Propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos

Amino ácidos

• Término generalmente aplicado a los amino-alcano-ácidos

• Su formula general es H3N+-(CR1R2)n-COO-

• Si n = 1 obtengo la serie alfa, si es igual a 2, la beta, etc.

• En general se puede aplicar a sustancias que tengan aminos y ácidos

(aproximadamente 700 en organismos)

Ac antranilico

Características generales de AA “proteicos”

• Todos los AA son alfa aminoácidos

• Las propiedades físico-químicas de un AA dependen en gran medida de

su grupo R

• Existen 20 aminoácidos codificados en el código genético

• Por tener un centro quiral, existen dos estereoisómeros D y L

• Tienen actividad óptica (levógiros o dextrógiros)

• Son anfolítos

• solidos cristalinos de alto punto de fusión

• pueden sufrir modificaciones covalentes post-traduccionales

Isómeros ópticos

Modificaciones postraduccionales de aa

Estabilizan la fibra de

colágeno (escorbuto)

Fosforilacion activada por insulina (regulacion de la

proliferacion celular)

Fosforilacion activada por

adrenalina (altera la actividad de

enzimas)

Quiralidad y función

El D-Asp 0.14% por año en el cristalino (uso forense para determinar edad)

Nomenclatura

K E

Tipos de aminoácidos

Tipos de aminoácidos

Tipos de aminoácidos

Ala ArgAsnAspCysGln Glu Gly His Ile LeuLysMetPhePro Ser Thr Trp Tyr Val

Vo

lum

en

40

60

80

100

120

140

160

180

Algunas propiedades fisicoquímicas del R

Ala ArgAsnAspCysGlnGlu Gly His Ile LeuLysMetPhePro Ser Thr Trp Tyr Val

Hid

rofo

bic

ida

d

-3

-2

-1

0

1

2

Propiedades ácido-base

Porque estudiarlas?

• del estado ácido-base de una molécula se deduce su carga neta

• de la carga de una molécula dependerá su energía y así su

conformación

• la actividad biológica depende de la conformación y (en algunos casos)

de la presencia de cargas en el sitio activo

• permite la cuantificación (titulación), identificación y purificación

Propiedades Acido-Base

(Bronsted-Lowry)

zwitterion

Henderson-Hasselbach

14

14

17

Titulación de un ácido débil

+1 0 -1

+ pKa: efecto del entorno

25

Interacciones carga-carga 1

McIntosh, L. P. et al. Biochemistry 1997, 36, 14985-91.

Glu

pKa = 4.4

-

pKa = 6.7

Interacciones carga-dipolo 2

+ pKa: efecto del entorno

26

Solvatacion 3

Dwyer, J. J. et al. Biophys J. 2000, 79, 1610-20.

Glu

pKa = 4.4 pKa = 8.8

+ pKa: efecto del entorno

27 Modified from Grimsley, G. R. et al. Prot. Sci. 2009, 18, 247-51.

Num

ber

of M

easure

ments

pKas alterados se suelen

encontrar en sitios

activos para aumentrar

la reactividad

Cambios sutiles del

entorno del aa alteran el

pKa para obtener:

sensibilidad a cambios

de pH pKa

Punto isoiónico e isoeléctrico

El punto isoiónico (PI) es el pH en el cual el número de

cargas positivas es igual al número de cargas negativas

El punto isoeléctrico (PE) es el pH en el cual una molécula

puesta en un campo eléctrico no presenta movilidad (ya que

tiene carga neta igual a cero)

Para moléculas pequeñas (aminoácidos y péptidos) el PI=PE

+1 0 -1 -2

Sistemas Buffer

• Son sistemas formados por una ácido y una base conjugadas que

mantienen constante el ph dentro de ciertos límites

• La capacidad buffer es la variación del ph con respecto al agregado

de H+ u OH-

• La capacidad buffer es máxima cuando la actividad del ácido sea

igual al de la base conjugada (pka)

• Para obtener un buffer efectivo en un determinado pH debemos

elegir un par acido/base conjugada con un pka cercano al pH deseado

Buffers de importancia biológica

pK= 6.0

imidazolio imidazol

pK= 6.86

pK= 7.4

Propiedades químicas de peptidos y proteínas

(1) Equilibrio fuertemente desplazado a la hidrolisis

(2) La mayoría del N de las proteínas está unido como amina/imina

(3) Las proteínas son hidrolizadas en ácidos fuertes (enlace amida) y por

“fermentos”

Enlace peptídico

KOH + (CuSO4) + tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O).

Biuret

Condensacion de

dos ureas

En presencia de peptidos:

Azul -> violeta (540 nm)

Secuencia: AlaGluGlyLys o AEGK

Consecuencias de la resonancia

NH2

COO-

NH2 NH2

COO-

COO-

Puentes disulfuro

Por qué estudiar la secuencia de

una proteina?

• Determinar el mecanismo de reacción (mecanismo catalítico

asociado a su función biológica)

• Establecer la relación secuencia-estructura (leyes que rigen el

plegamiento)

• detección de patologías moleculares (por mutaciones)

• historia evolutiva

A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V

A

R

N

D

C

Q

E

G

H

I

L

K

M

F

P

S

T

W

Y

V

Matriz de sustitución

• Reacciones del enlace peptídico

• Reacciones del grupo amino terminal

• Reacciones del grupo carboxilo terminal

I Análisis químico

Composición? Detección? Secuencia?

Determinación de la composición de una proteína

1 Hidrólisis

• Ácida

• Muy usada. HCl 6M 24hs a ebullición.

