PROFIL ANTIBODI IgM DAN IgG PADA BERUK (Macacanemestrina) SETELAH DIINFEKSI VIRUS DENGUE

SEROTIPE-3 (DEN-3) MELALUI RUTE INTRADERMAL

RANTI ASRYYUNI

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWANINSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR2010

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBERINFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi Profil Antibodi IgM dan IgGpada Beruk (Macaca nemestrina) setelah Diinfeksi Virus Dengue serotipe-3(DEN-3) melalui Rute Intradermal adalah karya saya dengan arahan dari komisipembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggimanapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkanmaupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dandicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Bogor, September 2010

Ranti AsryyuniNIM B04060931

ABSTRACT

RANTI ASRYYUNI. Profile of Immunoglobulin M (IgM) and IgG Antibodies in Pig-tailed macaques (Macaca nemestrina) Infected by Dengue Virus Serotype-3(DEN-3) by Intradermal Route. Under direction of JOKO PAMUNGKAS andRACHMITASARI NOVIANA.

The aim of this study was to detect IgM and IgG antibodies titer on plasmaof pig-tailed macaques (Macaca nemestrina) which were infected with denguevirus sero (DEN-3) through intradermal route. Eighty four plasma samples werecollected from six animals for fourteen days in the study, i.e. on day 0 beforeinfection and followed by day 1 through day 13 post infection. The serological testused for detection of IgM and IgG titer was indirect ELISA using ELISA kit(HUMAN®, Germany). The results showed that IgM titer started to increase onday 4 or day 5 post infetion and reached its peak on day 9 post infection andstarted to decline afterwards. The IgG titer started to increase on day 6 or day 7post infection and continued to increase until day 13 post infection. These resultsin general showed that IgM titer increase occured earlier than IgG titer increase,and IgM titer was higher than IgG titer, and each individual animal had differentability with the humoral immune response against dengue virus serotype-3 (DEN-3) when primary infection was performed through intradermal route.

Keywords: IgM, IgG, plasma, indirect ELISA, intradermal route

RINGKASAN

RANTI ASRYYUNI. Profil Antibodi IgM & IgG pada Beruk (Macaca nemestrina)setelah Diifeksi Virus Dengue serotipe-3 (Den-3) melalui Rute Intradermal. Dibawah bimbingan JOKO PAMUNGKAS dan RACHMITASARI NOVIANA.

Penelitian ini bertujuan untuk memeriksa titer antibodi IgM dan IgG padaplasma dari beruk (Macaca nemestrina) yang diinfeksi primer dengan virusdengue serotipe-3 (DEN-3) melalui rute intradermal. Penelitian ini menggunakandelapan puluh empat sampel plasma dari enam ekor beruk yang dikoleksiselama empat belas hari, yaitu pada hari ke-0 sebelum infeksi primer dan diikutihari ke-1 sampai dengan hari ke-13 pasca infeksi. Uji serologi yang digunakanuntuk memeriksa titer antibodi IgM dan IgG adalah uji ELISA tidak langsungdengan menggunakan ELISA kit (HUMAN®, Germany). Hasil pemeriksaanmenunjukkan titer IgM mulai meningkat pada hari ke-4 atau hari ke-5 pascainfeksi dan mencapai puncaknya pada hari ke-9 pasca infeksi dan menurunsetelahnya; sedangkan titer IgG mulai meningkat pada hari ke-6 atau hari ke-7pasca infeksi dan terus meningkat sampai hari ke-13 pasca infeksi. Secaraumum hasil penelitian menunjukkan bahwa setelah infeksi primer titer IgMmeningkat lebih awal daripada titer IgG, titer IgM lebih tinggi dibandingkandengan titer IgG dan masing-masing beruk memiliki kemampuan responkekebalan humoral yang berbeda terhadap virus dengue (DEN-3) ketikadilakukan infeksi primer melalui rute intradermal.

Kata Kunci : IgM, IgG, Plasma, ELISA Tidak Langsung, Rute Intradermal

©Hak Cipta milik IPB, tahun 2010Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkanatau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atautinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentinganyang wajar IPB.Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulisdalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

PROFIL ANTIBODI IgM DAN IgG PADA BERUK (Macacanemestrina) SETELAH DIINFEKSI VIRUS DENGUE

SEROTIPE-3 (DEN-3) MELALUI RUTE INTRADERMAL

RANTI ASRYYUNI

Skripsisebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan padaFakultas Kedokteran Hewan

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWANINSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR2010

Judul Skripsi : Profil Antibodi IgM dan IgG pada Beruk (Macacanemestrina) setelah Diinfeksi Virus Dengue Serotipe-3(DEN-3) melalui Rute Intradermal

Nama Mahasiswa : Ranti AsryyuniNIM : B04060931

Disetujui

Dr. drh. Joko Pamungkas, M.Sc Rachmitasari Noviana, SKHPembimbing I Pembimbing II

Diketahui

Dr. Nastiti KusumoriniWakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan IPB

Tanggal Lulus :

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan atas segala karunia Allah SWT sehinggakarya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulanMaret 2009 dengan judul Profil Antibodi IgG dan IgM pada Beruk (Macacanemestrina) setelah Diinfeksi Virus Dengue Serotipe-3 (DEN-3) melalui RuteIntradermal. Penyelesaian skripsi ini tidak lepas dari bantuan dari berbagai pihak.Penulis ucapkan terima kasih kepada kedua orangtua, Bapak Zakri Oktarinal danIbu Asmarni, serta kedua adikku (Harsy Tamimi dan Hifzhuzzilal) dan tidak lupapula kepada keluarga besar yang telah memberikan dorongan moral dan doanya.

Terima kasih penulis ucapkan juga kepada Dr. drh. Joko Pamungkas,M.Sc. selaku pembimbing I dan Rachmitasari Noviana, SKH. selaku pembimbingII skripsi yang telah membimbing dan memberikan motivasi untuk menyelesaikanskripsi ini; drh. Muhammad Kusdiantoro, M.Si. selaku dosen pembimbingakademik yang senantiasa memberikan arahan selama menjalani masaperkuliahan di FKH IPB; drh. Abdul Gani Amri Siregar, MS selaku dosen penilaiseminar; drh. Savitri Novelina, M.Si dan Dr. Drh. Muhammad Agil, M.Sc.Agr.selaku dosen penguji ujian akhir sarjana; seluruh dosen Fakultas KedokteranHewan IPB yang telah memberikan ilmu-ilmu yang bermanfaat kepada penulis;seluruh staf Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi PSSP IPB yang telahmemfasilitasi penulis untuk melakukan penelitian; Fenny, Rahma dan Yusniaatas kerja sama dalam penelitian dan persahabatan yang indah; Laras Andini,Yulia Riza, Fifit, dan Upik yang selalu menghadirkan keceriaan dan kak ratnaserta kak ulfa yang selalu memberi masukan kepada penulis; warga pondok senayang selalu memberi semangat kepada penulis; seluruh anggota Aesculapius 43atas kebersamaan dan persaudaraan yang terjalin selama penulis belajar di FKHIPB dan teman-teman HIMPRO SATLI FKH IPB, DKM An-nahl, IMAKAHI danVEC atas pengalaman dan pembelajaran yang sangat berharga.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2010

Ranti Asryyuni

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Lubuak Tarok kabupaten Sijunjung pada tanggal 12Agustus 1988 dari ayah H. Zakri Oktarinal dan ibu Asmarni. Penulis merupakanputri pertama dari tiga bersaudara.

Penulis bersekolah di SDN 13 Jambu Lipo kecamatan Lubuak Tarok danlulus pada tahun 2000, kemudian melanjutkan di MTsN Sijunjung dan lulus padatahun 2003. Pada tahun 2006, penulis berhasil menyelesaikan studi pada jenjangSMA dari SMA Negeri 1 Sijunjung. Pada tahun yang sama penulis diterimasebagai mahasiswi IPB melalui jalur Ujian Seleksi Masuk IPB (USMI) danmemilih mayor Fakultas Kedokteran Hewan.

Selama mengikuti perkuliahan penulis aktif sebagai ketua keputrianDewan Keluarga Mushala An Nahl (2009-2010), pengurus HIMPRO SATLI FKHIPB (2008-2009), Pengurus IMAKAHI cabang FKH IPB (2008-2010) dan pernahmenjadi panitia di berbagai acara internal kampus.

x

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xii

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xiii

PENDAHULUAN ....................................................................................... 1Latar Belakang .............................................................................. 1Tujuan Penelitian ........................................................................... 2Manfaat Penelitian ......................................................................... 2

TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 3Virus Dengue ................................................................................ 3

Morfologi Virus Dengue............................................................... 3Infeksi Virus Dengue terhadap Sel Inang .................................... 4Inokulasi Virus Dengue secara Intradermal ................................. 5Respon Kekebalan Humoral Tubuh Inang terhadap Virus Dengue.................................................................................................... 6Gejala Klinis Demam Berdarah Dengue ..................................... 8Diagnosa Virus Dengue .............................................................. 8

Beruk (Macaca nemestrina) .......................................................... 9Morfologi Beruk .......................................................................... 9Status Konservasi ...................................................................... 10

Primata sebagai Hewan Laboratorium .......................................... 11Plasma Darah ................................................................................ 12ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ............................. 12ELISA Tidak Langsung .................................................................. 15

MATERI DAN METODE ........................................................................... 16Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................ 16Materi Penelitian ........................................................................... 16

Sampel Plasma Beruk................................................................. 16Alat dan Bahan ........................................................................... 16

Metode Penelitian ......................................................................... 17Pendeteksian Antibodi IgM dan IgG melalui Uji ELISA TidakLangsung .................................................................................... 17Rumus Interpretasi Hasil ............................................................ 18

HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................................... 20Titer IgM pada Plasma Beruk yang Diinfeksi Virus Dengue............ 21Titer IgG pada Plasma Beruk yang Diinfeksi Virus Dengue............ 25Perbandingan Peningkatan Rataan Titer IgM dan IgG padaPlasma Beruk yang Diinfeksi Virus Dengue ................................... 27

SIMPULAN DAN SARAN.......................................................................... 30Simpulan ..................................................................................... 30Saran .......................................................................................... 30

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 31

xi

LAMPIRAN................................................................................................ 35

xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Virus dengue….. ………..…………………………………………………….. 4

