Prof. Michele Segreto I.T.C. Primo Levi – Bollate Ultima revisione a.s. 2012 - 2013

Prof. Michele Segreto

I.T.C. Primo Levi – Bollate

Ultima revisione a.s. 2012 - 2013

I Citocromi

Sono enzimi il cui coenzima presenza un gruppo eme recante uno ione ferro

Forma ossidata Fe3+ forma ridotta Fe2+

Esempio

2 cit.a3 (Fe2+) + ½ O2 2 cit.a3 (Fe3+) + O2-

Nella respirazione aerobia il substrato di partenza, allo stato ridotto, viene completamente ossidato con la massima produzione di energia possibile

2 H+ H2OO2-+



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Batteri ottengono energia dall’uso di substrati ridotti, sia organici (chemiorganotrofi), sia inorganici (chemiolitotrofi).

Il substrato organico ridotto di elezione per i batteri eterotrofi è il glucosio (C6H12O6).

La reazione globale della respirazione è

C6H12O6 + 6 O2 6 H20 + 6 CO2 + energia (ATP)

L’intero processo si svolge in due stadi

Glicolisi (o via di Embden-Meyerhof)

Ciclo di Krebs



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Vista la mancanza di mitocondri nei batteri, il disordine citoplasmatico porta i batteri a svolgere il ciclo di Krebs in modo caotico e a volte ad avere una catena

respiratoria ramificata

Ciclo di krebs Catena respiratoria

Cit. a2

Cit. o

O2

Acido latticoMeccanismo alternativo in Escherichia coli



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Batteri chemiolitotrofi - autotrofi

Usano come substrati ridotti alcuni composti inorganici come

H2 H2O

H2S SO42-

NH3 NO3-

Fe2+ Fe3+

A titolo di esempio si riporta il metabolismo di due generi batterici nitrificanti: Nitrosomonas e Nitrobacter

2 NH3 + 3 O2 2 NO2- + 2 H2O + 2 H+

NO2- + ½ O2 NO3

-



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La respirazione anaerobia: processo catabolico tipico dei batteri chemiorganotrofi, in cui il substrato di partenza allo stato ridotto viene ossidato attraverso un sistema di trasporto di elettroni e idrogeno e in cui l’accettore finale non è rappresentato da ossigeno

Gli accettori finali più comuni sono nitrato NO3- , solfato SO4

2-, anidride carbonica CO2

Esempi di questo processo sono batteri denitrificanti e metanobatteri

C6H12O6 + 4 NO3- 6 CO2 + 2 N2 + 6 H20 + ATP

4 H2 + CO2 2 H2O + CH4



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La fermentazione: processo catabolico in cui il substrato iniziale, donatore di idrogeno ed elettroni, è un composto organico e l’accettore finale è rappresentato anch’esso da un composto organico, caratterizzato da un numero inferiore di atomi di carbonio

C6H12O6 + 2 NAD+ + 2 ADP 2 C3H4O3 + 2 NADH + H+ + 2 ATPAcido piruvico

L’acido piruvico è la base per numerosi processi fermentativi: i più noti sono la fermentazione alcoolica (Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis) e lattica

(Steptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus)

alcoolica

lattica

C3H4O3 + NADH+H+ C2H5OH + CO2 + NAD+

C3H4O3 + NADH+H+ C3H6O3 + NAD+



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La fotosintesi – i batteri fotolitotrofi

Attraverso l’uso di batterioclorofilla, questi batteri (cianobatteri o alghe azzure) sono in grado di captare la luce solare per svolgere un processo di riduzione della CO2 secondo il seguente schema

CO2 + 2 H2O (CH2O) + O2 + H2O

I batteri dei Generi Chromatium e Thiospirillum non usano acqua per ridurre l’anidride carbonica, ma acido solfidrico

CO2 + 2 H2S (CH2O) + 2 S + H2O



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La sintesi proteica

• Viene divisa in 5 fasi– Attivazione degli aminoacidi– Inizio– Allungamento– Terminazione e rilascio del ribosoma– Ripiegamento e modificazioni post-traduzione



