UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO – MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Miroljub Đurđanović

Proizvodnja biomase mikroalge iz roda Coccomyxa u

zavisnosti od izvora azota u podlozi

MASTER RAD

Niš, 2018.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO – MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

MASTER RAD

Proizvodnja biomase mikroalge iz roda Coccomyxa u

zavisnosti od izvora azota u podlozi

Kandidat: Mentor:

Miroljub Đurđanović 150 Dr Nataša Joković

Niš, 2018.

UNIVERSITY OF NIS

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

MASTER THESIS

Biomass production by microalgae from the genus

Coccomyxa depending on the nitrogen source in media

Candidate: Mentor:

Miroljub Đurđanović 150 PhD Nataša Joković

Niš, 2018.

Zahvalnica

Na prvom mestu želim da izrazim veliku zahvalnost svom mentoru prof dr. Nataši Joković.

Hvala Vam na svemu što ste me naučili, na ukazanom poverenju, strpljenju i neizmernoj podršci.

Hvala što ste verovali u mene i onda kada ja nisam verovao u sebe.

Zatim veliku zahvalnost dugujem Nikoli Stankoviću, i Ivani Kostić, na pomoći u

eksperimentalnom delu ovog rada. Hvala vam što ste učinili da svaki dan u laboratoriji bude

zabavan, poučan, i nezaboravan.

Takođe želim da se zahvalim koleginici Jeleni Veličković sa kojom sam delio sve muke izrade

master rada.

Hvala i mojim prijateljima, Milici Stanković, Sanji Stamenkov, Mileni Kostić i Nemanji

Laziću. „Radije bih hodala s prijateljem u mraku, nego sama na svetlu! “, Helen Keler

I na kraju hvala mojoj porodici, Slađani, Marini i Jovici Gavrilović. „Ne postoji ništa što

može da te izludi kao porodica. Ili da te učini toliko srećnim. Ili uznemirenijim. Ili... sigurnijim

“, Džim Bučer.

Hvala na svemu!

Biografija

Ime i prezime: Miroljub Đurđanović

Datum rođenja: 01.05.1991.

Mesto rođenja: Aleksinac

Osnovna škola: “Vožd Karađorđe” Aleksinac

(1998 – 2006)

Srednja škola: “Aleksinačka gimnazija”

Aleksinac (2006 – 2010)

Fakultet: Prirodno-matematički fakultet u

Nišu, departman za biologiju i

ekologiju (2010 – 2018)

Osnovne akademske studije: smer biologija (2010 – 2014)

Master akademske studije: smer biologija (2014 – 2018)

SAŽETAK

Mikroalge imaju široku primenu u biotehnologiji. Poslednjih godina aktuelno je

dobiljanje velike količine biomase algi koja se može iskoristiti u različitim biotehnološkim

procesima. Kako korišćenje mikroalgi u biotehnologiji zavisi od izolovanog soja algi, različite

prirodne sredine predstavljaju potencijalne rezervoare sojeva algi koji se mogu iskoristiti u

različitimm biotehnološkim procesima.

Cilj ovog master rada bio je izolacija mikroalgi iz Bovanskog jezera i identifikacija

izolata do nivoa roda. Zatim je rađena optimizacija rasta izolovanog soja u zavisnosti od izvora

azota koji je dodavan u podlogu. Rast je praćen spektrofotometrijski, dok je produkovana

biomasa određena gravimetrijskom metodom. Koncentracija azota u podlozi određivana je

spektrofotometrijskom metodom.

U ovom radu izolovana su dva izolata mikroalgi iz Bovanskog jezera, koja su

identifikovana kao vrste iz rodova Chlorella i Coccomyxa. Dalja ispitivanja vršena su na

mikroalgama iz roda Coccomyxa.

Mikroalga iz roda Coccomyxa pokazala je dobar rast na podlozi sa amonijum

fericitratom, kao i na podlozi sa mešavinom amonijum fericitrata i natrijum nitrata. Hemijske

analize podloge su pokazale da mikroalga koristi amonijum fericitrat kao izvor azota, a da ne

koristi natrijum nitrat kao izvor azota. Gravimetrijskom metodom određeno je da je nakon mesec

dana gajenja najveći prinos biomase mikroalge bio u podlozi sa mešovitim izvorom azota,

amonijum fericitratom i natrijum nitratom.

Ključne reči: mikroalga, Coccomyxa, biomasa, azot

ABSTRACT

Microalgae have a wide variety of uses in biotechnology. Generating massive algal

biomass that can be used in different biotechnological processes has been very popular in the last

few years. Considering that the use of microalgae in biotechnology depends on the specific algal

strain, different natural environments can be used as potential reservoirs of algal strains for

biotechnological use.

The purpose of this master thesis was to isolate microalgae from the Bovan lake and

identify isolates to the level of the genus. After that, the growth optimization of the isolated

strain depending on the nitrogen source in the medium was done. The growth was observed

using spectrophotometry, while the gravimetric analysis was used to assess the produced

biomass. The concentration of nitrogen in the media was analyzed using the spectrophotometric

method.

In this thesis two genus of algae were isolated form the Bovan lake, which were

identified as Chlorella and Coccomyxa. Further experiments were done with the microalgae from

the genus Coccomyxa.

Microalgae from the genus Coccomyxa have shown good growth on the medium with

ammonium fericitrate as well as on the medium with a mix of ammonium fericitrate and sodium

nitrate. Chemical analysis of the medium has shown that the microalgae use ammonium

fericitrate as the source of nitrogen, while they don’t use sodium nitrate as the source of nitrogen.

Gravimetric analysis done after a moth of cultivation has shown that the biggest biomass growth

happened on the media with mixed sources of nitrogen, ammonium fericitrate and sodium

nitrate.

Key words: mikroalgae, Coccomyxa, biomass, nitrogen

Sadržaj

1. Uvod ........................................................................................................................................ 1

1.1. Klasifikacija algi .............................................................................................................. 2

1.2. Alge u jezerima ................................................................................................................ 9

1.3. Uloga i značaj algi .......................................................................................................... 10

1.4. Upotreba algi u industriji................................................................................................ 11

2. Ciljevi rada ............................................................................................................................ 13

3. Materijal i metode .................................................................................................................. 14

3.1. Materijal ......................................................................................................................... 14

3.1.1. Uzorkovanje ............................................................................................................ 14

3.1.2. Podloge ................................................................................................................... 14

3.1.3. Reagensi .................................................................................................................. 15

3.2. Metode rada .................................................................................................................... 16

3.2.1. Izolacija algi ............................................................................................................ 16

3.2.2. Identifikacija algi .................................................................................................... 16

3.2.3. Zasejavanje podloga................................................................................................ 16

3.2.4. Određivanje biomase algi ....................................................................................... 17

3.2.5. Određivanje koncentracije nitrata ........................................................................... 17

3.2.6. Određivanje koncentracije amonijumove soli ........................................................ 17

4. Rezultati i diskusija ............................................................................................................... 19

4.1. Izolacija algi iz Bovanskog jezera .................................................................................. 19

4.2. Identifikacija mikroalgi ................................................................................................. 19

4.3. Rast mikroorganizama u zavisnosti od azota ................................................................. 20

4.4. Određivanje koncentracije nitrata i amonijum fericitrata u podlogama ......................... 21

4.5. Gravimetrijsko određivanje biomase algi ...................................................................... 22

5. Zaključci ................................................................................................................................ 26

6. Literatura ................................................................................................................................ 27

1

1. Uvod

Alge su u prirodi široko rasprostranjena i značajna grupa organizama. Naziv alga potiče

od latinske reči algae što u prevodu znači morska trava. U biološkom smislu pod ovim nazivom

podrazumeva se više razdela nižih biljaka koje u svojim ćelijama imaju holorfil i koje su tipični

stanovnici vodenih staništa. Hrane se fotoautotrofno, tj. obavljaju fotosintezu (mada postoje i

vrste koje se hrane miksotrofno i heterotrofno). Da bi vršile fotosintezu alge poseduju specifične

pigmente, u prvom redu pigmente iz grupe holorfila. Osim hlorofila, alge imaju pigmente iz

grupe karotena, ksantofila i fikobilina. Razmnožavaju se vegetativno, bespolno (sporama) i

polno, a u njihovom ciklusu razvića dominira haploidna faza. Žive samostalno ili u zajednici sa

drugim biljnim i životinjskim organizmima. Neke vrste na površini svog tela mogu imati ćelijski

zid, dok druge mogu imati čvrst omotač (teku), elističan sloj (pelikulu ili periplast) ili pak samo

plazmalemu (gimnoplasti). Protoplast svih predstavnika algi morfološki je diferenciran na jedro i

citoplazmu u kojoj se nalaze organele. Jedro algi ima sve karakteristike jedra eukariota, dok se

citoplazma sastoji od strome u kojoj se nalaze organele (hromatofori, mitohondrije, diktiozomi,

endoplazmatični retikulum, mikrotubule, lizozomi, peroksizomi, sferozomi). Izuzev

modrozelenih i crvenih algi, sve ostale alge imaju aktivno pokretne ćelije u vegetativnom

stadijumu ili ih obrazuju pri razmnožavanju (zoospore, gameti). Aktivno pokretne alge se u

vodenoj sredini kreću ili pomoću rizpodija (nepostojane strukture) ili pomoću cilija i bičeva

(trajne strukture).