2 Siklus hidup virus dengue di dalam sel inang………..…………………….. 5

3 Beruk (Macaca nemestrina)..………………………………………………… 9

4 Tahap ELISA tidak langsung..……….……………………………………….. 15

5 Profil peningkatan titer IgM selama empat belas hari pada plasmaberuk yang diinfeksi virus dengue…………..……………………………….. 21

6 Profil titer IgM pada hewan kontrol selama empat belas hari……………… 24

7 Profil peningkatan titer IgG selama empat belas hari pada plasmaberuk yang dinfeksi virus dengue……….…………………………………… 25

8 Profil titer IgM pada hewan kontrol selama empat belas hari………..……. 27

9 Profil perbandingan rataan kenaikan titer IgM dan IgG selamaempat belas hari pada plasma beruk yang diinfeksi virus dengue………… 28

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Titer antibodi IgM terhadap virus dengue…………………………………….. 35

2 Titer antibodi IgG terhadap virus dengue …………………………………… 35

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Virus dengue merupakan virus dari keluarga Flaviviridae dan merupakan

virus patogenik yang dapat menyebabkan kematian pada manusia. Infeksi virus

dengue terhadap manusia terjadi pada setiap tahunnya dengan jutaan orang

yang berada di wilayah tropis dan subtropis akan terpapar virus ini dan infeksi

virus dengue digolongkan sebagai penyakit re-emerging yang sangat penting

(Yamada et al. 2002). Virus ini dapat menyebar secara endemik dan epidemik,

umumnya bentuk penyakit yang ditimbulkan oleh virus dengue adalah demam

dengue secara akut, sedangkan bentuk fatal dan serius dari infeksi virus ini

dikenal sebagai DHF atau dengue haemorrhagic fever dan DSS atau dengue

shock syndrome (PAHO 2003).

Pada tahun 1975 dilaporkan bahwa sekitar dua puluh provinsi di

Indonesia terjangkit DHF (Sumarmo 1988). Kejadian penyakit demam berdarah

dengue di Indonesia secara tidak langsung dipengaruhi oleh tingginya kepadatan

jumlah penduduk, sehingga akan berdampak terhadap kebersihan lingkungan

yang akan menyebabkan meningkatnya jumlah nyamuk Aedes aegypti yang

berperan sebagai vektor penyebaran virus (Sumarmo 1988).

Salah satu diagnosa laboratorium yang digunakan untuk melihat infeksi

dari virus dengue secara serologi adalah dengan menggunakan uji ELISA. IgG

ELISA merupakan salah satu kualitas pengujian untuk mendeteksi antibodi IgG

ketika terjadi demam dengue. Umumnya IgG ELISA digunakan untuk membantu

diagnosa infeksi virus sebelum terjadinya demam berdarah dengue atau sebagai

diagnosa infeksi sekunder, sedangkan IgM ELISA digunakan untuk melihat

antibodi IgM ketika demam dengue terjadi secara akut atau sebagai diagnosa

infeksi primer (Buchy et al. 2007).

Indonesia merupakan negara yang memiliki jenis fauna yang beraneka

ragam salah satunya adalah satwa primata, diantara jenis satwa primata yang

melimpah di Indonesia adalah monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) dan

beruk (Macaca nemestrina). Gambaran antibodi IgM dan IgG terhadap virus

dengue pada hewan khususnya satwa primata belum banyak diketahui, tetapi

Infeksi virus dengue pada hewan dapat dibuktikan salah satunya melalui isolasi

virus dari monyet yang terinfeksi secara alami (WHO 1985). Malaysia pernah

mengoleksi 600 serum dari monyet liar yang jauh dari populasi manusia, dan

2

dihasilkan 8% dari serum monyet terpapar oleh virus dengue (Rudnick 1966).

Mengingat satwa primata sebagai hewan yang memiliki kedekatan filogeni

dengan manusia dan beresiko terpapar virus dengue (Kuiken et al 2003), maka

perlu penelitian lebih lanjut terhadap satwa primata, salah satunya terhadap

serum atau plasma dari beruk (Macaca nemestrina) ketika terinfeksi virus

dengue, sehingga bisa diambil kesimpulan apakah satwa primata dapat dijadikan

sebagai hewan model penelitian virus dengue.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengamati profil kenaikan titer antibodi IgM

dan IgG pada plasma dari beberapa ekor beruk (Macaca nemestrina) yang telah

diinfeksi virus dengue melalui rute intradermal menggunakan analisis

laboratorium dengan teknik uji ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay).

Manfaat Penelitian

Penelitian diharapkan memberikan manfaat diperolehnya pengetahuan

mengenai profil kenaikan titer antibodi IgM dan IgG pada beruk setelah diinfeksi

primer dengan virus dengue serotipe-3 (DEN-3) sehingga memudahkan

penelusuran respon kekebalan terhadap kasus demam berdarah pada manusia.

TINJAUAN PUSTAKA

Virus Dengue

Morfologi Virus Dengue

Virus dengue (DENV) adalah virus yang mempunyai genom RNA serabut

tunggal (single-stranded) dengan panjangnya adalah 11 kilobasa dan tergolong

sebagai positif sense, jenis virus ini termasuk ke dalam genus Flavivirus (bentuk

arbovirus kelompok B) dari keluarga Flaviviridae (Beasley dan Alan 2008). Virus

dengue mempunyai tiga protein struktural yaitu kapsid (protein C), premembran

(protein M) dan amplop atau glikoprotein E (protein E) yang berada di permukaan

virion yang berfungsi untuk menempel, fusi membran spesifik virus dan perakitan

yang akhirnya akan meningkatkan infeksi virus, kemudian mempunyai tujuh

protein nonstruktural yaitu NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5 (Silva et

al. 2009). Virus ini stabil pada pH 7-9 dan pada suhu rendah, sedangkan pada

suhu yang relatif tinggi infektivitas cepat menurun. Sifat dari virus dengue adalah

sangat peka terhadap beberapa zat kimia seperti sodium deoksicholat, eter,

kloroform dan garam empedu karena adanya amplop lipid pada virus

(Kusumawati 2005).

Menurut PAHO (2003), virus dengue terdiri atas dua tipe yaitu tipe

homolog dan heterolog serta mempunyai empat serotipe yaitu DEN-1, DEN-2,

DEN-3 dan DEN-4. Kekebalan tubuh untuk menghadapi virus ini tergantung pada

tipenya, virus dengue yang bertipe homolog akan ditanggapi oleh kekebalan

tubuh dengan lengkap dan lama, sedangkan tipe heterolog akan ditanggapi

dengan sebagian dan durasi yang singkat, persilangan protein tidak akan terjadi

antar serotipe sehingga tidak akan melindungi individu yang terinfeksi oleh salah

satu serotipe terhadap infeksi serotipe yang lain (White dan Frank 1994).

Nyamuk Aedes aegypti adalah vektor untuk semua jenis serotipe yang ada di

dunia, sedangkan nyamuk Aedes albopictus adalah sebagai vektor untuk

beberapa wilayah di Asia tenggara (PAHO 2003).

Virus DEN-3 memiliki 493 asam amino, sehingga variasi asam amino

akan meningkatkan ikatan dan neutralisasi oleh antibodi (Wahala et al. 2010).

Virus DEN-3 berasal dari Asia Tenggara yang mempunyai virulensi yang tinggi,

perbedaan genotipe pada DEN-3 akan menggambarkan perbedaan asam amino

pada gen struktural dan nonstruktural, DEN-3 dibagi atas empat genotipe, yaitu

genotipe I,II,III, dan IV (King et al. 2008).

4

Gambar 1 Virus Dengue (Anonimus 2009)

Infeksi Virus Dengue terhadap Sel Inang

Infeksi virus dengue yang ada di saliva nyamuk ditularkan ke manusia

melalui gigitan akan dimulai dengan menempelnya virus pada permukaan sel

inang, kemudian virus akan masuk ke dalam sel secara endositosis melalui

peran reseptor, kemudian virus bereplikasi di dalam tubuh manusia pada organ

targetnya seperti makrofag dan monosit, lalu menginfeksi sel-sel darah putih dan

jaringan limfatik (Fenner et al. 1987). Setelah virus dilepaskan ke dalam aliran

darah, maka endosom yang mempunyai pH asam akan menyebabkan fusi pada

virus dan membran sel, kemudian nukleokapsid akan dilepaskan ke dalam

sitoplasma, selanjutnya terjadi pemisahan antara protein C dan RNA. Sekali

genom dilepaskan ke sitoplasma maka positif sense dari RNA diterjemahkan ke

dalam bentuk poliprotein tunggal.

Replikasi genom terjadi di dalam membran intraselular. Perakitan dan

pembuatan partikel virus yang belum matang terjadi di permukaan retikulum

endoplasma ketika adanya struktur protein yang baru dan sintesis dari tunas

RNA ke lumen retikulum endoplasma, walaupun partikel virus terdiri atas protein

E dan M, membran lipid dan nukleokapsid, tetap saja partikel virus tidak mampu

untuk memfusi sel inang sisa non infeksius, hal ini dikarenakan protein M

membutuhkan proses yang lebih (Stiasny dan Frans 2006).

Pembentukan dari partikel subviral di retikulum endoplasma hanya

mengandung glikoprotein, membran dan sedikitnya protein C serta genom RNA,

membuat mereka tidak infeksius atau masih belum matang, tetapi pemotongan

purin protease inang menghasilkan partikel infeksius yang telah matang, virion

5

yang telah matang dan partikel subviral akan dilepaskan dari sel inang secara

eksostosis (Stiasny dan Frans 2006).

Gambar 2 Siklus hidup virus dengue di dalam sel inang (Stiasny dan

Heinz 2006)

Inokulasi Virus Dengue secara Intradermal

Inokulasi intradermal digunakan ketika dilakukan immunisasi pada hewan

besar, inokulasi intradermal bertujuan untuk melepaskan immunogen/virus

dengue secara sangat lambat diantara lapisan kulit dan diserap sangat lambat ke

dalam tubuh (Harlow dan Lane 1988).

Virus dengue yang diinokulasi secara intradermal akan mempertinggi

efisiensi inokulasi, karena secara langsung diketahui target virus dengue adalah

di antigen presenting cells (APC) dari makrofag dan monosit pada dermis dan

epidermis, sehingga inokulasi intradermal juga akan menginduksi respon kebal

(Roukens et al. 2008).

