Bioingineriea Reabilitarii

Bioingineriea ReabilitariiPavel LorenaAn II

Sisteme specifice de culturi celulare utilizate in ingineria tisulara

Ingineria tisular este un domeniu multidisciplinar care include biologia, medicina iingineria i are ca scop promovarea calitii vieii umane prin restabilirea,meninerea sau ameliorarea funciei esuturilor sau organelor. Are atat alicatie terapeutica - esutul crete n corpul pacientului sau n afara lui i ulterior este transplantat, cat si diagnostic - esutul este crescut in vitro i este utilizat pentru testarea metabolismului in prezenta unor substane medicamentoase, toxicitatea i patogenitatea lor.

Scopul ingineriei tisulare este restabilirea funciei prin distribuirea elementelor vii care devin integrate n corpul pacientului.

Baza ingineriei tisulare este constituita din biomateriale- materiale noi, neviabile care sunt prevzute pentru organizarea creterii i diferenierii celulelor n procesul de formarea a unui esut funcional (Matrige, spongii -Sintetice sau naturale), celule: sursa, diferenierea, purificarea metode, protocoale, care trebuie s asigure numrul necesar de celule, i diferenierea lor n dependen de esutul lezat (celule autologice, alogene, xenogene, cellule obinute prin inginerie i prin manipulare imunologic); biomolecule: includ factori de cretere sau genele lor,factori de difereniere i proteine morfogenetice; aspectele de Desigh Ingineresc: includ expansia celulelor pe structuri 2-D, creterea esuturilor 3-D, bioreactore, stocarea celulelor i esuturilor i distribuirea lor. Aspectul biomecanic: determin proprietile esuturilor native; identificarea unor proprieti minime necesare esutului ingineresc, semnalelor mecanice care influeneaz esuturile ingineriei tisulare, eficacitatea i sigurana acestor esuturi. Informatizarea pentru susinerea ingineriei tisulare: analiza secvenelor de gene i proteine, analiza expresiei genice,expresiei proteinelor. Analiza interaciunilor, analizarea cantitativ a celulelor i esuturilor, modelarea tisular i celular, manufactura digital a esuturilor, sisteme automatizate de asigurare a calitii, interfeelor.

Culturile celulare reprezinta cultivarea in vitroaunorfragmentede tesutsaua unor suspensii celulare naturale sau obtinute prin tehnici de laborator ,in scopul muliplicarii celulare. Prin definitie reprezinta totalitatea tehnicilor de mentinere si in unele situatii de crestere si multipliare in vitro a unor mici fragmente tisulare extrase de la plante sau animale. Culturile tisulare sau celulare sunt necesare pentru studiul efectelor unor substante endogene sau exogene asupra sistemele vii. Culturile de tesut sunt utilizate pentru a initia culturi celulare.Experimentele de cultivare pot avea loc in vitro (ad literam, pe sticl) sau in vivo, n cadrul unor organisme intacte. Exist posibilitatea unor confuzii, mai ales n sens biochimic, deoarece termenul in vitro se refer la reacii biochimice care au loc n afara celulelor iar termenul in vivo se refer la reacii care au loc n interiorul unei celule vii.Noiunea de cultur celular se refer la situaia n care fragmentul de esut este disociat n elementele celulare componente; aceste elemente celulare pot prolifera n condiii fizico-biochimice speciale prestabilite, prin aderarea la un substrat de plastic sau sticl sau n suspensie n mediul de cultur. Noiunea de cultur tisular a unor fragmente mici este sinonim cu cea de explant. Meninerea fragmentelor mici la o interfa lichid-solid prin ataarea tisular la un substrat de plastic sau de sticl permite creterea celulelor pe substrat i migrarea i proliferarea celular ulterioar; poate fi astfel generat o linie celular

Dac postulm c celulele vii sunt necesare pentru a fabrica noi nlocuitori de esuturi, mai sunt multe de nvat in ceea ce priveste comportamentul lor n dou condiii normale:dezvoltarea normala in morfogeneza i vindecarea normal a unei rani.. n ambele situaii, celule creaza sau recreaza structuri funcionale pe baza informaiilor preprogramate i a semnalelor. Unele abordri ale ingineriei tisulare se bazeaz pe regenerarea ghidat folosind materiale ce servesc drept modele pentru creterea n profunzime a celulelor i esuturilor gazd. Alte abordri se bazeaz pe celule care au fost implantate ca parte a unui dispozitiv de inginerie. Datorita faptului ca avem incredere in programele de dezvoltare normala si in genele de vindecare cat si in comportamentul celulelor, putem folosi toate aceste in avatajul nostru pentru crearea de tesuturi vii rationale.

Dobndirea de celule pentru crearea de structuri ale corpului este o mare provocare, soluia care continu s evolueze. Scopul final n aceast privin - fabricarea de structuri la scar larg - este de a crea bnci mari de celule compuse din celulele universale care ar fi imunologic transparent la un individ. Aceste celule universale ar putea fi diferite tipuri de celule diferentiate care ar putea fi acceptate de un individ sau ar putea fi rezervoare de celule stem, care ar putea rspunde la semnalele de diferentiere in diferite clanuri pentru aplicatii structurale specific.

Ca etape intermediare, esutul poate fi recoltat ca alogrefa, autogrefa, sau xenogref. esuturile pot fi apoi disociate i plasate n culturi de celule, n care proliferarea celulelor poate fi iniiat. Dup expansiunea catre numrul potrivit de celule, ele pot fi transferate la template-uri,unde remodelarea poate avea loc. Mase mari de celule pentru ingineria tesuturilor trebuie sa fie inut n via, nu numai in vitro, dar i in vivo. Proiectarea de sisteme pentru a realiza acest lucru, atat in flow bioreactoars in vitro cat i n vivo prin strategii de ntreinere a masei de celule,reprezinta o provocare enorm .

Cele mai optime configuratii chimice si fizice de biomateriale care interacioneaz cu celulele vii pentru a produce construcii tisulare sunt studiate de catre multe grupuri de cercetatori. Aceste biomateriale pot fi permanente sau biodegradabil. Ele pot fi materiale naturale,materiale sintetice sau materiale hibride. Sunt dezvoltate pentru a fi compatibile cu sistemele vii sau cu celule vii in vitro i in vivo. Caracteristicile de proiectare sunt provocri majore i ar trebui s fie considerate un nivel chimic molecular. Sistemele pot fi nchise, semipermeabil, sau deschis. n prezent, studiile pentru dezvoltarea i proiectarea materialelor n spaiu tridimensional sunt dezvoltate folosind att modul natural cat i molecule sintetice. Unele esuturi poate fi concepute ca tesuturi universale care se vor potrivi oricarui individ, sau pot fi esuturi personalizate dezvoltate specific pentru un pacient.S-a artat c anumite esuturi poate fi conduse la finalizare in vitro, n bioreactoare. Cu toate acestea, timpi optimi de incubare vor varia de la esut la esut. Chiar i aa,noul tesut va necesita o alimentare de sange intact n momentul implantare pentru o grefare si functinare normala. Punctul de pornire pentru orice ncercare de a creea un esut sau organ este luarea n considerare a celulelor ce urmeaza a fi folosite. Nu numai ca va fi nevoie de o aprovizionare suficient de mare dar care sa i asigure lipsa de patogeni i contaminarea de orice tip. Acesta sursa poate fi autologa, alogena, sau xenogena, fiecare dintre acestea avand att avantaje, ct i dezavantaje;

Din punct de vedere istoric, cultur de esut a aprut din ideea c fragmente mici de tesut pot fi meninut in afara corpului ntr-un mediu adecvat, in care celulele ar supravieui. Harrison (1907) a fost primul care a arta c celulele nu numai ar putea supravieui, dar c acestea ar puteandeplini funcii. Civa ani mai trziu, cultur de tesut a deviat n cultura de celule, i cultura de organe, unde pstrarea structurii histologice a fost vzuta ca indicativ de pstrarea a funciei in vivo, att de clar pierduta n culturi dispersate de celule.Cultura de celule are avantajul c este posibila cuantificarea are capacitatea i permite dezvoltarea de condiiile de cultur optimizate, iniial pentru proliferarea celulelor, dar n cele din urm pentru expresia functinala a aceastora. Ca o resurs, cultura de celule a contribuit istoric nu doar pentru studii fundamentale ale genotipurilor i fenotipurilor cat i alte procese celulare, dar de asemenea, la producerea de produse biofarmaceutice. Acum, cu substraturi sau schele elaborate corect i capacitatea de a regla microclimatul, a devenit o resurs de materiale credibila pentru reconstructia tesuturilor.

Sisteme in bioreactoare, 3D si 2D

Celulele active, sunt introduse n spatiere tridimensionala (3D) i la condiii de mediu astfel incat pot reconstrui imatur, dar funcional, esuturi. In natura, celulele sunt arhitectii cheie de dezvoltare a esuturilor i organelor. Odata ce acestea sunt prevzute cu medii adecvate, ele pot remodela micromediile lor imediate i, de asemenea, se pot integra ntr-un tot funcional prin interactiuni heterotipice cu celulele vecine, att n vivo (dezvoltare / regenerare) i in vitro (inginerie tisulara). Prin urmare, pentru aplicaii in ingineria tisulara eforturi extraordinare au fost facute pentru a caracteriza mediile native ai acestor esuturi i expresia unei combinaie de parametri care pot fi reproduce experimental. Bioreactoare sunt instrumentele principale pentru imitarea aceste medii si care ofere construcii pe baz de celule cu stimuli fiziologici relevanti, care faciliteazi orchestreaza transformarea unei "ansamblu de celule" ntr-un fenotip specific de tesut.

Exista doua clase de bioreactoare.

Prima clasa este cea a bioreactoarelor pentru ingineria tisulara, care include o nelegere cantitativ att a mediilor native cat si a caracteristicilor structurale ale tesutului, in proiectarea sa globala. Astfel, sunt concepute pentru a reglementa cu precizie micromediul celular, pentru a facilita construirea in uniformitate i viabilitatea celular a ansamblului. Cerinele cheie a acestor reactoare includ eficien n schela 3D, mbuntirea transferului de mas, schimbul de gaze adecvat la mediul de cultur,alimentarea regulata a mediului uzat, controlul temperaturei /controlul pH-ului i a stimulilor fiziologici.

Cea de a doua clas de bioreactoare are ca scop optimizarea variabilelor de proces nainte de aplicaiile de inginerie tisulara reale.Acestea sunt utilizate n principal n scopuri de screening i sunt deosebit de avantajoase pentru economia de celule necesare, precum i pentru investigarea intervalele fiziologice,parametrilor i efectele lor sinergice. Aceste bioreactoare sunt de obicei proiectate pentru a fi modulare, miniscaled, i multiparametrice. Organizarea spaial 3D de celule din aceste reactoare nu este critic, iar ele de obicei nu sunt celule sau esuturi specifice. De exemplu, sistemele pot fi utilizate pentru a investiga efectele nivelului de oxigen sau tensiuni de forfecare pe supravieuirea, proliferarea, sau interactiunile de celule. n sistemul tisular,calitatea populaiei de celule, organizaia spaial a celulelor, i efectele variabilelor parametrice sunt toate componentele din micromediul de cultur care interacioneaz n modaliti complexe pentru a influena biochimic, fenotipic, sau caracteristicile mecanice ale esutului rezultat. Astfel, capacitatea de a asigura un control rafinat al micromediul celular,de manipulare exact a parametrilor de proces este esenial pentru succesul ingineriei tisulara.

Scopul principal al oricrei bioreactor este de a oferi un mediu de cultur celular steril care poate fi bine controlat. Bioreactoare poate fi folosit pentru a furniza un mediu in vitro similar cu condiia in vivo. Schelele tridimensionale (3D) servesc drept substrat temporar pentru sprijinirea i ndrumarea formarii de tesut de la diferite stari in vitro si in regenerarea tesutului in vivo. Deoarece celulele vii i esuturile sunt sisteme extrem de complexe, o tem central n proiectarea constructii este de a nelege modul n care structurile de schele, proprietiile i funciile sunt corelate. Un concept cheie in ingineria tisular este utilizarea material pe baz de schele 3D poroase pentru a oferi sprijin fizice i un mediu ce permite facilitare dezvoltarii esutului.De la mijlocul anilor 1980, sistemele 3D au evoluat pentru a servi functii complexe de ghidare a comportamentului celular n diferite aplicaii ale ingineriei tisulare. Schele poate fi nsmnat cu celule stem embrionare sau celulele stem adulte, celule progenitoare, mature ,difereniate sau co-culturi de celule pentru a induce formarea de esut n vitro i in vivo; schele pot fi, de asemenea, implantate direct in vivo cu capaciti de a livra biomolecule solubile / insolubilei repere temporale / spaiale pentru a ghida funcia de regenerare n esuturi i organe defecte. n timp ce funciile specifice variaza n funcie de tipul de esut i necesitii clinice, schele pot coordona evenimente biologice la nivelurile tisulare, moleculare, celulare, timpul i lungimescri variind de la cteva secunde pn la sptmni i de la cativa nanometri la cativa centimetri. Din punctul de vedere al proprietilor materialelor, transport n comun, mecanica, conductivitate electric, suprafata chimica, i topologie mediaz comportamentul celulelor de la scari nano, micro la macroscopice. Aceste proprieti sunt adesea corelate cu compoziii chimice ale schelelor i structuri din modul interdependent.

Comparativ cu sistemele de culturi bi-dimensionale (2D)culturi monostrat, construcii 3D impun cerine mai stricte pentru eficienta transportului n mas a celulelor pentru a obine uniformitatea tesutului i pentru a evita moartea celulelor pe scara larga in interiorul schelei. Nutrieni, oxigenul, i molecule de reglementare trebuie s fie eficient transportate de la mediu de culturla suprafeele de esut (masa externa de transfer) i apoi prin esut a celulelor (masa intern de transfer). n mod similar, metabolii i CO2 sunt eliminate din celulele prin matricea de esut la suprafeele i apoi la mediul vrac. Ratele de transfer de mas externe depind n primul rnd de condiiile hidrodinamice din bioreactor, n schimb, ratele interne pot depinde de difuzie i convecie i n mod semnificativ de structura schel / esut.

7