0,844 para P(3HB). O valor de F
calculado para biomassa foi aproximadamente 5 vezes maior que o valor de F
tabelado, enquanto para P(3HB) o F calculado foi 1,87 vezes maior. A análise de
variância permitiu a construção de superfícies de resposta e curvas de contorno,
que podem ser visualizadas nas Figuras 24 e 25.
95
Figura 24 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para a produção de massa seca em função da agitação e taxa de aeração do sistema (planejamento 3).
A
B
96
Figura 25 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para a produção
de P(3HB) em função da agitação e taxa de aeração do sistema (planejamento
3).
A
B
97
Considerando o comportamento expressado nas superfícies de resposta,
percebe-se que o máximo acúmulo de biomassa (7,100 g·L-1) e P(3HB) (3,574
g·L-1) encontram-se a uma faixa próxima a 500 rpm de agitação, em qualquer
taxa de aeração. Contudo, observa-se uma tendência de incremento da
biomassa e P(3HB), com o aumento da velocidade de agitação. Com base neste
comportamento, níveis de agitação foram extrapolados (500, 600 e 700 rpm) e
fixando a taxa de aeração em 4 vvm. Os resultados referentes a estes ensaios
estão descritos na Tabela 16.
Tabela 16 – Concentração de massa seca e P(3HB) para cultivos em biorreator
a 500, 600 e 700 rpm.
Ensaio* Agitação
(rpm)
Respostas
Massa Seca (g∙L-1)
P(3HB) (g∙L-1)
P(3HB) (%)
1 500 7,10a ± 0,200 3,57a ± 0,031 50,43a ± 0,804
2 600 5,35b ± 0,050 1,56b ± 0,050 30,04b ± 0,882
3 700 4,10c ± 0,100 0,318c ± 0,030 9,76c ± 0,504 *Aeração = 4 vvm; médias ± desvio padrão seguidas de letras iguais indicam não haver diferença
significativa á nível de 5% (Teste de Tukey).
Em relação a massa seca (Tabela 16), o aumento da velocidade de
agitação para 600 rpm (Ensaio 2) causou uma redução de aproximadamente
24,6 % na concentração final, sendo que quando a agitação atingiu 700 rpm a
concentração de massa seca obtida foi de apenas 57,7 % em relação ao
resultado do ensaio a 500 rpm (Ensaio 1).
Uma tendência similar foi observada em relação ao acúmulo de P(3HB).
O aumento da agitação para 600 rpm causou uma queda de 56,3 % na
concentração de P(3HB) em relação ao valor obtido na agitação de 500 rpm. O
mesmo comportamento foi observado a 700 rpm, com redução de P(3HB) de
aproximadamente 91,1 % em relação ao cultivo a 500 rpm (Ensaio 1, Tabela 16).
A literatura cita que a tensão de cisalhamento elevada causa injúrias na
célula e reduz sua velocidade de crescimento e, consequentemente, de acúmulo
de produto. No caso do P(3HB), pelo mesmo se tratar de uma reserva
energética, injúrias na parede celular promovem o consumo do mesmo de modo
a estabilizar o metabolismo e acelerar a recuperação do micro-organismo
98
(KUMAR et al., 2013; GRUMEZESCU; HOLBAN, 2018; THOMAS;
BALAKRISHNAN; SREEKALA, 2018).
De acordo com os dados da Tabela 16, percebe-se que os melhores
resultados foram obtidos ao se utilizar uma velocidade de agitação de 500 rpm.
Desta forma, um perfil cinético da cultura foi elaborado de modo a visualizar
melhor o comportamento da cepa de B. megaterium ao longo do período de
cultivo sob estas condições maximizadas (500 rpm, 4 vvm O2) (Figura 26).
Os dados encontrados no decorrer da elaboração das curvas cinéticas da
cultura mostram que sob estas condições (500 rpm, 4 vvm O2), a fase lag foi
relativamente curta, com o crescimento exponencial das células começando a
ocorrer após 4 h e se mantendo até aproximadamente 8 h. Contudo, o maior
valor de biomassa encontrado foi de 7,55 g∙L-1 após 32 h, em função do aumento
da concentração de P(3HB). No que se refere ao polímero, a primeira amostra
dentro do limite mínimo de detecção do método de quantificação foi obtida em
8 h, com aproximadamente 0,68 g∙L-1 de P(3HB) (12,2 % da biomassa seca
total), enquanto que a maior concentração de produto observada ocorreu em
32 h, com 3,78 g∙L-1 (50,1 % da massa seca total).
Comparando estes valores com a literatura, Saratale et al. (2021)
cultivaram Lysinibacillus sp em meio mínimo por 4 h e, ao utilizar sacarose como
fonte de carbono, obtiveram 1,44 g∙L-1 de P(3HB). O maio resultado obtido por
eles foi encontrado ao se utilizar glicose, obtendo 2,65 g∙L-1, ambos os resultados
consideravelmente abaixo dos valores encontrados neste estudo.
99
Figura 26 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo de substrato (COT e NT) (B) sob condições maximizadas de produção em biorreator batelada simples.
Naresh Kumar et al. (2020) buscaram produzir P(3HB), utilizando uma
cultura mista de bactérias e biomassa desengordurada de microalgas como
substrato. Enquanto os autores não relatam a quantidade de biomassa total
obtida ao longo do estudo, a concentração de polímero obtida por eles foi de
aproximadamente 43 % da concentração total de biomassa após 48 h de cultivo,
um resultado similar aos dados obtidos durante nossos ensaios.
Amini et al. (2020) também obtiveram resultados similares. Quando os
autores cultivaram Cupriavidus necator em um meio de cultura composto por
efluentes da indústria cervejeira acrescido de maltose, eles obtiveram 7,9 g∙L-1
de massa seca total e 3,0 g∙L-1 de P(3HB). Faccin et al. (2013) cultivaram
B. megaterium DSM 32T em meio mineral com sacarose, sob diferentes
condições de aeração e obtiveram um máximo de 6,0 g∙L-1 de biomassa seca e
3,0 g∙L-1 de P(3HB). Já Jayakrishnan, Deka & Das (2020) utilizaram diferentes
concentrações de inóculo e composições de meio de cultura para produzir
B
A
100
P(3HB) utilizando bactérias mistas obtidas de lodo ativado e obtiveram entre 7,8
a 14,4 % de polímero, quase 3,5 vezes a menos do que foi encontrado ao longo
do presente estudo.
Comparando ainda os dados da Figura 26 com o que foi apresentado na
Figura 17, constata-se que as bateladas apresentaram um rendimento
substancialmente maior, uma vez que parâmetros de cultivo podem ser
controlados de forma mais minuciosa.
Em relação ao acúmulo de massa seca, os cultivos em frascos agitados
atingiram um máximo de 4,13 g·L-1. Ao se utilizar a mesma composição de meio
de cultura em biorreator, o rendimento de massa seca foi de 7,55 g·L-1. Nos
cultivos em frascos agitados a maior concentração de P(3HB) encontrada foi de
1,92 g·L-1, enquanto as condições maximizadas de bioprodução no biorreator
geraram 3,78 g·L-1, indicando um aumento de aproximadamente 2 vezes na
concentração total de produto.
5.5 Parâmetros cinéticos da bioprodução em biorreator batelada simples
Conforme realizado para os cultivos em frascos agitados os parâmetros
cinéticos de bioprodução, também foram calculados para os cultivos em
biorreator sob as condições maximizadas (Figura 26). A Figura 27 apresenta a
produtividade global de P(3HB) encontrada durante a cultura utilizando 500 rpm
como velocidade de agitação.
Algo a ser considerado é o fato de que ao comparar a Figura 27 com a
Figura 18 B, é possível observar que ambas as culturas apresentam uma fase
lag de aproximadamente 4 h, porém, o ponto mais importante a ser notado é o
fato de que houve uma redução das oscilações entre os valores registrados ao
longo do cultivo. Peña et al. (2014), Grumezescu & Holban (2018) e Thomas,
Balakrishnan & Sreekala (2018) sugerem que este comportamento está ligado
as características de processos fermentativos conduzidos em biorreator, visto
que o equipamento permite um maior controle de variáveis e parâmetros
diretamente ligados ao metabolismo celular do que os cultivos em frascos
agitados.
101
Figura 27 – Produtividade global de P(3HB) ao longo da bioprodução em biorreator batelada simples.
A relação entre a produção de P(3HB) e a quantidade de células foi
avaliada também (Figura 28). Para este parâmetro, o ponto com maior taxa de
acúmulo de P(3HB) em relação a quantidade de células presentes foi observado
ao final do período de cultivo, em 32 h, com um valor de 0,507 g P(3HB)·g
células. Ao se comparar estes resultados com aqueles encontrados durante os
cultivos em frascos agitados (Figura 19), observa-se que, para a cultura em
batelada simples, não foram observadas reduções na concentração de P(3HB)
após a entrada da cultura na fase estacionária, demonstrando que as células de
B. megaterium não apresentaram necessidade de consumir os grânulos de
P(3HB), sugerindo que o metabolismo celular se manteve estável durante o
período (LIN; CHEN, 2017c; YEO et al., 2017; RAZA; ABID; BANAT, 2018).
102
Figura 28 – Relação entre a produção de P(3HB) e a produção de células (YP/X) ao longo da bioprodução em biorreator batelada simples.
A velocidade específica de crescimento global (μx) e a produtividade
global em células (Px) foram avaliadas na sequência, com resultados
apresentados na Figura 29. Observando os dados encontrados, é possível notar
que a velocidade específica de crescimento (µx) atinge seu pico após 8 h de
cultivo (0,61 h-1). Após o período de 8 h a velocidade de crescimento reduz
drasticamente, até atingir 0,01 h-1 em 32 h. Este comportamento condiz com o
que foi observado na Figura 26, visto que grande parte da fase de crescimento
exponencial da cultura ocorre entre 4 h e 12 h.
103
Figura 29 – Evolução da velocidade específica de crescimento (µx) e da produtividade em célula (Px) ao longo da bioprodução em biorreator batelada simples.
Shahid et al. (2013) observaram um comportamento similar de µx ao
cultivar B. megaterium DSM 32T (0,47 h-1), B. megaterium DSM 90 (0,51 h-1) e
B. megaterium DSM 509 (0,44 h-1) para a produção de P(3HB) por 24 h em meio
mineral com glicose. Dalsasso et al. (2019) também avaliaram os parâmetros
cinéticos da produção de P(3HB), desta vez utilizando a bactéria Cupriavidus
necator em meio sintético com melaço e vinhaça de cana como fonte de carbono.
Os autores obtiveram valores máximos de crescimento específico na faixa de
0,19 h-1 a 0,37 h-1 ao utilizar diferentes composições de meio de cultura. García-
Cabrera et al. (2020), por sua vez, avaliaram a cinética de produção de
Rhizobium phazeoli e encontraram velocidades de crescimento específico na
faixa de 0,09 h-1 a 0,16 h-1. Os dados da literatura, quando comparados com os
valores apresentados na Figura 29, corroboram com a ideia de que
B. megaterium apresenta bom potencial de aplicação a produção de P(3HB)
104
devido ao seu crescimento rápido, que auxilia na redução do tempo necessário
para finalizar a cultura.
A produtividade em células (Px), por sua vez, apresenta uma tendência
similar a de µx, com o máximo de produtividade encontrado em 8 h (0,65 h-1)
seguido de uma redução até 0,23 h-1 em 32 h de cultivo. Contudo, observa-se
que a taxa em que a redução da produtividade ocorre é consideravelmente
menos súbita do que o comportamento expressado para µx.
Na sequência os fatores de conversão de substrato (COT e NT) em
produto e células foram quantificados, com resultados presentados nas Figuras
30 e 31, respectivamente.
Figura 30 – Fatores de conversão de COT e NT em produto ao longo da bioprodução em biorreator batelada simples.
105
Figura 31 – Fatores de conversão de COT e NT em células ao longo da bioprodução em biorreator batelada simples.
Observando os valores descritos nas Figuras 30 e 31 nota-se um
comportamento peculiar no perfil de consumo de substrato. Tanto para
conversão em P(3HB) quanto para em células, NT apresentou uma taxa de
consumo consideravelmente maior do que COT. Para conversão em produto, a
maior taxa de conversão para carbono foi de aproximadamente 0,13 g·g-1
durante o período de 20 h a 24 h, a conversão de NT, todavia, apresentou um
fator máximo de 3,4 g·g-1 em 32 h de cultivo. Para conversão em células um
comportamento semelhante foi observado, onde o maior valor de conversão para
COT foi encontrado após 8 h de cultivo, com 0,45 g·g-1. NT, em contrapartida,
apresentou um fator máximo de conversão de 8,41 g·g-1 em 12 h.
Egli (2015) aponta que este comportamento é comum em sistemas de
produção de P(3HB) onde há excesso de fonte de carbono, sendo que em certos
casos, a taxa de conversão de nitrogênio em produto e/ou células pode atingir
níveis de até 20,0 g·g-1. Oliveira-Filho et al. (2020) relatam fatores de conversão
semelhantes ao encontrados durante o presente estudo, com uma taxa de
106
conversão de NT em células de 7,5 g·g-1 para a produção de P(3HB) por
Burkholdria sacchari LMG 19450, utilizando xilose como fonte de carbono.
Khanna & Srivastava (2008) cultivaram Ralstonia euthropa NRRL B14690 em
meio otimizado com frutose e obtiveram uma taxa de conversão de nitrogênio
em biomassa de aproximadamente 10,01 g·g-1. Finalmente, Faccin et al. (2011),
ao cultivar B. megaterium DSM 3T em meio mineral com sacarose, obtiveram
fatores de conversão para célula próximos a 8,48 g·g-1, valor este, quase idêntico
ao encontrado no presente estudo para B. megaterium ATCC 14581.
Para melhor visualizar os as velocidades de produção e fatores de
conversão, os dados foram organizados e tratados estatisticamente e os
resultados estão descritos na Tabela 17.
Tabela 17 – Máximos parâmetros cinéticos e estequiométricos da bioprodução em biorreator batelada simples.