Na osnovu rezultata dobijenih gajenjem algi u kulturi konstatovano je da se mnoge alge

uspešno razvijaju na podlogama bogatim organskim jedinjenjima na svetlosti i u mraku. Alge

gajene u mraku imaju manji prirast biomase od onih na svetlosti. Pored toga, alge mogu uspešno

da se razvijaju i bez prisustva CO2, iz čega proizilazi da su sposobne da kao izvog ugljenika

koriste i druga jedinjenja osim CO2. Osim korišćenja ugljenika iz različitih organskih izvora

(glukoza, galaktoza, manoza, laktoza, saharoza, fruktoza, itd.), alge imaju osobinu da azot koriste

iz pojedinih organskih jedinjenja kao što su amidi i neke aminokiseline (Blaženčić, 2000).

2

1.1. Klasifikacija algi

Prema svom izgledu, veličini i građi alge se odlikuju velikom raznovrsnošću. Prema

morfološkoj složenosti mogu biti jednoćelijske, kolonijalne, kapsalne, sifonalne i višećelijske

(Blaženčić, 2000). Na osnovu veličine mogu biti podeljene u dve kategorije – makroalge i

mikroalge (Chen et al., 2009). Sistematika i taksonomija algi zasniva se na opšte prihvaćenim

principima filogenetske sistematike. Na osnovu najprihvaćenije podele sve alge su svrstane u

deset razdela: Cyanobacteriophyta (modrozelene alge), Rhodophyta (crvene alge), Pyrrophyta

(vatrene alge), Xanthophyta (žutozelene alge), Chrysophyta (zlatne alge), Bacillariophyta

(silikatne alge), Phaeophyta (mrke alge), Euglenophyta (euglene), Chlorophyta (zelene alge) i

Charophyta (pršljenčice) (Mihailov-Krstev, 2008).

Cyanobacteriophyta – modrozelene alge su jedine alge koje imaju prokariotični tip ćelije.

U pogledu morfološke organizacije mogu biti jednoćelijske, kolonijalne i trihalne. Na površini

ćelije imaju ćelijski zid. Od pigmenata imaju samo hlorofil a. Imaju gasne vakuole ili

pseudovakuole, tj. prostore ispujene azotom. Razmnožavaju se deobom ćelija, hormogonijama, a

neke vrste i gonidijama, kokama i planokokama. Najpoznatiji predstavnici su iz rodova:

Microcystis, Nostoc, Anabaena, Rivularia, Gloeotrichia, Oscillatoria, Spirulina i Lyngbya (Slika

1.).

a) b) c)

d) e) f)

Slika 1. Predstavnici modrozelenih algi: a) Rod Microcystis, b) Rod Nostoc, c) Rod Anabaena, d) Rod Rivularia, e) Rod

Gloeotrichia, f) Rod Oscillatoria

3

Rhodophyta – crvene alge su bentosne alge. Najprostije vrste imaju jednoćelijsku i

kolonijalnu građu, dok ostale vrste karakteriše končasti i višećelijski talus. Imaju kalcifikovan

ćelijski zid. Hromatofori crvenih algi se nazivaju rodoplasti. Od pigmenata sadrže hlorofil a i d,

α i β karotene, ksantofile zeaksantin, lutein i neoksantin, aod fikobilina imaju fikoeritrin i

fikocijanin. Kao produkt fotosinteze i rezervna supstanca kod crvenih algi javlja se floridea

skrob. Neke vrste se odlikuju žlezdanim ili mehurastim ćelijama koje su ispunjene jedinjenjima

joda ili broma, a neke imaju ćelije koje izrastaju u jednoćelijske ili višećelijske dlake.

Razmnožavaju se vegetativno, bespolno (sporulativno) i polno (oogamija). Koriste se u ishrani

kao salata, a najveću primenu u industrji imaju zbog produkcije fikokoloida agar-agar.

Najznačajniji predstavnici su iz rodova: Bangia, Porphyra, Batrachospermum, Nemalion,

Gelidium i Lithotamnion (Slika 2).

Pyrrophyta – vatrene alge su jednoćelijske alge sa retkim kokoidnim i trihalnim vrstama.

Na telu imaju jednu ili dve brazde. Karakteriše ih dorzoventralna građa, kao i prisustvo bičeva.

Od pigmenata imaju hlorofil a i c, karotene i ksantofile. Razmnožavaju se vegetativno, bespolno

a) b) c)

d) e) f)

Slika 2. Predstavnici crvenih algi: a) Rod Bangia, b) Rod Porphyra, c) Batrachospermum, d) Nemalion, e) Gelidium, f)

Lithotamnion

4

a) b) c)

d) e)

(zoosporama i aplanosporama) i polno. Najpoznatiji predstavnici su iz rodova: Cryptomonas,

Vacuolaria, Gymnodinium, Peridinium i Ceratium (Slika 3).

Xanthophyta – žutozelene alge imaju vrste na mondaoidnom, rizopodijalnom,

kokoidnom, kolonijalnom, trihalnom, heterotrihalnom i sifonalnom stupnju morfološke

organizacije. Kod malog broja predstavnika u ćelijskom zidu se javlja celuloza. Od pigmenata

neke vrste imaju hlorofil a i c, a neke a i e, kao i ksantofile i karotene. Kao rezervnu supstancu

imaju hrizolaminarin, volutin i ulja. Razmnožavaju se vegetativno, bespolno i polno. Najbitnije

rodove čine: Tribonema, Botrydium i Vaucheria (Slika 4).

Slika 3. Predstavnici vatrenih algi: a) Cryptomonas, b) Vacuolaria, c) Gymnodinium, d) Peridinium, e) Ceratium

a) b) c)

Slika 4. Predstavnici žutozelenih algi: a) Rod Tribonema, b) Rod Botrydium, c) Rod Vaucheria

5

Chrysophyta – zlatne alge se odlikuju jednoćelijskim, kolonijalnim i višećelijskim

končastim oblicima. Prema tipu građe imaju i rizopodijalne, monadoidne, kokoidne, trihalne i

heterotrihalne vrste. Od pigmenata sadrže hlorofil a i c, kao i karotene i ksantofile.

Hrizolaminarin i ulja su rezervne supstance ovog razdela algi. Najprimitivniji stupnjevi na

površini imaju periplast, dok se kod viših stupnjeva javlja pancir. Razmnožavaju se vegetativno

(deobom i fragmentacijom), bespolno (zoosporama i autosporama) i polno. Najznačajniji

predstavnici su iz rodova: Chromulina, Dinobryon, Chrysamoeba, Hydrurus i Phaeothamnion

(Slika 5).

Bacillariophyta – silikatne alge mogu biti jednoćelijske i kolonijalne (otvorene). Od svih

ostalih algi se razlikuju po prisustvu dvodelnog pancira (teke). Gornji deo se naziva epiteka a

donji hipoteka. Od pigmenata sadrže hlorofil a i c, kao i karotene i ksantofile. Od ksantofila za

njih je jedinstveno karakterističan dijatomin. Kao rezervne materije imaju hrizolaminarin, volutin

i ulje. Razmnožavaju se vegetativno (deobom ćelija), bespolno (auksosporama) i polno

(izogamijom, heterogamijom i oogamijom). Zbog svoje osetljivosti na sadržaj i koncentraciju

hlorida, silikatne alge služe kao bioindikatori stepena saliniteta vode. Najznačajniji predstavnici

su iz rodova: Melosira, Asterionella, Tabellaria, Pinnularia, Navicula i Cymbella (Slika 6).

a) b) c)

d) e)

Slika 5. Predstavnici zlatnih algi: a) Rod Chromulina, b) Rod Dinobryon, c) Rod Chrysamoeba, d) Rod Hydrurus, e) Rod

Phaeothamnion

6

Phaeophyta – mrke alge su višećelijski, sesilni i skoro isključivo makroskopski morski

organizmi. Talus im je končast (granat, heterotrihalan), korast, loptast, pločast i žbunast. Na

a) b) c)

d) e) f)

Slika 6. Predstavnici silikatnih algi: a) Rod Melosira, b) Rod Asterionella, c) Rod Tabellaria, d) Rod Pinnularia, e) Rod

Navicula, f) Rod Cymbella

a) b)

c) d)

Slika 7. Predstavnici mrkih algi: a) Rod Dictyota, b) Rod Laminaria, c) Rod Macrocystis, d)

Rod Fucus

7

preseku talusa razlikuju se kora i srž. U ćelijskom zidu sadrže alginsku kiselinu i njene soli.