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Il codice genetico

• Il codice del DNA è formato da 4 lettere (A, T, G e C)

• Il codice proteico è formato da 20 aminoacidi

• Il DNA può essere lo stampo su cui si basa la sintesi proteica solo prevedendo che triplette di basi azotate possano codificare il singolo aminoacido



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seconda lettera

prima lettera U C A G

U

UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys

UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys

UUA Leu UCA Ser UAA Stop UGA Stop

UUG Leu UCG Ser UAG Stop UGG Trp

C

CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg

CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg

CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg

CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg

A

AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser

AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser

AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg

AUG Met - inizio ACG Thr AAG Lys AGG Arg

G

GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly

GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly

GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly

GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly

Ala : alanina; Arg : arginina; Asn : asparagina; Asp : aspartato; Cys : cisteina; Gln: glutammina; Glu : glutammato;

Gly : gllicina; His : istidina; Ile : isoleucina; Leu: leucina; Lys: lisina; Met : metionina; Phe : fenilalanina; Pro : prolina;

Ser : serina; Thr : treonina; Trp : triptofano; Tyr : tirosina; Val : valina Prof. Michele Segreto


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Tra le diverse triplette portate dal messaggero (codoni) non ci sono segnali di interruzione.

Il segnale di inizio è dato dal codone AUG, quindi normalmente l’aminoacido iniziale è metionina.

La lettura del codone va in direzione 5’ – 3’

Il segnale di chiusura (codoni di terminazione) del gene è dato dalle triplette STOP.

Il fatto che più di una tripletta codifichi il singolo aminoacido ha dato origine al termine di “codice degenerato”.

Il codice genetico è universale, ossia praticamente tutte le specie viventi, compresi i batteri, studiate gli aminoacidi sono 20 e sono codificati dalle stesse triplette.

La terza base del codone spesso è poco influente nel decidere l’amminoacido corrispondente. La sua funzione sembra essere quella di velocizzare il distacco del tRNA dall’mRNA, visto il suo legame debole nell’appaiamento.

La tripletta complementare del codone è chiamata anticodone.

Ogni transfer RNA (tRNA) porta un anticodone specifico per l’amminoacido corrispondente.



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Fase 1 : attivazione aminoacidi

• Avviene nel citoplasma

• Serve ad attivare il gruppo carbossilico dell’amminoacido

• Questa fase è seguita da enzimi chiamati aminoacil-tRNA sintetasi

• Gli enzimi sono attivati da Mg2+



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Fase 2 : inizio

• L’mRNA si lega alla subunità minore del ribosoma

• Alla tripletta di inizio si lega il primo tRNA

• Le proteine che seguono questo processo sono dette “fattori di inizio”



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Fase 3 : allungamento

• Il secondo codone viene letto dal ribosoma, che richiama il tRNA complementare. Il primo aminoacido, di solito metionina, viene legato con il legame peptidico al secondo aminoacido.

• Il primo tRNA, libero dall’aminoacido trasportato, si stacca dal codone e torna libero nel citoplasma.

• Il rRNA si sposta di 3 basi lungo il messaggero. Al terzo codone si lega il tRNA corrispondente.

• L’amminoacido corrispondente viene legato al secondo amminoacido

• Il secondo tRNA, libero dall’aminoacido trasportato, si stacca dal codone e torna libero nel citoplasma.



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Fase 4 : terminazione

• Quando il ribosoma legge il codone Stop termina di leggere il messaggero e libera la catena polipeptidica prodotta

• Le proteine che avviano il distacco vengono chiamate “fattori di rilascio”

• Il ribosoma inizia un nuovo ciclo produttivo



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Fase 5 : ripiegamento

• Il polipeptide, per poter essere funzionante, deve prendere la sua forma tridimensionale definitiva

• A volte alla catena amminoacidica vengono aggiunti gruppi chimici funzionali (gruppi acetile, fosfato, metile, ecc.)

