I MICROORGANISMI e il loro AMBIENTE NATURALE · METODI per l’ANALISI dei MICROORGANISMI e delle COMUNITA’ MICROBICHE Metodi ... conta al microscopio ottico conta al microscopio

I MICROORGANISMI e il loro

AMBIENTE NATURALE

In natura le cellule vivono in associazione con altre cellule

L’insieme di più popolazioni che occupano lo stesso habitat e

sono metabolicamente correlate

CONSORZIO MICROBICO

POPOLAZIONI INSIEME DINUMEROSI ORGANISMI DELLA STESSA SPECIE

Composte da gruppi di cellule che derivano da divisioni cellulari successive a partire

da una singola cellula parentale

Si definisce habitat il luogo in cui una popolazione microbica vive

Metodologie microbiche – AA 2011-2012

sono costituite da diverse popolazioni microbiche (consorzi)

che interagiscono tra di loro in un determinato ambiente.

COMUNITA’ MICROBICHE

I componenti e il num di cellule che costituiscono una comunità microbica dipendono dalle risorse e

dalle condizioni presenti in quel determinato habitat

ECOSISTEMA

è costituito dagli organismi viventi unitamente ai

costituenti chimici e fisici dell’ambiente di cui fanno parte

Le popolazioni in una comunità microbica interagiscono tra loro in modo benefico e/o dannoso

In molti casi vi è cooperazione: per esempio i prodotti di scarto delle attività metaboliche di alcune

cellule possono fungere da nutrienti per altre cellule


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I MICROORGANISMI e il loro

AMBIENTE NATURALE

Un ECOSISTEMA è controllato in modo significativo dalle

TRASFORMAZIONI MICROBICHE

I microorganismi, conducendo i loro processi metabolici, rimuovono nutrienti dall’ambiente circostante.

Allo stesso tempo, liberano nell’ambiente i loro prodotti di scarto

Nel tempo, un ECOSISTEMA gradualmente cambia, sia

CHIMICAMENTE che FISICAMENTE attraverso le

trasformazioni microbiche dei nutrienti

ECOLOGIA MICROBICA studio dei microrganismi nei

loro habitat naturali


METODI per l’ANALISI dei MICROORGANISMI e

delle COMUNITA’ MICROBICHE

Metodi

CULTURE-DEPENDENT

Metodi

CULTURE-INDEPENDENT

Permettono l’ISOLAMENTO dei

microrganismi mediante l’impiego

di terreni selettivi specifici per la

crescita seguito da una

CARATTERIZZAZIONE mediante

saggi fisiologici e metabolici

Tecniche che prescindono dalla

coltivabilità di un microrganismo.

Consentono di monitorare la

COMPOSIZIONE e le DINAMICHE di

popolazione delle comunità

microbiche presenti in varie matrici

(acqua, suolo, reflui, etc.) senza

ricorrere a isolamenti preventivi

convenzionali molecolari

Permettono di analizzare le caratteristiche biochimiche e

genetiche delle cellule che compongono la comunità

Metodi MICROSCOPICI Utilizzando sonde fluorescenti permettono

l’identificazione in situ dei microrganismi (FISH)


Le tecniche molecolari permettono la caratterizzazione sia della

frazione coltivabile che di quella non coltivabile presente in un

campione ambientale. Con le tecniche di coltivazione standard è

invece possibile identificare solo quei microorganismi capaci di

crescere su determinati terreni selettivi

La quantità di campione necessaria per lo studio della comunità

microbica utilizzando tecniche molecolari è minore rispetto a quella

necessaria per l’approccio classico

Solo con le tecniche culture-dependent è possibile avere a

disposizione il microorganismo isolato per studi di carattere

fisiologico e metabolico. È importante cercare di ottimizzare le

tecniche di pre-arricchimento e arricchimento selettivi per riuscire a

recuperare le popolazioni microbiche meno dominanti, stressate e

non coltivabili, che sono presenti a bassa carica


METODI CULTURE-DEPENDENT

Costituiscono le cosiddette ‘procedure standard’ di identificazione dei

microorganismi

Prevedono: 1) ISOLAMENTO in COLTURA PURA

2) CARATTERIZZAZIONE fenotipica degli isolati ottenuti

sulla base di caratteristiche morfologiche , biochimiche e

della composizione chimica cellulare

LIMITI • Questo approccio non è applicabile indifferentemente a qualsiasi

specie microbica. Necessita quindi di essere adattato e ottimizzato

di volta in volta sulla base della matrice (ambientale e/o alimentare)

da analizzare e dei ceppi microbici in studio.

