Proteómica de segunda generación: análisis masivo de proteínas

Identificación de la proteína

BASE DE DATOS

Proteoma

Espectro de fragmentación

Digestión tríptica

péptidos

Separación de los péptidos por cromatografía líquida

+

péptido

fragmentos

Espectrometría de masas

Cuantificación diferencial de proteomas mediante técnicas de segunda generación

• Cada muestra se analiza por separado en paralelo en las mismas condiciones cromatográficas:

• Permite comparar N muestras en diferentes carreras.

• Se pueden seguir dos estrategias para la cuantificación: 1. Medida de la intensidad de la señal de cada espectro y/o péptido

2. Número de espectros (“spectral counting”) y/o péptidos identificados (“peptide counting”)

Cuantificación mediante técnicas “label-free” (sin marcaje)

Isótopos • Átomos isotópicos:

Tienen un neutrón más.

Ejemplo: C12 y C13

Cromatografía líquida

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bu

nd

ance

15.21

24.55 28.77

16.89 16.29 19.28

25.67 18.19 20.97

22.07 28.15 18.06 19.55 12.80 14.23 22.29 29.46 26.57 27.33 23.26 13.15

Fase reversa

Péptido ligero (A) y pesado (B)

Espectro de masas

>3 Da

A

B

m/z

Inte

nsit

y

Cuantificación del

ratio de los niveles

de intensidad de los

isótopos A y B:

Log2(A/B)

Precisión de la medida determinada por la resolución del espectrómetro de masas y por la

relación señal/ruido de la medida

• Moléculas isotópicas: Tienen más masa que su pareja no isotópica. Presentan

la mismas propiedades fisico-químicas. Un espectrómetro de masas detecta la

diferencia de masa entre los dos.

Cuantificación (relativa) con Isótopos Estables

15N, SILAC (metabólicos)

ICAT (químico)

iTRAQ (químico)

18O (enzimático)

Stable Isotope Labelling of Aminoacids (SILAC)

• Suplementa el medio de cultivo con arginina (Arg) marcada con seis 13C:

Identificación en MS2 y cuantificación en MS1

VENTAJAS:

Se mezclan las muestras para obtener un extracto de proteínas único antes de la digestión tríptica. Disminuye la variabilidad analítica/técnica en la medida

INCONVENIENTES:

X Sólo se puede usar en cultivos celulares, no es aplicable en otro tipo de muestras biológicas.

X Es muy caro y difícil de optimizar

X Puede haber una variabilidad en el cultivo debido a la adición de AAs con isótopos

DESVENTAJAS RESUELTAS ACTUALMENTE:

SuperSILAC: ratón alimentado con AAs marcados

MIX

Cells

Sample A Sample B

C12-Arg C13-Arg

Digest with trypsin

RP-HPLC-MS

Identify by MS/MS and quantify by MS

Denature, reduce & alkylate proteins

Isotope-Codec Affinity Tag (ICAT)

• Marcaje químico diferencial de las cisteínas de los extractos proteicos:

Se produce una diferencia de masa de 8 Da.

• Se estima que tan solo el 10% de los péptidos trípticos de un proteóma tienen cisteína.

Identificación en MS2 y cuantificación en MS1

Se requiere un paso de enriquecimiento de cisteínas para poder cuantificar un porcentaje aceptable del proteoma completo.

VENTAJAS: Todo tipo de muestras biológicas Purificación de péptidos con cisteína

INCONVENIENTES × El marcaje con biotina da fragmentaciones muy

ruidosas × El deuterio altera el tiempo de retención en la

cromatografía líquida de fase reversa × Solo cuantifica péptidos con cisteína: menos

péptidos para cuantificar una proteína.

DESVENTAJAS RESUELTAS Utilización de 13C en vez de deuterio: no

interfiere en la cromatografía líquida Marcaje tras la digestión tríptica: más acceso a

péptidos con cisteína

Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ)

• Reactivo específico de aminas (N-terminal y Lisina (K))

• Todos los reactivos tienen la misma masa, pero al fragmentarse se generan reporteros de distinta masa

Identificación y cuantificación en MS2

Péptidos marcados con iTRAQ aparecen como un único pico en modo MS…

… pero en MS/MS aparecen los picos del grupo reportero específico de cada muestra, que representan la cantidad del péptido en cada muestra mientras aparece un único espectro de fragmentación perteneciente al péptido.

