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Progetto Regione Emilia-Romagna
“Studio e modellazione degli aspetti enzimatici legati alla stagionatura del formaggio Parmigiano-Reggiano”
Azione 3: Aspetti enzimatici legati alla stagionatura del Parmigiano-Reggiano
Fase 1: Determinazione delle caratteristiche microbiologiche e chimiche dei campioni scelti
EVOLUZIONE DELLA FRAZIONE AMMINOACIDICA E EVOLUZIONE DELLA FRAZIONE AMMINOACIDICA E OLIGOPEPTIDICANEL FORMAGGIO PARMIGIANOOLIGOPEPTIDICANEL FORMAGGIO PARMIGIANO--REGGIANO REGGIANO
NEI PRIMI MESI DI STAGIONATURANEI PRIMI MESI DI STAGIONATURA
Dipartimento di Chimica Organica ed IndustrialeFacoltà di Agraria
Università di Parma
Rosangela MarchelliArnaldo Dossena
Stefano SforzaGianni GalavernaValeria Cavatorta
Fausto Stefani
LA PROTEOLISI NEL PARMIGIANOLA PROTEOLISI NEL PARMIGIANO--REGGIANOREGGIANOEnzimi responsabili del processo proteolitico e loro origine
CASEINA
Chimosina
PlasminaAmmino acidi
Di- tripeptidiOligopeptidi
FORMAGGIO
LISI
Proteasi intracellulari
Sistemi di trasporto
Proteasi associate alla parete cellulare
Endoproteasi
Amminoproteasi
Tripeptidasi
Dipeptidasi
Lactobacillus
LatteLatte
CaglioCaglio
Proteasi Proteasi associate associate alla parete alla parete cellularecellulare
SieroinnestoSieroinnesto
Il gruppo di ricerca si propone:A. L’analisi quantitativa del contenuto amminoacidico dei campioni
B. L’analisi della frazione peptidica a basso peso molecolare (<10 kDa) per l’identificazione dei peptidi maggiormente presenti e la loro semi-quantificazione
C. L’utilizzo dei dati per ricavare informazioni sulle attività enzimatiche e la correlazione dei dati ottenuti con le attività enzimatiche determinate dal gruppo di Microbiologia degli Alimenti – Biotecnologie Microbiche
ANALISI DEGLI AMMINOACIDIANALISI DEGLI AMMINOACIDI
omogeneizzazione
derivatizzazione
Filtrazione su carta
Centrifugazione (4°C)
Deproteneizzazione (7,5 ml TFA) 20 min
Estrazione fase lipidica
Filtrazione (0,45 µm)
Neutralizzazione con NaOH 1 N
Purificazione medianteScambio ionico
Essiccazione
Neutralizzazione con NaOH 1 N
Essiccazione e ridissoluzione in
1 ml di H2O bidistillata
5g formaggio +500µl D-L Nor-Leucina+50 ml H2O bidistillata
Analisi HPLC-FLD
Essiccazione
mV
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
140.00
Minutes12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00
15.090
16.640 17
.584
18.402
18.814 19
.580
23.634
24.246
25.721
28.331
33.666
34.980
35.663
37.842
39.008
39.836
40.498
41.242
41.798Asp
Ser Glu His
Thr
Arg
Ala Pro
Tyr
ValGly Met
Lys Ile Leu
N-Leu
Phe
AMMINOACIDI TOTALIAMMINOACIDI TOTALI
Non emergono differenze significative nella quantità totale di amminoacidi tra parte esterna e parte centrale della forma fino al 2° mese.Una certa disomogeneità compare dal 3° mese per poi accentuarsi al 6°, con prevalenza di amminoacidi nella parte esterna.
01000
20003000
400050006000
70008000
900010000
0 50 100 150 200 250 300giorni di stagionatura
a.a.