Hromatofori ovih algi se nazivaju feoplasti. Od pigmenata sadrže hlorofile a i c, kao i

karotenoide β karotin i fukoksantin. Imaju i fizode. Razmnožavaju se vegetativno (delovima

talusa), bespolno (zoosporama i tetrasporama) i polno (izogamijom, heterogamijom i

oogamijom). Najpoznatiji predstavnici su iz rodova: Dictyota, Laminaria, Macrocystis i Fucus

(Slika 7).

Euglenophyta – euglene su jednoćelijski organizmi monadoidne građe, koji imaju jedan

ili dva biča. Na površini tela imaju pelikulu. Karakteriše ih prisustvo očne mrlje ili stigme. Od

pigmenata sadrže hlorofila a i b, kao i karotene i ksantofile. Kao rezervnu supstancu imaju

paramilon. Prema načinu iskrane, euglene spadaju u miksotrofe, mada ima i vrsta koje su

saprofiti – osmotrofi, kao i vrsta koje se hrane holozojski (animalnim putem). Razmnožavaju se

vegetativno, pri čemu u nepovoljnim uslovima mogu da pređu u palmeloidno stanje. Najpoznatiji

predstavnici su iz rodova: Euglena, Phacus i Trachelomonas (Slika 8).

Chlorophyta – zelene alge se odlikuju jednoćelijskim, kolonijalnim, sifonalnim i

višećelijskim oblicima, koji mogu biti aktivno pokretni ili nepokretni. Naziv su dobile zbog

zelene boje talusa koja potiče od hlorofila a i b. Karakterišu ih hloroplasti najrazličitijih oblika

(peharasti, prstenasti, pločasti, trakasti, zvezdasti i sočivasti). Razmnožavaju se vegetativno

(deoba ćelija, fragmentacija), bespolno (zoospora, aplanospore) i polno (hologamija, izogamija,

heterogamija, oogamija i konjugacija). Većina živi u planktonskoj ili bentosnoj zajednici slatkih

voda. Najznačajniji predstavnici su iz rodova: Chlamydomonas, Volvox, Hydrodictyon,

Pediastrum, Ulothrix, Oedogonium, Acetabularia, Spirogyra i Zygnema (Slika 9).

a) b) c)

Slika 6. Predstavnici euglena: a) Rod Euglena, b) Rod Phacus, c) Rod Trachelomonas

8

Charophyta – pršljenčice predstavljaju višećelijske krupne alge koje su slične rastavićima

(Equisetum). Imaju talus složene građe, na kojem se razlikuju stabloliki, listoliki deo i rizoidi.

Od pigmenata sadrže hlorofil a i b, kao i karotenoide. Kao rezervnu supstancu imaju skrob.

Razmnožavaju se vegetativno i polno. Najpoznatiji predstavnici su iz rodova: Chara i Nitella

(Slika 10).

a) b) c)

d) e) f)

h) i) g)

Slika 7. Predstavnici zelenih algi: a) Rod Chlamydomonas, b) Rod Volvox, c) Rod Hydrodictyon, d) Rod Pediastrum, e)

Rod Ulothrix, f) Rod Oedogonium, g) Rod Acetabularia, h) Rod Spyrogyra, i) Rod Zygnema

a) b)

Slika 8. Predstavnici pršljenčica: a) Rod Chara, b) Rod Nitella

9

1.2. Alge u jezerima

Na osnovu svojih osobina i karakteristika biotopa koji naseljavaju, alge se svrstavaju u

nekoliko ekoloških grupa. Prema delu vodenog basena koji nastanjuju alge se dele na bentosne i

planktonske.

Bentosne alge su dobile naziv od grčke reči bentos što znači dubina. U ovu grupu spadaju

alge koje svoj životni ciklus provode na dnu vodenog basena. Najčešće su sesilne tj. pričvršćene

za podlogu, ali se mogu naći i vrste koje su slobodnoživeće (nisu pričvršćene za podlogu a mogu

biti pokretne i nepokretne). Svetlosni intenzitet je jedan od osnovnih ekoloških faktora koji utiču

na razviće i rasprostranjenje bentosnih algi. Međutim, stepen iskorišćavanja ove energije zavisi

od temperature, sadržaja i količine biogenih supstanci, količine kiseonika i CO2, kao i od brzine

protoka vode. Pored ovih abiotičkih faktora, na razviće algi u bentosnoj zajednici utiču i biotički

faktori. Ovaj uticaj se ispoljava kroz konkurentske odnose sa drugim algama, biljkama ili

životinjama. Prema karakteristikama staništa bentosne alge se dele u dve velike ekološke grupe:

slatkovodne i morske bentosne alge.

U slatkovodnom bentosu najzastupljenije sesilne alge pripadaju razdelu Chlorophyta, dok

se među nepričvršćenim oblicima najviše nalaze one iz razdela Bacillariophyta, mada ima i dosta

predstavnika razdela Cyanobacteriophyta i Chlorophyta (Blaženčić, 2000). Zahvaljujući

specifičnom delovanju ekoloških faktora, rasprostranjenost algi moze da varira od staništa do

staništa. Tako se na istoj dubini različitih jezera može pronaći različiti sastav algi. Usled

činjenice da su alge fotoautotrofni organizmi jedan od bitnih ekoloških fatora koji utiče na

njihovo vertikalno rasprostranjenje je svetlosni režim biotopa u kome se razvijaju. U velikim

jezerima sa čistom i prozračnom vodom bentosne alge se rasprostiru do dubine od 50 m. U

jezerima sa manje providnom vodom bentosne alge se nalaze na dubini do 10 m. Jezero

karakterišu sledeće zone: mlatna obala, litoral, sublitoral i profundal. Pošto se ove zone razlikuju

u pogledu kvaliteta i intenziteta ekoloških faktora, u jezerima se jasno ispoljava vertikalna

zonacija algi.

Planktonske alge čitav svoj životni ciklus provode u slobodnoj vodenoj masi, i zajedno sa

drugim biljnim organizmima čine fitoplankton. Ove alge su uglavnom jednoćelijske i

kolonijalne, a pripadaju razdelima Bacillariophyta, Chlorophyta, Chrysophyta i

10

Cyanobacteriophyta (Blaženčić, 2000). Osnovni preduslov planktonskog načina života je

mogućnost lebdenja u slobodnoj vodi, koji su alge ispunile razvijanjem niza morfoloških i drugih

adaptacija. U neke od adaptacije spadaju: tanji pancir kod silikatnih algi, gasne vakuole kod

modrozelenih algi i nagomilavanje ulja kao rezervne supstance kod silikatnih algi. Kao što je

slučaj sa bentosnim algama, i kod fitoplanktona sastav i rasprostranjenost zavise od kompleksa

ekoloških faktora. Fitoplankton se razvija u gornjim prosvetljenim slojevima vode. U jezerima

koja se nalaze u zoni umerenokontinentalne klime vegetacioni ciklus fitoplanktona počinje u

proleće (mart-april) (Blaženčić, 2000).

1.3. Uloga i značaj algi

Alge su značajni činioci osnovnih bioloških procesa kao što su kruženje materije i

proticanje energije. Jedan od osnovnih značaja algi u prirodi potiče iz činjenice da su one

primarni producenti organske materije u vodenim sredinama, a to je osnova na kojoj počiva sav

živi svet tih staništa (Blaženčić, 2000). Proizvodnja kiseonika od strane algi veća je od svih

šumskih i livadskih ekosistema na kopnu (Ranđelović, 2015). Oslobađanjem kiseonika u procesu

fotosinteze alge doprinose boljem aerisanju vode, pri čemu taj kiseonik sa jedne strane koriste

vodeni organizmi u procesu disanja, a sa druge stvara uslove za ubrzaniji proces mineralizacije

materija.

Modrozelene alge imaju sposobnost vezivanja, drugim vrstama često nedostupnog,

molekularnog azota. Značaj azotofiksirajućih algi ogleda se kroz obogaćivanje zemljišta azotnim

jedinjenjima. Alge se javljaju kao pionirske vrste koje pripremaju zemljište za naseljavanje

drugim organizmima. Priznate su kao značajan faktor održavanja plodnosti zemljišta, a žive

samostalno ili u simbiozi sa bakterijama, gljivama ili višim biljkama.

U pogledu biološkog čišćenja zagađenih voda, alge predstavljaju biološki filter i deluju u

sadejstvu sa bakterijama obrazujući sluzave omotače kojima vezuju koloidna jedinjenja i

dispergovane supstance. Imaju praktičnu primenu u prečišćavanju otpadnih voda. Koriste se i

kao bioindikatori stepena zagađenosti voda zbog svoje osetljivosti na kvalitativne i kvantitativne

promene osobina vode.

U primorskim oblastima svih kontinenata alge se koriste u ishrani. Najpoznatije vrste

koje se koriste za ovu svrhu su Porphyra tenera, Laminaria sacchariana, Ulva lactuca,

11

Rhodymenia palmata, Phylitis fascia, Nemalion vermiculare, kao i vrste rodova Alaria,

Enteromorpha, Codium i druge. Morske alge sadrže najviše ugljenih hidrata, nešto manje

belančevina, a najmanje masti.

1.4. Upotreba algi u industriji

Najpoznatija organska jedinjenja izolovana iz algi su: algin ili alginska kiselina, odnosno

njene soli alginati i agr-agar. Alginati imaju široku primenu u tekstilnoj, prehrambenoj,

građevinskoj i kozmetičkoj industriji. U tekstilnoj industriji, kao i pri proizvodnji papira alginati

služe za slepljivanje vlakana, a u građevinarstvu se dodaju cementu i asfaltu kako bi povećali

njihove hidroizolacione sposobnosti. Agar-agar se dobija iz crvenih algi koje pripadaju rodovima

Gelidium, Gracilaria, Pterocladia i drugih. To je suva amorfna supstanca slična želatinu. Koristi

se u medicini i biologiji za pravljenje čvrstih podloga pri gajenju čistih kultura mikroorganizama

i tkiva. Pored toga koristi se i u tekstilnoj, prehrambenoj i farmaceutskoj industriji kao sredstvo

koje daje određenu čvrstinu proizvodima kao što su marmelada, paste, kremovi, pilule,

nezapaljivi zavoji i dr.

Za razliku od morski algi, slatkovodne alge sadrže veću količinu lipida, ali se manje

koriste u industriji zbog svog sporadičnog razvića u prirodnim uslovima. Međutim, rezultati

istraživanja na hloreli pokazali su da se kontrolisanjem faktora spoljašnje sredine može uticati na

pravac biosinteze pojedinih supstanci. Pod optimalnim uslovima, alge sintetišu masne kiseline

pretežno za esterifikaciju i dobijanje membranskih lipida (Guschina i Harwood, 2006; Hu et al.,

2008; Khozin-Goldberg i Cohen, 2011). Mnoge mikroalge odgovaraju na uslove deficijencije

nutrijenata pojačanom akumulacijom lipida (Geider et al., 1998; Phadwal i Singh, 2003; Lamers

et al., 2012). U uslovima nedostatka azotnih jedinjenja u hloreli se stimuliše sinteza lipida i do

85% (Blaženčić, 2000).

Alge se koriste kao sirovina za dobijanje biodizela i spadaju u sirovine tzv. treće

generacije. (Danilović et al., 2014). Ideja za korišćenje algi kao energetske sirovine datira još iz

1950. godine (Chen et al.,2009). Najpodesnije alge za dobijanje biodizela su jednoćelijske ili

kolonijalne fotosintetske mikroalge. One mogu rasti veoma brzo i u roku od 24 h mogu

udvostručiti svoju masu. Rast mikroalgi zavisi od: abiotičkih (svetlost, temperatura,

12

koncentracija nutrijenata, kiseonik, CO2, pH, salinitet i prisustvo toksičnih elemenata), biotičkih

(prisustvo patogena i kompeticija sa drugim vrstama algi) i procesnih (mešanje, stepen

razblaženja, frekvencija uklanjanja biomase i dodatak bikarbonata) faktora (Mata et al., 2010).

Mikroalge pružaju mogućnost proizvodnje do 100 puta više biodizela po jedinici površine

gajenja u odnosu na suncokret i uljanu repicu (Danilović et al., 2014). Slatkovodne vrste

proizvode velike količine zasićenih neutralnih lipida. Prednost upotrebe mikroalgi za

proizvodnju biogoriva jesu povećana efikasnost i smanjeni troškovi proizvodnje (Ahmad et al.,

2011).

Prvi korak u kultivaciji algalne biomase je pronalazak odgovarajuće vrste (Chen et al.,

2009). Postupak izolovanja mikroalgi obuhvata izdvajanje iz prirodnog staništa, obogaćivanje i

prečišćavanje izolovane kulture. Obogaćivanje kulture podrazumeva obezbeđivanje optimalnih

uslova za rast i razmnožavanje odgovarajuće vrste uz, istovremeno sprečavanje rasta ili

uništavanje ostalih vrsta mikroorganizama (Becker, 1994). Prečišćavanje se vrši presejavanjem

izolata na odgovarajuće podloge dok se ne dobiju čiste kulture. Za maksimalni prinos i kvalitet

neophodno je uspostaviti kontrolisane uslove (Chen et al., 2009). Tri tipa industrijskih reaktora

se mogu koristiti za gajenje mikroalgi: fotobioreaktori, otvoreni bazeni i hibridni sistemi

(Danilović et al., 2014). Gajenje mikroalgi u otvorenim sistemima može da dostigne

produktivnost biomase u proseku do 100 t ha-1god. -1 (Wijffels et al., 2010). Mikroalge mogu da

rastu u čistoj, braktičnoj i otpadnoj vodi, kao i u razblaženom životinjskom đubrivu. Korišćenje

otpadnih voda, ne samo da smanjuje cenu industrijskog procesa, vec ima i značaja u eliminisanju

organskog ugljenika koji bi inače bio emitovan u atmosferu (Chen et al., 2009). Posle kultivacije

mikroalgi sledi proces izdvajanja biomase koji podrazumeva odvajanje tečne i čvrste faze

centrifugiranjem, filtracijom ili taloženjem (Molina Grima et al., 2003). Nakon izdvajanja,

biomasa je podložna kvarenju pa je neophodno preraditi je nekom od metoda sušenja (Brennan i

Owende, 2010). Zatim se vrši ekstrakcija organskih jedinjenja pomoću rastvarača. Problemi koji

se javljaju u ovom delu industrijskog procesa su povećani troškovi vezani za uklanjanje vode i

poteškoće u narušavanju ćelijske strukture da bi se obezbedio pristup organskim jedinjenjima

(Chen et al., 2009). Za dostizanje masivne produkcije algi neophodno je održavanje stabilne

produktivnostu u dužem vremenskom periodu kao i izbegavanje kontaminacije od strane drugih

organizama (Mata et al., 2010; Wijffels et al., 2010; Borowitzka i Moheimani, 2013).

13

2. Ciljevi rada

Zbog velikog značaja i širokog spektra primene mikroalgi u različitim industrijskim

procesima ciljevi ovog rada su:

izolacija mikroalgi iz uzorka vode sa Bovanskog jezera,

identifikacija dobijenih izolata mikroskopskim metodama i

ispitivanje produkcije biomase mikroalgi u odnosu na različite izvore azota u podlozi.

14

3. Materijal i metode

3.1. Materijal

3.1.1. Uzorkovanje

U ovom radu za izolaciju mikroalgi korišćeni su uzorci vode iz Bovanskoj jezera. Uzorci su

uzeti 16-og aprila 2016. godine sa nekoliko lokaliteta i čuvani su u staklenim teglama. Tegle su

bile izložene svetlosti, do transporta u laboratoriju.

3.1.2. Podloge

Za izolaciju, gajenje algi i pripremu inokuluma korišćena je Blue-Green 11 podloga (BG11).

Sastav BG11 podloge:

Stok 1 (po litru):

15.0 g NaNO3

Stok 2 (po 500 ml):

2.0 g K2HPO4

3.75 g MgSO4·7H2O

1.80 g CaCl2·2H2O

0.30 g Limunska kiselina

0.30 g Amonijum fericitrat

0.05 g EDTANa2

1.00 g Na2CO3

Stok 3 (po litru):

2.86 g H3BO3

1.81 g MnCl2·4H2O

0.22 g ZnSO4·7H2O

0.39 g Na2MoO4·2H2O

0.08 g CuSO4·5H20

0.05 g Co(NO3)2·6H2O

Podloga je pravljena mešanjem 100 ml stoka 1, 10 ml stoka 2, 1ml stoka 3 i dodavanjem

destilovane vode do 1 litra. pH podloge je podešavan na 7.1 sa 1M NaOH ili HCl. Za pravljenje

15

čvrste podloge dodavan je bakteriološki agar 15g po litru. Pripremljena podloga je sterilizovana

u autoklavu, 15 min na 121°C.

Za ispitivanje uticaja azota na rast algi, pored BG11 podloge, korišćene su i modifikovane

BG11 podloge. U modifikovane podloge kao izvori azota dodavani su natrijum nitrat (15 g/L) ili

amonijum fericitrat (0,3 g/L). U podlozi koja je imala natrijum nitrat kao izvor azota, dodat je

feri hlorid (0,3 g/L) kao izvor gvožđa za rast algi.

3.1.3. Reagensi

Za određivanje nitrata u podlozi UV-spektrofotometrijski korišćeni su sledeći reagensi:

1. demineralizovana voda

2. osnovni rastvor nitrata, dobijen rastvaranjem 7211,9 mg osušenog kalijum nitrata (KNO3)

i razblaživanjem do 1 litra vodom. Dobijen rastvor koncentracije 1ml = 0,1 mg N = 100

µg N,

3. standardni rastvor nitrata, dobijen razblaživanjem 100,00 ml osnovnog rastvora nitrata do

1 litra vodom; dobijen rastvor koncentracije 1,00 ml = 10 µg N = 44,3 µg NO3,

4. hlorovodonična kiselina (HCl) 1 M,

5. suspenzija aluminijum-hidroksida; dobijena odmeravanjem 125 g AlK(SO4)·12H20 ili

AlNH4(SO4)·12H20 i rastvaranjem u litru vode. Zatim je zagrejana do 60°C i postepeno

je dodato 55 ml koncentrovanog rastvora amonijaka, uz mešanje. Smeša je ostavljena da

stoji jedan sat, zatim je prebačena u široku bocu, a talog ispran sukcesivnim dodavanjem i

dekantovanjem vode (bez sadržaja amonijaka, hlorida, nitrata i nitrita). Nakon taloženja,

dekantovano je što je moguće više bistre tečnosti i ostavljena je samo koncentrovana

suspenzija.

Za određivanje koncentracije amonijumovog jona u podlozi spektrofotometrijski korišćeni su

sledeći reagensi:

1. rastvor amonijum-hlorida dobijen je rastvaranjem 0,0314 g NH4Cl u 100 ml destilovane

vode (0,1 mg NH3/cm3)

2. Neslerov reagens

3. rastvor sumporne kiseline 0,05M dobijen rastvaranjem 2,7 cm3 H2SO4 U 1000 ml

destilovane vode.

16

3.2. Metode rada

3.2.1. Izolacija algi

Za izolaciju algi korišćene su sledeće metode:

-metoda iscrpljivanja eze (metoda poteza) – Ezom je zahvaćena mala količina početnog uzorka

(10µl) koja je prenešena na jedan deo podloge. Zatim je nanešena kap ezom prevlačena i na

druge delove podloge, tzv. striklovanje;

-metoda razlivanja kapi – Određena količina uzorka (500 µl) je prenešena na podlogu i razlivena

po površini podloge štapićem po Drigalskom.

Nakon zasejavanja podloga, Petri ploče su stavljene na inkubaciju u dobro osvetljenoj

prostoriji na sobnoj temperaturi 14 dana. Pojedinačne kolonije algi sa Petri ploča su dalje

prečišćavane prebacivanjem na nove Petri ploče do dobijanja uniformnih kolonija.

3.2.2. Identifikacija algi

Identifikacija algi rađena je na osnovu morfoloških karakteristika. Od kolonija sa Petri ploča

napravljeni su nativni preparati koji su posmatrani svetlosnim mikroskopom na uvećanju od 40 x

(Leica DM 1000).

3.2.3. Zasejavanje podloga

Priprema inokuluma rađena je zasejavanjem BG11 tečne podloge kolonijama uzetim sa Petri

ploča. Zasejana podloga inkubirana je na sobnoj temperaturi (oko 28°C) 15 dana, uz konstanto

prisustvo svetlosti i mešanja na 210 obrtaja u minuti (PSU-20i, Multi-functional Orbital Shaker).

Određivanje uticaja izvora azota na rast algi rađeno je u 3 podloge:

▪ modifikovana BG11 podloga bez natrijum nitrata, ali sa amonijum fericitratom kao

izvorom azota (1),

▪ modifikovana BG11 podloga bez amonijum fericitrata, ali sa natrijum nitratom kao

izvorom azota (2),

▪ BG11 podloga koja je sadržala natrijum nitrat i amonijum fericitrat kao izvore azota (3).

Podloge su zasejavane 2% inokulumom algi, inkubirane su na sobnoj temperaturi (oko

28°C), uz konstantno prisustvo svetlosti i mešanjem na 210 obrtaja u minuti.

17

3.2.4. Određivanje biomase algi

Rast algi je praćen u periodu od 16 dana, uzimanjem uzoraka za određivanje biomase na

svakih 2 dana. Nagrađena biomasa algi je određivana spektrofotometrijskim merenjem

apsorbance uzoraka na 620 nm.

Na kraju završenog perioda gajenja algi (30 dana), rađeno je gravimetrijsko određivanje

biomase. 10 ml podloge filtrirano je pod vakuumom i sušeno na filter papiru do konstantne mase.

Biomasa algi odrađena je kao razlika mase filter papira sa algama i filter papira bez algi i

izražena je kao masa mikroalgi/L/danu.

3.2.5. Određivanje koncentracije nitrata

Određivanje koncentracije nitrata u uzorcima podloga rađeno je UV-spektrofotometrijski

merenjem apsorbance na 220 nm.

Najpre su pripremljeni kalibracioni standardi rastvora nitrata u opsegu od 0 do 8 mg nitrata

po litru i to razblaženjem do 50 ml sledećih zapremina standardnog rastvora nitrata: 0; 1,00;

2,00; 4,00; 6,00; 8,00 ml. Pošto su ispitivani uzorci prilikom određivanja nitrata razblaženi 1000

puta, obojenje uzorka je tako izbegnuto, a samim tim i postupak uklanjanja obojenja koji se

sastoji u dodavanju suspenzije Al(OH)3 i ceđenju kroz membran-filter od 0,45 µm, kao i

naknadno zakišeljavanje sa HCl. Očitana je apsorbanca svih standardnih rastvora i uzoraka u

odnosu na slepu probu (demineralizovana voda) na 220 i 275 nm.

3.2.6. Određivanje koncentracije amonijumove soli

Određivanje koncentracije amonijumove soli rađeno je Neslerovim reagensom tako što se

uzorak zakiseli pomoću H2SO4. Nagrađeni amonijum-sulfat se određuje spektrofotometrijski, jer

uzorci koji sadrže amonijumov jon sa Neslerovim reagensom razvijaju žuto obojenje, čiji

intenzitet boje zavisi od količine amonijaka ili amonijumove soli u uzorku.

Najpre je napravljen radni rastvor NH4Cl odmeravanjem 10 ml primarnog rastvora i

rastvaranjem u normalnom sudu od 100 ml, pri čemu je dobijen rastvor koncentracije 0,01 mg

NH3/ml. Od toga rastvora napravljena je standardna serija rastvora u normalnim sudovima od 50

ml odmeravanjem 1, 2, 4, 6, 8 i 10 ml. Dobijeni rastvori su u opsegu koncentracija: 0,2; 0,4; 0,8;

1,2; 1,6 i 2 mg/L. Standardnim rastvorima je zatim dodato 10 ml 0,05 M H2SO4 i 2 ml

Neslerovog reagensa, i nakon 15 minuta izmerena je apsorbanca rastvora na 425 nm. Priprema

18

slepe probe je izvršena tako što je u normalni sud od 50 ml odmereno 10 ml 0,05 M H2SO4 i

dodato 2 ml Neslerovog reagensa, a zatim je normalni sud dopunjen do crte destilovanom

vodom. Uzorci su najpre razblaženi 100 puta, a onda je kao i kod pripreme standardnih rastvora

dodato 10 ml 0,05 M H2SO4 i 2 ml Neslerovog reagensa, i nakon 15 minuta izmerena je

apsorbanca rastvora na 425 nm. Na osnovu konstruisanog kalibracionog grafika nanošenjem

vrednosti apsorbance na ordinatu i koncentracije amonijumove soli na apscisu, očitane su

vrednosti koncentracije amonijumovog jona u ispitivanim uzorcima.

19

4. Rezultati i diskusija

4.1. Izolacija algi iz Bovanskog jezera

U ovom radu izolovane su mikroalge iz uzoraka vode Bovanskog jezera. Korišćenjem

metoda opisanim u odeljku Metode, dobijeni su izolati koji su formirali zelene kolonije. Na Slici

11 prikazane su kolonije koje su formirali dobijeni izolati.

4.2. Identifikacija mikroalgi

Nativni preparati izolovanih mikroalgi posmatrani svetlosnim mikroskopom pod

uvećanjem od 40 x prikazani su na slikama 12 i 13.

Slika 10. Nativni preparat mikroalge Roda Chlorella Slika 11. Nativni preparat mikroalge Roda Coccomyxa

Slika 9. Kolonije mikroalgi na Petri ploči

20

Korišćenjem ključa za identifikaciju Slatkovodna algalna flora Britanskih ostrva Jhon D.

M. i saradnika identifikovana su dva roda zelenih mikroalgi: Chlorella i Coccomyxa. Rod

Coccomyxa, koji pripada familiji Coccomyxaceae, razdelu zelenih algi Chlorophyta, karakterišu

cilindrične, izduženo-ovoidne ili elipsoidne, tankozidne, ponekad asimetrične ćelije bez

pirenoida, sa parijetalnim hloroplastima. Coccomyxa se često koristi kao model organizam jer je

objavljena njena celokupna genomska sekvenca (Darienko et al., 2015). Chlorella, koja pripada

familiji Chlorellaceae, razdelu Chlorophyta, je jednoćelijska zelena mikroalga sferičnog ili

ovalnog oblika sa peharastim hloroplastom. Zbog većeg broja kolonija dalji eksperimenti vršeni

su sa mikroalgama iz roda Coccomyxa.

4.3. Rast mikroorganizama u zavisnosti od azota

Nutrijenti neophodni za rast i razviće algi obuhvataju makronutrijente (C, N, P, S, K, Na,

Fe, Mg, i Ca) i mikronutrijente (B, Cu, Mn, Zn, Mo, Co, V, i Se). Ovi nutrijenti određuju stopu

rasta i potencijal za proizvodnju biomase. Sinteza i akumulacija velikih količina triacilglicerola

(TAG) nastaje u ćelijama algi kada se one podvrgnu stresnim uslovima kao što su azotna

deficijencija, salinizacija, i jako velika ili jako niska pH medijuma (Chen et al., 2009).

U ovom radu je ispitivan rast izolata mikroalgi izolovanog iz Bovanskog jezera u tri

podloge sa različitim izvorima azota. Upotrebljavana je BG11 podloga sa natrijum nitratom i

amonijum fericitratom kao izvorom azota, kao i modifikovane BG11 podloge koje sadrže samo

natrijum nitrat ili samo amonijum fericitrat. Rast mikroalge u gore navedenim podlogama praćen

je spektrofotometrijski u period od 16 dana (Slika 14).

Slika 12. Rast mikroalge Roda Coccomyxa u podlogama sa različitim izvorima azota (1 – podloga sa amonijum fericitratom, 2 –

podloga sa natrijum nitratom, 3 – podloga sa amonijum fericitratom i natrijum nitratom)

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

2 4 6 8 10 12 14 16

A6

20

nm

VREME (dani)

1

2

3

21

Slika 13. Kalibracioni grafici za nitrat i amonijak

U svim podlogama sa različitim izvorima azota zapažen je rast mikroalgi. Nakon

vremenskog perioda u kojem je praćen rast mikroalgi, najveća produkcija biomase zapažena je

na podlozi sa amonijum fericitratom (A620 0,337), a najmanja na podlozi sa natrijum nitratom

(A620 0,081).

4.4. Određivanje koncentracije nitrata i amonijum fericitrata u podlogama

Tokom praćenja rasta mikroalge na podlogama sa različitim izvorima azota, rađena je i

hemijska analiza podloga. Ova analiza obuhvatala je određivanje koncentracije natrijum nitrata i

amonijum fericitrata. Koncentracije su određivane spektrofotometrijski, a očitavane su na osnovu

kalibracionih grafika (Slika 15).

U Tabeli 1 predstavljeni su rezultati koncentracije nitrata i amonijum fericitrata u

korišćenim podlogama. Odstupanje u koncentraciji amonijum fericitrata tokom drugog dana u

podlozi broj 3 verovatno predstavlja eksperimentalnu grešku.

Koncentracija amonijum fericitrata u praćenom periodu se postepeno smanjivala.

Smanjenje je zabeleženo u podlozi sa amonijum fericitratom kao jedinim izvorom azota (1), ali i

u podlozi koja sadrzi pored amonijum fericitrata i natrijum nitrat (3). Veće smanjenje amonijum

fericitrata je zapaženo u podlozi 1, što ukazuje da su ga mikrolage koristile kao izvor azota. Do

smanjenja amonijum fericitrata dolazi i u podlozi 3 ali u manjoj meri u odnosu na podlogu 1.

Razlog može biti da se iskorišćavanje amonijum fericitrata smanjuje u prisustvu natrijum nitrata

u podlozi.

22

Tabela 1. Koncentracija amonijum fericitrata i natrijum nitrata u različitim podlogama

Dan Amonijum fericitrat (mg/L) Natrijum nitrat (mg/L)

1 3 2 3

2. 3,390 10,984 120,8 110,8

4. 3,056 3,460 113,9 118,5

6. 2,902 3,355 112,1 114,0

8. 2,690 2,704 117,1 116,0

10. 2,196 1,701 112,6 117,1

12. 0,629 0,427 129,2 130,1

14. 0,963 0,983 127,3 123,9

16. 0,356 1,519 118,0 119,2

(1 – podloga sa amonijum fericitratom, 2 – podloga sa natrijum nitratom, 3 – podloga sa amonijum fericitratom i

natrijum nitratom)

Sa druge strane koncentracija natrijum nitrata je ostala relativno konstantna kako u

podlozi u kojoj je natrijum nitrat bio jedini izvor azota (2), tako i u podlozi koja sadrži i natrijum

nitrat i amonijum fericitrat kao izvor azota (3). To ukazuje da mikroalge nisu koristile natrijum

nitrat kao izvor azota. Minimalna povećanja koncentracije natrijum nitrata koja su izmerena

tokom eksperimenta su verovatno rezultat eksperimentalne greške.

4.5.Gravimetrijsko određivanje biomase algi

Nakon mesec dana gajenja mikroalgi na

rotacionoj mućkalici, dobijen je različit rast u

korišćenim podlogama (Slika 16).

Slika 14. Erlenmajeri sa različitim podlogama u kojima je gajena

mikroalga iz Roda Coccomyxa

23

Produkovana masa određivana je gravimetrijski i rezultati su prikazani u Tabeli 2.

Tabela 2. Produktiovnost biomase algi u različitim podlogama

Produktivnost

biomase

(g/L/d)

1 0,006

2 0,002

3 0,013

(1- podloga sa amonijum fericitratom, 2 – podloga sa natrijum nitratom, 3 – podloga sa amonijum fericitratom i

natrijum nitratom)

Najviše biomase produkovano je u podlozi koja je sadržala i amonijum fericitrat i

natrijum nitrat kao izvor azota. Nakon mesec dana gajenja mikroalgi u ovoj podlozi prinos

biomase je iznosio 0,013 g/L/d. U druge dve podloge biomasa je izrazito manja. Nasuprot

rezultatima spektrofotometrije prema kojim je biomasa u prvih 16 dana ispitivanja bila najveća u

podlozi koja sadrži samo amonijum fericitrat, nakon mesec dana gajenja, konačna biomasa bila

je najveća u podlozi koja sadrži i amonijum fericitrat i natrijum nitrat. Ova pojava se može

objasniti uticajem amonijuma na promenu pH vrednosti podloge. Usled korišćenja amonijuma

kao izvora azota od strane mikroalgi, dolazi do smanjenja pH vrednosti podloge koja zauzvrat

inhibira dalji rast mikroalgi.

Pretraživanjem literature pronađena su sledeća istraživanja mikroalgi iz roda Coccomyxa:

Ruiz-Dominguez i saradnici su ispitivali akumulaciju lipida kod vrste Coccomyxa sp. (soj

onubensis) – acidofilna mikroalga. Gajenjem mikroalge Coccomyxa sp. (soj onubensis) u podlozi

sa deficitom nutrijenata (azot, fosfor i sumpor) dobili su da je maksimalna količina masnih

kiselina iznosila 13% suve biomase i 50% ukupne lipidne frakcije (Ruiz-Dominguez et al.,

2014). Rezultati njhovih istraživanja su pokazali da nedostatak azota, fosfora i sumpora u

podlogama, favorizuju na kraće staze biosintezu lipida.

24

Massan i saradnici ispitivali su promene u metaboličkoj i genskoj ekspresiji izazvane

nedostatkom azota kod vrste Coccomyxa sp. C-169. Zapazili su smanjenje u količini hlorofila i

proteina. Smatraju da azotom bogata jedinjenja kao što su proteini predstavljaju izvor

ugljenika/energije za biosintezu triacilglicerola (TAG) u ćelijama lišenim nutrijenata.

Coccomyxa sp. C-169 je predstavnik koji je adaptiran na ekstremne uslove Antarktika (Holm-

Hasen, 1964). Ćelije Coccomyxa sp. C-169 lišene azota pokazale su povećanje u sintezi lipida, i

do 80% na kraju ispitivanog perioda (Msanne et al., 2012). Na podlozi bogatoj nutrijentima

dominirale su polinezasićene masne kiseline, dok je uklanjanjem azota iz podloge ta pozicija

pripala monozasićenim masnim kiselinama, u prvom redu oleinskoj kiselini.

Vrste Coccomyxa koje ulaze u simbiotske odnose sa gljivama su takođe sposobne da

akumuliraju triacilglicerole, ali sredinski uslovi koji utiču na metabolizam lipida nisu još uvek

dobro proučeni (Guschina et al., 2003).

Allen i saradnici ispitivali su sintezu triacilglicerola u stresnim situacijama izazvanim

nedostatkom azota kod mikroalge Coccomyxa subellipsoidea C-169. Ova vrsta akumulirala je

lipidne kapljice tokom deset dana ispitivanja pod uslovima nedostatka azota. Količina

triacilglicerola iznosila je 75% lipida. Dodavanje nitrata 10-og dana dovelo je do smanjenja u

količini lipidnih kapljica.

J. Veličković je vršila ispitivanja u istim uslovima opisanim u ovom radu, ali sa

mikroalgom iz roda Closterium (Veličković, 2016). Dobila je slične rezultate: mikroalga iz roda

Closterium nakon 16 dana pokazala je dobar rast u podlozi samo sa amonijum fericitratom kao

izvorom azota, kao i u podlozi sa mešovitim izvorima azota (amonijum fericitrat i natrijum

nitrat), a najmanji rast u podlozi sa natrijum nitratom kao jedinim izvorom azota. Hemijska

ispitivanja podloge pokazala su da mikroalga koristi amonijum fericitrat kao izvor azota, a ne

koristi natrijum nitrat. Nakon 30 dana gravimetrijskom metodom određena je biomasa, i najveći

prinos je dobijen u podlozi sa mešovitim izvorom azota (amonijum fericitrat i natrijum nitrat).

Usled sličnih rezultata može se zaključiti da nezavisno od roda mikroalge, postoje određeni

metabolički putevi koji se ispoljavaju u istim uslovima.

Da bi se određeni produkti izdvojili iz mikroalgi neophodno je prvo dobiti veliku količinu

biomase što često može biti problem pri korišćenju u industriji. Rezultati ovog rada su pokazali

da je najveća produkcija biomase prisutna u podlozi sa amonijum fericitratom i natrijum

25

nitratom. Međutim druga istraživanja su pokazala da za nagomilavanje lipida u biomasi, koji su i

krajnji cilj gajenja mikroalgi, neophodno je ograničiti količnu azota i na taj način izazvati stres

kod ćelija mikroalgi i preusmeriti metaboličke puteve, na račun smanjenja deobe ćelija.

Kompromis koji bi mogao da se napravi i iskoristi u budućim istraživanjima može biti

kombinacija ovih istraživanja. Pronalazak odgovarajućeg izvora azota, dobijanje maksimalne

količine biomase, zatim izazivanje stresa smanjenjem količine azota u podlozi i nagomilavanje

lipida.

26

5. Zaključci

Na osnovu dobijenih rezultata mogu se izvesti sledeći zaključci:

1. Iz vodenog uzorka sa Bovanskoj jezera izolovane su mikroalge iz rodova Chlorella i

Coccomyxa, pri čemu je u daljem istraživanju praćen samo rast mikroalge iz roda

Coccomyxa,

2. Mikroalga iz roda Coccomyxa je pokazala dobar rast na podlozi sa amonijum

fericitratom, kao i na mešovitoj podlozi sa amonijum fericitratom i natrijum nitratom,

3. Hemijske analize podloga su pokazale da mikroalga u velikoj meri koristi amonijum

fericitrat kao izvor azota, a da ne koristi natrijum nitrat kao izvor azota,

4. Na kraju eksperimenta najveća količina biomase proizvedena je na mešovitoj podlozi sa

amonijum fericitratom i natrijum nitratom.

27

6. Literatura

Ahmad, A.L., Yasin N.H.M., Derek, C.J.C., Lim, J.K., 2011: Microalgae as a sustainable

energy source for biodiesel production: A review, Renew. Sustain. Energ. Rev. 15, 584–

593.

Allen, J. W., DiRusso, C. C., Black, P. N., 2015: "Triacylglycerol synthesis during

nitrogen stress involves the prokaryoticlipid synthesis pathway and acyl chain remodeling

in the microalgae Coccomyxa subellipsoidea". Algal Research 10 (2015), pp 110–120.

Becker, W., 1994: Microalgae: Biotechnology and Microbiology, Cambridge University

Press, Cambridge.

Blaženčić, J., 2000: Sistematika algi. – NNK Internacional, Beograd.

Borowitzka, M. A., Moheimani, N. R., 2013: Open pond culture systems. In: Borowitzka

MA, Moheimani NR (eds) Algae for Biofuels andEnergy. Springer, Dordrecht, pp 133–

152.

Brennan, L., Owende, P., 2010: Biofuels from microalgae – A review of technologies for

production, processing, and extractions of biofuels and co-products, Renew. Sustain.

Energ. Rev. 14, 557–577.

Chen, P. et al., 2009: Review of the biological and engineering aspects of algae to fuels

approach. - Int J Agric & Biol Eng 2, 4.

Danilović, B. R., Avramović, J. M., Ćirić, J. T., Savić, D. S., Veljković, V. B., 2013:

Proizvodnja biodizela iz ulja mikroalgi. – Savez hemijskih inženjera Srbije 68, 213-232.

Darienko, T., Gustavs, L., Eggert, A., Wolf, W., Pröschold, T., 2015: "Evaluating the

Species Boundaries of Green Microalgae (Coccomyxa, Trebouxiophyceae, Chlorophyta)

Using Integrative Taxonomy and DNA Barcoding with Further Implications for the

Species Identification in Environmental Samples". PLOS ONE. 10 (6): e0127838. doi:

10.1371/journal.pone.0127838. ISSN 1932-6203.

Geider, R. J., MacIntyre, H., Graziano, L. M., McKay R.M., 1998: Responses of the

photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and

phosphorus limitation. Eur JPhycol 33:315–332.

Guschina, I.A., Harwood, J. L., 2006: Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae.

Prog. LipidRes. 45, 160–186.

28

Holm-Hasen, O., 1964: Isolation and culture of terrestrial and fresh-water algae of

Antarctica. Phycologia4, 43–51.

Hu, Q., Sommerfeld, M., Jarvis, E., Ghirardi, M., Posewitz, M., Seibert, M., Darzins, A.,

2008: Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and

advances. Plant J. 54,621–639.

Khozin-Goldberg, I., Cohen, Z., 2011: Unraveling algal lipid metabolism: recent

advances in geneidentification. Biochimie 93, 91–100.

Lamers, P. P., Janssen, M., De Vosc, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H., 2012:

Carotenoid and fatty acidmetabolism in nitrogen-starved Dunaliellasalina, a unicellular

green microalga. J Biotechnol 162:21–27.

Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S., 2010: Microalgae for biodiesel production

and other applications: a review. Renew Sust Energ 14:217–232.

Mata, T., Martins, A., Caetano, N., 2010: Microalgae for biodieselproduction and other

applications: A review, Renew. Sustain. Energ. Rev. 14, 217–232.

Mihailov-Krstev, T., 2008: Praktikum iz algologije i mikologije. – Prirodno-matematički

fakultet, Niš.

Molina Grima, E., Belarbi, E.H., Acién Fernández, F.G., Robles Medina, A., Chisti, Y.,

2003: Recovery of microalgal biomass and metabolites: process options and economics,

Biotechnol. Adv. 20, 491–515.

Msanne, J., Xu, D., Konda, A. R., Casas-Mollano, J. A., Awada, T., Cahoon, E. B.,

Cerutti, H., 2012: "Metabolic and Gene Expression Changes Triggered by Nitrogen

Deprivation in the Photoautotrophically Grown Microalgae Chlamydomonas reinhardtii

and Coccomyxa sp. C-169". Phytochemistry 75, pp. 50–59.

Phadwal, K., Singh, P. K., 2003: Effect of nutrient depletion on β-carotene and glycerol

accumulation in two strains of Dunaliella sp. Bioresource Technol 90:55–58.

Ruiz-Dominguez, M. C., Vaquero, I., Obregon, V., de la Morena, B. A., Vilchez, C.,

Vega, J. M., 2015: Lipid accumulation and antioxidant activity in the eukaryotic

acidophilic microalga Coccomyxa sp. (strain onubensis) under nutrient starvation.

Journal of Applied Phycology 27(3):1099-1108.