• Le tecniche proprie della tassonomia fenotipica forniscono

risultati a volte incerti e di difficile interpretazione

• I microorganismi coltivabili e quindi isolabili in una matrice

rappresentano solo una parte dell’intera comunità microbica

Per esempio: in una matrice ambientale i coltivabili sono < 10% del

totale


ISOLAMENTO DI CEPPI MICROBICI IN COLTURA PURA

Anche su mezzo di crescita ottimizzato risulta isolabile al massimo il 20%, in

media la frazione isolabile risulta compresa tra 1%-10%

CONDIZIONI COLTURALI

NON ADEGUATE

VITALITA’ del

microorganismo da isolare

Vi sono microrganismi che su

determinati terreni di coltura non

attecchiscono o crescono molto

lentamente

Vi sono microrganismi che in condizioni

ambientali sfavorevoli entrano in uno stato

di metabolismo ridotto

VNC – “non coltivabili ma vitali”

(viable but not cultivable)

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vanni V

allin

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LA COLTIVAZIONE DEI BATTERI

I microorganismi quando crescono su un terreno di laboratorio sono chiamati

COLTURA

I MEZZI SU CUI VENGONO COLTIVATI I MICROORGANISMI VENGONO

DETTI TERRENI DI COLTURA

I TERRENI DI COLTURA

Con i terreni di coltura si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in

grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microorganismo che si

desidera coltivare.

Il terreno prima della semina deve essere sterile e contenuto in recipienti

sterili dotati di un sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto.

Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte osservando

precauzioni necessarie a evitare la contaminazione del terreno ad opera dei

batteri presenti nell’ambiente


I TERRENI DI COLTURA – IMPIEGHI

• conteggio dei microorganismi presenti in una matrice;

• isolamento dei microorganismi;

• mantenimento in coltura pura;

• identificazione e studio delle caratteristiche biochimiche;

• coltivazione per la produzione di antibiotici, enzimi, tossine, antisieri, vaccini,

colture starter;

• valutazione dell’attività di prepararti farmacologicamente attivi (per es:

antibiotici, ricerca di sostanze inibenti)


IL CAMPIONAMENTO

IL CAMPIONE AMBIENTALE NON è OMOGENEO!!

Le cellule presenti in un singolo grammo di matrice NON SONO UGUALMENTE

DISTRIBUITE nello spazio della matrice (aggregati)

Numerosi REPLICATI

Raccolti in punti diversi dell’ambiente in esame

1. OMOGENIZZAZIONE

2. DISTACCO DELLE CELLULE MICROBICHE DALLA MATRICE

lavaggi con soluzioni saline che alterano le interazioni elettrostatiche

tra la parete batterica e la matrice stessa

3. La sospensione microbica così ottenuta viene quindi utilizzata per

l’isolamento o la quantificazione

L'analisi di un piccolo campione prelevato da una massa di grandi dimensioni

ha senso soltanto se il campione è rappresentativo di tutta la massa e ne

rispecchia quindi la composizione media.


ISOLAMENTO E COLTIVAZIONE DEI BATTERI

Isolamento: la separazione di un dato individuo (cellula) dagli altri

individui (popolazione mista naturale di cellule)

Coltivazione: moltiplicazione del singolo individuo (cellula) su un

substrato adatto alla crescita così da ottenere alla fine una

popolazione di cellule appartenenti ad un’unica specie.

COLTURA PURA o AXENICA

Per coltura pura si intende l’insieme delle cellule che si

ottengono dalla riproduzione di una sola cellula iniziale


METODI PER LA QUANTIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI

DIRETTI

INDIRETTI

conta al microscopio ottico

conta al microscopio a fluorescenza (FISH, colorazioni)

conta su piastra

MPN

PCR quantitativa

Biomassa

attività microbica


METODI PER LA QUANTIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI

CONTA SU PIASTRA

Partendo dalla matrice ambientale preparo una sospensione

Vengono allestite diluizioni seriali della sospensione

Opportune diluizioni seriali vengono seminate su opportuni mezzi di crescita:

Minimi, ricchi, arricchiti, selettivi

Sulla base della diluizione piastrata e del volume piastrato posso risalire al

numero di UFC (Unità Formanti Colonia) presenti per grammo di matrice

M (UFC)= n * F

V

M= num di m.o. per ml

n = num di colonie cresciute

V = volume seminato

F = fattore di diluizione


ISOLAMENTO DIRETTO

Sospensione di un’aliquota di matrice in soluzione fisiologica (0.9% NaCl)

-L’ottenimento dei ceppi avviene a seguito di semina su piastra contenente

mezzo non selettivo agarizzato

-i ceppi ottenuti vengono successivamente testati per la loro capacità di

crescere in presenza del contaminante di interesse

L’ottenimento di ceppi in coltura pura avviene dopo strisci

successivi di colonie singole a partire dalla piastra iniziale COLTURA PURA

MANTENIMENTO

degli isolati

Gli isolati devono essere mantenuti su mezzi di crescita

in presenza del contaminante

METODI PER L’ISOLAMENTO DI CEPPI BATTERICI in COLTURA PURA


METODI PER L’ISOLAMENTO DI CEPPI BATTERICI in COLTURA PURA

COLTURA DI ARRICCHIMENTO

Sospensione di un’aliquota della matrice in mezzo di crescita liquido selettivo,

contenente il contaminante di interesse.

Fattori importanti da considerare:

-Concentrazione del contaminante

-Solubilità in acqua del contaminante: possono essere utilizzati solventi

organici miscibili in acqua DMSO, DIMETILFORMAMMIDE, ALCOOL

ETILICO, ACETONE (conc del solvente < 1% vol/vol)

-Il contaminante può essere aggiunto anche per evaporazione

-Preparazione di soluzioni stock sterilizzate per filtrazione

-Tempo di incubazione

L’ottenimento dei ceppi selezionati avviene a seguito di semina su piastra

contenente mezzo selettivo agarizzato

Fa ricorso all’utilizzo di terreni selettivi in grado di sostenere la crescita delle

differenti specie microbiche aventi necessità trofiche distinte


CARATTERIZZAZIONE MORFOLOGICA

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE

MACROSCOPICHE

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE

MICROSCOPICHE

Colore e forma delle colonie - Forma delle cellule batteriche (cocchi,

bacilli, spirilli)

- Dimensione cellulare

- Colorazione di Gram

MICROSCOPIA OTTICA

MICROSCOPIA ELETTRONICA TEM (microscopia elettronica a trasmissione)

SEM (microscopia elettronica a scansione)

Risulta estremamente difficile identificare ogni componente di una comunità

microbica attraverso la semplice osservazione al microscopio. Inoltre molti

gruppi microbici presentano caratteri fenotipici non specifici e quindi non

utilizzabili ai fini della loro identificazione


STUDIO DELLA MORFOLOGIA

NUTRIENT AGAR SLANT

• quantità di crescita: nessuna, lieve, moderata, abbondante

• colore: il colore può essere presente nella biomassa batterica (Serratia

marcescens),oppure diffondere nel mezzo facendolo colorare (Pseudomonas

fluorescens)

• opacità: dipende dalla quantità di biomassa prodotta: opaco, trasparente,

traslucente

• forma: la strisciata su uno slant può dare crescita di diversa forma a seconda del

tipo di batterio


STUDIO DELLA

MORFOLOGIA

NUTRIENT AGAR

PLATE


CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA I saggi biochimici forniscono un maggior numero di informazioni rispetto ai

saggi morfologici,consentendo quindi una più facile identificazione

Misurano: - capacità di utilizzare diverse fonti di carbonio

- capacità di condurre determinate reazioni enzimatiche (ossidasi,

catalasi)

Alcuni KIT diagnostici per microbiologia API (BioMerieux)

BIOLOG

CRYSTAL (Becton-dickinson)

AUXACOLOR (Sanofi Pasteur) Svantaggi: 1. Le proprietà biochimiche possono essere instabili e suscettibili alle variazioni

dell’ambiente circostante (es. temperatura, pH, età della coltura, concentrazione di O2)

2. Può risultare difficile distinguere microrganismi appartenenti a specie diverse che

presentano lo stesso profilo biochimico

3. I saggi biochimici sono immediati ma proprio per questo è facile interpretare in

maniera errata l’esito della reazione

4. È necessario mettere a punto saggi biochimici sempre più sensibili in grado di

discriminare nuove specie microbiche

È tra le più efficienti e per questo è molto utilizzata


ANALISI DEGLI ACIDI GRASSI (FAME)

METODO BIOCHIMICO CHE SI BASA SULLA SEPARAZIONE GAS

CROMATOGRAFICA DEGLI ESTERI METILICI DEGLI ACIDI GRASSI

Gli acidi grassi rappresentano un frazione relativamente costante della biomassa cellulare

Esistono profili di acidi grassi caratteristici e distintivi dei principali gruppi

tassonomici di microrganismi

Nel caso in cui tale analisi sia effettuata su campione ambientale, una variazione del

profilo in acidi grassi può essere dovuto a un cambiamento nella composizione

tassonomica della comunità microbica


METODI CULTURE-INDEPENDENT

1. SEGUIRE L’EVOLUZIONE E IL COMPORTAMENTO DI UN CONSORZIO

MICROBICO NEL TEMPO (MONITORAGGIO DIACRONICO)

2. VALUTARE LA SICUREZZA MICROBIOLOGICA TRAMITE

MONITORAGGIO in situ DI MICROORGANISMI PATOGENI

3. RICOSTRUIRE L’EFFETTIVA COMPOSIZIONE DI UNA COMUNITA’

MICROBICA

4. MONITORARE in situ LA PERSISTENZA DI UN DETERMINATO

INOCULO BATTERICO (bioaugmentation)

TECNICHE MOLECOLARI

Permettono di rilevare sia microorganismi presenti a basse

concentrazioni che microorganismi non coltivabili in laboratorio


Le tecniche molecolari sviluppate per il monitoraggio della dinamica

delle comunità microbiche possono essere raggruppate

essenzialmente in due categorie:

A. Tecniche che si basano sull’analisi delle sequenze di DNA

indipendentemente da conoscenze pregresse circa la struttura della

comunità microbica di interesse. In particolare le tecniche che si basano

sulla PCR si sono rivelate un mezzo estremamente veloce ed efficace per

l’identificazione, la caratterizzazione e il monitoraggio dei microorganismi in

generale e dei batteri in particolare

B. Tecniche di ibridazione che impiegano sonde molecolari, utilizzate quando

esistono informazioni pregresse riguardo alla comunità microbica di

interesse


PRINCIPALI TECNICHE DI INDAGINE MOLECOLARI


TECNICHE DI PCR FINGERPRINTING

In generale le metodiche molecolari basate sull’utilizzo della PCR permettono di

distinguere entità microbiche strettamente correlate dal punto di vista genetico

attraverso l’ottenimento di specifiche impronte molecolari (molecular

fingerprinting)

PCR con primers per marker genici di particolare interesse filogenetico

16S rDNA, 23S rDNA, regione intergenica 16S-23S

18S e 26S rDNA


rRNA RIBOSOMALI

I rRNA possono essere considerati dei veri e propri

CRONOMETRI MOLECOLARI

perché caratterizzati dalla presenza al loro interno di zone più o meno

conservate,soggette a differente variabilità durante il processo evolutivo.

L’informazione contenuta nei rRNA fa si che il sequenziamento dei geni

(rDNA) che codificano per le suddette macromolecole permetta

l’individuazione,su base genetica, di generi e specie, anche nel caso di batteri

di difficile classificazione

Molecole essenziali per la vita delle cellule

Costituiscono la parte non proteica dei ribosomi

Elementi chiave della sintesi proteica


IL GENE 16S rDNA

LA SEQUENZA DEL GENE CHE CODIFICA PER IL16S rRNA NEI

MICROORGANISMI PROCARIOTI (EUBATTERI E ARCHEBATTERI) SI E’

RIVELATA UN OTTIMO STRUMENTO TASSONOMICO

È una sequenza universale tra i batteri

Non è soggetta a trasmissione orizzontale

Presenta regioni conservate e regioni variabili intersperse discriminanti le

diverse specie batteriche

Le regioni al 5’ e 3’ del 16S rDNA sono fortemente conservate mentre quelle

interne presentano una maggiore variabilità.

I primers per le reazioni di PCR possono essere disegnati su tutte e due le

regioni fornendo informazioni differenti:

-Se disegnati al 5’ e 3’ permettono amplificazione e sequenziamento di

regioni conservate che consentono l’identificazione del genere

-Se disegnati sulle regioni ipervariabili è possibile ottenere anche

l’identificazione della specie

RDP – Ribosomal Database Project – allineamento e identificazione


ARDRA – Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

Consiste nello studio dei profili elettroforetici ottenuti dopo

digestione con enzimi di restrizione della sequenza di 16S

rDNA ottenuta mediante PCR

Tecnica efficace, veloce, semplice ed economica per l’identificazione della

composizione di comunità microbiche complesse

• Permette analisi simultanea di un elevato numero di microorganismi

• Fornisce importanti informazioni sulle popolazioni microbiche presenti in

ambienti differenti descrivendo il loro grado di biodiversità e il loro

comportamento nel tempo

• Riesce a discriminare i microorganismi a livello di specie

PCR-RFLP


ARDRA – Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

L’ARDRA può essere utilizzata per lo screening di microorganismi coltivabili

e non coltivabili

Per ceppi microbici coltivati:

1. Isolamento dei batteri dall’ambiente naturale mediante le tradizionali

tecniche di coltura

2. Amplificazione del 16S/18S rDNA dei singoli isolati via PCR

3. Digestione degli ampliconi ottenuti mediante l’impiego di

endonucleasi

4. Separazione elettroforetica dei prodotti della digestione per ciascun

amplicone e ottenimento di profili elettroforetici tipici (impronta) per

ciascun amplicone digerito

5. Suddivisione dei profili ottenuti per ciascun amplicone in gruppi

definiti OTU (Operational Taxonomic Units)

6. Sequenziamento del 16S/18S rDNA per il capostipite di ogni OTUs

7. Allineamento delle sequenze ottenute con quelle presente in banca

dati mediante programma BLAST

8. Assegnazione dell’appartenenza a genere e specie

Su 16S/18S/26S


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