promjena histološke građe jetre štakora izazvana prehranom

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

STOMATOLOŠKI FAKULTET

Iva Marolt Banek

PROMJENA HISTOLOŠKE GRAĐE JETRE

ŠTAKORA IZAZVANA PREHRANOM

DIPLOMSKI RAD

Zagreb, rujna 2011.

Iva Marolt Banek, diplomski rad ,

Rad je ostvaren u:

1. Zavodu za fiziologiju Stomatološkog fakulteta, Sveučilište u Zagrebu

(eksperimentalni dio, prof. dr. sc. Jagoda Roša)

2. Zavodu za Histologiju i embriologiju Medicinskog fakulteta,

Sveučilište u Zagrebu

(histološki dio, prof. dr. sc. Ljerka Banek)

Voditelj rada:

Prof. dr.sc. Ljerka Banek

Zavod za histologiju i embriologiju

Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

Lektor hrvatskog jezika: Anja Hohnjec, prof. hrvatskog jezika

Lektor engleskog jezika: Ivan Sertić, prof. engleskog jezika

Rad sadrži: 30 stranica

7 slika

1 CD


Zahvaljujem prof. dr. sc. Jagodi Roši, koja mi je omogućila rad na ovoj temi i pod

čijim je vodstvom načinjen cjelokupni eksperimentalni dio rada

Također, zahvaljujem prof. dr. sc. Ljerki Banek, na pomoći kod izrade histološkog

dijela istraživanja i vodstvu pri pisanju i oblikovanju diplomskog rada

Preliminarni rezultati ovog rada prikazani su na 2. hrvatskom mikroskopijskom

kongresu s međunarodnim sudjelovanjem, Topusko, 2006.


SADRŽAJ

1. UVOD ................................................................................................... 1

1.1. Jetra - središnji metabolički organ .................................................................... 2

1.2. Sudjelovanje hepatocita u metabolizmu glukoze, masti i aminokiselina ......... 5

1.3. Masno tkivo sadrži najkoncentriraniji oblik pohranjene energije .................... 8

1.4. Debljina i pretilost – prijetnje zdravlju sadašnjih i budućih generacija ........... 8

1.5. Masna bolest jetre i prehrana ............................................................................ 9

2. CILJ I SVRHA RADA ....................................................................... 11

3. MATERIJALI I POSTUPCI ............................................................... 12

3.1 Pokus .............................................................................................................. 12

3.2. Svjetlosna i elektronska mikroskopija ............................................................ 12

4. REZULTATI ....................................................................................... 14

5. RASPRAVA ....................................................................................... 18

6. ZAKLJUČAK ..................................................................................... 25

7. SAŽETAK ........................................................................................... 26

8. SUMMARY ........................................................................................ 27

9. LITERATURA .................................................................................... 28

10. ŽIVOTOPIS ...................................................................................... 30


POPIS OZNAKA I KRATICA

DAG (engl. diacylglycerol) – diacilglicerol

GLUT-2 (engl. glucose transporter protein 2) – protein za prijenos glukoze 2

GLUT-4 (engl. glucose transporter protein 4) – protein za prijenos glukoze 4

HDL (engl. high-density lipoprotein) – lipoprotein velike gustoće

IRS-2 (engl. insulin receptor substrate 2) – substrat inzulinskih receptora 2

LDL (engl. low-density lipoprotein) – lipoprotein male gustoće

NAFLD (engl. nonalcoholic fatty liver disease) – nealkoholna masna bolest jetre

NASH (engl. nonalcoholic steatohepatitis) – nealkoholni steatohepatitis

PKCε – protein kinaza Cε

PUFA (engl. poliunsaturated fatty acid) – polinezasićena masna kiselina

TNF-α (engl. tumor necrosis factor alfa) – faktor tumorske nekroze alfa

VLDL- (engl. very-low-density lipoprotein) – lipoprotein vrlo male gustoće


1

1. UVOD

Jetra je glavni metabolički organ u tijelu. Hranjivi sastojci, koji se apsorbiraju u

crijevu ulaze putem krvi u jetru i tu se obrađuju i pohranjuju za uporabu u cijelom

organizmu. Zato jetrene stanice, hepatociti imaju ključnu ulogu u metabolizmu

glukoze, masti i aminokiselina. Također, sintetiziraju brojne bjelančevine kao i

lipoproteine važne za metabolizam i prijenos masti u krv.

Zbog razvoja tehnologije posljednjih desetljeća znatno se promijenio životni stil pa

su ljudi mnogo manje fizički aktivni. Također, zbog velikog napretka u proizvodnji i

preradi hrane glad je gotovo nestala u razvijenim zemljama svijeta. Danas je

relativno širokom sloju populacije dostupno obilje raznovrsne hrane. Međutim, zbog

obilne, a osobito masne prehrane uz relativno smanjenu fizičku aktivnost vrlo lako

dolazi do nekontrolirane i neželjene debljine pa i pretilosti u svim dobnim

skupinama.

Debljina, a osobito pretilost osobe može biti praćena brojnim, dodatnim

zdravstvenim problemima. Kako je jetra središnji metabolički organ za preradu i

pohranu hranjivih sastojaka to će kod prevelikog unosa hrane i pojave pretilosti često

doći i do prevelikog i patološkog nakupljanja masti i u samoj jetri. Ukoliko se

preveliki unos hrane i nepravilna prehrana nastavi i dalje, doći se do poremećaja

cjelokupnog metabolizma tijela. To često izaziva bolest različitih organa, a

nakupljanje masti u jetri, uz djelovanje nekih drugih nepovoljnih čimbenika, može

konačno dovesti do ciroze jetre i čak biti uzrok smrti osobe.


2

1.1. Jetra - središnji metabolički organ

Jetra je najveća žlijezda pridružena probavnoj cijevi. Glavni je metabolički organ

tijela pa ima strateški položaj u krvotoku. Većina krvi (oko 80 %), ulazi u jetru

putem v. porte. Ova venska krv sadrži hranjive sastojke apsorbirane u crijevu.