Inconvenientes: destruye Trp, Tyr, Cisteina

Asn y Gln Asp y Glu (se determinan por el NH2 liberado)

•Alcalina

•Inconvenientes: destruye Ser y Thr.

•Enzimática

Es conservativa

Inconvenientes: no es posible una hidrólisis completa, costos

Determinación de la composición de una proteína

1 Hidrólisis

• Ácida

•Alcalina

Hidrólisis enzimatica

1 Espectroscopía UV

Ley de Lambert - Beer: A = E b c

(E es una función de lambda y del número de

aa que absorben en esa lambda)

Aminoácidos aromáticos: Phe (260nm), Tyr

(275)

y Trp(280) = en general 280 nm

OJO: AN 260nm

Todos los AA = 210 nm (enlace peptídico) Phenylalanine

Cuantificacion Química

2 Identificación de los AA

Cromatografía

volumen

abso

rban

cia

Técnicas espectroscópicas

3. Absorbancia Visible

• Reacción de Biuret ( SO4Cu/tartrato alcalino 540nm).

Formación de complejo. Reducción del Cu++. Baja sensibilidad (1mg) pero alta

especificidad

• Reacción de Lowry et al. (Reactivo de Folin-Ciocalteau = mezcla de

óxidos de tungsteno y molibdeno 720-750 nm)

Alta sensibilidad(2-100ug). Problemas con interferencias. Color varía con la composición

de la proteína.

• Ninhidrina(570 nm)

Muy sensible pero poco específico. Destruye muestra (deaminación oxidativa del NH2)

• Coomassie Brillant Blue (Bradford)

No hay reacción química. Grupos polares. Se usa para geles o para soluciones. 10-7gr

• Reactivos Fluorescentes

Fluorescamina, o-ftalaldehído. Picomolar. No son específicos.

•Plata

Muy sensible (1 10-9 gr). Para geles.

• Reacción de Lowry et al. (Reactivo de Folin-Ciocalteau = mezcla de

óxidos de tungsteno y molibdeno 720-750 nm)

Coomassie Brillant Blue (Bradford)

No hay reacción química. Grupos polares. Se usa para geles o para soluciones. 10-7gr

Abs. A 595 nm

Método Sensibilidad Tiempo Principio Interferencias Comentarios

Biuret Baja (1-20mg) 20-30min Enlaces

peptídicos

Algunos buffers, Tris Rápido pero no

sensible. Color similar

a distintas proteínas

Lowry Alta (5 ug) 1hs Biuret +

Reactivo de

Folin

Sulfato de amonio,

buffers, mercaptanos

Lento. El color varia

con las proteínas. Se

debe ajustar muy bien

el tiempo

Bradford Alta (1ug) 15 min Interacción

no-polar

Buffers básicos,

Triton X-100, SDS

Excelente. Color

estable en el tiempo.

Color varía con las

proteínas

Espectrofo

tométrico Moderada (50-

100ug)

5-10min Absorción a

280 (Tyr y

Trp)

Purinas, pirimidinas,

AN, AR

Adecuado para

monitorear. AN se

puede corregir

Comparación de métodos

Producto púrpura

Reacción de ninhidrina

Reacciones del grupo amino (terminal)

• Ninhidrina (570 nm) Pro a 440nm

• Fluorescamina (producto fluorescente). Alta sensibilidad

• 1-Fluoro-2,4 dinitrobenceno (FDNB, reactivo de Sanger) (específico

alfa-amino)

• Cloruro de dansilo (específico alfa-amino)

• Reactivo de Edman (Fenilisotiocianato) (específico alfa-amino)

• o-ftalaldehído (en sn con mercaptoetanol, producto fluorescente).

Alta sensibilidad

• Cianato (específico alfa-amino)

Emisión (fluorescencia)

Reacciones del grupo Carboxilo

• Hidrazina (H2NNH2)

• Carboxipeptidasa

Caracterización de Cys y Cistinas

• Oxidación de las Cistinas a Ac. Cisteico

Ac perfórmico HC=O

OOH

• Reducción y posterior identificación

Ditiotreitol (1,4 ditio 2,3 butanodiol) + Acetilacion con Iodoacetato

+ Cianometilacion con Acrilonitrilo (CH=CH-CN)

Secuenciación

1. Purificación de la proteína o péptido

2. Ruptura de los puentes disulfuro

3. Determinación de los extremos amino-terminales y carboxilo-

terminales

4. Corte específico de la secuencia principal en fragmentos

menores, al menos en dos formas distintas

5. Purificación de cada segmento y secuenciación

6. Determinación de la secuencia total

Frederick Sanger

1918-

Nobel Prize (Chemistry, 1958)

Nobel Prize (Chemistry, 1980)

Secuenciación

1. Purificación de la proteína o péptido

2. Determinación de la composición y PM

3. Determinación del número de cadenas (ruptura de los puentes

disulfuro)

4. Determinación de los extremos amino-terminales y carboxilo-

terminales

5. Corte específico de la secuencia principal en fragmentos

menores, al menos en dos formas distintas

6. Purificación de cada segmento y secuenciación

7. Determinación de la secuencia total

Resumen

1,2,4 fluorodinitrobenceno

• La reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente

• Los DNP derivados tienen color (amarillo)

• Los DNP derivados se pueden separar e identificar por cromatografía

Edman, P., 1950 Method for determination of the amino acid sequence

in peptides. Acta Chem. Scand. 4: 283–293.

Phenylthiocarbamyl (PTC) Phenylthiohedantoin (PTH)