Tempo (h)
Produtividade Células (g·L·h-1)
Produtividade P(3HB) (g·L·h-1)
Yp/s COT (g·g-1)
Yp/s NT (g·g-1)
Yx/s COT (g·g-1)
Yx/s NT (g·g-1)
µx
(h-1)
0 - - - - - - -
4 0,610e
± 0,024 - - -
0,227d
± 0,021 2,50e
± 0,045 -
8 0,396b
± 0,016 0,084d
± 0,005 0,058c
± 0,003 1,04d
± 0,124 0,452a
± 0,015 8,05b
± 0,219 0,61a
± 0,050
12 0,033a
± 0,001 0,129b
± 0,003 0,092c
± 0,006 2,17c
± 0,113 0,358b
± 0,020 8,41a
± 0,166 0,39b
± 0,020
16 0,018c
± 0,006 0,137ab
± 0,001 0,118b
± 0,010 2,49bc
± 0,131 0,347b
± 0,019 7,34c
± 0,229 0,033c
± 0,001
20 0,012cd
± 0,012 0,146a
± 0,001 0,136a
± 0,011 3,05b
± 0,109 0,326c
± 0,021 7,09cd
± 0,261 0,027c
± 0,002
24 0,011d
± 0,004 0,124b
± 0,001 0,138a
± 0,011 2,85b
± 0,056 0,328c
± 0,017 6,78d
± 0,063 0,023c
± 0,002
28 0,007d
± 0,010 0,124bc
± 0,002 0,115b
± 0,005 3,16ab
± 0,153 0,241d
± 0,020 6,60d
± 0,259 0,014d
± 0,003
32 0,007d
± 0,004 0,118c
± 0,001 0,120b
± 0,006 3,40a
± 0,196 0,236d
± 0,011 6,70d
± 0,248 0,010d
± 0,003 Médias ± desvio padrão seguidas de letras iguais indicam não haver diferença significativa de acordo com Teste de Tukey (p<0,05); Yp/s COT – fator de conversão de COT em P(3HB); Yp/s NT – fator de conversão de NT em P(3HB); Yx/s COT – fator de conversão de COT em células; Yx/s NT – fator de conversão de NT em células; µx – velocidade específica de crescimento;
De acordo com os valores apresentados, observa-se pela análise
estatística que o maior período de produtividade de células ocorreu após 12 h de
cultivo, com aproximadamente 0,033 g·L·h-1. No que se refere a produção de
P(3HB), o ponto máximo de produtividade ocorreu entre 16 e 20 h, com uma
produção na faixa de 0,137 a 0,146 g·L·h-1 de P(3HB). Em relação ao consumo
107
de COT para a síntese de polímero, nota-se que o maior consumo ocorreu entre
20 e 24 h (0,136 a 0,138 g·g-1), isto é interessante visto que o auge da
produtividade teve início aproximadamente 4 h antes do ponto máximo de
conversão de COT em produto. Em contrapartida, em relação ao consumo de
COT para produção de células, nota-se que o maior consumo (0,452 g·g-1)
ocorre junto ao início da fase de crescimento exponencial da cultura, após
aproximadamente 8 h de cultura.
Ainda em no que se refere aos dados da Tabela 17, nota-se que o
consumo de NT para síntese de células e produção de polímero apresentaram
comportamentos distintos. O ponto máximo de conversão de NT em P(3HB) foi
observado a partir de 28 h de cultivo, ponto no qual também foi observado uma
das menores taxas de produtividade de P(3HB). O consumo de NT para
produção de células, por outro lado, apresentou um ponto máximo de conversão
(8,41 g·g-1) após 12 h de cultivo, o mesmo período em que foi observada a maior
produtividade de células. Por fim, focando na velocidade de crescimento
específico das células de B. megaterium, um máximo de 0,61 h-1 foi observado
após 8 h de cultivo, com redução considerável após este período. Entre o
período de 8 h e 12 h, observou-se uma redução de aproximadamente 36 % na
velocidade de crescimento específico. Tal comportamento pode estar
relacionado a mudança no metabolismo celular para a produção de P(3HB), uma
vez que ambas as rotas metabólicas competem pelas moléculas de Acetil-Co-A.
5.6 Avaliação do Potencial Redox na produção de P(3HB)
A avaliação do potencial redox das culturas utilizando EIB e APA. Cultivos
iniciais tiveram duração de 28 h, com o POR do sistema sendo apenas medido.
Os resultados obtidos podem ser visualizados na Figura 32.
108
Figura 32 – Cinética de crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo de substrato (COT e NT) e POR em biorreator batelada simples.
Observando os valores descritos, observa-se que o máximo de biomassa
encontrado foi de, aproximadamente, 4,67 g·L-1, com uma concentração de
polímero de 46 % (2,16 g·L-1). Ao se comparar os valores encontrados com os
dados obtidos na Figura 26 nota-se que houve uma redução considerável da
quantidade de biomassa total obtida no tempo de 28 h (4,67 g·L-1 versus
7,35 g·L-1). A concentração de P(3HB) total também foi reduzida (2,16 g·L-1
versus 3,48 g·L-1), contudo a relação entre a biomassa total e o teor de polímero
acumulado apresentou uma tendência similar em ambos os cultivos (46,33 %
versus 46,97 %).
Em relação ao POR do sistema, nota-se que ele reduz gradativamente
até 16 h e então se mantém estável até o fim do período de cultura. Lin & Liu
(2014) apontam que o perfil de POR de um sistema deve apresentar três faixas
distintas, uma fase inicial de declínio, uma fase de estabilização e, por fim, uma
fase de aumento do valor de POR. Os autores trazem ainda que em casos onde
uma ou mais fases do perfil de POR não forem observadas, o tempo total do
ensaio deve ser prolongado.
109
De modo a melhor compreender o efeito do POR no metabolismo das
células de B. megaterium, novos ensaios foram realizados, desta vez utilizando
diferentes valores de POR (0 mV, -20 mV e -40 mV) e ampliando a duração dos
cultivos para 48 h. Os resultados encontrados ao longo destes ensaios estão
descritos nas Figuras 33, 34 e 35.
Figura 33 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo de substrato (COT e NT) e POR (B) em biorreator batelada simples (0 mV POR).
110
Figura 34 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo de substrato (COT e NT) e POR (B) em biorreator batelada simples (-20 mV POR).
Figura 35 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo de substrato (COT e NT) e POR (B) em biorreator batelada simples (-40 mV POR).
111
Comparando os valores apresentados nas Figuras 33, 34 e 35, nota-se
que a alteração do POR das fermentações causou grandes alterações no
comportamento das células bacterianas. Em relação ao teor de biomassa total
encontrado, ao se utilizar 0 mV o teor máximo encontrado foi de 5 g·L-1 após
30 h, enquanto para as demais condições (-20 mV e -40 mV) os máximos obtidos
para biomassa total foram de 2,90 g·L-1 e 0,53 g·L-1, respectivamente.
Para P(3HB) uma tendência similar foi observada, o cultivo utilizando
0 mV produziu uma quantidade máxima de 3,54 g·L-1 após as 48 h de cultura,
enquanto que os demais deram origem a 1,68 g·L-1 (-20 mV) e 0,30 g·L-1 (-40
mV). A proporção de polímero presente na biomassa também apresentou um
comportamento similar, com P(3HB) representando 69,87 % da biomassa total
produzida no cultivo utilizando 0 mV, para as demais condições, foram
encontradas proporções de polímero versus biomassa de 55,45 % e 46,66 %
para -20 mV e -40 mV, respectivamente.
Os dados encontrados durante este conjunto de experimentos mostram
que apesar da ampliação do período de cultivo, a curva de POR apresentou os
três estágios descritos por Lin & Liu (2014) apenas ao se utilizar um valor de
POR de 0 mV. Neste caso (Figura 33), nota-se que o POR do sistema atinge o
valor mínimo de 0 mV em aproximadamente 6 h, mantendo-se então estável até
24 h e então aumentando gradativamente durante o período restante. Para as
demais condições, é possível perceber que a queda inicial do valor de POR
ocorre mais lentamente, com os valores mínimos sendo atingidos após 12 h (-20
mV) e 18 h (-40 mV).
O comportamento dos parâmetros cinéticos apresentados nas Figuras 34
e 35 sugerem que a taxa de aeração do sistema foi incapaz de suprir a demanda
necessária pelas células (FACCIN et al., 2013). Shimizu & Matsuoka (2019) e
Liu, Qin & Lin (2017) apontam que a oxigenação do sistema fermentativo é um
fator crucial para o desenvolvimento de microrganismos aeróbios, sendo que
níveis insuficientes de aeração reduzem a taxa de crescimento celular e/ou de
acúmulo de produto.
Kukec & Wondra (2002), Lin, Chien & Duan (2010), bem como Verhagen,
Van Gulik & Wahl (2020) também apontam que o comportamento atípico da
curva de POR pode estar relacionada ao pH, que influencia diretamente na
112
condutividade do sistema, e por consequência, no valor de POR. Com isto em
mente, um novo experimento foi realizado, utilizando POR de 0 mV e fixando o
valor mínimo de pH em 7,0. Os resultados encontrados sob estas condições de
cultivo encontram-se descritos na Figura 36.
Figura 36 – Cinética de pH (A), crescimento, bioprodução de P(3HB), consumo de substrato (COT e NT) e POR (B) em biorreator batelada simples (0 mV POR, pH mínimo 7,0).
Os resultados descritos na Figura 36 mostram que o controle de pH
alterou drasticamente o perfil de POR do sistema. É possível observar que
embora o comportamento inicial siga a mesma tendência observada na Figura
33, com uma rápida redução para 0 mV após 6 h de cultivo, o POR não
apresentou alterações até o fim do período de cultivo.
Em relação aos demais parâmetros, observa-se que as respostas se
assemelham com os dados encontrados na Figura 33, com máximo de biomassa
obtido de 5,11 g·L-1 versus 5,07 g·L-1 para o cultivo sem controle de pH. Em
relação a concentração de P(3HB), uma leve redução foi observada, 3,32 g·L-1
versus 3,54 g·L-1 para o cultivo sem controle de pH, o mesmo também foi
113
observado na proporção de polímero em relação a biomassa total, com o máximo
obtido (65,12 %) estando levemente abaixo do resultado encontrado no cultivo a
0 mV sem controle de pH (69,87 %).
Contudo, observando o perfil de pH, nota-se que ele permanece
relativamente estável até 30 h, apresentando então um aumento na alcalinidade
do meio de cultura, atingindo um valor máximo de 7,88 após 48 h de cultivo. Este
é um fator importante, uma vez que o aumento do pH sugere morte da cultura
(THRASH; COATES, 2008; EGLI, 2015; VERHAGEN; VAN GULIK; WAHL,
2020).
Outro ponto que deve ser ressaltado é o comportamento da proporção de
polímero em relação a biomassa total. Os valores obtidos nos cultivos com
controle de POR, independente do pH, foram significativamente mais elevados
(65,12 % a 69,87 %) quando comparados ao cultivo maximizado descrito na
Figura 26 (50,07 %). Lin, Chien & Duan (2010), Liu, Qin & Lin (2017) e Guo et al.
(2021) sugerem que isto se deve a alterações no fluxo metabólico das células,
fazendo com que a rota metabólica responsável pela produção de P(3HB) seja
expressa com maior frequência.
5.7 Recuperação de P(3HB) via fluído supercrítico
As Tabelas 18, 19, e Figura 37 apresentam os resultados da cinética de
recuperação do biopolímero (5 min a 60 min) utilizando CO2 supercrítico e co-
solventes etanol e propanol como co-solventes, nas condições de 150 bar e
50 ºC, respectivamente.
Tabela 18 - Recuperação de P(3HB) via extração por fluido supercrítico utilizando etanol como co-solvente.
Tempo (min)
Extrato (g)
P(3HB) (g)
P(3HB) (%)
5 0,065 2,40 x 10-6 3,37 10 0,027 1,00 x 10-4 6,26 15 0,019 6,41 x 10-5 37,85 20 0,011 2,25 x 10-5 2,04 30 0,023 4,64 x 10-5 2,02 45 0,034 7,59 x 10-5 2,23 60 0,026 4,49 x 10-5 1,73
*Variáveis fixas: Quantidade de células (2 g); pressão (150 bar); temperatura (50 °C)
114
Tabela 19 - Recuperação de P(3HB) via extração por fluido supercrítico utilizando propanol como co-solvente.
Tempo (min) Extrato (g) P(3HB)
(g) P(3HB) (%)
5 0,001 0,0002 21,35
10 0,002 0,0005 25,77
15 0,003 0,0001 4,98
20 0,005 0,0001 2,91
30 0,010 0,0000 0,23
45 0,002 0,0003 14,90
60 0,003 0,0002 5,85 *Variáveis fixas: Quantidade de células (2 g); pressão (150 bar); temperatura (50 °C)
Os dados encontrados nas Tabelas 18 e 19 mostram que, a maior taxa de
recuperação ocorre em 15 min para os tratamentos realizados com etanol e em
10 min para o propanol. Observou-se ainda que, ao utilizar propanol como co-
solvente, o processo apresentou maior oscilação entre os pontos de amostragem
quando comparado com a utilização de etanol, onde a recuperação permanece
quase constante após 15 min. Este efeito pode ser explicado devido a maior
permeabilização dos solventes nas células em função do tempo de contato,
facilitando a recuperação do residual do polímero (HEJAZI; VASHEGHANI-
FARAHANI; YAMINI, 2003; DARANI; MOZAFARI, 2010).
Figura 37 – Recuperação cumulativa de P(3HB) durante o período de recuperação por CO2 supercrítico utilizando etanol (A) e propanol (B) como co-solventes.
A B
115
Observando a Figura 37, nota-se que ao se utilizar etanol (A), a
recuperação máxima obtida ao final do processo foi de 55,51 %, enquanto o
tratamento com propanol (B) apresentou uma taxa de recuperação de 75,99 %.
Daly et al. (2018) avaliaram a recuperação de P(3HB) previamente extraído via
tecnologia supercrítica utilizando CO2 (150 bar e 50 ºC). Os autores foram
capazes de obter uma taxa de recuperação de 73 % sem utilizar nenhum co-
solvente, sendo que ao se empregar etanol em conjunto com CO2, a eficiência
do processo chegou a 93 %. Os resultados obtidos Daly et al. (2018) se
contrastam com os valores encontrados ao longo do presente estudo, contudo,
o principal motivo para esta diferença significativa entre processos realizados
sob as mesmas condições está na amostra analisada. Daly et al. (2018)
utilizaram P(3HB) bruto, previamente extraído como amostra, buscando apenas
a purificação do produto. Isto corrobora a hipótese de que a baixa eficiência do
processo se dá devido a inabilidade do processo supercrítico romper
completamente a membrana celular do B. megaterium, dificultando o arraste das
moléculas de polímero pelo CO2, já que as mesmas apresentam um alto peso
molecular, podendo chegar a pesar até 1500 KDa (KHOSRAVI-DARANI;
VASHEGHANI-FARAHANI, 2004; DARANI; MOZAFARI, 2010; DEMIRDÖĞEN
et al., 2018).
Khosravi-Darani & Vasheghani-Farahani (2004) avaliaram a recuperação
de P(3HB) de células de Ralstonia eutropha por CO2 supercrítico utilizando
condições de 200 bar de pressão, 40 ºC e metanol como co-solvente. O
processo teve duração de 100 min e permitiu a recuperação de 59,2 % a 68,3 %
da concentração total de P(3HB) presente na amostra. Os autores, no entanto,
também realizaram um pré tratamento da biomassa com hidróxido de sódio em
concentrações variando de 0,2 % a 0,8 %, de modo a auxiliar na ruptura da
parede celular. Comparando estes valores com os dados obtidos no presente
estudo, nota-se que a taxa de recuperação ao se utilizar propanol (75,18 %) foi
superior aos valores encontrados por Khosravi-Darani & Vasheghani-Farahani
(2004) (máximo de 68,3 %), mesmo sem o tratamento prévio das amostras.
Isto sugere que o propanol possui potencial para ser utilizado como co-
solvente na recuperação de P(3HB) por tecnologia supercrítica empregando
116
CO2, contudo mais testes são necessários de modo a verificar o comportamento
do processo, caso a amostra de biomassa seja submetida a diferentes pré-
tratamentos alternativos, sugerindo-se o uso de compostos alcalinos, ácidos ou
até mesmo enzimáticos isolados e/ou assistidos com o co-solvente, para auxiliar
na ruptura das células de B. megaterium e na recuperação do P(3HB).
117
6 Conclusão
Os resultados encontrados ao longo do presente trabalho indicam que o
uso de coprodutos agroindustriais podem ser empregados na produção de
P(3HB) por B. megaterium. Dentre os coprodutos avaliados, o efluente da
indústria de candies e balas, em conjunto com a água de parboilização de arroz
apresentaram os melhores resultados quando comparados a água de
maceração de milho.
No que se refere a bioprodução, tanto me frascos agitados quanto em
biorreator, percebe-se que os resultados encontrados para biomassa total e
concentração de P(3HB) se assemelham ou superam resultados obtidos na
literatura ao se utilizar fontes de carbono muito mais dispendiosas, como melaço
de cana ou glicose. Sob condições maximizadas em biorreator, o sistema foi
capaz de produzir, após 32 h, 7,55 g·L-1 de biomassa total, sendo que 50,07 %
(3,78 g·L-1) deste valor corresponde a P(3HB). Observou-se também que o
potencial redox do meio de cultura, bem como o pH são fatores cruciais para a
manutenção do metabolismo celular, com dados indicando que a alteração
destes parâmetros possibilita o aumento da taxa de acúmulo de polímero em
relação a quantidade de células devido a alterações no fluxo metabólico.
Por fim, técnicas de recuperação de P(3HB) utilizando técnologia
supercrítca também foram avaliadas, contudo testes preliminares apontam a
necessidade de utilizar co-solventes ou efetuar um pré-tratamento da amostra.
Assim, sendo, estudos futuros serão realizados para verificar a potencial
aplicação de técnicas como a tecnologia de ultrassom e maceração celular
utilizando nitrogênio líquido em conjunto com a tecnologia supercrítica na
recuperação de P(3HB).
118
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134
135
8 Apêndice I
Tabela 20 – Coeficientes de regressão, erro padrão e valores t e p do planejamento fatorial 22 em biorreator para massa seca (planejamento 3).
Coeficiente de Regressão
Erro Padrão t(3) p
Médias* 4,61 0,206 22,41 0,0001 (1)Aeração (L) -0,729 0,272 -2,68 0,0751 (2)Agitação(L)* 2,34* 0,272 8,62 0,0032
1L x 2L 0,279 0,272 1,02 0,380 * Fatores estatisticamente significativos (p<0,05)
Tabela 21 – Análise de variância do planejamento fatorial 22 em biorreator para massa seca (planejamento 3).
Fontes de Variação
Soma dos Quadrados
Graus de Liberdade
Quadrados Médios
F Calculado
(2)Agitação(L) 22,01 1 22,01 33,07
Resíduo 3,33 5 0,665
Total 25,34 6
*Ftab(95 %) = 6,607;
Tabela 22 – Coeficientes de regressão, erro padrão e valores t e p do planejamento fatorial 22 em biorreator para concentração de P(3HB) (planejamento 3).
Coeficiente de Regressão
Erro Padrão t(3) P
Médias* 2,35 0,277 8,51 0,003 (1)Aeração (L) 0,491 0,366 1,340 0,273 (2)Agitação(L)* 1,28 0,366 3,50 0,040
1L x 2L -0,138 0,366 -0,377 0,731 * Fatores estatisticamente significativos (p<0,05)
Tabela 23 – Análise de variância do planejamento fatorial 22 em biorreator para P(3HB) (planejamento 3).
Fontes de Variação
Soma dos Quadrados
Graus de Liberdade
Quadrados Médios
F Calculado
(2)Agitação(L) 6,56 1 6,56 12,39 Resíduo 2,65 5 0,529
Total 9,20 6
*Ftab(95 %) = 6,607;
Tabela 24 – Coeficientes de regressão, erro padrão e valores t e p do planejamento fatorial 22 em biorreator para concentração de P(3HB) em função da massa seca (planejamento 3).