Također, sadrži i krv iz gušterače i slezene [1].

(Ostatak od oko 20 % krvi, koja je bogata kisikom ulazi u jetru iz jetrene arterije).

U jetri, venska krv bogata hranjivim sastojcima najprije prolazi kroz interlobarne

vene, a zatim putem interlobularnih vena dolazi na periferiju jetrenih režnjića [1].

Režnjići (sl. 1), su osnovna građevna jedinica jetre. Čine ih tračci ili ploče jetrenih

stanica ili hepatocita, koje teku radijalno od periferije prema središtu režnjića, a

između njih nalaze se sinusoidne kapilare. Na periferiji režnjića, krv se iz

interlobularne vene (bogata hranjivim sastojcima iz portalne vene) ulijeva u

sinusoidne, vijugave kapilare, koje teku između tračaka (ploča) hepatocita i konačno

se ulijevaju u središnju venu (centrolobularnu venu ili v. centralis). Sva krv

sinusoidnih kapilara, (nakon što su hepatociti metabolizirali sastojke hrane zajedno s

tvarima koje su izlučili), konačno se ulijeva se u središnju venu svakog režnjića.

Napuštajući režnjić, središnja vena režnjića ulijeva se u veću prijelaznu

(sublobularnu) venu. Prijelazne vene se spajaju u više jetrenih vena. Na kraju, jetrene

vene ulijevaju se u donju šuplju venu.


3

Slika 1. Jetreni režnjić. Krv iz interlobularne vene (V) i arterije (A) ulijeva se u sinusoidne

kapilare (S) obložene fenestriranim endotelnim stanicama. Ploče hepatocita (H). Disseov

prostor (*). Modificirano prema : Weiss L, Greep RO. Histology. 4th ed. New York:

McGraw-Hill;1977. [2]

Osnovni građevni sastojak jetre je hepatocit. Jezgra mu je okrugla s dvije ili više

jezgrica. Citoplazma ovih stanica sadrži brojne mitohondrije (oko 2000 po stanici)

kao i Golgijeve komplekse (do pedeset po stanici, [1]). U citoplazmi se nalazi i

obilna hrapava i glatka endoplazmatska mrežica te lizosomi i peroksisomi.

Peroksisomi kao i lizosomi sadrže enzime. Enzimi peroksisoma sudjeluju u

oksidaciji suvišnih masnih kiselina, razgradnji vodikova peroksida i purina.

Hepatociti su vjerojatno najsvestranije stanice u tijelu. U njima se zbivaju brojni

komplicirani kemijski procesi kao glukoneogeneza te neutralizacija (detoksikacija)

otrovnih odnosno štetnih spojeva (alkohola, lijekova i dr.). Imaju i endokrinu

V

A

S

H

*


4

funkciju (izlučivanje lipoproteina i bjelančevina krvne plazme direktno u krv).

Između susjednih hepatocita nalaze se i žučne kapilare, u koje ove stanice izlučuju

žuč (egzokrina sekrecija jetre). Također, hepatociti imaju važnu ulogu u

metabolizmu glukoze, koju prerađuju u pričuvni glikogen, koji se u obliku

elektronski gustih zrnaca nalazi uz glatku endoplazmatsku mrežicu (sl. 2)

Slika 2. Ploča hepatocita između dviju sinusoidnih kapilara. Fenestrirane endotelne stanice.

Disseov prostor. Itova stanca. Kupfferova stanica. hEM (hrapava endoplazmatska mrežica s

ribosomima).gEM (glatka endoplazmatska mrežica). Preuzeto iz: Ross MH, Pawlina W.

Histology: a text and atlas. 5th ed. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins; 2005. [3]

Sinusoidne kapilare jetre građene su od isprekidanog sloja fenestriranih endotelnih

stanica s brojnim sitnim otvorima. U lumenu sinusoidnih kapilara nalaze se

makrofazi koji se nazivaju Kupfferove stanice. Između endotelnih stanica krvnih


5

kapilara i hepatocita je subendotelni, perisinusoidalni ili Disseov prostor, u koji strše

mikrovili hepatocita. Krv teče polagano, kroz nepravilno proširene sinusoidne

kapilare, od periferije režnjića do središnje vene. Pri tome se krvna plazma iz

kapilara cijedi kroz otvore endotelnih stanica u Disseov prostor, oplakuje površinu

hepatocita i vraća se natrag u kapilare. Na taj način hranjive tvari iz krvi u obliku

glukoze, masti i aminokiselina dolaze direktno do hepatocita i tu se apsorbiraju i

prerađuju.

U Disseovom, perisinusoidalnom prostoru jetre, koji se nalazi oko sinusoidnih

kapilara, smještene su zvjezdolike Itove stanice. One u zdravih ljudi primaju i

pohranjuju A vitamin te izlučuju tek oskudnu mrežicu kolagenih vlakana (kolagen

tipa III), koja služi kao potpora hepatocitima. Pod utjecajem patoloških čimbenika

ove stanice se pretvaraju u miofibroblaste i imaju glavnu ulogu u nastanku ciroze

jetre (sl. 2).

1.2. Sudjelovanje hepatocita u metabolizmu glukoze, masti i

aminokiselina

Kod normalne jetre u citoplazmi hepatocita nalazi se i mali broj sitnih masnih

kapljica koje nisu omeđene membranom. Uz njih mogu biti prislonjeni mitohondriji.

