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Septiembre, 2010. Resultados de purificación de Proteínas (LDH). Curva estándar Interpolar valor de peso molecular LDH Geles de poliacrilamida de cada equipo Identificar la banda de interés en el gel de su equipo. Instrucciones. - PowerPoint PPT Presentation
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Resultados de purificación de Proteínas (LDH)
a) Curva estándarb) Interpolar valor de peso molecular LDHc) Geles de poliacrilamida de cada equipod) Identificar la banda de interés en el gel de su equipo
Septiembre, 2010
Instrucciones
Hacer curva de calibración con los estándares de peso molecular que se proporcionan en la siguiente transparencia,
Calcular los Rfs,
Rf =distancia recorrida de la proteína de interés
distancia total recorrida por el colorante
Realizar el gráfico del log del peso molecular vs Rf
Proteínas KDa
Miosina 250
Fosforilasa B
148
BSA 98
Glutámico DH
64
Alcohol DH
50
Anhidrasa carbónica
36
Mioglobina 22
Lisozima 16
Aprotinina 6
Cadena B de insulina
4
PESOS MOLECULARES ESTÁNDAR
Estás proteínas se salen del gel, ya que migran más rápido que el colorante que el azul de bromofenol, colorante que usamos de indicador de la corrida de las proteínas
Curva std de proteínas1. Para encontrar en
donde está la banda de interés se hace una curva estándar.
2. interpolar el log del peso molecular y conocer en que posición o Rf debe estar la proteína
Equipo 1 Equipo 2
Equipo 3 Equipo 4
Equipos 1 a 4Recuerden la banda anaranjadita es la fosforilasa B
36
36
36
36
Equipo 5
FosforilasaBSAGlutDHAlcohol DHAnhidrasa Carbon
No se logra observar la primera banda de alto peso molecular pero les puse las que yo puedo distinguir, son suficientes para producir la gráfica de calibración
Les coloque los estándares que pude detectar.
Equipo 7
MiosinaFosforilasa
BSAGlutDH
Alcohol DHAnhidrasa Carbonica
Excelente gel del equipo 6. El gel que corrieron hoyComentarios Le falto correrse
pero quedo precioso, supongo que las fracciones menos puras son las que tienen bandas de peso molecular más alto.
¿Qué resina usaron para la purificación? Fue intecambio iónico?
Std FPA FPB F4 F3 F2 F1 F0
75
25
Mi gel
COMENTARIOS: Yo use otros estándares
de peso molecular Como ven al pasar de
la F2 a la 3 se pierden proteínas de alto peso molecular
Y al pasar al intercambio iónico perdemos una banda gorda arriba de 37,
Mientras que en afinidad se purifica una banda preferencial a los 37 kDa de peso molecular
Stds usados en el gel del equipo 6 y el mío
Reporte
Recuerden que la entrega del reporte será hasta pasando el puente del 15 y 16 de septiembre.
Y llevará en los resultados:A) La concentración de proteína en cada una de las
fracciones obtenidas de la purificación, B) El gel de las fracciones (pueden usar otro gel para
comparar lo que ustedes obtuvieron con lo que se debería de ver),
C) La curva patrón del estándar del gel con la predicción de la localización de la proteína y
D) la actividad total de cada fracción o de las que alcancemos a medir