tota
li (m
g/10
0g s
.s.) esterno forma
centro forma
Distribuzione percentuale degli amminoacidi a 1 mese di stagionaDistribuzione percentuale degli amminoacidi a 1 mese di stagionaturatura
Asp3%
Ser6%
Glu15%
Gly2%
His6%
Arg7%
Thr3%Ala
5%Pro9%
Tyr3%
Val6%
Met2%
Lys16%
Ile4%
Leu9%
Phe4%
Asp3% Ser
6%
Glu18%
Gly2%
His5%
Arg7%
Thr3%Ala
5%Pro10%
Tyr3%
Val6%
Met2%
Lys16%
Ile3%
Leu8%
Phe3%
CENTRO FORMAESTERNO FORMA
Nessuna differenza significativa nella distribuzione percentuale tra le due zone
Distribuzione percentuale degli amminoacidi a 6 mese di stagionaDistribuzione percentuale degli amminoacidi a 6 mese di stagionaturatura
CENTRO FORMA
Asp3% Ser
8%
Glu19%
Gly2%
His5%
Arg3%
Thr5%
Ala2%
Pro10%
Tyr1%
Val7%
Met2%
Lys14%
Ile6%
Leu9%
Phe4%
Asp3% Ser
7%
Glu20%
Gly2%
His5%
Arg3%
Thr4%Ala
2%Pro10%
Tyr1%
Val7%
Met2%
Lys15%
Ile5%
Leu10%
Phe4%
ESTERNO FORMA
Nessuna differenza significativa nella distribuzione percentuale tra le due zone
Distribuzione percentuale degli amminoacidi a diversi tempi di Distribuzione percentuale degli amminoacidi a diversi tempi di stagionaturastagionatura
Asp3%
Ser6%
Glu15%
Gly2%
His6%
Arg7%
Thr3%Ala
5%Pro9%
Tyr3%
Val6%
Met2%
Lys16%
Ile4%
Leu9%
Phe4%
1 mese di stagionatura
Asp3% Ser
8%
Glu19%
Gly2%
His5%
Arg3%
Thr5%
Ala2%
Pro10%
Tyr1%
Val7%
Met2%
Lys14%
Ile6%
Leu9%
Phe4%
6 mesi di stagionatura
Dimnuisce la percentuale di arginina, alanina e tirosinaAumenta la percentuale di acido glutammico, serina, isoleucina
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 50 100 150 200 250 300giorni di stagionatura
mg/
100
g s.
s.
ArgTyrGlu
I dati indicano un cambiamento nella produzione di amminoacidi apartire dal 2°-4° mese di stagionaturaQuesto cambiamento comporta un arresto nella produzione di Arg eTyr (o una loro degradazione) ed un incremento nella produzione diGlu
ANALISI DEI PEPTIDIANALISI DEI PEPTIDI
Ultrafiltrazione
Estrazione10 g di formaggio + 2,5 ml di Phe-Phe 1 mM +
45 ml di HCl 0,1 N (deproteinizzazione)
Filtrazione su carta
Estrazione della frazione lipidica
Filtrazione a 0,45 µm
Prelievo di un'aliquota di 3 ml di estratto
Evaporazione totale del solvente
Recupero del campione con 900 µl di soluzione acquosa di ac. Formico 0,1 %
Filtrazione a 10000 Da
3 lavaggi di recupero
Essiccazione completa del filtrato sotto flusso di azoto
Filtrato
Filtrato
ANALISI HPLC/MS DEI PEPTIDIANALISI HPLC/MS DEI PEPTIDISeparazione analitica Rivelazione
Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00
%
0
10015.04
6.34
5.304.42
3.22
6.65
6.89
10.81
15.28
15.68
15.84
27.42
16.40
24.46
22.95
42.99
27.9037.64
32.77
30.77
49.78
47.94
50.9062.00
57.04 65.51
74.3767.75
TICTIC
Phe-Phe
Interfaccia ESI
Zona di collisione in sorgente
� HPLC a fase inversa
� Colonna C18
� Eluente a gradiente H2O-CH3CN acidificati (ac. formico 0,1 %)
Spettrometro di massa a singolo quadrupolo con
interfaccia ESI
IDENTIFICAZIONE DEI PEPTIDIIDENTIFICAZIONE DEI PEPTIDI
Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00
%
0
10015.04
6.34
5.304.42
3.22
6.65
6.89
10.81
15.28
15.68
15.84
27.42
16.40
24.46
22.95
42.99
27.9037.64
32.77
30.77
49.78
47.94
50.9062.00
57.04 65.51
74.3767.75
Elaborazione dei dati: semiquantificazione
m/z300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
%
0
100706.4
642.3
588.9
542.2
697.1
784.7
719.4
882.7
811.1
1008.7
888.8 945.0 1171.61133.5
mass5900 6000 6100 6200 6300 6400 6500 6600 6700 6800 6900 7000 7100
%
0
1007054.0
m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
%
0
100706.4
642.3
588.9
100.1
543.7323.1162.9527.3
784.7
882.7
799.01008.6
898.7
945.01026.9 1176.51030.8 1259.4 1317.7
TICTICSpettro di massaSpettro di massa
Spettro di massa Spettro di massa ricostruitoricostruito
Picchi caratteristiciPicchi caratteristici
SEMIQUANTIFICAZIONE DEI PEPTIDISEMIQUANTIFICAZIONE DEI PEPTIDI
Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00
%
0
10054.71
XICXICArea del piccoArea del picco
Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00
%
0
10054,55
56471152
Calcolo del rapporto tra l'area generata dal peptide e l'area dello standard interno
Correzione del dato ottenuto in base al contenuto di umidità
Peptide
Frammentazione
IDENTIFICAZIONE DELLA SEQUENZA ESATTA DEI PEPTIDI IDENTIFICAZIONE DELLA SEQUENZA ESATTA DEI PEPTIDI TRAMITE CONFRONTO CON LE SEQUENZE CASEINICHE E TRAMITE CONFRONTO CON LE SEQUENZE CASEINICHE E
FRAMMENTAZIONE IN SORGENTEFRAMMENTAZIONE IN SORGENTE� Individuazione, in base al peso molecolare del peptide, delle possibili sequenze caseiniche
� Calcolo dei frammenti teorici
� Confronto dei frammenti teorici con quelli presenti nello spettro
m/z280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800
%
0
100788.3
657.2
528.2
399.2
354.0329.2286.2 371.2 413.8
529.3
548.1640.3
658.2
684.8
789.3
B (n-1)
B (n-2)
B (n-3)B (n-4)
L LEE
Attribuzione della sequenza caseinica, tra le
diverse possibili.
CARATTERIZZAZIONE DELLA FRAZIONE PEPTIDICACARATTERIZZAZIONE DELLA FRAZIONE PEPTIDICA
TR PM Sequenza TR PM Sequenza TR PM Sequenza TR PM Sequenza25,3 416 β CN(1-3) 48,2 2042 β CN(103-119) 10,0 874 36,4 1991 αS1 CN(1-17)25,4 545 β CN(1-4) 51,6 1122 β CN(111-119) 24,4 536 αS1 CN(1-4) 37,8 755 αS1 CN(10-16)25,4 1404 β CN(71-83) 55,2 7182 β CN(99-160) 24,4 745 αS1S1 CN(1-6) 38,3 1877 αS1 CN(1-16)26,4 1001 β CN(97-105) 55,5 7054 β CN(99-159) 26,2 707 αS1 CN(30-35) 42,4 601 αS1 CN(16-20)37,1 1510 β CN(82-95) 57,5 1151 β CN(199-209) 26,4 1132 αS1 CN(154-162) 46,1 2836 αS1 CN(174-199)39,3 1703 β CN(16-28) +3P 61,8 1717 β CN(194-209) 27,4 1535 αS1 CN(1-13) 49,9 905 αS1 CN(17-23)39,4 787 β CN(1-6) 62,1 1589 β CN(195-209) 28,8 1664 αS1 CN(1-14) 49,9 791 αS1 CN(18-23)40,4 1999 β CN(14-28) +4P 62,4 1881 β CN(193-209) 30,8 414 αS1 CN(10-13) 50,0 3452 αS1 CN(157-188)40,6 1790 β CN(130-144) 74,3 4696 β CN(51-93) 30,9 734 αS1 CN(186-192) 50,2 805 αS1 CN(24-30)41,3 2098 β CN(13-28) 74,4 4454 β CN(53-93) 32,4 1495 αS1 CN(24-36) 51,4 2764 αS1 CN(1-23)41,6 3132 β CN(98-124) 74,5 4253 β CN(55-93) 32,7 542 αS1 CN(10-14) 55,3 1246 αS1 CN(14-23)42,2 2746 β CN(159-183) 74,8 4024 β CN(57-93) 34,1 1348 αS1 CN(25-36) 56,9 1237 αS1 CN(24-34)43,3 2212 β CN(174-192) TR PM Frammenti 34,9 1138 αS1 CN(113-122) 58,5 3860 αS1 CN(83-114)47,8 754 β CN(47-52) 6,2 1140 αS1 CN(1-9) 36,3 1198 αS1 CN(23-32) 58,6 4238 αS1 CN(80-114)
αS1 CN(1-7)
PM TR Sequenza260 29,7260 29,9294 31,9
γ-glu-ileγ-glu-leuγ-glu-phe
Ore di stagionatura
Som
ma
A/A
si
0 12 48
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICOEVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO
Giorni di stagionatura2 30 60 90 120 180 240
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Andamento complessivo dei peptidi
Ore di stagionatura
Som
ma
A/A
si
0 12 48
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
2 30 60 90 120 180 2400,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
1. con un massimo a tempo zero
Giorni di stagionatura0 12 48
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
Ore di stagionatura
Som
ma
A/A
si
Giorni di stagionatura2 30 60 90 120 180 240
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICOEVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO
Andamento complessivo dei peptidi
I tre gruppi di peptidi:
0 12 48
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Ore di stagionatura
Som
ma
A/A
si
0 12 48
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
Ore di stagionatura
Som
ma
A/A
si
2 30 60 90 120 180 240
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Giorni di stagionatura
EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICOEVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO
Andamento complessivo dei peptidi
I tre gruppi di peptidi:
1. con un massimo a tempo zero2. con andamento crescente
2 30 60 90 120 180 240
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
Giorni di stagionatura
0 12 48
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Ore di stagionatura
Som
ma
A/A
si
Ore di stagionatura
Som
ma
A/A
si
2 30 60 90 120 180 240
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Giorni di stagionaturaGiorni di stagionatura
Andamento complessivo dei peptidi
I tre gruppi di peptidi:
1. con un massimo a tempo zero2. con andamento crescente3. con massimo
2 30 60 90 120 180 240
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
Giorni di stagionaturaOre di stagionatura
Som
ma
A/A
si
0 12 48
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICOEVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO
• αS1 CN f (1-23)
• αS1 CN f (24-34)
• β CN f (193-209)
• β CN f (99-159)
• β CN f (99-160)
2 30 60 90 120 180 2400,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
0 12 480,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
Ore di stagionatura Giorni di stagionatura
Som
ma
A/A
si
EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi con uncon un massimomassimo al tempo zeroal tempo zero
... Leu Arg Phe Phe Val Ala21 22 23 24 25 26
... Phe Leu Leu Tyr Gln Glu190 191 192 193 194 195
... Val Ser Lys Val Lys Glu95 96 97 98 99 100
αS1
β
βCHIMOSINA
• αS1 CN f (1-23)
• αS1 CN f (24-34)
• β CN f (193-209)
• β CN f (99-159)
• β CN f (99-160)
2 30 60 90 120 180 2400,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
0 12 480,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
Ore di stagionatura Giorni di stagionatura
Som
ma
A/A
si
EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi con uncon un massimomassimo al tempo zeroal tempo zero
... Leu Arg Phe Phe Val Ala21 22 23 24 25 26
... Phe Leu Leu Tyr Gln Glu190 191 192 193 194 195
... Val Ser Lys Val Lys Glu95 96 97 98 99 100
αS1
β
βCHIMOSINA
ENZIMI ENDOGENI DEL LATTE
2 30 60 90 120 180 2400,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00
2,25
2,50
Max a 30Max a 60Max a 90Max a 120
Giorni di stagionaturaOre di stagionatura
Som
ma
A/A
si
0 12 480,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00
2,25
2,50
EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi con uncon un massimo tra ilmassimo tra il primo edprimo ed il secondo meseil secondo mese
2 30 60 90 120 180 2400,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00
2,25
2,50
Max a 30Max a 60Max a 90Max a 120
Giorni di stagionaturaOre di stagionatura
Som
ma
A/A
si
0 12 480,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00
2,25
2,50
EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi con uncon un massimo tra ilmassimo tra il primo edprimo ed il secondo meseil secondo mese
Molti derivano dalla successiva degradazione di peptidi di origine chimosinica
FRLLNENLVEQPLGQHKIPHKPR
2322212019181716151413121110987654321
FRLLNENLVEQPLGQHKIPHKPR
2322212019181716151413121110987654321
1-23
1-16
1-17 18-23
1-14
1-13
10-14
10-16
10-13
1-9
1-7
1-4
1-6
14-23
17-23
16-20
1-16
1-17 18-23
1-14
1-13
10-14
10-16
10-13
1-9
1-7
1-4
1-6
14-23
17-23
16-20
1-16
1-17 18-23
1-14
1-13
10-14
10-16
10-13
1-9
1-7
1-4
1-6
14-23
17-23
16-20
2 30 60 90 120 180 2400,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00
2,25