Sel pertahanan yang terdapat di epidermis dan dermis dinamakan sel

langerhans, sel ini akan menginisiasi target selama virus bereplikasi dan

inokulasi virus dengue secara intradermal pada satwa primata akan

mengakibatkan proliferasi lokal dan migrasi aktif dari sel langerhans. Hanya virus

dengue hidup yang berkemampuan menginduksi pematangan dan migrasi sel

langerhans ke limponodus lokal dan membangkitkan respon antibodi dan sel T

sitoksik limfosit (Brandlers et al. 2005).

6

Respon Kekebalan Humoral Tubuh Inang terhadap Virus Dengue

Setiap makhluk hidup (mamalia) di dunia ini mempunyai sistem pertahanan

terhadap gangguan dari dalam dan luar tubuhnya, terutama untuk hewan dan

manusia mempunyai system pertahanan yang sering disebut sebagai sistem

kekebalan atau sistem imun. Menurut Bellanti (1978), kata immune berasal dari

kata latin “immunis” yang berarti bebas dari beban atau pajak, secara klasik

dapat diartikan sebagai kekebalan dari inang yang resisten terhadap reinfeksi

mikroba (bakteri, virus, parasit, protozoa dan jamur).

Ketika antigen (khususnya virus) menyerang maka antibodi sebagai salah

satu kekebalan humoral akan mengadakan perlawanan, disamping itu akan ada

perlawanan secara nonimmunologis yaitu dengan interferensi ( menghambat

replikasi virus). Antibodi yang dilepaskan untuk melawan virus mengandung

protein sehingga disebut immunoglobulin. (Tizard 2004). Menurut Tizard (2004)

kata immunoglobulin digunakan untuk menggambarkan semua reseptor antigen

sel B, ada lima kelas (isotope) dari immunoglobulin yaitu :

1. Immunoglobulin G (IgG) merupakan antibodi yang paling banyak

berada dalam serum yaitu 80% dari total serum (Kindt et al. 2007).

Immunoglobin ini disekresikan oleh sel plasma yang ada di limpa,

limponodus, dan sumsum tulang belakang. Ukuran immunoglobulin ini

adalah 180 kDa sehingga bisa keluar dari pembuluh darah dengan

mudah, IgG merupakan satu-satunya immunoglobulin yang dapat

melewati plasenta sehingga menjadi pertahanan bagi bayi yang baru

lahir terhadap infeksi bakteri dan virus (Tizard 2004).

2. Immunoglobulin M (IgM) merupakan antibodi yang utama dihasilkan

dalam tanggap kebal primer, dan juga diproduksi dalam tanggap

kebal sekunder tetapi jumlahnya tertutup oleh IgG yang banyak sekali,

IgM hanya dihasilkan 5-10% dari total .serum dengan rata-rata

konsentrasi 1,5 mg/ml dan berbentuk pentamer, dan berukuran besar

yaitu 900 kDa sehingga tidak berdifusi secara baik dan akan

ditemukan dalam konsentrasi yang rendah dalam jaringan interseluler.

(Kindt et al. 2007).

3. Immunoglobulin A (IgA) merupakan immunoglobulin yang banyak

mengandung karbohidrat berstruktur konvensional. Immunoglobulin

7

jenis ini sebanyak 10-15% dari total serum. IgA merupakan

immunoglobulin utama yang terdapat dalam sekresi eksternal tubuh,

itulah sebabnya IgA sangat berperan penting untuk perlindungan

saluran-saluran intestinal, respirasi dan urogenital, serta kelenjar susu

dan mata terhadap invasi mikroba, diperkirakan cara kerja IgA adalah

mencegah melekatnya antigen pada permukaan tubuh. Walaupun IgA

merupakan immunoglobulin terbanyak di serum manusia biasanya

dalam serum hewan hanya berupa komponen minor (Tizard 2004).

4. Immunoglobulin E (IgE) mempunyai konsentrasi 0,3 µg/ml di dalam

serum, IgE akan menginisiasi reaksi hipersensitifitas I (alergi dan

anafilaksis). IgE memiliki bagian Fc yang unik sehingga

memungkinkan berikatan dengan jaringan tertentu, terutama sel mast

dan basofil serta antigen sehingga nantinya metranslokasi granulnya

ke membran plasma, immunoglobulin ini akan hancur dengan

pemanasan 56ºC selama 30 menit. (Tizard 2004).

5. Immunoglobulin D (IgD) pertama ditemukan karena adanya pasien

multiple myeloma yang protein myelomanya gagal untuk bereaksi

dengan dengan antiisotipe antisera melawan IgA, IgM dan IgG.

Konsentrasi di dalam serum 30 µg/ml yaitu sebanyak 0,2% dari total

serum. Immunoglobulin ini ditemukan di permukaan limfosit terutama

pada waktu baru lahir (Bellanti 1978).

Selain lima tipe immunoglobulin diatas pada unggas ada bentuk

immunoglobulin lain yaitu Immunoglobulin Y (IgY) terdapat pada telur

(Imunoglobulin Yolk) ayam yang mampu melawan berbagai serangan infeksi.

Imunoglobulin Y atau lazim disebut Ig-Y adalah antibodi humoral utama pada

ayam. Diantara tiga kelas imunoglobulin unggas (IgA, IgM, dan IgY) yang analog

dengan imunoglobulin mamalia, IgY adalah imunoglobulin yang tersedia dalam

jumlah yang paling banyak ditemukan pada serum dan didepositkan ke dalam

kuning telur (Haak-Frendscho 1994). IgY mengemban fungsi yang setara dengan

IgG mamalia. IgY berevolusi dan diduga menjadi cikal bakal IgG dan IgE

mamalia. Molekul IgY terdiri dari dua rantai berat dan dua rantai ringan.

Infeksi virus dengue akan mengakibatkan terbentuknya antibodi sebagai

sistem kekebalan humoral. Antibodi yang pertama dibentuk ialah neutrilizing

8

antibodi (NT) atau IgM dan IgG yaitu kira-kira pada hari ke-5. Titer antibodi ini

naik sangat cepat, kemudian menurun secara lambat dalam waktu yang lama,

biasanya seumur hidup serta antibodi ini bersifat spesifik. Setelah neutrilizing

antibodi maka akan timbul hemaglutination inhibiting antibodi (HI), antibodi ini

akan naik secara sejajar dengan NT dan kemudian akan turun secara perlahan-

lahan, lebih cepat daripada antibodi NT, untuk waktu yang lama tetapi dalam

waktu yang relatif singkat jika dibandingkan dengan antibodi NT. Antibodi yang

terakhir timbul adalah complement fixing antibodi (CF) yaitu pada hari ke-20 titer

naik mencapai waktu 1-2 bulan dan kemudian turun secara cepat dan

menghilang selam 1-2 tahun (Sumarmo 1988).

Gejala Klinis Demam Berdarah Dengue

Penyakit demam berdarah dengue terbagi dalam empat derajat tingkatan

yaitu derajat I, demam disertai gejala tidak khas dan satu-satunya manifestasi

perdarahan ialah uji tourniquet positif. Derajat II, derajat I disertai perdarahan

spontan kulit atau perdarahan yang lain. Derajat III, ditemukannya kegagalan

sirkulasi, yaitu nadi cepat dan lambat, tekanan nadi menurun (≤ 20 mmHg) atau

hipotensi disertai kulit yang dingin, lembab, dan penderita menjadi gelisah.

Derajat IV, renjatan berat dengan nadi yang tidak dapat diraba dan tekanan

darah yang tidak dapat diukur (WHO 1997).

Diagnosa Virus Dengue

Diagnosa laboratorium yang bisa dilakukan untuk mendeteksi virus

dengue diantaranya diagnosa secara serologi, identifikasi virus, isolasi virus, RT-

PCR (Gubler 1998). Diagnosa secara serologis yang dapat dilakukan adalah

haemaglutination inhibition (HI), complement fixation (CF), indirect

immunoflurescence (fluorescence antibody technique/ FAT), ELISA untuk

antibodi IgM dan IgG, RIA (radioimmunoassay), uji imunodifusi atau agar gel

presipitasi (AGPs) dan serum neutalization (PAHO 2003 dan Malole 1988).

Beruk (Macaca nemestrina)

Menurut Dolhinow dan Fuentez (1999), klasifikasi beruk (Macaca

nemestrina) adalah sebagai berikut :

Kingdom : Animalia

Phylum : Chordata

9

Subphylum : Vertebrata

Class : Mammalia

Order : Primata

Suborder : Anthropoieda

Infraorder : Cattarhini

Superfamily : Cercopithecoidea

Family : Cercopithecidae

Subfamily : Cercopithecine

Genus : Macaca

Species : Macaca nemestrina

Morfologi Beruk (Macaca nemestrina)

Beruk merupakan jenis monyet yang mempunyai ekor pendek, seperti

ekor babi sehingga sering disebut dengan “Pigtail Macaque” dan kira-kira

mempunyai panjang ekor sepertiga dari panjang tubuhnya atau sekitar 180 mm.

Warna rambut mulai dari cokelat sampai cokelat kekuningan, dengan bagian

mahkota bewarna lebih gelap. Memiliki panjang tubuh 450-600 mm. Berat tubuh

jantan antara 7-9 Kg, sedangkan betina antara 4-6 Kg ( Supriatna dan Wahyono

2000).

Gambar 3 Beruk (Macaca nemestrina)

Sumber : Properti Pusat Studi Satwa Primata PSSP

10

Status Konservasi

Untuk memastikan terjaganya kelestarian primata dan juga jenis satwa

lainnya di Indonesia, secara umum telah diatur dalam Undang-Undang nomor 5

tahun 1990 tentang Konservasi Sumber Daya Alam Dan Ekosistemnya. Menurut

UU No. 5 tahun 1990 satwa dikelompokan menjadi 2 yaitu satwa yang dilindungi

dan satwa yang tidak dilindungi. Satwa yang dilindungi dilarang untuk

diperdagangkan. Berdasarkan Peraturan Pemerintah Nomor 7 tahun 1999 dari

sekitar 40 jenis primata Indonesia hanya 2 jenis yang belum dilindungi yaitu

monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) dan beruk (Macaca nemestrina)

(Purnama 2007).

Penangkapan Beruk sering terjadi terutama di Sumatera, biasanya untuk

diperdagangkan dan dijadikan sebagai alat untuk memetik buah kelapa, tidak

hanya itu habitat Beruk juga semakin berkurang sampai 49% dari habitat asalnya

(Supriana dan Wahyono 2000). Beruk diklasifikasikan sebagai primata yang

rentan (vulnerable) dalam daftar IUCN (International Union for Conservation of

Nature) tahun 2008 (IUCN 2010), dan dimasukkan kedalam Appendix II CITES

(Convention on International Trade in Endangered Spesies of wild fauna and

flora). Beruk juga sering dijadikan sebagai hewan penelitian biomedik seperti

halnya monyet ekor panjang (Supriana dan Wahyono 2000).

Menurut Soehartono dan A. Mardiastuti (2003), beberapa orang dan

lembaga telah menentang penggunaan satwa primata utuk penellitian medis,

karena adanya anggapan bahwa peneliti melaksanakan eksperimen dengan

kejam terhadap satwa primata tersebut.

Primata sebagai Hewan Laboratorium

Hewan laboratorium adalah setiap hewan yang digunakan untuk

percobaan di dalam laboratorium dan dipelihara secara intensif. Meskipun

beberapa hewan percobaan dapat digunakan untuk memperoleh keuntungan

ekonomi. Menurut Smith dan Mangkoewidjojo (1988) pada dasarnya hewan

percobaan digunakan antara lain untuk :

1. Untuk memperoleh hasil yang benar

2. Untuk memperoleh prosedur sebaik-baiknya yang dapat dipakai untuk

penelitian lebih lanjut

3. Untuk memperoleh data maksimum dalam penelitian simulasi

11

4. Uji pengamanan dan diagnostik

5. Untuk studi komparatif termasuk dalam dunia pendidikan

6. Untuk memperoleh hasil yang dapat dipergunakan pada hewan dan

manusia

Primata adalah salah satu hewan laboratorium yang sangat erat

hubungannya dengan manusia misalnya fisiologi dan patologinya hampir sama

sehingga hewan ini sering digunakan untuk penelitian yang berhubungan dengan

manusia. Satwa primata peka terhadap penyakit yang berasal dari manusia,

sebaliknya satwa primata juga dapat menularkan penyakit kepada manusia

terlebih lagi penyakit yang berhubungan dengan virus .

Fiennes (1976) acuan dalam Smith dan Soesanto (1988) mengusulkan

ada tiga ketentuan sederhana dalam menggunakan satwa primata dalam

penelitian yaitu :

1. satwa ini tidak boleh digunakan jika masih ada hewan jenis

lain yang dapat digunakan, tapi jika tidak ada maka harus

dipilih primata yang tepat.

2. Satwa primata harus digunakan untuk penelitian tahap akhir

yaitu setelah melalui penelitian melalui hewan jenis lain.

3. Satwa primata harus diberi akomodasi yang senyaman

mungkin selama penelitian

Plasma Darah

Plasma merupakan bagian dari cairan darah berbentuk suspensi dengan

45%-78% dari total volume darah tergantung spesies hewan dan ukuran sel

darah merah (Colville dan Bassert 2002). Menurut Schaller et al. (2008),

komponen plasma darah adalah air dengan banyak 90% dari total plasma, ion

dan garam mineral, komponen dengan berat molekul yang tinggi seperti

olisakarida, komponen dengan berat molekul yang ringan seperti glukosa, gas

terlarut seperti oksigen dan karbondioksida, buangan metabolit.

Samuelson (2007) menyatakan bahwa ada berbagai macam protein

primer yang terdapat dalam plasma, termasuk albumin dan globulin yang

memiliki peranan penting dalam respon imun dan transportasi hormon, logam

dan non logam. Selain itu juga terdapat fibrinogen sehingga plasma bisa

12

membeku, biasanya plasma berwarna kuning. Banyak sekali uji kimia dari

diagnosis klinis yang memanfaatkan plasma ataupun serum, setelah sampel

disentrifus maka plasma ataupun serum telah siap untuk dianalisa atau

dibekukan agar bisa bertahan untuk pengujian selanjutnya (Colville dan Bassert

2002).

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Prosedur yang berhubungan dengan pendeteksian reaksi antigen dan

antibodi pada serum maupun plasma yang melibatkan enzim sebagai konjugasi

maka dikategorikan ke dalam EIA test (Enzyme immunoassay). EIA dibagi

berdasarkan ikatan antara antigen dan antibodi, reaktan, metode pendeteksian,

dan metode pemisahan ikatan dan reaktan bebas. Ada dua tipe EIA yaitu : tipe

heterogenous (reaksi antigen dan antibodi tidak mempengaruhi aktivitas enzim)

dan tipe homogenous (reaksi antara antigen dan antibodi memodulasi aktivitas

enzim), adapun uji-uji yang termasuk ke dalam EIA (melibatkan konjugasi

dengan enzim) yaitu ELISA dan Dot Blot Immuno Assay (Nakamura et al. 1992).

ELISA dapat diklasifikasikan kedalam bentuk heterogenus dan homogenus,

tetapi dalam diagnosa secara immunologi yang banyak digunakan adalah ELISA

heterogenus (Rose et al. 1992).

Prinsip dasar ELISA heterogenus adalah penggunaan konjugat antibodi

dengan enzim yang akan bereaksi dengan substrat dan menghasilkan reaksi

warna. Perubahan warna yang terjadi bisa dilihat secara fisik maupun dengan

menggunakan spektrometer untuk menjelaskan proporsi diantara jumlah warna

dan jumlah analisis yang dihasilkan (Rose et al. 1992). Sedangkan Menurut

Wagner dan Martinez (2004), ELISA menggunakan konjugasi yang berisi enzim

(antibodi sekunder) yang bisa memproses warna substrat yang mengandung

target enzin dan kromagen ke warna ikatan produk yang ada di FC region. Ketika

molekul antibodi primer diikat oleh antigen maka enzim akan terikat juga ke FC

region, dan jika ikatan antigen dan antibodi kompleks diinkubasi dengan substrat

yang tepat untuk pengikatan enzim maka pembentukan warna bisa digunakan

sebagai pembuktian terdapatnya antibodi

Menurut Crowther (2001) dan Tritten (2009), ada beberapa manfaat

pendiagnosaan ELISA yaitu :

1. Mempunyai kualitas diagnosa yang serbaguna

2. Perlakuan yang sederhana

13

3. Memiliki sensitivitas yang tinggi

4. Bisa dipresentasikan berupa angka

5. dapat diproduksi dengan banyak

6. memerlukan peralatan yang sedikit

7. bisa diaplikasikan pada laboratorium di lapangan.

ELISA merupakan salah satu jenis uji pengikatan primer, uji jenis ini

merupakan uji yang mengukur tanggap kebal humoral yang paling peka. Ciri

utama teknik ini adalah dipakai indikator enzim untuk reaksi imunologi.

Keragaman terbesar dalam merancang ELISA dapat dilihat dalam pemilihan

konjugat dan subtratnya, berbagai enzim telah tersedia dan enzim ini akan

mengikat secara langsung ke antibodi atau antigen secara tak langsung melalui

biotin atau jembatan protein A. Banyak keuntungan yang akan didapatkan kalau

digunakan kombinasi enzim dan subtrat tertentu dan berbagai pilihan harus

diteliti supaya sampai pada cara optimal (Burges ed 1988).

Menurut Crowther (2001) ada eberapa aspek penting yang harus

diperhatikan dalam proses pengujian ELISA yaitu:

a. Fase padat (solid phase) adalah sumur mikrotiter yang terdapat dalam

satu plate yang bisa terbuat dari bahan plastik, nitroselulosa, agarosa,

selulosa dan lain sebagainya, umumnya berjumlah 96 sumur.

b. Antigen adalah protein atau karbohidrat yang disuntikkan ke hewan

dan akan mempengaruhi terbentuknya antibodi

c. Antibodi adalah sesuatu yang dihasilkan oleh tubuh mamalia sebagai

respon dari antigen

d. Konjugat enzim adalah enzim yang berikatan secara tetap ke protein

seperti antibodi

e. Substrat adalah senyawa kimia yang mengandung kromogen dan

target enzim sehingga berikatan dengan enzim secara spesifik yang

digunakan untuk mengasilkan tanda yang dibaca sebagai reaksi

warna, jika terlalu lama membiarkan reaksi antara substrat dan enzim

akan mempertinggi intensitas warna (Rose et al. 1992).

f. Larutan basa atau asam kuat yang digunakan untuk menghentikan

aksi enzim dalam substrat

14

Ada tiga dasar metode pengujian ELISA yaitu ELISA langsung, ELISA

tidak langsung dan ELISA penangkap antigen (sandwich). Gabungan dari tiga

metode dasar itu akan membentuk metode baru yang dikenal sebagai ELISA

kompetisi (Crowther 2001).

ELISA tidak langsung

ELISA ini merupakan konfigurasi yang paling sederhana yang dapat

digunakan untuk mengukur titer antibodi. Prinsip dari metode ELISA tidak

langsung adalah menghubungkan antara antigen, antibodi primer dan konjugat

(antibodi sekunder), disini sampel uji mengandung antibodi yang bisa berikatan

dengan masing-masing antigen target yang telah menempel pada fase padat.

Penambahan konjugat sebagai antibodi antispesies yang dilabel enzim akan

menghaslkan perubahan warna jika bereaksi dengan substrat yang mengandung

target enzim dan kromogen (Crowther 2001). Keuntungan dari metode ini adalah

beberapa jumlah antiserum bisa diujikan selama mengikat ke antigen yang

menggunakan konjugat antispesies single. Sedangkan kelemahan dari metode

ini adalah bervariasinya ikatan nonspesifik dalam serum individual sehingga

memperlebar dispersi pada hasil pengujian (Crowther 2001). Pada metode ini

ditambahkan blocking agent untuk mencegah terjadinya ikatan nonspesifik

antara antibodi dengan antigen bukan target yang mempunyai afinitas yang

rendah (Rose et al. 1992).

15

Gambar 4 Tahap ELISA tidak langsung (Anonimous 2010)

MATERI DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2009 di Laboratorium

Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi Satwa Primata, Lembaga Penelitian dan

Pengabdian kepada Masyarakat (PSSP- LPPM ) IPB Jalan Lodaya II No. 5,

Bogor.

Materi Penelitian

Sampel Plasma Beruk (Macaca nemestrina)

Sampel yang digunakan merupakan plasma yang berasal dari enam ekor

beruk (Macaca nemestrina) yang telah diinfeksi virus dengue serotipe-3 (DEN-3)

dengan dosis 107-108 Pfu/ml melalui rute intradermal dan empat ekor beruk

sebagai hewan kontrol yang diinokulasi larutan PBS (Phosphate buffer saline )

serta telah mendapat persetujuan dari Komisi Pengawas Kesejahteraan dan

Penggunaan Hewan Penelitian (Animal Care and Use Committe, ACUC ) di

PSSP-LPPM IPB dengan nomor P.09-08-IR.

Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan adalah ELISA reader/microplate reader BIO-

RAD 3550, lemari pendingin, inkubator, mesin pencuci otomatis (automatic

washing machine/immunowash) BIO-RAD MODEL 1575, adhessive strips,

vortex, pipet volumetrik, barrier tips, mikropipet single chanel dan mikropipet

multichanel.

Bahan yang digunakan adalah plasma beruk (Macaca nemestrina) dari

berbagai titik waktu pengambilan sebelum dan sesudah infeksi primer, aquades,

larutan PBS (phosphate buffer saline) tween 20% (larutan pencuci), kemudian kit

ELISA komersial dari HUMAN® (human Gesellschaft für Biochemia und

Diagnostica mbH, Germany) yang berisi antigen (virus dengue) yang telah

dilekatkan pada plate pengujian, rabbit antihuman IgM/ IgG yang dikonjugasi

dengan enzim peroksidase (konjugat), 3,3´, 5,5´-tetrametilbenzidin (substrat),

larutan penyangga, antibodi virus dengue kontrol negatif, antibodi virus dengue

kontrol positif dan larutan pemberhenti reaksi (asam sulfat 0,2 mol/ l)

17

Metode Penelitian

Pendeteksian Antibodi (IgM dan IgG) melalui Uji ELISA Tidak Langsung

Penelitian ini menggunakan metode ELISA Indirect (tidak langsung) untuk

mendeteksi terdapatnya antibodi (IgM dan IgG) di dalam sampel plasma dari

beruk (Macaca nemestrina) yang diinfeksikan virus dengue (DEN-3). Sebagai

langkah awal adalah pemisahan plasma beruk (Macaca nemestrina) dari sampel

darah utuh (whole blood), selanjutnya sampel plasma yang telah tersedia

dilanjutkan dengan pengujian ELISA mengikuti metode yang dijelaskan pada

manual yang disediakan oleh pembuat kit (kit manufactured).

Langkah ke-1 adalah pembuatan rancangan template pada kertas yang

tersedia sesuai dengan yang akan diatur dalam plate kit (paket perlengkapan uji

ELISA dengan sumur pada plate yang telah dilekatkan antigen dan blocking

agent) dengan susunan sumur A1 sebagai blanko control, B1 dan C1 sebagai

antibodi virus dengue kontrol negatif serta D1 dan E1 sebagai antibodi virus

dengue kontrol positif sehingga hasil pembacaan akan optimal. Langkah ke-2,

masing-masing sampel plasma dari berbagai titik waktu pengambilan dilarutkan

dengan pelarut yang telah tersedia dalam kit dengan perbandingan 1: 100,

selanjutnya sumur-sumur yang terdapat dalam plate akan diisikan sampel

plasma sebanyak 100 µl yang sudah diencerkan kecuali terhadap sumuran yang

ditetapkan sebagai blanko control. Pengisian plate dengan sampel plasma

bertujuan agar terbentuk ikatan kompleks antara antibodi dan antigen yang telah

dilekatkan ke dinding sumuran yang terbuat dari bahan polistiren sebagai solid

phase. Kemudian plate ditutup dengan adhesive strips dan siap diinkubasi pada

suhu 37ºC selama 60 menit supaya ikatan antara antibodi dan antigen terjadi

dengan sempurna.

Langkah ke-3 adalah pencucian plate sebanyak tiga kali menggunakan

automathic washing machine/immunowash yang berisi larutan PBS (phosphate

buffer saline) tween 20% yang diencerkan 10 kali dengan tujuan untuk

membersihkan antibodi yang tidak berikatan dengan antigen (nonspesifik

antibody) agar tidak mengganggu pembacaan hasil oleh ELISA reader. Langkah

ke-4, pemberian konjugat (rabbit anti-human IgG/ IgM ) yang dikonjugasikan

dengan peroxidase) pada setiap sumuran sebanyak 100 µl, dilanjutkan dengan

diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit. Langkah ke-5 yaitu melakukan

pencucian dengan cara yang sama dengan langkah ke-3.

18

Langkah ke-6 adalah pemberian larutan substrat yang berisi TMB (tetra

metil benzidin) sebanyak 100 µl. Substrat yang digunakan harus dipilih yang

sesuai dengan enzim yang digunakan. Substrat tersebut berisi target enzim dan

kromogen serta larutan penyangga. Apabila enzim mengurai targetnya akan

dihasilkan O2 yang selanjutnya mengoksidasi kromogen sehingga terjadi

pembentukan warna. Intensitas warna yang terbentuk berkorelasi positif dengan

konsentrasi IgM/ IgG pada sampel plasma yang diperiksa. Proses pembentukan

warna terjadi selama inkubasi 15 menit pada 25ºC (suhu ruang) dengan

meletakannya pada tempat yang terlindung dari sinar matahari. Pembentukan

warna dihentikan dengan menambahkan larutan pemberhenti reaksi (stop

solution) sebanyak 100 µl pada sumuran, dilanjutkan pembacaan hasil dengan

alat ELISA reader pada pada panjang gelombang 450 nm sehingga diperoleh

nilai optical density (OD) yang selanjutnya akan dikonversi menjadi konsentrasi

IgM/ IgG menggunakan kurva standar yang dibangun dengan immunoglobulin

standar dan telah diketahui konsentrasi antibodinya.

Rumus Interpretasi Hasil

a. Penghitungan nilai kontrol dan cut-off

MNC = A450 (B1) + A450(C1)

2

Cut-off value (COV) = MNC +0,35

Cut-off value adalah nilai yang dihasilkan untuk mengklasifikasikan antara

kasus positif dan negatif serta didasarkan atas standar deviasi yang

berada diatas nilai MNC.

Keterangan :

MNC → Mean absorbance value/ Mean control negative

B1 dan C1→ Kontrol Negatif

Hasil uji akan valid jika :

1. Sumur yang Blank <0,100

2. MNC ≤ 0,300

3. Kontrol Positif : nilai absorbnce sama atau lebih besar dari nilai COV

*Sampel POSITIF apabila A450(sampel) ≥ COV +10%

*Sampel GREY ZONE apabila COV - 10% < A450(sampel) < COV+ 10%

19

*Sampel NEGATIF apabila A450(sampel) < COV - 10%

b. Titer antibody IgG atau IgM

Nilai absorbansi sampel x 10 = U/ml

Cut-off value (COV)

Cut-off = 10 U/ml Grey Zone = 9-11 U/ml

Negatif = < 9 U/ml Positif = > 11 U/ml

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini menggunakan enam ekor beruk (Macaca nemestrina) yang

bebas dari infeksi virus dengue dan kemudian diinfeksi virus DEN-3 melalui rute

intradermal, sehingga belum ada sel memori yang akan menstimulasi antibodi

khusus terhadap virus dengue. Sel memori merupakan sel yang berasal dari sel

limfosit B yang peka antigen dan mempunyai reseptor serta hidup berbulan-bulan

sampai bertahun-tahun setelah terpapar antigen pertama kali (Tizard 2004).

Menurut Parija (2009), rute inokulasi antigen (virus) sangat mempengaruhi

terjadinya replikasi pada virus dan juga berpengaruh terhadap munculnya

antibodi sebagai respon kekebalan humoral.

Inokulasi virus dengue melalui rute intradermal akan mencapai dermis

kulit yang mempunyai banyak pembuluh darah kapiler yang akan mengalirkan

virus untuk mencapai sel targetnya. Secara umum inokulasi intradermal

digunakan ketika dilakukan immunisasi pada hewan besar, inokulasi intradermal

bertujuan untuk melepaskan immunogen/virus dengue secara sangat lambat

diantara lapisan kulit dan diserap sangat lambat ke dalam tubuh (Harlow dan

Lane 1988). Respon kebal antibodi terhadap virus dengue yang diinokulasikan

secara intradermal pada beruk (Macaca nemestrina) dapat dilihat dengan

menggunakan uji ELISA tidak langsung (indirect) yaitu dengan melihat

interpretasi hasil dari uji ELISA. Menurut Tritten (2009), ELISA merupakan

metode yang sederhana untuk dilakukan, menggunakan peralatan yang sedikit,

sangat banyak diproduksi dan mampu untuk diaplikasikan pada laboratorium di

lapangan. Berdasarkan interpretasi hasil dari uji ELISA, IgM menghasilkan nilai

COV= 0,4245, MNC =0,0745, sedangkan IgG menghasilkan nilai MNC = 0,1385

dan COV= 0,4885

Nilai COV dan MNC masing-masing antibodi dihasilkan dan dipengaruhi

oleh nilai ODnya, terbentuknya nilai OD yang beragam sangat bergantung pada

kontrol, hubungan antara kejadian sebenarnya dan nilai OD tidak akan selalu

bersifat linear walaupun tidak terlalu menunjukkan perbedaan dan secara ideal

nilai OD ELISA adalah berbentuk linear (Tran et al. 2006)

Titer IgM pada Plasma Beruk yang Diifeksi Virus Dengue

Kekebalan humoral oleh antibodi memainkan peranan penting melawan

infeksi ekstraseluler dan melawan viremia oleh virus, kekebalan humoral juga

21

menghambat multiplikasi sitolitik oleh virus. Viremia akan dipengaruhi oleh onset

masuknya virus, titer antibodi dan strain virus (Gubler 1998). IgM merupakan

antibodi yang akan melakukan respon pertama kali (primer) terhadap antigen

yang menyerang tubuh mamalia dan juga berfungsi sebagai tanggap kebal

humoral (Bellanti 1978).

Gambar 5 Profil peningkatan titer IgM selama empat belas hari pada plasmaberuk yang diinfeksi virus dengue

Berdasarkan pengamatan yang dilakukan terhadap plasma beruk yang

diinfeksi virus dengue secara intradermal, maka dapat dilihat pada Gambar 5

bahwa respon IgM terhadap virus dengue pada hari ke-0 sampai hari ke-4

berbeda-beda pada setiap beruk. Hal ini dikarenakan setiap beruk mempunyai

kekuatan pertahanan yang berbeda-beda yang dipengaruhi oleh faktor genetik,

umur, status nutrisi, rute antigen, dosis antigen dan jenis antigen (Parija 2009).

Faktor genetik akan mempengaruhi respon inang terhadap antigen (virus) karena

adanya perbedaan kontrol genetik dan pengontrolan gen respon kebal yang

terletak pada kromosom keenam pada inang. Perbedaan umur pada inang akan

mempengaruhi respon kekebalan contohnya pada manusia umur 5-7 tahun

respon IgG akan lebih sempurna. Kemudian status nutrisi, ketika malnutrisi

terjadi maka akan mempengaruhi kekebalan humoral dan kekebalan seluler

seperti kekurangan asam amino dan vitamin yang dapat menurunkan produksi

antibodi. Selanjutnya rute antigen, induksi respon kebal pada inang tergantung

pada rute administrasi antigen (virus), terbukti bahwa administrasi parenteral

lebih baik daripada administrasi secara oral dan nasal. Berdasarkan dosis

22

antigen (virus), jika terlalu sedikit atau terlalu tinggi dosis virus yang masuk maka

akan menurunkan stimulasi sistem kebal (Parija 2009).

Terlihat secara umum bahwa menjelang hari ke-5, titer IgM pada

sebagian besar beruk belum terlalu menunjukkan kenaikan dan boleh dikatakan

masih stabil karena diduga IgM pada masa ini masih mengalami lag phase yaitu

masa ketika IgM mengalami keterlambatan menanggapi virus yang masuk atau

fase ini bisa disebut sebagai masa adaptasi bagi antibodi (Tizard 2004), selain itu

menurut Gubler (1998) aktivitas virus dapat dihambat oleh beberapa faktor yaitu

temperatur yang panas, pH, dan bahan kimia sehingga faktor-faktor tersebut bisa

menjadi penyebab belum terlalu terjadinya kenaikan titer IgM. Hal ini terlihat

dengan bentuk grafk yang masih stabil dan nilai titer yang rendah pada Gambar

5, tetapi mulai pada hari ke-4 atau ke-5 sampai hari ke-9 jumlah IgM pada

sebagian besar beruk mengalami kenaikan titer (kecuali pada beruk (1.8875)

dengan titik puncaknya pada hari ke-9.

Beruk yang paling tinggi titer IgMnya pada hari ke-9 adalah beruk (8882)

yaitu 33,14 U/ml. Peningkatan IgM tergantung pada replikasi virus dan waktu

pematangan antibodi (Bernardo et al. 2008). Kenaikan jumlah IgM ini

membuktikan bahwa IgM bertambah banyak untuk mengaktivasi komplemen,

melakukan opsonisasi, netralisasi dan aglutinasi virus. Hal ini merupakan bukti

bahwa tercapainya tanggap kebal yang baik dari IgM. Secara teori ketika infeksi

primer dari virus terjadi maka respon IgM akan terdeteksi sebelum hari ke-7

setelah infeksi (Parija 2009).

Berdasarkan penelitian Raviprakash et al. (2000) yang dilakukan infeksi

virus dengue melalui rute intradermal pada monyet rhesus (Macaca mullata), IgM

akan mulai naik dan terdeteksi pada hari ke-7 dan akan mencapai puncaknya

pada hari ke-14 setelah infeksi primer, sehingga jika dibandingkan dengan

muncul dan meningkatnya IgM pada penelitian ini, maka akan terlihat bahwa IgM

pada penelitian ini lebih awal terdeteksi dan lebih cepat mengalami kenaikan

daripada yang terjadi terhadap monyet rhesus. Terjadinya hal ini karena

dipengaruhi oleh : faktor genetik inang, dosis antigen, faktor nutrisi dan lain-lain

(Parija 2009. Kemudian juga dipengaruhi oleh kemampuan antigen

(antigenitas/virulensi) termasuk keasingan dan limitasi fisikokimiawi (Tizard 2004)

serta sensitivitas pengujian terhadap antibodi. Beruk (8882) merupakan beruk

yang mengalami peningkatan lebih awal dan titer IgM yang paling tinggi pada

23

saat puncak peningkatan, hal ini membuktikan bahwa beruk (8882) memiliki

respon kebal humoral yang paling baik diantara beruk yang lainnya.

Menurut Sa-Ngasang et al. (2005) respon kebal humoral pada manusia

ketika infeksi primer virus dengue terjadi, maka IgM akan terdeteksi pertama kali

pada hari ke-5 dan menunjukkan kenaikan pada hari ke-6. Semakin tinggi

jumlah IgM maka dapat dikatakan semakin banyak dan kuatnya ikatan yang

terjadi antara antibodi IgM dengan virus dengue sebagai antigen. Kekuatan

ikatan antibodi dan antigen ini disebut dengan aviditas, adapun ikatan–ikatan

yang terbentuk yaitu ikatan hidrogen, hidrofobik, van der waals dan ikatan ionik

(Tizard 2004).

Penurunan jumlah IgM terjadi pada hari ke-10 seragam dialami oleh

semua beruk, pada Gambar 5 dapat dilihat bahwa kecenderungan titer IgM

mengalami penurunan terjadi secara perlahan sampai hari ke-13. Menurut Parija

(2009), IgM secara umum akan mengalami penurunan setelah hari ke-13 ketika

IgG akan mulai naik dan terdeteksi sehingga keadaan IgM terhadap virus dengue

akan berkurang dan akan mulai didominasi oleh IgG sebagai tanggap kebal

sekunder.

Menurut Raviprakash et al. (2000), penurunan titer IgM pada monyet

rhesus ketika diinfeksikan virus dengue serotipe-1 (DEN-1) dimulai setelah

melewati hari ke-14 setelah infeksi primer, tetapi penurunan ini terjadi secara

perlahan. Perbedaan penurunan titer IgM pada beruk dan monyet rhesus tidak

lepas dari peran transmisi oleh virus yang menginfeksi, transmisi ini akan

dipengaruhi oleh replikasi pada virus serta adanya amplop pada virus (Parija

2009). Jika replikasi virus di dalam tubuh meningkat, maka titer IgM juga akan

meningkat, beberapa hari kemudian kemampuan virus akan berkurang karena

telah diopsonisasi, dinetralkan dan diaglutinasi oleh IgM dan IgM pun mulai

mengalami penurunan titer sebagai pengaruh umpan balik negatif dari titer IgM

yang tinggi. IgM akan bereaksi secara spesifik dengan epitop yang awalnya

diidentifikasi oleh reseptornya, spesifisitas pada IgM dipengaruhi oleh asam

amino dan konfigurasi tiga dimensinya (White dan Frank 1994), selain itu karena

virus DEN-3 memiliki 493 asam amino, sehingga variasi asam amino akan

meningkatkan ikatan dan neutralisasi oleh antibodi (Wahala et al. 2010).

Silva et al. (2009) menyatakan bahwa amplop (protein E) yang terdapat

pada permukaan partikel virion mempunyai fungsi untuk menempel pada inang,

fusi pada membran, dan untuk perakitan sehingga akan meningkatkan infeksi

24

virus, tetapi dengan kemampuan pendeteksian yang spesifik oleh IgM

(spesifisitas antibodi) serta adanya aviditas tinggi (kemampuan terikat kuat

dengan antigen/virus) sehingga mampu menetralkan infektivitas dari virus

dengue (White dan Frank 1994), oleh karena itu IgM disebut juga sebagai

neutralizing antibody. Bersamaman dengan berhasilnya IgM untuk menetralisasi

virus, maka titer IgM akan mulai menurun sehingga terjadi penurunan titer IgM

lebih awal pada beruk dibandingkan pada monyet rhesus karena perbedaan

kemampuan dari amplop pada masing-masing virus yang menginfeksi kedua

hewan tersebut.

IgM akan bertahan selama 30-90 hari setelah infeksi primer dan hanya

beberapa waktu ketika infeksi sekunder (Gubler dan Burns 2008), walaupun

pada penelitian ini hanya menggambarkan titer IgM selama empat belas hari,

tetapi jika ditelusuri lebih lanjut maka IgM masih terdeteksi, dari Gambar 5 kita

juga bisa melihat bahwa penurunan IgM terjadi secara perlahan, maka

penurunan titer IgM akan berlanjut melewati hari ke-13 sampai waktu yang tidak

lebih dari 90 hari walaupun titer IgM lebih sedikit dari biasanya.

Gambar 6 Profil titer IgM pada hewan kontrol selama empat belas hari

Berdasarkan Gambar 6 dapat kita amati bahwa titer IgM di dalam plasma

beruk kontrol (diinokulasi larutan PBS) selama empat belas hari pengamatan

menunjukkan tidak terjadi kenaikan titer, terbukti dengan adanya bentuk grafik

pada Gambar 6 yang cenderung terlihat stabil dan mendatar, hal ini sangat

berbeda sekali jika dibandingkan dengan beruk yang telah diinfeksikan virus

dengue secara intradermal, maka akan terlihat kenaikan dan penurunan titer IgM.

25

Titer IgG pada Plasma Beruk yang Diinfeksi Virus Dengue

IgG merupakan antibodi yang mempunyai konsentrasi tertinggi di dalam

serum darah yaitu 80% dibandingkan dengan antibodi yang lain (Kindt et al.

2007).