Također, hepatociti sintetiziraju lipoproteine, važne za metabolizam i prijenos masti

te ih oslobađaju u krv. Od lipoproteina jetre najvažniji je lipoprotein vrlo male

gustoće (engl. very low density lipoprotein, VLDL). Ovaj lipoprotein sadrži jetrene

trigliceride nastale esterifikacijom apsorbiranih masnih kiselina iz portalne krvi, na

glatkoj endoplazmatskoj mrežici hepatocita (sl. 3). VLDL lipoproteini obloženi su s

različitim apolipoproteinima sintetiziranim na hrapavoj endoplazmatskoj mrežici


6

hepatocita. Funkcija lipoproteina male gustoće jest da prenose većinu jetrenih

triglicerida u druge organe, a prije svega u masne stanice ili adipocite.

Slika 3. Hepatocit. Sinteza lipoproteina. Esterifikacija masnih kiselina u glatkoj

endoplazmatskoj mrežici. Hrapava endoplazmatska mrežica. Modificirano prema: Bloom W,

Fawcett DW. A Textbook of histology, 10th ed. Philadelphia: Saunders; 1975. [4]

U adipocitima pohranjuje se također u obliku triglicerida i mast iz hrane, koju

prenose najveći lipoproteini krvne plazme, hilomikroni. Oni nastaju isključivo u

tankom crijevu u apsorpcijskim stanicama i to od apsorbiranih masnih kiselina duga

lanca. Hilomikroni ulaze najprije u limfu, a zatim u krv. Zanimljivo je da masne

kiseline kratkog i srednjeg lanca, odmah nakon apsorpcije, zaobilazeći

reesterifikaciju na glatkoj endoplazmatskoj mrežici apsorpcijskih stanica crijeva,

odlaze direktno u krv pa putuju do jetre gdje se dalje prerađuju.


7

Postoje još i lipoproteini: LDL i HDL. Oni su također vezani uz jetru. LDL prenosi

estere kolesterola iz jetre u periferne organe. HDL nosi kolesterol iz perifernih tkiva

u jetru. (Povećan rizik nastanka kardiovaskularnih bolesti je u direktnoj vezi s

povišenim razinama LDL-a u krvnoj plazmi.)

Glukoza ulazi i u hepatocite i β stanice Langerhansovih otočića gušterače, pomoću

transportnog proteina za prijenos glukoze 2 (engl. glucose transporter protein 2,

GLUT-2) na membrani ovih stanica. Ovaj prijenosni protein (GLUT-2) neovisan je o

inzulinu. Zato će kad se povisi razina glukoze u krvi, ona ulaziti kako u hepatocite,

tako i u β stanice gušterače. Visoka razina glukoze u krvi stimulira β stanice

Langerhansovih otočića gušterače na izlučivanje hormona inzulina. Kod povišene

razine glukoze u krvi, inzulin omogućuje povećanje prijenosa glukoze iz krvi u

masne stanice (adipocite) te u skeletni i srčani mišić. Međutim, prijenosna

bjelančevina na površini membrane adipocita i mišićnih stanica ovisna je o inzulinu i

naziva se protein za prijenos glukoze 4 (eng. glucose transporter protein 4, GLUT-

4). Dakle, normalna funkcija hepatocita, adipocita i mišićnih stanica ovisna je o

glukozi i inzulinu. Inzulin omogućuje ulazak glukoze i aminokiselina u stanice te

stvaranje glikogena u hepatocitima i mišićnim stanicama. Ovaj hormon također u

hepatocitima inhibira enzime za glukoneogenezu . Na hepatocite djeluje i glukagon,

hormon α stanica Langerhansovih otočića gušterače. Ovaj hormon izaziva djelovanje

suprotno inzulinu, dakle povisuje razinu glukoze u krvi. Hiperglikemija koju izaziva

glukagon nastaje upravo zbog razgradnje glikogena pohranjenog u hepatocitima

(glikogenoliza).


8

1.3. Masno tkivo sadrži najkoncentriraniji oblik pohranjene energije

Pored glikogena u hepatocitima i mišićnom tkivu, tijelo također skladišti energiju u

obliku masnih kapljica, koje sadrže adipociti. Veći broj masnih stanica čini masno

tkivo. Kod odraslih ljudi masno tkivo čine stanice, koje sadrže u citoplazmi samo

jednu masnu kapljicu, a zbog boje u živom stanju nazivaju se bijelo masno tkivo.

Masna kapljica adipocita sadrži trigliceride, koji su najkoncentriraniji pohranjeni

oblik metaboličke energije u ljudskom tijelu. Trigliceridi su međutim, dinamički

oblik pohrane energije. Stvaraju se uvijek kad je energija dobivena konzumiranom

hranom veća od energije, koju je tijelo potrošilo [3]. Također, trigliceridi se troše

kada je unos energije hranom manji od potrošene energije [3]. Ulazak glukoze u

adipocite te njenu pretvorbu u trigliceride omogućuje inzulin. Također, ovaj hormon

(inhibicijom enzima lipaze) smanjuje lipolizu i istjecanje slobodnih masnih kiselina

iz ovih stanica, što dovodi do pohranjivanja triglicerida u njima. Djelovanje hormona

glukagona na adipocite jest suprotno te izaziva lipolizu i dovodi do mobilizacije

rezervi triglicerida [5]. Novija istraživanja su pokazala da i neki drugi hormoni

također povećavaju ili smanjuju lipolizu u adipocitima [5]. Isto tako ustanovljeno je

da i masno tkivo izlučuje različite hormone, čimbenike rasta i citokine pa se sada

smatra i endokrinim organom [3].

1.4. Debljina i pretilost – prijetnje zdravlju sadašnjih i budućih

generacija

Masno tkivo je normalno prisutno u tijelu kao potkožno tkivo (lat. panniculus

adiposus ili hypodermis) te u unutrašnjosti tijela u omentumu, mezenteriju kao i

retroperitonealno oko bubrega. Međutim, zbog načina života, koji uključuje premalo


9

fizičke aktivnosti , a bogatu prehranu dostupnu širokom sloju pučanstva, količina

masnog tkiva osobe može se znatno povećati. Smatra se da već povećanje tjelesne

težine za oko 20 % (od prosječne težine za određenu populaciju), predstavlja

zdravstveni rizik [3]. Usprkos tome danas statistički podaci o tjelesnoj težini odraslih

osoba širom svijeta, pokazuju epidemijski porast debljine i pretilosti. Neželjeni

porast učestalosti debljine i pretilosti nalazi se u svim slojevima pučanstva ( pa čak i

kod djece) [3], [6], [7], [8]. Uzroci ovog porasta nisu još potpuno razumljivi, ali

analize pokazuju čak i vjerojatno daljnje povećanje ovog fenomena u budućnosti [7].