• Altre volte vengono rimossi atomi o molecole, anche amminoacidi, in grado di attivare o rendere più efficiente la proteina



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Alcune curiosità

• Una cellula di Escherichia coli contiene oltre 15.000 ribosomi, che costituiscono il 25% del peso secco della cellula;

• I 2/3 del peso del ribosoma è dato da RNA ribosomale ed 1/3 da proteine;

• La funzione delle proteine non è stata ancora completamente chiarita, ma probabilmente la più importante è di tipo strutturale;

• Il ribosoma batterico è costituito da 2 subunità, denominate rispettivamente 50 e 30 S, con un diametro di 23 nm, mentre il ribosoma eucariotico è più grande con velocità di sedimentazione di 60 e 40 S



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• Si tratta di molecole RNA piccole, formate da 73 – 93 nucleotidi, con pm da 24.000 – 31.000

• Ogni cellula contiene almeno 32 tipi di tRNA (alcuni riconoscono più di un codone)

• La forma, definita a trifoglio, viene schematizzata con un braccio lungo a cui è legato in cima l’amminoacido corrispondente all’anticodone

• Dalla parte opposta si trova il braccio con l’anticodone specifico

• A rinforzo della struttura troviamo 2 anse o bracci



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RNA transfer

Attivazione del tRNA• Avviene nel citoplasma• L’enzima responsabile dell’operazione è chiamato amminoacil-tRNA

sintetasi• Per ogni amminoacido c’è un diverso enzima responsabile• L’aggancio dell’amminoacido al suo tRNA richiede il consumo di 1

ATP degradato però ad AMP• ATP AMP + 2 Pi

• L’operazione raggiunge due scopi: attivare il messaggero e fare in modo che possa arrivare nella posizione corretta sul messaggero

• I possibili errori nello svolgimento del processo sono corretti dalla tRNA sintetasi (proofreading o correttore di bozze)

• La correzione è possibile solo a questo livello, una volta fatto lo sbaglio e non corretto successivamente nelle fasi successive non c’è modo di porre rimedio



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Inizio sintesi proteica

• L’importanza del codone AUG, e quindi della metionina, nell’inizio della sintesi proteica è testimoniato dal fatto che troviamo 2 diversi tRNA per la metionina, uno solo per il codone di inizio sequenza (tRNA Met), l’altro per i codoni di centro messaggio (tRNA fMet)



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Formazione del complesso di inizio nei batteri

I fattori di inizio IF-1 e IF-3 si legano al sito P, lo attivano e a quel punto il messaggero si lega alla subunità minore del ribosoma.

Al sito P si appoggia il codone AUG che codifica metionina.

Al codone si attacca il transfer UAC che trasporta fMet. Il processo è controllato dal fattore di inizio IF-2, attivato da GTP che nel dare energia al processo si trasforma in GDP, liberando una molecola di Pi

• Il secondo amminoacil-tRNA entra nel ribosoma, si lega al sito A su cui si trova la seconda tripletta di nucleotidi.

• Il tRNA viene attivato da un fattore di allungamento, indicato con Tu, a sua volta caricato con GTP, che perdendo un Pi si trasforma in GDP fornendo l’energia necessaria al processo



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• Tappe di inizio sintesi proteica• La subunità minore del ribosoma viene attivata

mediante l’attacco di due fattori di inizio (fattore 1 e 3) al sito amminoacilico A ed in luogo periferico (negli eucarioti i fattori di inizio sono almeno 9)

• Il messaggero viene posizionato sulla subunità. La direzione 5’ viene indicata dalla presenza ad inizio messaggero di 4 – 9 basi puriniche (sequenza di Shine-Dalgarno)