Veličković, J., 2016: Zavisnost produkcije biomase mikroalge izolovane iz Vlasinskog

jezera od izvora azota u podlozi. – Prirodno-matematički fakultet, Niš.

29

Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M., 2010: Microalgae for the production of

bulk chemicals and biofuels. Biofuels BioprodBiores 4:287–295.

Slike su preuzete sa sledećih linkova:

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB3/PCD2939/D/22.jpg

http://dbmuseblade.colorado.edu/DiatomTwo/sbsac_site/images/Nostoc_sp2/Nostoc_sp2

2_big.jpg

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Prokaryotes/Nostocaceae/Anabaena/Anabaena7c.j

jp

http://dbmuseblade.colorado.edu/DiatomTwo/sbsac_site/images/Rivularia_biasolettiana/

Rivularia_biasolettiana1_big.jpg

http://dbmuseblade.colorado.edu/DiatomTwo/sbsac_site/images/Gloeotrichia_longiarticu

lata/Gloeotrichia_longiarticulata1_big.jpg

https://naturaevision.files.wordpress.com/2016/09/oscillatoria.jpg?w=512&h=312&crop=

1

http://cfb.unh.edu/phycokey/Choices/Rhodophyceae/Microreds/BANGIA/Bangia_03_60

0x450_atropurpurea.jpg

http://www.seaweed.ie/_images/Porleu2.jpg

http://cfb.unh.edu/phycokey/Choices/Rhodophyceae/Microreds/BATRACHOSPERMU

M/Batrachospermum_15_600x418_protist.i.hosei.ac.jp.jpg

https://static.inaturalist.org/photos/1042699/large.jpg?1407733761

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/eb/Gelidium_sp.jpg

http://cfb.unh.edu/phycokey/Choices/Rhodophyceae/Crustreds/LITHOTHAMNION/Lith

othamnion_03_500x374.jpg

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/mastigophora/cryptomonas/ovata/sp_03.jpg

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Heterokontophyta/Vacuolaria/sp_07.jpg

30

https://www.landcareresearch.co.nz/__data/assets/image/0020/62381/gymnodinium_phil

1000.jpg

http://protist.i.hosei.ac.jp/pdb/images/Mastigophora/Peridinium/sp_01.jpg

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB6/PCD0014/D/70.jpg

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Heterokontophyta/Tribonema/sp_03.jpg

http://fmp.conncoll.edu/Silicasecchidisk/Pics/Other%20Algae/Other_jpegs/Botridium_K

ey272.jpg

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7b/Vaucheria_sp_sexial_reproductiv

e_organ01.jpg

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Heterokontophyta/Chromulina/sp_12.jpg

http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/imagsmall/Dinobryonb.jpg

http://www.penard.de/Explorer/Stramenopiles/Chrysophyceae/files/stacks-image-

7360797.jpg

http://www.nhm.ac.uk/content/dam/nhmwww/our-science/Data/algaevision/hydrurus-

algae-hero-mobile.jpg

http://cfb.unh.edu/phycokey/Choices/Phaeothamniophyceae/PHAEOTHAMNION/Phaeo

thamnion_02_300x401_confervicola.jpg

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Heterokontophyta/Centrales/Melosira/varians/sp_

07.jpg

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Heterokontophyta/Araphidineae/Asterionella/sp_0

7.html

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Heterokontophyta/Araphidineae/Tabellaria/sp_09.

html

https://naturalhistory.museumwales.ac.uk/diatoms/browsespecies.php?-recid=3729

31

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Heterokontophyta/Raphidineae/Navicula/sp_06.ht

ml

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Heterokontophyta/Raphidineae/Cymbella/sp_03/s

p_7b3.html

http://www.seaweed.ie/descriptions/Dictyota_dichotoma.php

http://www.irishseaweeds.com/kelp-laminaria-digitata/

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f8/Sanc0063_-_Flickr_-

_NOAA_Photo_Library.jpg

http://www.wikiwand.com/en/Fucus_serratus

https://www.uniprot.org/taxonomy/3040

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Mastigophora/Phacus/index.html

http://protist.i.hosei.ac.jp/pdb/images/mastigophora/Trachelomonas/hispida/sp_1c6.html

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Chlamydomonas/Pleiochloris/pyreno

idosa_1.html

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Volvox/index.html

http://cfb.unh.edu/phycokey/Choices/Chlorophyceae/colonies/colonies_not_flagellated/H

YDRODICTYON/Hydrodictyon_Image_page.htm

http://biodidac.bio.uottawa.ca/thumbnails/filedet.htm/File_name/brie024p/File_type/jpg

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Ulothrix/zonata_3.html

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Oedogonium/sp_1d.html

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Spirogyra/group_C/porticalis/sp_03.

html

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Zygnema/sp_04.html

https://microscopesandmonsters.files.wordpress.com/2016/02/stonewort-chara-hisp-

macro_.jpg

32

https://en.wikipedia.org/wiki/Nitella#/media/File:Nitella_mucronata.jpeg

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

33

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: Мастер рад

Аутор, АУ: Мирољуб Ђурђановић

Ментор, МН: Наташа Јоковић

Наслов рада, НР: ПРОИЗВОДЊА БИОМАСЕ МИКРОАЛГЕ ИЗ РОДА COCCOMYXA У

ЗАВИСНОСТИ ОД ИЗВОРА АЗОТА У ПОДЛОЗИ

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2018.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

6 поглавља, 42 стране; 16 слика, 2 табеле

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Алгологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО:

УДК 662.63/.641: 561.26/.27+ 631.45:546.17

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН: уколико је рад рађен ван факултета (у лабораторији) Извод, ИЗ: Микроалге имају широку примену у биотехнологији. Последњих година актуелно је добијање

велике количине биомасе алги која се може искористити у различитим биотехнолошким процесима. Како коришћење микроалги у биотехнологији зависи од изолованог соја алги, различите природне средине представљају потенцијалне резервоаре сојева алги који се могу искористити у различитим биотехнолошким процесима. Циљ овог мастер рада био је изолација микроалги из Бованксог језера. Затим је рађена оптимизација раста изолованог соја у зависности од извора азота који је додаван у подлогу. Раст је праћен спектрофотометријски, док је продукована биомаса одређена гравиметријском методом. У овом раду изолована су два изолата микроалги из Бованског језера, која су идентификована као врсте из родова Chlorella и Coccomyxa. Даља испитивања вршена су на микроалгама из рода Coccomyxa. Микроалга из рода Coccomyxa показала је добар раст на подлози са амонијум ферицитратом, као и на подлози са мешавином амонијум ферицитрата и натријум нитрата. Хемијске анализе подлоге су показале да микроалга користи амонијум ферицитрат као извор азота, а да не користи натријум нитрат као извор азота. Гравиметријском методом одређено је да је након месец дана гајења највећи принос биомасе микроалге био у подлози са мешовитим извором азота, амонијум ферицитратом и натријум нитратом.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан:

Члан, ментор:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORD DOCUMENTATION

34

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Miroljub Đurđanović

Mentor, MN: Nataša Joković

Title, TI: Microalgae biomass production from the genus Coccomyxa

depending on the nitrogen source in media

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2018

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD:

(chapters/pages/ref./tables/pictures/gra

phs/appendixes)

6 chapters, 42 pages; 16 pictures, 2 tables

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Algology

Subject/Key words, S/KW:

UC 662.63/.641: 561.26/.27+ 631.45:546.17

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: Microalgae have a wide variety of uses in biotechnology. Generating massive algal biomass that can be used in different biotechnological processes has been very popular in the last few years. Considering that the use of microalgae in biotechnology depends on the specific algal strain, different natural environments can be used as potential reservoirs of algal strains for biotechnological use. The purpose of this master thesis was to isolate microalgae from the Bovan lake and identify isolates to the level of the genus. After that, the growth optimization of the isolated strain depending on the nitrogen source in the medium was done. The growth was observed using spectrophotometry, while the gravimetric analysis was used to assess the produced biomass. The concentration of nitrogen in the media was analyzed suing the spectrophotometric method. In this thesis two genus of algae were isolated form the Bovan lake, which were identified as Chlorella and Coccomyxa. Further experiments were done with the microalgae from the genus Coccomyxa. Microalgae from the genus Coccomyxa have shown good growth on the medium with ammonium fericitrate as well as on the medium with a mix of ammonium fericitrate and sodium nitrate. Chemical analysis of the medium has shown that the microalgae use ammonium fericitrate as the source of nitrogen, while they don’t use sodium nitrate as the source of nitrogen. Gravimetric analysis after a moth of cultivation has shown that the biggest biomass growth happened on the media with mixed sources of nitrogen, ammonium fericitrate and sodium nitrate.

Accepted by the Scientific Board on,

ASB:

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member,

Mentor:

Образац Q4.09.13 - Издање 1