Gambar 7 Profil peningkatan titer IgG selama empat belas hari pada plasmaberuk yang diinfeksi virus dengue

Berdasarkan jumlah IgG yang ditunjukkan pada Gambar 7, titer IgG pada

hari ke-0 sampai hari ke-6 pada semua beruk belum terlalu menunjukkan

kenaikan. Hal ini disebabkan respon terhadap antigen masih didominasi oleh IgM

dan secara umum pun IgG akan terlihat pada hari ke 5-7 setelah onset infeksi

primer dari virus dengue (Gubler dan Burns 2008). Pada hari ke-7 titer IgG mulai

mengalami kenaikan sedangkan kemunculan IgG pada monyet rhesus menurut

Raviprakash et al. (2000) terjadi pada hari ke-14, sehingga IgG yang terdeteksi

lebih cepat pada beruk. Hal ini dipengaruhi oleh derajat ransangan virus dan lag

phase yang singkat dari IgG (Tizard 2004) serta perbedaan strain virus yang

diinokulasikan juga akan memengaruhi respon kebal humoral inang (Gubler

1998). Selain itu terlalu cepatnya IgG terdeteksi menunjukkan bahwa adanya

perbedaan faktor genetik inang antara monyet rhesus dan beruk sehingga

mempengaruhi kekebalan humoral masing-masing hewan model

kenaikan titer IgG tertinggi pada sebagian besar beruk terjadi pada hari

ke-11 dan hari ke-13 tetapi terjadi secara berbeda pada tiap beruk. Perbedaan

kenaikan IgG pada setiap beruk dipengaruhi oleh faktor genetik, umur, status

nutrisi (Parija 2009), kemampuan kekebalan inang, dan virulensi (White dan

26

Frank 1994). Kemampuan kekebalan inang akan mengalami penurunan jika

terjadi immunodepresi yang disebabkan oleh penyakit lain dan obat-obatan yang

dapat menurunkan kekebalan tubuh, sedangkan virulensi (kemampuan infeksi

virus) juga dapat mempengaruhi meningkatnya titer IgG, salah satu parameter

yang berkaitan dengan virulensi adalah strain virus, karena setiap strain virus

memiliki virulensi yang berbeda.

Kenaikan titer IgG tertinggi dialami oleh beruk (1.6791) pada hari ke-11

yaitu 19,30 U/ml. Menurut Raviprakash et al. (2000), kenaikan titer IgG dimulai

terjadi pada hari ke-29 pada monyet rhesus. Jika dibandingkan pada beruk maka

kenaikan IgG yang terlalu awal dipengaruhi oleh kemampuan kekebalalan inang,

tingginya virulensi dari virus berdasarkan strain virus, karena adanya umpan balik

negatif yang terlalu awal terhadap IgM sehingga IgG meningkat dengan cepat,

umpan balik ini juga akan menekan IgG lebih lanjut terhadap virus yang sama

(Tizard 2004). Penelitian ini hanya mendeteksi IgG selama empat belas hari

setelah infeksi primer, sehingga lanjutan peningkatan dan penurunan titer IgG

tidak bisa terlihat secara lengkap. Secara umum virus akan menyebabkan

kenaikan IgG oleh infeksi primer setelah melewati hari ke-14 (Parija 2009), tetapi

secara khusus kenaikan IgG yang disebabkan oleh virus dengue pada manusia

terjadi pada hari ke-14 setelah onset infeksi primer (Sa-Ngasang et al. 2005).

Pada hari ke-12 secara umum titer IgG mulai mengalami kestabilan yang

tidak bisa diamati setelah hari ke-13 dan terjadi berbeda pada setiap beruk. Hal

ini dipengaruhi oleh afinitas dan derajat infeksi virus, faktor genetik pada beruk

tersebut (Gubler 1998), kemampuan kekebalan inang (White dan Frank 1994),

dan serotipe dan titer virus (Vaughn DW et al. 2000). Pengamatan lanjutan tidak

bisa dilihat secara lengkap pada Gambar 2, karena penelitian ini hanya

mendeteksi IgG selama empat belas hari, sedangkan masa bertahan untuk IgG

pada infeksi primer virus dengue akan sampai ratusan hari dan jarang melewati

640-1280 hari (Gubler dan Burns 2008).

Infeksi Primer dari virus dengue akan memperlihatkan titer IgM dan IgG

yang berbeda dengan keadaan infeksi sekundernya, pada infeksi sekunder IgG

akan lebih banyak daripada IgM pada awal hari infeksi karena merupakan

lanjutan dari infeksi primer, sedangkan jumlah IgM sedikit karena tertutup oleh

jumlah IgG (Sa-Ngasang et al. 2005).

27

Gambar 8 Profil titer IgG pada hewan kontrol selama empat belas hari

Berdasarkan Gambar 8 dapat dilihat bahwa titer IgG pada beruk kontrol

(diinokulasikan larutan PBS) tidak menunjukkan kenaikan, hal ini sangat berbeda

jika dibandingkan dengan beruk yang telah diinfeksikan virus dengue yang

cenderung terlihat kenaikan titer IgG.

Perbandingan Peningkatan Rataan Titer IgM dan IgG

Tizard (2004) menyatakan bahwa IgM merupakan antibodi utama yang

dihasilkan dalam tanggap kebal primer, walaupun IgM pada tanggap kebal

sekunder juga diproduksi tetapi jumlahnya jauh lebih sedikit dari IgG,

berdasarkan hal itu maka akan terlihat pada Gambar 7 perbandingan kenaikan

dan penurunan yang terjadi pada kedua antibodi tersebut secara jelas.

28

Gambar 9 Profil perbandingan rataan kenaikan titer IgM dan IgG selama empatbelas hari pada plasma beruk yang diinfeksi virus dengue

Melalui rataan titer IgM dan IgG pada Gambar 7 diatas dapat diamati

bahwa IgM mulai mengalami kenaikan mulai pada hari ke-4 yang terjadi hampir

pada semua beruk, sedangkan pada IgG mulai mengalami kenaikan pada hari

ke-7. Hal ini sesuai dengan teori dinyatakan oleh Tizard (2004) bahwa IgM

merupakan antibodi utama yang dihasilkan dalam tanggap kebal primer,

walaupun IgM pada tanggap kebal sekunder juga diproduksi tetapi jumlahnya

jauh lebih sedikit dari IgG. Selain itu hal ini juga didukung oleh pernyataan dari

Kindt et al. (2007) bahwa respon IgM akan muncul pertama kali sebagai respon

pimer terhadap antigen dan juga merupakan immunoglobulin yang pertama

diproduksi setelah lahir serta IgM akan lebih efisien daripada IgG dalam

mengaktivasi komplemen. Setelah titer IgM mulai turun maka akan diikuti oleh

munculnya IgG, pada penelitian ini jarak antara mulai naiknya IgM dan

munculnya IgG sangat berdekatan walaupun titer IgM masih cukup tinggi. Hal ini

terjadi karena meningkatnya replikasi virus dengan cepat di dalam intravaskular

sehingga memaksa IgM diproduksi lebih banyak tetapi karena efek umpan balik

negatif dari tingginya titer IgM mengakibatkan lanjutan IgM akan tertekan titernya,

sehingga IgG akan muncul lebih awal untuk mengantisipasi sedikitnya IgM yang

diproduksi (Tizard 2004).

Berdasarkan Gambar 7, titik puncak titer IgM pada hari ke-9 lebih tinggi

daripada titik tertinggi titer IgG pada hari ke-11 sampai ke-13 karena dipengaruhi

oleh peningkatan replikasi dari virus dengue di dalam darah yang semakin hari

akan semakin meningkat serta karena perbedaan aviditas dari jenis antibodi

29

yang muncul (Tizard 2004). Tetapi perbedaan titer antara kedua antibodi tidak

bisa dijadikan acuan untuk membandingkan antara IgM dan IgG. Penurunan titer

IgM dan IgG sebenarnya belum bisa dijelaskan secara utuh pada penelitian ini,

karena gambaran kedua antibodi hanya bisa dijelaskan selama empat belas hari.

Salah satu faktor yang dapat mempengaruhi infeksi virus dan induksi

respon imun adalah rute masuk virus (Parija 2009). Pemilihan rute injeksi

diputuskan berdasarkan atas tiga pertimbangan yaitu volume yang harus

dimasukkan, penyangga dan komponen yang akan diinjeksikan dengan

immunogen, serta kecepatan pelepasan immunogen ke limfatik dan sirkulasi

(Harlow dan Lane 1988). Perbandingan rute masuk virus dengue antara rute

intradermal, intravena, subkutan dosis rendah dan subkutan dosis tinggi

menyebabkan tanggapan humoral (IgM dan IgG) yang berbeda pada setiap

beruk, hal ini dapat dilihat dari segi kenaikan, puncak kenaikan dan penurunan

titer IgM dan IgG.

SIMPULAN DAN SARAN

SIMPULAN

1. Uji ELISA tak langsung akan mendeteksi peningkatan titer IgM

dan IgG terhadap virus dengue (DEN-3) pada plasma beruk yang

diinokulasikan melalui rute intradermal

2. Infeksi primer oleh virus dengue (DEN-3) akan mengakibatkan

munculnya IgM terlebih dahulu daripada IgG

3. Titer IgM akan terdeteksi lebih tinggi daripada titer IgG ketika

infeksi primer oleh virus dengue melalui rute intradermal

4. Peningkatan titer IgM dan IgG pada penelitian ini terlihat berbeda

pada setiap beruk (Macaca nemestrina) yang dipengaruhi oleh

faktor genetik.

SARAN

Perlunya penelitian lanjutan untuk melihat peningkatan dan

penurunan IgM dan IgG secara lengkap pada plasma beruk (Macaca

nemestrina) yang telah diinokulasikan virus dengue (DEN-3) secara

primer melalui rute intradermal.

DAFTAR PUSTAKA

[Anonimus]. 2009. Emerging Viruses. [terhubung berkala]

http://thevirologyblogspot.com [ 2 Mei 2010]

[Anonimus]. 2010. ELISA Indirect. [terhubung berkala]http://entomology.tfrec.wsu.edu [21 Mei 2010]

Beasley D. dan Alan B. 2008. The Infectious Agent. Di dalam : Halstead, Scott,editor. Tropical Medicine : Science and Practice. Vol-5. USA : ImperialCollege Press. Hlm 29-57

Bellanti AJ. 1978. Immunology II. Asian Edition. Philadelphia : W.B SaundersCompany.

Bernardo L, Izquierdo A, Prado A, Rosario ID, Alvarez M, Santana E, Castro J,Martinez R, Rodrìguez R, Morier L, Guillèn G, dan Guzmán MG. 2008.Primary and secondary infection of Macaca fascicularis monkeys withAsian and American genotypes of dengue virus 2. Clinical and VaccineImmunology 15 (3) : 439-446

Brandler S, Brown N, Ermak TH, Mitchell F, Parsons M, Zhang Z, Lang J, MonathTP, dan Guirakhoo F. 2005. Repilications of chimeric yellow fever virusdengue serotypes 1-4 virus vaccine strains in dendritic and hepatic cells.Am. J. Trop. Med. Hyg 72(1) : 74-81

Buchy P, Yoksan S, Peeling RW, dan Hunsperger E. 2007. Laboratory Test forThe Diagnosis of Dengue Virus Infection. Switzerland : TDR

Burgess WG, ed. 1988. Teknologi ELISA Dalam Diagnosis dan Penelitian. Bab 2hlm 50-60. Artama, T. Wayan, penerjemah. Yogyakarta : Gajah MadaUniversity Press. Terjemahan dari : ELISA Technology in Diagnosis andResearch.

Colville T dan Bassert JM. 2002. Clinical Anatomy & Physiology for VeterinaryTechnicians. Missouri : Mosby, Inc.

Crowther JR. 2001.The ELISA Guidebook : Methods in Molecular Biology, vol.14. New Jersey : Humana Press Inc

Dolhinow P dan Fuentez A. 1999. The Non Human Primates. California : MayfieldCompany

Fenner FJ, Gibbs EPJ, Murphy FA, Rott R, Studdert MJ, dan White DO. 1987.Virology Veteriner 2

nd Edition. USA : Academic Press

Fiennes RN. 1976. Primates. In the UFAW Handbook on the Care andManagement of Laboratory Animals, 5th edition. Hal : 377-391. Edinburgh: Churchill Livingstone

Ginanjar G. 2007. Demam Berdarah. Jakarta : Pustaka Mizan

32

Gubler DJ dan Burns JA. 2008. Dengue Viruses. USA : Elsevier Ltd

Gubler DJ. 1998. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clinical MicrobiologyReviews Vol II (3): 480-496

Haak-Frendscho M. 1994. Why IgY? Chicken Polyclonal Antibody, anAppealingAlternative. Promega Notes Magazine: 11.

Halrow ED dan Lane D. 1988. Antibody a Laboratory Manual. USA : Cold SpringHarbor Laboratory

[IUCN] International Union of Conservation Nature . 2010. The IUCN Red List ofThreatened Species. [terhubung berkala].http://www.iucnredlist.org/apps/redlist/details/12555/0/full [15 Juli 2010]

Jones V. 2010. Inexpensive Immuno-Marking Systems to Measure InsectMovement Patterns. [terhubung berkala]. http://entomology.tfrec.wsu.edu[ 24 April 2010]

Kindt TJ, Goldsby RA, dan Osborne BA. 2007. Immunology. 6th Ed. USA : W.H.Freeman and Company

King C, Chao DY, Chien LJ, Chang GJJ, Lin TH, Wu YC, dan Huang JH . 2008.Comparative analysis of full genomic sequences among differentgenotypes of dengue virus type 3. Virology Journal (5) : 63

Kuiken T, Rimmelzwaan GF, van Amerongen G, dan Ostehaus ADME. 2003.Pathology of human influenza A (H5N1) virus infection in cynomolgusMacaques (Macaca fascicularis). J Vet Pathol 40 : 304-310

Kusumawati L. 2005. Teori Sequential Infection dari Halstead. Medan : USU.[terhubung berkala]. http://library.usu.ac.id/download/fk/mikrobiologi-lia%20kusumawati.pdf [2 Mei 2010]

Malole MB.1988. Virologi. Bogor : Pusat antar Universitas IPB bekerja samadengan lembaga sumberdaya informasi-IPB

Nakamura RM, Kasahara Y, dan Rechnitz GA.1992. Immunochemical Assay andBiosensor Technology for the 1990s. Washington DC : American Societyfor Microbiology

[PAHO] Pan American Health Organization. 2003. Zoonoses and CommunicableDiseases Common to Man and Animals. 3rd Ed. Volume II. WashingtonDC : PAHO HQ Library

Parija SC. 2009. Textbook of Microbiology and Immunology. India : Elsevier

Purnama RA. 2007. Konservasi Primata Indonesia. Volume XI. [terhubungberkala] www.Profauna.org. [14 Juli 2009]

Raviprakash K, Porter KR, Kochel J, Ewing D, Simmons M, Philips I, Murphy G,WR Weiss, dan Hayes CG. 2000. Dengue virus type 1 DNA vaccineinduces protective immune responses in Rhesus Macaques. Journal ofGeneral Virology 81 : 1659-1667

33

Ridge S.E dan Vizard A.L. 1993. Determination of the optimal cut off value for aserological assay an example using the Johnes absorbed EIA. Journal ofClinical Microbiology, Vol 31 (5): 1256-1261

Rose NR, de Macario EC, dan Fahey JL. 1992. Manual of Clinical LaboratoryImmunology, 4th Edition. Washington DC: American Society forMicrobiology

Roukens AH, Vossen AC, Bredenbeek PJ, van Dissel JT, dan Visser LG. 2008.Intradermally administrated yellow fever vaccine at reduce dose induces aprotective immune response : a randomized controlled non-inferiority trial.PloS ONE 3 (4) : e19993

Rudnick A. 1966. Studies of the ecology of dengue in Malaysia. Bull world HealthOrgan 35 : 78-79

Samuelson DA. 2007. Textbook of Veterinary Histology. Missouri : Saunders, animprint of Elsevier Inc.

Sa-Ngasang A, Anantapreecha S, A-Nuegoonpipat A, Chanama S,Wibulwattanakij S, Pattanakul K, Sawanpanyalert P, dan Kurane I. 2005.Specific IgM and IgG responses in primary and secondary dengue virusinfections determinated by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.Epidemiol Infect 134(4) : 820-825

Schaller J,Gerber S, dan Kampfer U. 2008. Human Blood Plasma Protein.England : John Wiley & Sons Ltd

Silva R da ANM, Nascimento E, Cordeiro MT, Gil LG, Abath FGC, MontenegroSML, dan Marques ETA. 2009. Identification of continous human B-cellepitopes in the envelope glycoprotein of dengue virus type 3 (DENV-3).Plos ONE 4(10) : e7425

Singh G. 2007. Determination of cutoff score for a diagnostic Test. The InternetJournal of Laboratory Medicine, Volume II: 1

Smith BJ dan Mangkoewidjojo S. 1988. Pemeliharaan, Pembiakan danPenggunaan Hewan Percobaan di Daerah Tropis. Jakarta : UniversitasIndonesia Press.

Stiasny K dan Franz H. 2006. Flavivirus Membran Fusion. J Gen Virol 87: 2755-2766

Soehartono T dan Mardiastuti A. 2003. Pelaksanaan konvensi CITES diIndonesia. Jakarta: Japan International Cooperation Agency.

Sumarmo S. 1988. Demam berdarah (Dengue) Pada Anak. Jakarta : UniversitasIndonesia Press.

Supriatna J dan Wahyono EH. 2000. Panduan Lapangan Primata Indonesia.Jakarta : Yayaan Obor Indonesia.

34

Tizard RI. 2004. Veterinary Immunology an Introduction. 7th Ed. USA : Saundersan Imprint of Elsevier.

Tran NTT, de Vries PJ, Hoang LP, Phan GT, Le HQ, Tran BQ, Vo CMT, NguyenNV, Kager PA, Nagelkerke N, dan Groen J. 2006. Enzyme-linkedimmunoassay for dengue virus IgM dan IgG antibodies in serum and filterpaper blood. BMC Infectious Diseases 6 : 13

Tritten L. 2009. A New double-antibody sandwich ELISA tergeting Plasmodiumfalciparum aldolase to evaluate anti-malaria drug sensitive. Malar J 8 :226

Vaughn DW, Green S, Kalayana S. 2000. Dengue viremia titer antibody responspatern and virus serotype correlate with disease severity. J.Infect 181: 2-9

Wagner KE dan Martinez HJ. 2004. Basic Virology. Second Edition. USA :Blackwell Publishing

Wahala MPB, Donaldson EF, de Alwis R, Accavitti-Loper MA, Baric RS, dan deSilva AM. 2010. Natural strain variation and antibody netralization ofdengue serotype 3 viruses. PLos Pathog 6 (3) : e1000821

White OD dan Frank FJ. 1994. Medical Virology. California: Academic Press.

[WHO] World Health Organization. 1985. Viral Hemorrhagic Fever. Report of aWHO Expert Committee. Jenewa : WHO

Yamada KI, T Takasaki, Nawa M, dan Kurane I. 2002. Virus isolation as one ofthe diagnostic methods for dengue virus infection. J Clin Virol 24 : 203-209

LAMPIRAN

Antibodi IgM

Lampiran 1 Titer antibodi IgM terhadap virus dengue

AI/DAY 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1.6791 2,90 3,82 4,19 4,15 4,90 8,01 12,72 19,03 24,38 24,43 22,78 18,37 18,00 16,23

1.8875 3,72 4,24 3,82 4,31 3,96 6,10 11,31 16,09 18,82 20,07 17,39 16,73 14,72 14,30

6099 3,84 3,79 3,58 5,02 8,55 11,47 12,79 15,97 18,47 24,43 24,76 23,30 20,66 18,82

8882 4,90 4,99 4,69 4,52 5,09 4,95 11,54 20,45 29,09 33,14 30,25 27,59 24,41 24,12

1.8258 0,92 0,97 1,18 1,20 1,34 2,71 3,96 9,19 16,58 19,55 19,18 17,03 14,42 12,89

9173 3,46 4,76 4,10 5,02 5,09 7,30 13,52 23,39 26,48 28,86 24,00 21,96 22,61 20,14

Antibodi IgG

Lampiran 2 Titer antibodi IgG terhadap virus dengue

AI/DAY 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1.6791 0,27 0,31 0,35 0,41 0,41 0,41 0,90 2,97 8,72 13,80 16,38 19,30 18,30 18,49

1.8875 0,29 0,27 0,27 0,16 0,18 0,41 1,00 5,08 9,40 13,41 15,15 16,91 17,09 17,91

6099 0,43 0,51 0,41 0,47 0,55 1,04 2,54 5,77 8,45 12,69 14,00 17,18 16,60 15,68

8882 0,18 0,25 0,23 0,27 0,25 0,29 0,45 2,78 8,86 13,74 15,01 17,97 17,93 19,02

1.8258 0,45 0,45 0,47 0,59 0,43 0,47 0,55 1,64 6,63 12,47 16,46 16,40 16,11 16,27

9173 0,23 0,27 0,20 0,20 0,27 0,35 0,82 2,93 9,38 12,18 16,13 17,22 16,91 16,97