• Il tRNA Met viene posizionato sul codone di inizio sul sito P

• Vengono liberati i fattori di inizio• Il ribosoma si ricompone con l’aggiunta della

subunità maggioreProf. Michele Segreto


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Allungamento • Il tRNA corrispondente alla seconda tripletta, al momento

appoggiata sul sito A, viene posizionato;• Il GTP (guanosina tri-fosfato), legato al tranfer come attivatore,

viene idrolizzato• La peptidil trasferasi unisce i due amminoacidi con il legame

peptidico; il primo tRNA resta privo del suo amminoacido (traslocazione);

• Il ribosoma scivola di una tripletta verso la terminazione 3’;• Giunto sul sito E, il tRNA scarico (deacilato) si stacca dal

messaggero• Un nuovo tRNA, complementare alla tripletta letta dal sito A, si

appoggia sul messaggero;• Una nuova traslocazione ha inizio



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Terminazione

• Dopo una serie di traslocazioni, il ribosoma legge il segnale di fine messaggio

• Un fattore di rilascio occupa il sito A• A questo punto i fattori di terminazione (o di rilascio)

idrolizzano l’ultimo legame che tiene unita la catena polipeptidica con l’ultimo tRNA, in posizione P

• Il tRNA scarico viene rilasciato dal sito P• Il ribosoma si divide nelle due subunità• Tutti i componenti vengono rilasciati e liberano il

messaggero, che può ricominciare tutta l’operazione



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Regolazione dell’espressione genica

• Processo 1: trascrizione• Processo 2: modificazioni

del mRNA post-trascrizione• Processo 3: degradazione

del mRNA• Processo 4: traduzione• Processo 5: modificazione

delle proteine post-traduzione

• Processo 6: trasporto della proteina

• Processo 7: degradazione proteica



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I principi della regolazione genica

• Alcuni geni in alcune cellule sono sempre attivi: questi sono chiamati geni costitutivi

• Il carattere non sottoposto a regolazione è chiamato espressione genica costitutiva

• I caratteri sottoposti a regolazione ambientale sono detti espressione genica regolata

• I prodotti dovuti a caratteri regolabili sono detti inducibili• Il processo di attivazione dei geni regolabili è detto

induzione• Quando il gene viene bloccato si parla di carattere

reprimibile• Il processo che blocca il gene che determina il carattere

da fermare è detto repressione Prof. Michele Segreto


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• RNA polimerasi si lega al DNA• La trascrizione avviene solo se l’enzima riesce a

legarsi al sito promotore• L’interazione tra promotore ed RNA non è mono-

dimensionale, può variare a seconda delle richieste della cellula: più il prodotto è richiesto e maggiore è la velocità di sintesi

• I fattori di specificità modificano la capacità dell’RNA polimerasi di legarsi al promotore e dare inizio alle operazioni

• I repressori bloccano l’interazione tra enzima e promotore

• Gli attivatori facilitano l’operazioneProf. Michele Segreto


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• Nei batteri i siti a cui si legano i repressori sono detti operatori e in genere sono vicini al promotore

• Se il repressore è legato all’operatore, l’RNA polimerasi si blocca

• Il blocco dell’attività enzimatica è detto regolazione negativa

• L’effettore è una molecola generalmente di piccole dimensioni che funge da segnale molecolare: si lega al repressore e lo modifica strutturalmente

• Il legame effettore – repressore modifica la velocità della trascrizione.

• A volte l’interazione effettore – repressore modifica la conformazione tridimensionale della molecola finale e la lettura può avere inizio



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Regolazione negativa

a) Il repressore è legato all’operatore, che è parte del promotore. La molecola segnale si lega al repressore e si libera il promotore per cui inizia la sintesi proteica

b) Il repressore è legato all’operatore insieme alla molecola regolatrice. Il segnale esterno provoca il distacco della proteina regolatrice dal repressore che quindi libera il promotore per cui inizia la sintesi proteica

• Gli attivatori, una volta legati al DNA, aumentano la velocità di sintesi (regolazione positiva)

• I siti a cui si legano gli attivatori, nei procarioti, è normalmente vicino al promotore

• A volte negli eucarioti si trovano attivatori legati a siti detti enhancer (incrementatori) distanti dal promotore

• A volte gli attivatori vengono attivati dalla molecola segnale, altre volte vengono bloccati da tale molecola. Pertanto la velocità di trascrizione può essere sia velocizzata, sia decrementata dalla presenza del segnale.