Opasnost za zdravlje kod debelih i pretilih osoba predstavlja znatno povećani rizik

pojave dijabetesa tipa 2 te kardiovaskularnih bolesti. Pojava ovih bolesti skraćuje

očekivano trajanje života [7]. Često se javlja metabolički sindrom praćen

poremećajem metabolizma glukoze i lipida (dislipidemija) te povišenim krvnim

tlakom (hipertenzija). Isto tako debljinu i pretilost te metabolički sindrom može

pratiti i nealkoholna masna bolest jetre (engl. non-alcoholic fatty liver disease,

NAFLD). Smatra se da je vjerojatni uzrok ovih poremećaja metabolizma rezistencija

na hormon inzulin koji ne može adekvatno regulirati metabolizam.

1.5. Masna bolest jetre i prehrana

NAFLD je danas najčešća bolest jetre. Većinom se javlja kod debelih, pretilih

odnosno starijih osoba i često je dio metaboličkog sindroma. Ključna morfološka

promjena jetre je obilno nakupljanje triglicerida u hepatocitima, koji su ispunjeni

jednom ili više masnih kapljica. Opsežno nakupljanje masti u hepatocitima (lat.

steatosis hepatis) može biti reverzibilno, dakle prolazno i benigno, čak i bez

kliničkih simptoma. Ipak, ove promjene hepatocita, osobito kod genetski


10

predisponiranih osoba, čine ove stanice osjetljivim na daljnja oštećenja pa mogu

izazvati i njihovo propadanje. Tada može doći do infiltracije jetre makrofazima, a

citokini pokreću upalne promjene. Tako nastaje stanje nealkoholnog steatohepatitisa

(engl. non-alcoholic steatohepatitis, NASH), koje konačno, zbog moguće aktivacije

Kupfferovih i Itovih stanica može napredovati do ciroze jetre i biti uzrok smrti.

Brojne studije pokazuju da je povećanje učestalosti pojave masne bolesti jetre

povezano s epidemijom debljine i pretilosti. Također, smatra se da je vrlo obilna,

masna i bogata prehrana uz sjedilački način života ljudi uzrok nastanka masne

bolesti jetre kao i pojave pretilosti.


11

2. CILJ I SVRHA RADA

Masna i obilna prehrana ljudi mogla bi biti uzrok nastanka masne bolesti jetre kao i

pojave pretilosti. Međutim, utjecaj pojedinih vrsta hrane pa tako i pojedinih vrsta

masti i ulja na patogenezu spomenutih poremećaja tek se istražuje. Zbog toga je

svrha ovog rada bila ispitati da li prehrana bogata suncokretovim uljem izaziva

promjenu u histološkoj građi jetre štakora i može li izazvati masnu promjenu jetre.


12

3. MATERIJALI I POSTUPCI

3.1 Pokus

U svim eksperimentima, korišteni su odrasli, muški štakori soja Wistar tjelesne mase

između 250-325g.

Štakori su bili smješteni pojedinačno, u žičane kaveze u prostoriji s kontroliranom

temperaturom od 21 ± 1 °C i 12-satnim ciklusom svjetlo-tama te slobodnim

pristupom hrani i vodi.

Eksperimentalna skupina obuhvatila je 5 životinja na visoko masnoj dijeti. Ovi

štakori hranjeni su prehranom s visokim udjelom masti. Hrana s visokim udjelom

masnoća, bila je pripremljena dodavanjem 30 % suncokretovog ulja standardnoj

hrani. Nakon toga hrana s visokim udjelom masnoća, sadržavala je prema udjelu

energije 30 % ugljikohidrata, 16 % bjelančevina i 54 % masti.

Kontrolna skupina od 3 životinje hranjena je standardnom hranom, koja je prema

udjelu energije sadržavala 57 % ugljikohidrata, 32 % bjelančevina i 11 % masti.

Pokus je trajao tri tjedna.

Štakori su anestezirani fenobarbitolom (10 mg/100 g tjelesne težine) i izvađena im je

jetra. Primijenjeni su svi principi njege životinja (NIH br.85-23, revidirani 1996.g.).

3.2. Svjetlosna i elektronska mikroskopija

Dokazivanje lipida

Tkivo jetre izrezano je u blokove. Dio blokova stavljen je u kriotube i odmah

smrznut s tekućim dušikom. Tkivo je izrezano u kriostatu na rezove debele 10 μm.


13

Smrznuti rezovi obojeni su s hemalaun eozinom te Sudan III i IV (Kay i Whitehead,

1941, cit. [9], str. 696) kao i Oil Red O bojom (po Lillieu, 1944, cit. [9], str.697) , za

dokazivanje neutralnih masti.

Polutanki rezovi

Drugi dio jetrenog tkiva izrezan je u male blokove, ( s duljinom stranice od oko 0,5

mm). Ovi blokovi fiksirani su u mješavini 2,5 % glutaraldehida i 0,8 %

paraformaldehida u 0,1 M fosfatnom puferu. Nakon toga uzorci su postfiksirani u

1 % osmijevom tetroksidu, dehidrirani i uklopljeni u Durcopan. Tkivo je izrezano na

polutanke rezove debljine 1 µm i obojeno toludinskim modrilom.


