Protocolo de purificación de LDH de pechuga de polloLuz del Carmen Castellanos Román

1. La carne de pollo 20 g se corta en cubos (puede congelarse) y se licua en aproximadamente dos y medio volúmenes de amortiguador “A” frío . Se realiza la operación a 4°C mediante pulsos, se enjuaga el vaso de la licuadora con 10 mL del mismo amortiguador y se agrega al licuado. Se registra el volumen del licuado F0 y se almacenan tres alícuotas de 50 µL para posteriores análisis.

2. Se centrifuga a 10 000 rpm por 10’ a 4°C. Se filtra el sobrenadante con una gasa, éste es la fracción F1, se determina su volumen y se almacenan tres alícuotas de 50 µL.

3. Se agrega lentamente sulfato de amonio pulverizado hasta alcanzar una concentración del 55 % de saturación (0.351 g/mL). Se centrifuga a 10 000 rpm por 10’a 4°C. Se colecta el sobrenadante F2, se registra el volumen final y se almacenan tres alícuotas.

4. A la fracción F2 se le agrega lentamente sulfato de amonio pulverizado hasta alcanzar una concentración del 75 % de saturación (0.141 g/mL). Se centrifuga a 10 000 rpm por 10’a 4°C. El precipitado se resuspende en 1 mL de agua destilada, esto es la fracción F3, se registra el volumen final y se almacenan tres alícuotas.

Desalado5. En una columna de 2.5 mL de Sephadex equilibrada con 3 mL de amortiguador “A”, se cargan 600 µL

de F3 y se eluye con 2 mL de amortiguador “A”, se desecha el volumen vacío aproximadamente 1 mL, se colecta el primer mL, F4, y el segundo; se almacenan tres alícuotas de F4.

CromatografíasMacroprepA una columna de Macroprep de 1.5 mL equilibrada con 5 mL de amortiguador ”A”, se cargan 200 µL de F4. Se lava con 2 mL de amortiguador A y se eluye con 2 mL de amortiguador “A” + NaCl 1 M, se toman fracciones de 1 mL.

CibacronA una columna de 0.5 mL de Cibacron Blue equilibrada con 10 mL de amortiguador “A” se le carga con 700 µL de F4, se lava con 10 mL de amortiguador “A” y se eluye con 5 mL de amortiguador “B”, se colectan fracciones de 2.5 mL. Se lava con 10 mL de amortiguador “A”.Determinar cantidad de proteína y actividad enzimática, en cada alícuota reservada durante la técnica. Calcular enriquecimiento y rendimiento de cada paso.

Amortiguador “A”: TRIS pH 8.6 20 mM , PMSF 1 mM, 2-mercaptoetanol 0.5 mM

Amortiguador “B”: TRIS pH 8.6 20 mM, PMSF 1 mM, 2-mercaptoetanol 0.5 mM, NADH 1 mM

Amortiguador A + NaCl 1 M

Para el cálculo de la concentración de proteína

Se toman 10 L de la fracción más 990 L de agua y se lee en celdas de plastibrand a 260 y 280 nm, ajustando a cero con agua destilada. Se utiliza la siguiente fórmula para el cálculo.

mg/mL = (1.51 A280 –0.76 A260 )dilución

Se toman como criterios de pureza: A260 / A280 proteína pura = 0.57 y A260 /A280 DNA puro = 2

Ensayo para medir la actividad de LDH

Amortiguador de fosfatos 100 mM 515 LPiruvato 10 mM 30 LAgua 395 L +9 LNADH 4 mM 50 LEnzima 1 L

*Se recomienda hacer diluciones de las fracciones F0, F1, F2, F3: 1L + 9 L agua y de ésta tomar 1 L para el ensayo de actividad.Fracciones F0 F1 F2 F3 F4 Macroprep o

Cibacron

A260

A280

Prot. mg/mL

t (s) F0 F1 F2 F3 F4 Macroprep o Cibacron

0

10

20

30

40

50

60

Si es necesario tomar las lecturas por más tiempo.