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Regolazione positiva

c) l’attivatore si lega al promotore e parte la trascrizione. La molecola segnale si lega all’attivatore, l’attivatore si stacca dal promotore e la sintesi si blocca

d) l’attivatore è legato al promotore insieme alla molecola segnale. Quando il segnale si stacca dall’attivatore, questo si stacca dal promotore e la sintesi si blocca

Gli operoni

• Nei procarioti si è trovato che diversi geni legati ad un unico processo di sintesi proteica sono riuniti in un’unica unità detta operone

• L’operone comprende diversi geni (da 2 a 6, a volte 20), un unico sito per l’attivatore, uno per l’operatore-repressore ed un solo promotore

• Lo studio di tali operoni è iniziato con l’osservazione dell’operone lac in Escherichia coli nel 1941 da J. Monod



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• Monod allestì colture di batteri chemioeterotrofi: il terreno di coltura era minerale e veniva aggiunto uno zucchero per volta

• L’aggiunta di glucosio portava ad una crescita piuttosto veloce della colonia batterica, mentre l’aggiunta di lattosio (un disaccaride formato da galattosio e glucosio) causava un periodo di latenza più lungo ma una crescita altrettanto rigogliosa

In blu la crescita normale della colonia con glucosio, in rosa con substrato di difficile assimilazione

• Mettendo entrambi gli zuccheri nel terreno di coltura si aveva una prima crescita veloce, sovrapponibile a quella con il glucosio, a cui segue un momento di pausa ed una seconda fase di crescita

• L’ipotesi di Monod fu che E.coli utilizzava glucosio fintanto che trovava questo zucchero come fonte di carbonio, e solo quando il glucosio termina, il battero rivolge le sue attenzioni al lattosio.

• A questo tipo di crescita venne dato il nome di crescita diauxica

• L’ipotesi, poi confermata dai lavori di laboratorio, era che E.coli utilizzava enzimi costitutivi, quelli per l’utilizzo del glucosio che il battero ha sempre presenti nella cellula, e quando lo zucchero semplice termina, vengono prodotti gli enzimi in grado di utilizzare il lattosio (enzimi inducibili)

• Nel 1961 Jacob e Monod (premi Nobel per la medicina nel 1965) presentarono il primo modello di regolazione genica, l’operone lattosio.

• Lo studio parte dall’osservazione che in E.coli un solo difetto genetico porta alla perdita dei 3 enzimi codificati da quello che sarà poi chiamato operone lattosio



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L’operone lattosio

• Comprende i geni b-galattosidasi, galattoside permeasi e tiogalattoside transacetilasi

• b-galattosidasi: sistema enzimatico complesso in grado di catalizzare due reazioni: la principale porta all’idrolisi del lattosio con liberazione di galattosio e glucosio, e la secondaria in grado di convertire il lattosio in allattosio

• Allattosio è l’induttore per l’intero processo• galattoside permeasi: è una proteina di membrana con

la funzione di catturare il lattosio presente nel mezzo di coltura

• tiogalattoside transacetilasi: sembra che abbia la funzione di eliminare i tiogalattosidi tossici fatti entrare dalla permeasi



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• Questo modello è detto di regolazione per induzione• I 3 geni sono adiacenti• Il modello è di regolazione negativa: il repressore, legato

al DNA, inibisce la trascrizione in assenza di lattosio. • Quando entra lattosio nella cellula, viene trasformato in

allattosio dalle poche molecole di galattossidasi presenti nel citoplasma.

• La molecola segnale (l’induttore allattosio) si lega al repressore e lo rimuove: da quel momento inizia la lettura del DNA



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Ma in che modo l’associazione lattosio + glucosio causa la crescita diauxica?

• Si è scoperto negli anni ’70 che l’operone lac è attivato dall’induttore ma è sottoposto ad un ulteriore meccanismo di controllo dovuto ad una proteina detta attivatore CAP o CRP

• La proteina CRP è codificata da un gene distante dall’operone lac

• Questa proteina viene sintetizzata in forma inattiva e attivata da AMP ciclico (cAMP)

• La concentrazione di CRP inattivo nella cellula è costante

• La concentrazione di cAMP è basso con concentrazioni intracellulari alte di glucosio, si alza con l’abbassarsi delle concentrazioni di glucosio

• Quindi cAMP funge da messaggero in grado di avvisare E.coli della situazione cellulare del glucosio



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• Quindi il controllo dell’operone è doppio: alta concentrazione di glucosio porta a basse concentrazioni di cAMP

• Viene consumato il glucosio a disposizione• Quando il glucosio è ormai poco concentrato, si alza la

concentrazione di cAMP• A questo punto viene attivata la proteina CRP• CRP attivata si lega all’operone su un sito a lato del promotore• Parte la sintesi delle proteine codificate dall’operone• Ma se non c’è lattosio nell’ambiente l’operone è comunque bloccato• Se c’è lattosio la galattosidasi ne trasforma una piccola parte in

allolattosio che toglie il repressore all’operone legandosi ad esso• A questo punto parte davvero la sintesi degli enzimi dell’operone e il

lattosio viene consumato• Viene liberato il repressore che blocca l’operone



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Modello dell’operone triptofano• È la tipica repressione da prodotto finale• In pratica quando manca il prodotto codificato dall’operone (5 geni),

il repressore è inattivo• L’alta concentrazione del prodotto (in questo modello il triptofano

che funge da corepressore) porta all’attivazione del repressore• Il repressore attivato si lega all’operatore e si blocca la sintesi

proteica legata all’intero operone• Anche per questo operone troviamo un attenuatore: si tratta di una

sequenza leader (162 nucleotidi all’estremità del messaggero) che comprende una coppia di triplette che codifica due codoni per il triptofano, disposti in successione

• Se il triptofano è ben presente saranno presenti tRNA carichi dell’amminoacido

• Il processo di trascrizione è contemporaneo al processo della traduzione



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• La caratteristica peculiare del modello operone trp è legata al fatto che la regolazione non è solo “produco – non produco” ma c’è anche la possibilità di regolare la velocità di tale processo

• Il controllo su tale meccanismo è dato da un processo detto “attenuazione della trascrizione”

• La trascrizione viene attenuata quando la richiesta dell’amminoacido è scarsa o ci sono molte molecole presenti nel substrato

• Il meccanismo funziona in base alla presenza nella regione leader di 4 sequenze (chiamate semplicemente sequenze 1, che comprende i due codoni per triptofano-tRNA, 2, 3 e 4) in grado di regolare la velocità di produzione dell’amminoacido

• Modelli simili vengono applicati per tutte le catene metaboliche procariotiche che portano alla produzione di amminoacidi o di molecole che si trovano in condizioni simili



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• Se nella cellula il livello del triptofano è alto, viene letta tutta l’area del leader ma i segmenti successivi (chiamati 3 e 4) si chiudono formando una forcina (o stelo) con l’impedimento alla continuazione della trascrizione dei geni strutturali. Quindi si ha di fatto la creazione di un terminatore in grado di bloccare la trascrizione degli altri geni

• Se la quantità di triptofano è bassa lo stelo viene formato tra i segmenti 2 e 3, quindi più a monte; il ribosoma, in seguito alla carenza del tRNA legato al triptofano, trova i codoni iniziali liberi (segmento 1) per cui inizia la lettura dei geni codificati dal codone

• Questo modello non è esportabile pari pari agli eucarioti, che avendo una membrana nucleare e la divisione tra i processi di trascrizione e traduzione,



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