14

4. REZULTATI

Jetra svih štakora hranjenih s prehranom, koja je sadržavala visoki udjel masnoća,

dobiven dodavanjem suncokretovog ulja njihovoj standardnoj hrani, sadržavala je

hepatocite krcate masnim kapljicama. Brojne masne kapljice u hepatocitima obojene

su sa Sudanom III i IV, kao i s Oil Red O (masne kapljice crveno-narančaste, jezgre

plave)(sl 4 i 5)

Slika 4. Jetra štakora na visoko masnoj dijeti. Steatoza u perivenskom području režnjića.

Sudan III i IV. Masne kapljice: crveno (600×)


15

Kod svih eksperimentalnih životinja, područja hepatocita s brojnim, nagomilanim

masnim kapljicama u citoplazmi, nalazila su se u perivenskom području jetrenih

režnjića oko v. centralis (fokalna steatoza). Međutim, svi hepatociti susjednih

režnjića, bili su također, potpuno ispunjeni masnim kapljicama (difuzna steatoza).

Slika 5. Jetra štakora na visoko masnoj dijeti. Oil Red O. Hepatociti sadrže brojne masne

kapljice. (600 ×)

Dakle, nakon tri tjedna konzumacije masne prehrane s povišenim udjelom masnoća,

zbog dodanog suncokretovog ulja, jetra eksperimentalne skupine štakora pokazivala

je miješanu fokalnu i difuznu steatozu. (sl. 4 i 5). Citoplazma hepatocita sadržavala

je veći broj masnih kapljica. Neke od njih dijelom su potiskivale jezgru.


16

Za razliku od toga, hepatociti jetre kontrolne skupine štakora, koji su hranjeni

standardnom hranom, sadržavali su tek vrlo sitne, diskretne kapljice lipida (sl. 6).

Slika 6. Jetra štakora. Kontrolna skupina. Oil Red O. Hepatociti sadrže diskretne, sitne

lipidne kapljice. (600 ×).

Na polutankim rezovima, citoplazma hepatocita štakora na visoko masnoj dijeti, sa

suncokretovim uljem, sadržavala je na polutankim rezovima veliki broj masnih

kapljica. Ove stanice, premda napuhnute, zbog brojnih kapljica sačuvale su svoju

građu. Lumen sinusoidnih kapilara bio je sužen (sl. 7).


17

Kod kontrolne skupine štakora, tek je poneki hepatocit u citoplazmi sadržavao

rijetke masne kapljice.

Slika 7. Jetra štakora na prehrani s visokim udjelom masti (suncokretovo ulje). Steatoza.

Toluidin blue. (600 ×)


18

5. RASPRAVA

Rezultati ovog istraživanja jasno pokazuju pojavu masne jetre (lat. steatosis hepatis),

kod štakora već nakon tri tjedna, neprekidnog konzumiranja hrane s visokim udjelom

masnoća (suncokretovo ulje). Rezultati ovog istraživanja direktno potvrđuju da

velika količina udjela masti u prehrani, može biti glavni uzrok nastanka steatoze

jetre. Naime, masne kiseline (osobito dugih lanaca) iz prehrane dolaze do hepatocita

putem najvećih lipoproteina plazme hilomikrona [10]. Hilomikrone sintetiziraju

apsorpcijske stanice tankog crijeva [3][10]. Pored toga masne kiseline srednjih i

kratkih lanaca iz masne hrane, nakon apsorpcije u stanicama tankog crijeva,

oslobađaju se direktno u krv, gdje se vežu na albumine plazme, pa ih hepatociti,

kada stignu do jetre, također mogu direktno upijati [10]. Sve masne kiseline pristigle

putem krvi do jetre će se reesterificirati na glatkoj endoplazmatskoj mrežici

hepatocita i zatim, u obliku brojnih masnih kapljica koje sadrže trigliceride,

nakupljati u citoplazmi ovih stanica [11]. Steatozu jetre štakora kao direktnu

posljedicu konzumiranja prehrane s povećanim udjelom masti, u obliku biljnih ulja,

dobili su i drugi autori [12]. Iako suncokretovo ulje, ali i neka druga biljna ulja

spadaju u polinezasićene masne kiseline (PUFA), u navedenom istraživanju nije

pobliže označena vrsta ispitivanog biljnog ulja [12].

Također, spomenuti autori opisali su i steatozu jetre štakora, koja je nastala kao

direktna posljedica prehrane s visokim udjelom ugljikohidrata. Naime veliki dio

glukoze, koja se apsorbira iz tankog crijeva, hepatociti odmah upijaju i pretvaraju u

glikogen [11]. Međutim, čim se jetra zasiti glikogenom, a to je već kada on čini oko

5 % mase jetre, sva se dodatna glukoza usmjeruje u metabolički put, koji vodi do


19

sinteze masnih kiselina [11]. Masne kiseline će zatim u hepatocitu biti esterificirane

u trigliceride. Velika količina tako stvorenih triglicerida će se, dakle, kao direktna

posljedica preobilne i prebogate prehrane ugljikohidratima (uz adekvatnu količinu

bjelančevina, i masti), taložiti u obliku velikog broja masnih kapljica u ovim

stanicama [11].

U ljudskom tijelu, normalno samo adipociti imaju sposobnost nagomilavanja viška

masnih kiselina, u obliku triglicerida u svojoj citoplazmi. Kod hepatocita povećano

nagomilavanje lipida može izazvati poremećaj funkcije ovih stanica kao što je

rezistencija na inzulin. Također, nagomilavanje masti u hepatocitima može dovesti i

do smrti stanica. Taj fenomen naziva se lipotoksičnost i povezuje se sa štetnim

djelovanjem zasićenih masti na hepatocite [11]. Istraživanja su pokazala da je

prehrana s visokim udjelom zasićenih masnoća, a sadržavala je životinjsku mast,

također izazvala steatozu jetre [12]. Međutim, steatoza izazvana obiljem zasićenih

masti u dijeti dovela je do izrazitog oštećenja jetre s naglašenim stresom

endoplazmatske mrežice, povišenom razinom aktivnosti kaspaze i apoptozom

hepatocita [12]. Ova istraživanja, dakle, pokazuju da je sastav masnih kiselina koje

izazivaju steatozu jetre bitan čimbenik koji određuje da li će doći do ozljede jetre

[12]. Nadalje, štetno djelovanje zasićenih masnih kiselina iz hrane direktno je

izazvalo oštećenje hepatocita i povećanje učestalosti njihove apoptoze. Zanimljivo je

da su se ova štetna djelovanja odvijala neovisno od pojave debljine, razina leptina,

TNF-α i funkcije mitohondrija ) [12].

Rezultati različitih istraživanja pokazuju da je apoptoza hepatocita glavni mehanizam

koji dovodi do fibrogeneze i ciroze jetre [13]. Apoptotička tjelešca nastala nakon


20

apoptoze hepatocita, fagocitiraju susjedne zvjezdolike Itove stanice, koje su još tada

u mirnom stanju [13]. Međutim, upravo ova fagocitoza apoptotičnih hepatocita

dovodi do aktivacije mirnih Itovih stanica u miofibroblaste. Navedena aktivacija

mijenja fenotip i funkciju ovih stanica. Aktivirane Itove stanice izlučuju sada

kolagen tipa I. Kolagen tipa I je glavna vrsta kolagena koja se nagomilava kod ciroze

jetre [13].

U našem istraživanju steatoze jetre štakora, nastale nakon tri tjedna konzumacije

prehrane s visokim udjelom masnoća podrijetlom iz suncokretovog ulja, nismo našli

oštećenje hepatocita niti njihovu apoptozu. To govori da je u ovom eksperimentu

nagomilavanje masti u jetri životinja vjerojatno još reverzibilan proces i da nije

došlo do oštećenja hepatocita.

Pored ovog direktnog djelovanja bogate prehrane s povećanim udjelom masti, tako

da se, dakle, lipidi iz hrane nagomilavaju u hepatocitima kao trigliceridne kapljice,

postoji dokazano i indirektno djelovanje masne prehrane na jetru, ali isto tako i na

masne stanice, adipocite te mišiće i to preko razvoja stanja rezistencije na inzulin [8],

[11], [14], [15].

Naime, inzulin normalno inhibira lipolizu u masnom tkivu sprečavajući tako

oslobađanje masnih kiselina iz adipocita i tako „štedi tijelu mast“ [11]. Također,

inzulin smanjuje proizvodnju glukoze od strane jetre (smanjujući glukoneogenezu i

glikogenolizu u jetri). Nadalje, ovaj hormon povećava upijanje glukoze u skeletne

mišiće i masno tkivo [11]. Sva spomenuta djelovanja inzulin vrši putem svojih

receptora u navedenim ciljnim tkivima [5].


21

Kod prehrane s visokim udjelom masnoća dolazi do nagomilavanja viška metabolita

masti, kao što je diacilglicerol (engl. diacylglycerol, DAG) u hepatocitima i

mišićima [8], [11].

Preveliko nakupljanje diacilglicerola unutar ciljnih stanica za inzulin dovodi do

aktivacije nove, atipične protein kinaze Cε (protein kinaza C epsilon - PKCε). Tako

aktivirana protein kinaza Cε veže se za inzulinski receptor u njegovim ciljnim

stanicama i inhibira aktivnost tirozin kinaze receptora [11]. Također, misli se da

aktivirana protein kinaza Cε može interferirati sa sposobnošću inzulina da

fosforilira substrat inzulinskih receptora 2 (engl. insulin receptor substrate 2, IRS-2)

[11]. Na taj način, dakle, zbog inaktivacije inzulinskih receptora spriječeno je

djelovanje inzulina na njegove ciljne stanice, pa nastaje stanje koje se naziva

rezistencija na inzulin. Tada je onemogućeno širenje signala inzulina te izostaju i

njegova različita metabolička djelovanja. Dakle, usprkos normalnoj razini inzulina u

krvi, koji izlučuju β stanice Langerhansovih otočića, glukoza neće moći ulaziti u

svoje ciljne organe pa će se njezina razina u krvi povisiti i nastat će hiperglikemija i

dijabetes tipa 2.

Zanimljivo je da stanje rezistencije na inzulin, pored prehrane s visokim udjelom

masti, može isto tako izazvati i prehrana s visokim udjelom ugljikohidrata [11].

Naime, i tada će nakon stvorene zalihe glikogena jetra svu dodatnu glukozu iz hrane

usmjeravati u metabolički put za sintezu masnih kiselina. I tada može kao posljedica

preobilne prehrane i udjela ugljikohidrata, konačno doći do nakupljanja viška

metabolita masti i razvoja rezistencije na inzulin u njegovim ciljnim organima [11].


22

Pored direktnog djelovanja sastava prehrane na nagomilavanje masti u jetri, višak

kalorija i prehrana s visokim udjelom masti i ugljikohidrata može biti uzrok debljine

i pretilosti, stanja koje je također povezano s rezistencijom na inzulin [15]. Naime,

masne stanice pohranjuju lipide u obliku triglicerida. Kod debelih i pretilih ljudi, kod

kojih postoji rezistencija na inzulin, vrlo često dolazi do pojačanog otpuštanja

neesterificiranih masnih kiselina iz povećane mase perifernog masnog tkiva [11].

Ovo povećano otpuštanje neesterificiranih masnih kiselina iz adipocita posljedica je

njihove rezistencije na inzulin. Naime, inhibicija lipolize inzulinom u masnom tkivu,

zbog rezistencije adipocita na inzulin, izostaje [15]. Zato kod pretilih osoba često

dolazi do “prelijevanja masti“ iz njihovog masnog tkiva prema jetri. Ta „prelivena

mast“, podrijetlom iz adipocita, ugradit će se u jetru i izazvati opsežno

nagomilavanje triglicerida u hepatocitima [11].

I epidemiološka istraživanja su pokazala povezanost između debljine i pojave masne

jetre. Naime, učestalost nealkoholne masne bolesti jetre iznosila je u općoj populaciji

oko 20 %. Kod debelih ljudi ova se učestalost povećala se na 75 %, dok je kod

pretilih i bolesno debelih osoba iznosila gotovo 100 % [15]. Također, učestalost

nalaza masne jetre bila je povećana kod dijabetesa tipa 2 (50-75%) i metaboličkog

sindroma [15].

Kako se učestalost pojave debljine drastično povećala u SAD, Kini, Indiji i brojnim

drugim državama svijeta (pa i u našoj zemlji) [15], porastao je interes za

istraživanjem funkcija masnog tkiva i njegove uloge u spomenutim metaboličkim

poremećajima. Ustanovljeno je da masno tkivo predstavlja aktivni endokrini organ,

koji izlučuje brojne tvari. Sve ove tvari nazivaju se adipokini [16]. Među


23

najpoznatijima je čimbenik rasta TNF-α, koji interferira sa signaliziranjem

inzulinskih receptora i može izazvati rezistenciju na inzulin kod pretilosti [3].

Povišena razina TNF-α u plazmi, povezuje se sa stanjem kronične upale niskog

stupnja, koju nalazimo kod pretilih osoba i starijih dijabetičara [7]. Slična uloga

pripisuje se i interleukinu-6, čija je razina u krvi povišena kod pretilih osoba kao i u

stanju rezistencije na inzulin [16]. Nadalje tu spada i resistin za koji se smatra da

povezuje debljinu, dijabetes tipa 2 i proupalno stanje [3], [16]. Suprotno djelovanje

ima adiponektin, koji povećava osjetljivost ciljnih stanica na inzulin [3], [16].

Adipociti nadalje izlučuju: inhibitor aktivatora plazminogena, čija povišena razina u

krvi dovodi do stvaranja krvnih ugrušaka, kao i angiotenzinogen, koji nakon

pretvorbe u angiotenzin izaziva povišenje krvnog tlaka [3]. Sve ove nove spoznaje o

adipokinima dodatno objašnjavaju ulogu debljine i pretilosti u povećanju bolesti i

smrtnosti pojedinca i populacije.

U našem istraživanju, međutim, prehrana s visokim udjelom masti trajala je samo tri

tjedna, tako da kod naše eksperimentalne skupine štakora, nije došlo do značajnog

porasta debljine. To znači da je steatoza jetre u našem istraživanju, vjerojatno nastala

isključivo kao posljedica obilne masne prehrane, bez dodatnog djelovanja

prelijevanja lipida u jetru, iz adipocita. Međutim, nakon prehrane s visokim udjelom

masti podrijetlom iz suncokretovog ulja nađen je porast proizvodnje glukoze u

hepatocitima viši za 79 % u odnosu na kontrolu. Ovaj porast glukoze u kulturi,

posljedica je razvoja rezistencije na inzulin u hepatocitima, a izazvan je masnom

prehranom [14]. Zato možemo pretpostaviti da je steatoza jetre u našem istraživanju

također posljedica razvoja rezistencije na inzulin u hepatocitma i inaktivacije


24

inzulinskih receptora. Tada zbog nemogućnosti inzulina da inhibira glukoneogenezu

dolazi do porasta proizvodnje glukoze u hepatocitima.

Konačno, povišena razina glukoze u krvi (hiperglikemija) zajedno s povišenom

razinom inzulina (hiperinzulinemija) može dovesti do skretanja staničnog

metabolizma hepatocita, s lipidne oksidacije na esterifikaciju triglicerida [11]. Na taj

način nastaje de novo lipogeneza u hepatocitima. Ova de novo sinteza masnih

kiselina, zajedno s oštećenom β oksidacijom, može izazvati steatozu jetre [11].

Također, rezultati našeg istraživanja pokazali su dijelom fokalnu steatozu, kod koje

je obilno nakupljanje kapljica masti obuhvatilo prije svega hepatocite oko središnje

vene. Međutim, u susjednim jetrenim režnjićima štakora su svi hepatociti bili

zahvaćeni opsežnim nakupljanjem masti. To nam govori da kod jako izražene

steatoze jetre i tako poremećenog metabolizma hepatocit, nestaje bilo kakve razlike u

reagiranju hepatocita smještenih u različitim dijelovima jetrenih režnjića.


25

6. ZAKLJUČAK

1. Jetra štakora koji je hranjen prehranom s visokim udjelom masnoća (podrijetlom

iz suncokretovog ulja) histološki je promijenjena.

2. Nakon 3 tjedna trajanja pokusa (tj. prehrane bogate suncokretovim uljem) na

histološkim preparatima nalazimo miješanu fokalnu i difuznu steatozu.

3. Citoplazma hepatocita sadržavala je veliki broj masnih kapljica (lat. steatosis

hepatis).

4. Navedene promjene hepatocita ukazuju na promjenu metabolizma u hepatocitima

uzrokovanu povećanim unosom suncokretovog ulja.


26

7. SAŽETAK

Preobilna i masna prehrana izaziva epidemiju debljine, ali i masnu bolest jetre. Do

sada nije jasno ustanovljeno kako pojedine vrste masnoća djeluju na jetru. Cilj ovog

rada bio je istražiti utjecaj prehrane s visokim udjelom masti, koja sadrži

suncokretovo ulje, na jetru štakora.

U svim eksperimentima upotrijebljeni su odrasli muški štakori soja Wistar.

Eksperimentalna skupina životinja hranjena je prehranom s visokim udjelom

masnoća, pripremljenom dodavanjem 30 % suncokretovog ulja standardnoj hrani.

Prema omjeru energije prehrana s visokim udjelom masti sadržavala je 30 %

ugljikohidrata, 16 % bjelančevina i 54 % masti. Kontrolna skupina hranjena je

standardnom hranom. Pokus je trajao tri tjedna.

Jedan dio tkiva jetre bio smrznut, a rezovi su bili obojeni Sudanom III i IV kao i

bojom Oil Red O. Drugi dio tkiva stavljen je u mješavinu 2,5 % glutaraldehida i

0.8 % paraformaldehida u 0,1 M fosfatnom puferu. Nakon toga, uzorci su

postfiksirani u 1 % osmijevom tetroksidu, dehidrirani i uklopljeni u Durcopan te su

načinjeni polutanki rezovi.

Kod jetre svih štakora čija je prehrana sadržavala visoki udio masnoća, u obliku

suncokretovog ulja, nađena je steatoza. Područja difuzne steatoze izmjenjivala su se

s fokalnom steatozom.

Ovo ukazuje da prehrana s visokim udjelom masnoća u obliku suncokretovog ulja

izaziva promjene u metabolizmu hepatocita.


27

8. SUMMARY

Diet-Induced Histological Change in Rat Liver

Excessive and fat diet causes epidemic obesity, but also the fat liver disease. It has

not been clearly established how fats of different kind act on liver. The aim of this

study was to investigate the effect of high-fat sunflower oil dietary intake on the liver

in rat.

In all experiments male adult Wistar rats were used. The experimental group was fed

with high-fat diet, which was prepared by adding 30 % of sunflower oil to the

standard food. In the terms of energy, the high-fat diet contained 30 %

carbohydrates, 16 % protein and 54 % fat. The control group was fed with the

standard food. The experiment lasted for three weeks.

One part of the liver tissue was immediately frozen and the sections were stained

with Sudan III and IV as well as Oil Red O. The other part of the tissue was placed in

a mixture of 2,5 % glutaraldehyde and 0,8 % paraformaldehyde in 0,1 M phosphate

buffer. After that, the specimens were postfixed in 1 % osmium tetroxide,

dehydrated, embedded in Durcopan and semi-thin sections were cut.

All rats treated with the sunflower oil high-fat diet presented a steatotic liver. Areas

of diffuse steatosis were mixed with focal steatosis.

This indicates that high-fat diet with sunflower oil induces a change in the

metabolism of hepatocytes.


28

9. LITERATURA

[1] Mecher AL, editor. Junqueira's basic histology text and atlas. 12th ed. New

York: McGraw-Hill; 2009.

[2] Weiss L, Greep RO. Histology. 4th ed., New York: McGraw-Hill; 1977.

[3] Ross MH, Pawlina W. Histology: a text and atlas. 5th ed. Baltimore:

Lippincott Williams & Wilkins; 2005.

[4] Bloom W, Fawcett DW. A Textbook of histology, 10th ed. Philadelphia:

Saunders; 1975.

[5] Kierszenbaum AL. Histology and cell biology. An introduction to pathology.

2nd ed. Philadelphia: Mosby Elsevier; 2007.

[6] Wree A, Kahraman A, Gerken G, Canbay A. Obesity affects the liver - the

link between adipocytes and hepatocytes. Digestion. 2011;83(12):124-33.

[7] Zeida M, Stuling TM. Obesity, inflamation and insulin resistance-A mini-

review. Gerontology. 2009;55:379-386.

[8] Samuel VT, Petersen KF, Shulman GI. Lipid induced insulin resistance:

unravelling the mechanism. Lancet. 2010;375:2267-2277.

[9] Pierce AGE. Histochemistry, Theoretical and applied, 3rd ed., vol 1. London:

Churchill; 1968.

[10] Gartner LP, Hiatt JL. Color textbook of histology, 2nd ed. Philadelphia:

Saunders; 2001.


29

[11] Postic C, Girard J. Contribution of de novo fatty acid synthesis to hepatic

steatosis and insulin resistance: lessons from genetically engineered mice. J

Clin Invest. 2008;118:829-838.

[12] Wang D, Yuren W, Pagliassotti MJ. Saturated fatty acids promote

endoplasmic reticulum strss and liver injury in rats with hepatic steatosis.

Endocrinology. 2006;147:943-951.

[13] Witek RP, Stone WC, Karaca FG, Syn WK, Pereira TA, Agboola KM,

Omenetti A, Jung Y, Teabery V, Choi SS, Guy CD, Pollard J, Charlton P,

Diehl AM. Pan-caspase inhibitor vx-166 reduces fibrosis in an animal model

of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2009;50:1421-1430.

[14] Roša J, Pancirov H, Skala H, Gadžić A, Roša J. Effects of troglitazone and

insulin on glucose production in cultured hepatocites isolated from rats on

high fat diet. Coll Antropol. 2004;28:631-637.

[15] Utzschneider KM, Kahn SE. Review: The role of insulin resistance in

nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Endocrinol Metab. 2006;91: 4753-

4761.

[16] Rabe K, Lehrke M, Parhofer KG, Broedl UC. Adipokines and insulin

resistance. Mol Med. 2008;14:741-751.

[17] Banek Lj, Roša J, Ježek D, Vrdoljak I, Marolt I, Žurić A. Diet induced

hepatic steatosis in rat. In: Gajović S, editor. Zbornik radova. 2. hrvatski

mikroskopijski kongres sa međunarodnim sudjelovanjem; 2006 May 18-25;

Topusko, Croatia. Zagreb: Croatian society for electron microscopy, 2006. p.

165-166.


30

10. ŽIVOTOPIS

Iva Marolt Banek je rođena 1982. u Zagrebu. Osnovnu školu pohađala je u Zagrebu.

Godine 2001. maturirala je na Zdravstvenom učilištu u Zagrebu. Akademske godine

2002./2003. upisuje Stomatološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu. Apsolvent postaje

2007. Udana je i majka je dvoje djece.

Documents

promjena histološke građe jetre štakora izazvana prehranom