2,50
Max a 30Max a 60Max a 90Max a 120
Giorni di stagionaturaOre di stagionatura
Som
ma
A/A
si
0 12 480,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00
2,25
2,50
EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi con uncon un massimo tra ilmassimo tra il primo edprimo ed il secondo meseil secondo mese
ESO- ed ENDO-PEPTIDASI BATTERICHE
• β CN f (16-28)3P
• β CN f (14-28)4P
• β CN f (174-192)
• αS1 CN f (83-114)
0 12 480,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
2 30 60 90 120 180 2400,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
Ore di stagionatura Giorni di stagionatura
Som
ma
A/A
si
EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi concon andamento crescenteandamento crescente
... Ile Ile ...26 27 28 29 30 31
... Val Pro ...167 168 169 170 171 172
... Ile ...77 78 79 80 81 82
Asn Lys Lys Glu
Gln Ser Lys Leu
Glu Gln Lys His GlnαS1
β
β
PLASMINA e AMMINOPEPTIDASI
EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi concon andamento crescenteandamento crescente
γ-glu-ileγ-glu-leuγ-glu-phe
NH
H2N
COOH
O COOH
γ-Glu-Phe
Peptidi di neo-formazione (NON di derivazione proteolitica) probabilmente generati da un’attività γ-glutamiltranspeptidasica
Fino a due mesi i peptidi formati dai batteri lattici si formano e si degradano più rapidamente all’esterno
Giorni di stagionaturaOre di stagionatura
Som
ma
A/A
si
Giorni di stagionaturaOre di stagionatura
Som
ma
A/A
si
Giorni di stagionatura
Som
ma
A/A
si
2 30 60 90 120 180 240
0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00
CentroEsterno
0 12 48
0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00
0 30 60 90 120 180 2400,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00
CentroEsterno
2 30 60 90 120 180 240
0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00
CentroEsterno
0 12 48
0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00
0 12 48
0,000,501,001,502,002,503,00
3,504,004,505,005,506,006,507,007,50
8,00
Nella parte esterna della forma vi è una maggior proliferazione batterica, ma la disomogeneità da essa provocata scompare a partire dal secondo-terzo mese
DISTRIBUZIONE DEL PATTERN PEPTIDICO NELLA FORMADISTRIBUZIONE DEL PATTERN PEPTIDICO NELLA FORMAFino a due mesi l’esterno è piùpovero di peptidi derivati dalla chimosina, ad indicare un’attivitàproteolitica più intensa nella parte esterna della forma
Non si notano sostanziali differenze tre le zone di campionamento
Ore di stagionatura
PRIME CONCLUSIONI:PRIME CONCLUSIONI:LL’’EVOLUZIONE NEL TEMPO DELLA FRAZIONE EVOLUZIONE NEL TEMPO DELLA FRAZIONE
AMMINOACIDICA E PEPTIDICAAMMINOACIDICA E PEPTIDICANel periodo che va dalla produzione al 10°mese di stagionatura i dati su amminoacidi e peptidiindicano due momenti ben distinti:
Da 0 a 2°-4° mese: - tutti gli amminoacidi in crescita costante ed omogenea tra esterno ed interno- i peptidi presenti provengono essenzialmente dalla parte N-terminale dell’αS1 caseina e dalla parte C-terminale della β-caseina- Disomogeneità nel contenuto peptidico tra esterno ed interno- Prevalenza dell’azione enzimatica del caglio e dei batteri lattici
Da 2-4°mese al 10° mese: - alcuni amminoacidi non aumentano più (Arg, Tyr, Ala), altri accelerano la loro crescita (Glu, Ser, Ile), con una certa disomogeneità tra esterno ed interno- I peptidi precedentemente presenti cominciano a scomparire e compaiono nuovi peptidi (parte centrale dell’αS1 caseina,fosfopeptidi dalla β-caseina, γ-glutamilpeptidi)- Omogeneità del contenuto peptidico tra esterno ed interno della forma- Prevalenza di nuove azioni enzimatiche (plasmina,amminopeptidasi, γ-glutamiltranspeptidasi)
Dal 10°mese in poi: ………..