Coeficiente de Regressão
Erro Padrão t(3) P
Médias* 45,10* 5,94 7,59 0,005 (1)Aeração (L) 10,73 7,86 1,37 0,265 (2)Agitação(L) 12,52 7,86 1,59 0,209
136
1L x 2L -9,03 7,86 -1,15 0,334 * Fatores estatisticamente significativos (p<0,05)
Tabela 25 – Análise de variância do planejamento fatorial 22 em biorreator para massa a P(3HB) em função da massa seca (planejamento 3).
Fontes de Variação
Soma dos Quadrados
Graus de Liberdade
Quadrados Médio
F Calculado
(1)Aeração (L) 460,87 1 460,87 1,87 (2)Agitação(L) 627,20 1 627,20
1L x 2L 326,41 1 326,41 Resíduo 740,43 3 246,81
Total 2154,91 6
*Ftab = 6,607;
Tabela 26 – Respostas para massa seca, P(3HB) e pH para cultivos utilizando diferentes proporções de EIB e APA.
Tempo (h)
Massa Seca (g∙L-1)
P(3HB) (g∙L-1)
P(3HB) (%)
pH
0 0,200 ± 0,082 ND ND 6,48 ± 0,026
2 0,267 ± 0,047 ND ND 6,51 ± 0,005
4 0,367 ± 0,170 ND ND 6,43 ± 0,012
6 0,633 ± 0,094 0,066 ± 0,019 14,24 ± 0,860 6,19 ± 0,034
8 1,27 ± 0,125 0,246 ± 0,053 17,43 ± 0,033 5,98 ± 0,036
10 1,97 ± 0,047 0,613 ± 0,044 29,87 ± 0,040 5,54 ± 0,102
12 1,87 ± 0,047 0,686 ± 0,101 39,86 ± 0,531 4,95 ± 0,168
14 2,47 ± 0,205 1,02 ± 0,079 42,57 ± 0,610 4,72 ± 0,012
16 2,90 ± 0,163 1,35 ± 0,092 46,54 ± 0,587 4,63 ± 0,025
18 3,30 ± 0,163 1,58 ± 0,070 50,67 ± 0,582 4,59 ± 0,070
20 3,33 ± 0,249 1,63 ± 0,107 48,85 ± 0,817 4,59 ± 0,017
22 3,60 ± 0,245 1,64 ± 0,179 45,50 ± 1,921 4,57 ± 0,017
24 3,70 ± 0,019 2,25 ± 0,124 44,25 ± 0,016 4,47 ± 0,043
26 4,37 ± 0,170 2,40 ± 0,113 45,28 ± 0,781 4,42 ± 0,049
28 4,30 ± 0,100 2,41 ± 0,067 47,92 ± 0,227 4,48 ± 0,008
30 4,10 ± 0,012 2,32 ± 0,047 44,53 ± 1,537 4,47 ± 0,086
32 4,50 ± 0,100 2,15 ± 0,224 49,88 ± 1,720 4,48 ± 0,009
34 4,33 ± 0,094 1,96 ± 0,016 46,48 ± 0,150 4,48 ± 0,029
36 4,55 ± 0,150 2,44 ± 0,108 49,83 ± 0,956 4,45 ± 0,016
38 4,60 ± 0,100 2,31 ± 0,168 49,79 ± 0,551 4,49 ± 0,015
40 4,75 ± 0,050 2,51 ± 0,100 46,97 ± 1,759 4,57 ± 0,055
42 5,00 ± 0,082 2,54 ± 0,090 45,96 ± 1,790 4,65 ± 0,024
44 5,10 ± 0,200 2,34 ± 0,076 45,87 ± 0,308 4,62 ± 0,014
46 5,25 ± 0,250 2,49 ± 0,070 43,23 ± 0,140 4,56 ± 0,070
48 5,37 ± 0,287 2,55 ± 0,129 45,18 ± 0,540 4,51 ± 0,025 Média ± desvio padrão
137
Tabela 27 – Análise de variância (ANOVA) sem efeitos não significativos para a concentração de massa seca (planejamento 3).
SQ GL QM F p
Agitação (L) 22,01 1 22,01 33,07 0,0022
Resíduo 3,33 5 0,6655
Total 25,34 6
Tabela 28 – Análise de variância (ANOVA) sem efeitos não significativos para a concentração de P(3HB) (planejamento 3).
SQ GL QM F p
Agitação (L) 6,56 1 6,56 12,39 0,0169
Resíduo 2,65 5 0,5295
Total 9,21 6
Tabela 29 – Análise de variância (ANOVA) para a concentração de P(3HB) em função da massa seca (planejamento 3).
SQ GL QM F p
Aeração (L) 460,87 1 460,87 1,87 0,2652
Agitação (L) 627,20 1 627,20 2,54 0,2092
Resíduo 326,41 1 326,41 1,32 0,3335
Total 740,43 3 246,81