VENTAJAS: Marcaje de todos los péptidos: más

péptidos distintos para cuantificar una proteína

Permite comparar de 4 a 8 muestras diferentes en un mismo experimento

Mayor señal/ruido en el MS/MS: permite cuantificar proteínas poco abundanes

INCONVENIENTES × Espectrómetros de baja resolución no

fragmenta en rangos de masa tan bajos × Marcaje post-digestión: mayor

variabilidad analítica DESVENTAJAS RESUELTAS Fragmentación PQD para baja resolución Fragmentación HCD para alta resolucióna

Isobaric tags for relative and absolute quantitation (8-plex-iTRAQ)

Trypsin-catalyzed 18O incorporation in peptides

H H H H

O18

C

O

R

CH

C

O

R

CH

R

CH

C

O

R

CH

R

CH

C

O

R

CH

R/K

CH HO

C

R

CH

OH

C

R

CH O O

OH

C

R

CH

OH

C

R/K

CH O O

OH

Trypsin-Ser

O-

C

R

CH

C

R

CH

R

CH O O

C

R

CH

R

CH

C

R

CH

R/K

CH O O

Trypsin-Ser

O

C

R

CH

C

R

CH O O

C

R

CH

C

R/K

CH O O

O-

HO18

Trypsin-Ser Non-labeled

peptide Bo

OH-Ser-Trypsin

C

R

CH

C

R

CH

C

O

R

CH

C

R

CH

OH

C

R

CH

OH

C

R

CH

C

O

R

CH

R

CH

C

R

CH

R

CH

OH

C

R

CH O O

OH

C

R

CH

R

CH O O

C

R

CH O O

C

R

CH

R

CH

C

R

CH

C

R

CH

R

CH

C

O

R

CH

R

CH

C

R

CH

R

CH

OH

C

R

CH

OH

C

R

CH

R

CH

C

O

R

CH

R/K

CH

C

R

CH

R/K

CH

OH

C

R/K

CH O O

OH

C

R

CH

R/K

CH O O

C

R/K

CH O O

C

R

CH

R/K

CH

Trypsin-Ser Trypsin-Ser

HO18 O O O O O18 O18-

H H H H

O18

O18

O18- O18

HO18 HO18

Trypsin-Ser

mono-labeled peptide B1

(+2Da)

di-labeled peptide

B2 (+4 Da)

Trypsin-Ser-OH

Marcaje enzimático con 18O

Extracto proteínas B

digestión

digestión

marcaje

marcaje

H 2 H 2

H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2

H 2 H 2

(+4 Da)

mezcla

B

B

A

Identificación masiva

Extracto proteínas A

Cuantificación masiva

log2(A/B)

Se produce una variación de masa de hasta +4Da

4 Da

Identificación en MS2 y cuantificación en MS

VENTAJAS: Marcaje de todos los péptidos Más barato Cromatografía “micro” hay coelución de los

isótopos en la cromatografía INCONVENIENTES × Solo se pueden comparar dos muestras × Cromatografía “nano” acoplada a alta

resolución, da problemas de no coelución de los isótopos

DESVENTAJAS RESUELTAS Integración de los valores de todo el pico

cromatográfico

Técnicas de cuantificación dirigida de proteínas

Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Transition 1

Transition 2

Transition 3

La señal de los iones fragmentos se monitoriza a lo largo de todo el tiempo de elución del pico cromatográfico

Se pueden monitorizar varias decenas de proteínas con péptidos proteotípicos de masa conocida en un único análisis sin necesidad

de fraccionar un proteoma

1. Seleccionar los péptidos proteotípicos que van a servir para cuantificar las proteínas de interés. Normalmente se eligen 2 o 3 péptidos por proteína. Estos péptidos se sintetizan usando Arg o Lys pesadas (C13) del extremo C-terminal del péptido y servirán como estándares internos para el análisis de MRM.

2. Configurar y optimizar los parámetros del MS para conseguir la máxima transmisión y sensibilidad de cada transición MRM de cada péptido y evitar interferencias debidas a muestras complejas.

3. Para definir los límites de detección y cuantificación (LOD y LOQ), se realizan curvas de calibración para cada péptido sintético.

Pasos: