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Proyecto de Investigación
“Estudio del repertorio de los receptores de células NK en mujeres durante
la peri y postmenopausia y su relación con los síntomas”
para Fortalecimiento de CA
Responsable Técnico
Dra. Nicté Guadalupe Figueroa Vega
Adscripción
Dpto. Ciencias Médicas División Ciencias de la Salud Universidad de Guanajuato
Campus León
Estudio del repertorio de los receptores de células NK en mujeres durante la peri y
postmenopausia y su relación con los síntomas
RESUMEN
Antecedentes: La menopausia, el cese de la menstruación como resultado de la pérdida irreversible de
la función ovárica significa el riesgo de síntomas físicos y emocionales que afectan seriamente la calidad
de vida de la mujer. La disminución de los estrógenos es el principal factor relacionado con la presencia
de bochornos, depresión y ansiedad durante la menopausia. Sin embargo dado que algunas mujeres no
presentan estos fenómenos a pesar de tener hipoestrogenismo, se propone participan otros factores,
como el proceso inflamatorio de bajo grado que ocurre durante la menopausia y que condiciona al
desarrollo de síntomas y el ciclo circadiano. A este respecto, se ha observado que las células NK
presentan alteración en número y expresión de receptores, durante la senescencia, lo que podría sugerir
que estas células puedan ejercer algún efecto en la incidencia y/o riesgo de enfermedades propias de
esta etapa. Además, las células NK se encuentran bajo control del ciclo circadiano, el cuál está
desregulado en la menopausia.
Objetivo: Estudiar la asociación del repertorio de receptores de células NK y el ciclo circadiano con
depresión, ansiedad, bochornos en mujeres voluntarias con perimenopausia y postmenopausia
temprana y tardía, así como la interacción de los niveles hormonales.
Diseño del estudio: Se efectuará un estudio clínico en sección transversal. Se incluirán voluntarias de
la ciudad de León, Gto. El total será de 100 mujeres en la perimenopausia, 100 en etapa temprana de la
postmenopausia (< 5 años), 100 mujeres en etapa tardía (>5 años) con síntomas y sin síntomas.
Metodología: Se aplicarán a las participantes cuestionarios para evaluar los síntomas de depresión,
ansiedad, estrés psicosocial, dominancia-sumisión y síntomas vasomotores. Además, se tomará una
muestra de sangre para determinar glucosa, perfil lipídico, FSH, estradiol, AMH, NPY por ELISA y RIA.
Asimismo, se obtendrá una muestra de sangre completa con la cuál se aislarán las células
mononucleares para determinar el número de las diversas poblaciones de células NK mediante
citometría de flujo Se realizará también la determinación determinación de los haploitpos de los
receptores de células NK mediante RT-PCR.
Resultados esperados. Se espera encontrar el repertorio de receptores de las células NK alterado, es
decir, que haya un desbalance entre los activadores e inhibitorios, en las mujeres postmenopausicas
tempranas y tadías, en comparación con las perimenopausicas. Además, la expresión de Per2 estaría
mayormente disminuida en la población de mujeres postmenopausicas que en las perimenopausicas.
Finalmente, se esperaría observar que aquellas mujeres en la postmenopausia que presentan
bochornos, ansiedad, depresión, sean las que muestren una mayor alteración en la expresión de los
haplotipos de receptores y un bajo número de células NK. En resumen, se espera encontrar una
correlación positiva entre los diversos componentes de la respuesta inmune innata con el fenómeno
depresión-ansiedad y bochornos. Además, se espera la consolidación de los grupos de investigación
participantes.
ANTECEDENTES
Menopausia
La menopausia el cese de la función ovárica significa, además de la pérdida de la función
reproductiva, conlleva el riesgo de síntomas físicos, vasomotores y emocionales [Malacara, 2004;
Szmuilowicz, 2011], así como también cambios en el sistema inmune [Abu Taha, 2009], que afectan
seriamente la calidad de vida de la mujer, además de un aumento del riesgo cardiovascular, de
enfermedades degenerativas y de cáncer mamario (Cagnacci, 2001). La edad promedio de la última
menstruación es 50 años. la menopausia comprende dos periodos, la transición a la menopausia,
denominada peri-menopausia (presencia de síntomas y alteraciones en el periodo menstrual) y la
menopausia establecida o postmenopausia (>1 año con amenorrea) (McKinlay, 1992).
Hasta el momento, no han sido elucidados completamente los mecanismos involucrados en la
fuerte asociación entre menopausia, bochornos, depresión, ansiedad y riesgo cardiovascular. Uno de los
mecanismos propuestos es la deficiencia de estrógenos durante esta etapa de la vida de la mujer.
Sin embargo, han surgido evidencias de que la menopausia cursa con un componente
inflamatorio crónico de bajo grado, que pudiera ser el responsable de desencadenar la sintomatología
que padecen las mujeres durante la menopausia (Abu Taha, 2009, Leonard, 2010; Novella, 2011).
A este respecto, existen varios estudios que demuestran que las mujeres en la postmenopausia,
presentan concentraciones séricas de moléculas de adhesión y citocinas pro-inflamatorias
incrementadas (Yasui, 2008, Bechlioulis, 2010, Meadows, 2011), y que sugieren un papel en el
desarrollo de riesgo cardiovascular, y con un aumento en el engrosamiento de la íntima media carotídea
(Bechlioulis, 2012), así como también con la presencia de bochornos (Thurston, 2011).
Sistema Inmune Innato
El sistema inmune innato juega un importante papel tanto en la defensa contra microoganismos,
como en el mantenimiento de la homeostasis del sistema reproductor femenino. Principalmente, el
sistema inmune innato juega un papel activo en varios procesos como foliculogénesis, ciclo menstrual,
embarazo, aborto espontáneo, endometriosis y menopausia (Bulmer, 1991).
El sistema inmune innato constituye la primera línea de defensa del organismo frente a
patógenos y antígenos propios. Varias son las barreras físicas, células y moléculas que participan
durante estas respuestas inmunes inespecíficas para eliminar a los microorganismos.
Las barreras físicas la conforman la piel, mucosas, lágrimas y el movimiento ciliar, que
constituyen el primer obstáculo para evitar que los patógenos colonicen/infecten nuestro organismo. El
sistema inmune de las mucosas, es capaz de monitorear la entrada de los patógenos en los ductos
lagrimales, tracto respiratorio, gastrointestinal, genitourinario y los ductos mamarios.
Dentro de las poblaciones celulares del sistema inmune innato encontramos a los monocitos, los
macrófagos, las células dendríticas (DCs) y las células NK (Robinson-Smith, 2007).
Las moléculas solubles sintetizadas por las células inmunes antes mencionadas, se denominan
citocinas de la respuesta inmune innata: IFN-γ, IL-12, IL-1β, IL-6, así como también la quimiocina IL-8.
Otro tipo de moléculas que se expresan sobre la superficie de las células inmunes son los
receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PPRs) tales como los
receptores tipo Toll (TLRs), el inflamasoma (NLR), la molécula DC-SIGN (CD209), el receptor de
manosa (CD206) y los péptidos anti-microbianos (AMPs) (Takeda, 2003; Brown, 2004).
El sistema inmune innato tiene la capacidad modificar en forma dinámica su número y proporción
de células, la producción de citocinas y la expresión de moléculas de superficie, que van a estar
relacionados con la senescencia, y aunque es un proceso fisiológico, muchos de estos cambios se
pueden asociar con diversas patologías características de la vejez (Panda, 2010).
A este respecto, se ha observado que las células NK, juegan un papel fundamental en la defensa
contra tumores e infecciones virales y se ha observado que además podrían tener una participación
importante en el desencadenamiento de los síntomas observados durante la menopausia y algunas
patologías propias de la senectud (Caruso, 2009).
Células natural killer (NK) y sus receptores
Existen 3 subtipos de células NK, cada una con funciones diferentes. La población mayoritaria
(90%) la comprenden las NK CD3-CD56dimCD16bright, que poseen función citotóxica pero no sintetizan
citocinas. Por otro lado, la población CD3-CD56brightCD16dim que constituye un 10% del total de células
NK, se caracterizan por no llevar a cabo funciones citotóxicas, pero son altamente productoras de
citocinas (IFN-γ). Recientemente, ha sido descrita una tercera población de células NK, que presentan el
fenotipo CD56brightCD16-, sin embargo, aún se desconoce con exactitud su función (Bryceson, 2006).
Las células NK son consideradas selectivas en su función de eliminar células tumorales y virales,
ya que son capaces de identificar células anormales y de liberar perforina, que forma canales en la
membrana de célula blanco; lo anterior permite la entrada de la granzima B, que activa caspasas e
induce apoptosis [Cooper, 2001, Segal, 2005]. El reconocimiento de las células anormales se lleva a
cabo a través de varios mecanismos: las células NK reconocen a aquellas células que no expresan
moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I a través de diversos receptores,
que van a inducir la activación de las células NK (Lee, 1998; López-Botet, 2005).
Las células NK, expresan una diversidad de receptores que comprenden tres grupos: a)
Receptores tipo KIR (killer cell inhibitory receptors), b) los receptores de leucocitos semejantes a
inmunoglobulinas o transcritos semejantes a inmunoglobulinas (leukocyte Ig-like receptor, LIR/LILRs o
Ig-like transcripts ILTs) y c) los receptores de células NK semejantes a lectinas, CD94/NKG2 (KLRs),
que reconocen específicamente a moléculas MHC clase I. Estos receptores se expresan además en
algunos subtipos de linfocitos T (Brown y col. 2004).
CD94/NKG2A y -NKG2C son lectinas codificadas en el complejo de células NK (NKC) en el
cromosoma humano 12. El heterodímero CD94/NKG2A constituye un receptor inhibitorio que recluta a
una fosfatasa de tirosina que contiene dominios SH2-1 (SHP-1), a través de las secuencias inhibitorias
que contienen residuos de tirosina o ITIMs (Immunoreceptor Tirosine-based Inhibitory Motifs), incluidas
en la subunidad NKG2A. Por otra parte, el complejo CD94/NKG2C es capaz de inducir la activación de
cinasas de tirosina, a través de la molécula adaptadora DAP12. (Carretero y col. 1998, Lanier y col.
1998). Ambos receptores de células NK (NKRs) reconocen específicamente a la molécula HLA-E, la cual
presenta péptidos derivados de las secuencial señal de otras HLA clase I (Lee, 1998), sin embargo se
ha descrito que puede presentar otros tipo de péptidos (Gumá y col. 2006).
Los receptors de lectina tipo C (denominados NKRs), CD16, CD56, CD85b/c/e/f/g/i,
CD158d/e2/j/k, NKG2C/D, y receptores de fragmentos Fc (FcR) tienen un efecto estimulador de la
actividad citotóxica de las células NK, mientras que otros ejercen un efecto inhibidor, tales como: CD94,
CD85a/d/j, CD158a/b/c/e1/f/g/h/I, y NKG2A.
Los miembros de la familia CD158 (KIRs) son altamente polimórficos (Bashirova et al, 2006), y
generalmente se expresan en forma co-dominante y en diversas combinaciones con CD16 y CD56. Se
ha considerado que la co-expresión de diversos receptores estimuladores e inhibidores es la
responsable de fineza de las respuestas de las NK. (Cheent & Khakoo, 2009; Wei, 2012).
Algunos receptores como NKG2, CD85, y CD158 tienen un reconocimiento promiscuo de las
moléculas del complejo principal de histocompatibilidad clase I (Eagle & Trowsdale, 2007; Middleton &
Gonzelez, 2010).
Influencia de las hormonas esteroides y no esteroides sobre el Sistema inmune
Las hormonas esteroides como estrógenos (E2), progesterona y testosterona, son potentes
inmunomoduladores y lo mismo puede decirse de la prolactina (PRL), además, poseen efectos en el
microambiente materno-fetal. Los niveles séricos de E2 y progesterona maternos están elevados en las
etapas tempranas del embarazo y a lo largo de la gestación (McMurray, 2005; Yu-Lee, 2002).
Los efectos inmunoreguladores de la progesterona incluyen la inhibición de la proliferación y
secreción de citocinas de linfocitos T CD8+ activados por PMA. Además promueve respuestas tipo Th2 e
incrementa la síntesis de LIF, lo cual tiene un papel en el mantenimiento del embarazo. En el caso de los
estrógenos, éstos son capaces de disminuir los fenómenos de hipersensibilidad de tipo tardío, de inducir
respuestas tipo Th2 y proteger contra rechazo de injerto. Además, se ha observado que los estrógenos
son capaces de inhibir la secreción de citocinas pro-inflamatorias, de inhibir la activación del endotelio y
mantener los niveles de óxido nítrico, con lo cual contribuye a disminuir enfermedades cardiovasculares.
La prolactina por su parte, ejerce funciones estimuladoras sobre las respuestas inmune celular (RIC) y
humoral (RIH). La magnitud de estos efectos dependen de modificaciones post-traduccionales en la
molécula de PRL (King, 1996; Grossman, 1985).
Sistema inmune en el tracto reproductivo
El útero es un órgano inmunológicamente privilegiado ya que permite la implantación del
embrión, evitando el rechazo de éste; y además posee un sistema que permite la depuración de detritus
endometriales que resulta en la menstruación.
El tracto reproductivo humano posee un sistema inmune innato y adaptativo, constituido por
células NK, neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células cebadas, linfocitos T y B, y moléculas
solubles como citocinas, quimiocinas y péptidos anti-microbianos, pero en niveles diferentes de los
encontrados en sangre venosa periférica. Estas células van a localizarse en el útero, endometrio, cérvix,
trompas de Falopio y vagina, donde juegan un importante papel en inmunidad, regulación de la
respuesta inmune, angiogénesis, y remodelación tisular [Croy, 2002; Thompson, 1992].
Las células NK son los únicos miembros del linaje linfoide que se encuentran en el endometrio,
presentando un fenotipo CD56dimCD16+. Estas NK se localizan en el endometrio perimenstrual y se
acumulan durante la fase secretora. Se ha descrito que la población CD56brightCD16- se encuentra en
bajo número en el endometrio no gestacional durante la fase folicular del ciclo menstrual,
incrementándose durante la fase lútea. Durante el embarazo, las células NK se localizan en la decidua
en el sitio de la implantación del embrión, alcanzando un mayor número en etapas tempranas de la
gestación y disminuyendo en la semana 20. Los cambios dinámicos en el número de las células NK
durante el ciclo son determinados por cambios hormonales, como la producción de prolactina, la cual a
su vez es sensible al efecto de las hormonas esteroides. Esto explica la correlación que existe entre los
niveles de prolactina endometrial y los niveles de las células NK (Loke, 2000; Trundley, 2004). Las
células NK persisten en la decidua durante el primer trimestre del embarazo, y representan alrededor del
70% de la población de leucocitos. Finalmente, otro punto de importancia de las NK radica en su papel
de células citotóxicas, constituyendo un mecanismo de inmunidad en contra de infecciones virales y
células neoplásicas.
Sistema Inmune y menopausia
Se ha descrito que el sistema inmune sufre alteraciones que se desarrollan como
consecuencia de la senescencia (Sansoni, 2008). El deterioro del sistema inmune debido a la edad y
la disminución de los niveles de estrógenos, es un importante factor en el incremento en la
susceptibilidad a enfermedades infecciosas y neoplásicas en la vejez [Abbe, 2011]. Además, los
síntomas físicos y emocionales en la menopausia, en particular los bochornos y la depresión, se han
atribuido a un proceso inflamatorio crónico cuya fisiopatogenia es motivo de controversia (Szmuilowicz,
2001; Saveanu, 2011). A este respecto, los síntomas durante la menopausia se han asociado a daño
vascular, evaluado por engrosamiento de la íntima-media de la carótida, resultado de un complejo
proceso inflamatorio (Thurston, 2011), cuyos detalles no son bien conocidos. El conocimiento del papel
de las células NK en este problema es sólo fragmentario.
Algunos de los cambios más importantes de la inmunosenescencia ocurren en la población de
las células NK y se han observado en mujeres >65 años (Hayhoe, 2010). A este respecto, se ha descrito
que la expresión de las moléculas de superficie (receptores KIR y NKG) se encuentra alterada y hay un
incremento de la subpoblación CD56dim y una disminución en la producción de IL-8, en comparación con
mujeres jóvenes. También se ha observado, en cohortes de mujeres >65 años, que las células NK
disminuyen su tamaño (Mariani et al, 1990; Erkeller-Yuksel et al, 1992; Ogata et al, 1997; Lin et al, 1998;
Mocchegiani et al, 2003; Sundström). Por otro lado, se ha reportado que la expresión de los receptores
CD94 y KLRG1 en las células NK está significativamente reducida en un grupo de mujeres mayores de
60 años (Korner, 2012). CD94, forma un complejo con KG2A que reconoce a la molécula HLA-E y por lo
tanto es capaz de inhibir la lisis de células normales (Lanier, 1998). KLRG1 que contiene un dominio
inhibitorio basado en tirosinas (ITIM), también permite la coordinación de la función inhibitoria. De
acuerdo a lo anterior, es probable que la reducción en el número de las células NK que expresan estos
receptores contribuya a las alteraciones del sistema inmune de los adultos mayores.
Por todo lo anterior, consideramos que resulta de interés determinar con mayor precisión los
cambios en el repertorio de receptores que expresan las células NK en las mujeres menopáusicas, así
como también explorar sus posibles consecuencias. Por otra parte, nos parece interesante proponer que
los cambios en el fenotipo de las células NK podrían estar relacionados con la sintomatología que cursa
la menopausia (bochornos, depresión, ansiedad, síndrome del nido vacío) y con el riesgo de enfermedad
cardiovascular.
Ciclo circadiano y sistema inmune
Además, de los cambios observados en el sistema inmune debido a la edad, y del papel
regulador de las diferentes hormonas esteroides y no esteroides, sobre los componentes del sistema
inmune, existe otro factor involucrado en la regulación hormonal y del sistema inmune: el reloj
circadiano. Diversos estudios demuestran que el ciclo circadiano a través de varios genes regula la
expresión de TLR9, citocinas pro-inflamatorias, el número de células NK, linfocitos Tγδ, linfocitos T CD8+,
linfocitos T CD4+ y el total de linfocitos T en la sangre venosa periférica. Los ciclos de estas células
muestran diferentes acrofases que correlacionan tanto positiva como negativamente con
concentraciones séricas de cortisol, epinefrina, melatonina, tirotropina, hormona liberadora de tirotropina
(TRH), hormona estimulante de tirotropina (TSH), y hormona de crecimiento (GH) (Arjona, 2012).
Per2 es un emergente e importante punto de conexión entre el ciclo circadiano y el sistema
inmune. Varios estudios han asociado a Per2 con cáncer, la síntesis de IFN-γ y la citotoxicidad mediada
por células NK. Se ha observado que en el cáncer Per2 está disminuido, y su sobreexpresión permite la
supresión de crecimiento tumoral in vivo, permitiendo un control en el ciclo celular. Se desconoce aún el
mecanismo por el cual Per2 contribuye a estos procesos. También se ha observado que Per2 es
importante para los cambios en la expresión de receptores citotóxicos como Ly49C y NKG2D en las
células de la médula ósea.
Otro componente importante del reloj circadiano es el heterodímero CLOCK-BMAL1 (receptor
nuclear translocador tipo I de hidrocarbono arilo de cerebro y músculo), el cual se une a los elementos
de caja E de genes que traducen a TLR9. Asimismo, se ha informado que Rev ErbA modula la
producción de citocinas pro-inflamatorias como IL-6, la cual aumenta en el suero de mujeres
menopáusicas. Por otro lado, E4BP4 es esencial para el desarrollo de células NK y células dendríticas
CD8α+, además está involucrado en la regulación de la activación de macrófagos, en la polarización de
linfocitos T CD4+ y en el rearreglo de la inmunoglobulina IgE (Arjona, 2012).
En base a estos conocimiento y debido a que en nuestro país, en un estudio realizado en tres
estados con mujeres en la menopausia, se encontró que la frecuencia de bochornos varía de 73 a 32%
(Malacara, 2002), y que además los factores como depresión, dominancia-sumisión, esfuerzo-
recompensa (Aguilar-Zavala 2012) están fuertemente asociados a mujeres en la menopausia, se sugiere
que esta asociación, se pudiera deber a los cambios circadianos ocurridos en el sistema inmune y
nervioso. Por lo tanto, es posible que los flujos circadianos del sistema inmune pudieran ser útiles como
biomarcadores en la identificación del tiempo de la menopausia y/o predisposición a síntomas, ya que
previos estudios muestran variabilidad en la secreción de cortisol (Moreno-Frías C, enviado, 2013), y en
la hormona anti-mülleriana (AMH). Además, es probable que muchos de los cambios observados
durante la menopausia sean el resultado de un desbalance de la homeostasis circadiana, como lo son
las alteraciones del sueño y los niveles de glucocorticoides.
Los trabajos hasta el momento realizados sobre las células NK, solamente describen la expresión
de algunos de los receptores que expresan estos leucocitos en mujeres mayores de 65 años, sin
embargo, no relacionan los hallazgos con la sintomatología, ni con estatus hormonal.
Por lo tanto, en el presente estudio se explorará la expresión de diferentes receptores por células
NK, su posible relación de los niveles de moléculas reguladoras del ciclo circadiano y con niveles
hormonales (estradiol, cortisol, AMH). Asimismo, se explorará la posible correlación entre los parámetros
anteriores y los diversos síntomas de la menopausia.
Hipótesis
Las mujeres en la postmenopausia temprana y tardía presentarán una alteración mayor en el repertorio
de los receptores de células NK, debida al proceso fisiológico de la edad y posiblemente a la variabilidad
hormonal y ciclo circadiano, en comparación con aquellas mujeres en la peri-menopausia.
Objetivo
Determinar la expresión de receptores de las NK y genes del ciclo circadiano en mujeres durante
la peri y la postmenopausia
Objetivos específicos
1) Determinar los niveles de expresión de diversos receptores de las células NK en mujeres
durante la peri, postmenopausia temprana y tardía
2) Determinar concentraciones séricas de hormonas (estrógeno, FSH, LH, prolactina) y citocinas
pro-inflamatorias
3) Determinar la expresión de los genes del ciclo circadiano (Per2)
4) Correlacionar los niveles de expresión de los receptores en las células NK con niveles
hormonales, síntomas de manopausia y ciclo circadiano.
METAS a) Metas científicas
Se tiene contemplado que a través del proyecto de Investigación se genere conocimiento básico nuevo de frontera y relevante en las áreas de Neuroendocrinología, Inmunología y menopausia, el cual será difundido a través de la publicación de artículos científicos originales en revistas de prestigio y alto índice de impacto. Así como también publicaciones difusión para dar a conocer el los resultados en mujeres vulnerables a éstos problemas. La generación de anticuerpos específicos frente a estas moléculas podrían desarrollar patentes que sirvieran tanto para el diagnóstico como para futuros tratamientos biológicos. Estos resultados obtenidos serán aportaciones nuevos al campo de la Reproducción e Inmunología que ayudarán a un mejor entendimiento de esta condición de vida. Además es importante mencionar que los 2 grupos de trabajo que participan en este Proyecto de Investigación al Fortalecimiento de CA, están conformados por un Investigador jóven y por otros con experiencia tanto básica como aplicada en el estudio de la menopausia y el sistema inmune, así como también con trayectoria en la investigación traduccional, es decir, integración entre la ciencia básica y el conocimiento clínico. Lo anterior asegura que los esfuerzos del grupo de trabajo irán en esa dirección, es decir, la generación de conocimiento básico de frontera y su posterior traslado a la sociedad en la forma de nuevas modalidades terapéuticas que permitan una disminución del fenómeno crónico inflamatorio de bajo grado que se desarrolla durante a menopausia y evite la aparición de síntomas tales como los bochornos, ansiedad y depresión, que conlleven a un riesgo de enfermedad cardiovascular. A este respecto, es importante mencionar que los integrantes del proyecto consideran al mismo como una excelente oportunidad para incubar a un grupo de investigación que en los siguientes 10 años debería de convertirse en un grupo líder a nivel mundial en el área básica y aplicada del sistema inmune y su implicación en la génesis de la menopausia. Es evidente que una vez conformado, este grupo tendría asegurada su actividad futura mediante la gestión de recursos para investigación, algo en lo que sus integrantes tienen amplia experiencia. Publicación de al menos un artículo científico original en revista de prestigio y alto índice de impacto. La constitución de un grupo multidisciplinario de investigación: Aunado a esto, se espera también poder elaborar de proyectos de investigación paralelos y generación de recursos adicionales, que asegurará la difusión del conocimiento generado y la posibilidad de acceder a recursos adicionales por diversas agencias nacionales e internacionales.
b) Formación de Recursos Humanos Con el presente Proyecto de Investigación se pretende llevar a cabo la formación de recursos humanos de alta calidad para la investigación científica. Lo anterior a través de la inclusión en el proyecto de estudiantes de posgrado y de su entrenamiento en tecnología de punta (citometría de flujo multiparamétrica, microscopía analítica de última generación, etc.). En el presente proyecto podrán participar 2 estudiantes de posgrado (1 de Maestría y 1 de Doctorado), quienes obtendrán su grado mediante su participación en el proyecto y lo harán durante el transcurso del mismo.
MATERIAL Y MÉTODOS
Diseño del estudio: Se efectuará un estudio clínico con una etapa en sección transversal. Se
seleccionará un conjunto de 100 mujeres en la peri-menopausia, 100 mujeres en etapa temprana de la
menopausia (menos de 5 años) y 100 mujeres en etapa tardía de la menopausia (más de 5
años),utilizando los criterios de STRAW, con y sin presencia de síntomas.
Tamaño de la muestra. Se calcula que para obtener 300 mujeres en la menopausia será
necesario entrevistar cerca de 600 mujeres que se sepan en menopausia establecida. Dada la
homogenización que se logrará con éstos criterios se espera obtener un nivel de beta al menos similar a
la obtenida en nuestros estudios previos (Aguilar-Zavala 2012, Malacara y cols, 2004).
Criterios de inclusión. Se estudiarán mujeres peri, y postmenopáusicas temprana y tardía con
más de 45 años, cuya última fecha de menstruación al menos un año previo, pero no más de diez, que
no estén recibiendo medicación hormonal, o hubiesen recibido radioterapia. Las mujeres seleccionadas
no tendrán diabetes, ni índice de masa corporal >35kg/m2 u otras enfermedades crónica-metabólicas,
degenerativas o infecciosas crónicas, y sin enfermedad infecciosa aguda los últimos 30 días.
Cuestionario sobre síntomas. Se colectarán los síntomas más frecuentes en la menopausia
(Anexo 2) de acuerdo con nuestro reportes previos (Malacara y cols 2002, Aguilar-Zavala y cols 2012):
bochornos, sequedad vaginal y disminución del interés sexual se clasificará como negativo=0, ligero=1,
moderado=2 y severo=3;
Depresión y ansiedad se colectarán usando la escala de Hamilton-Bech-Rafaelsen (HSD/MES);
depresión por medio de 9 items, y ansiedad con 19 items. Estrés percibido fue adaptado del reporte de
Cohen como en nuestro trabajos previos (Garay-Sevilla y cols, 2000), tiene 14 preguntas con una
calificación total de 0 a 56)
Cuestionarios sobre indicadores de estrés psicosocial. Se efectuarán de acuerdo a nuestro
reciente reporte (Aguilar-Zavala y cols, 2012), con los siguientes ítems:
A) Dominancia. La dominancia se evaluará con la “prueba simple de adjetivos” de acuerdo a
Grant (1992), que incluye 64 adjetivos arreglados en 2 columnas, para explorar los
sentimientos de los sujetos y que tienen un rango total de 0 a 6.
B) Sumisión. Se efectuará de acuerdo a Allan y Gilbert (1995), que contiene 16 items a
contestar como: nunca = 0, siempre = 4, para una calificación total de 0 a 64.
C) Desbalance esfuerzo-Recompensa. Se utilizará el cuestionario desarrollado por Siegrist,
adaptado al idioma español por Macías-Robles y cols (2003). La escala resulta de la relación
entre esfuerzo intrínseco y recompensa que después de estandarización puede dar valores
superiores o inferiores a 1.0, indicando respectivamente alto o bajo riesgo de daño
psicosocial.
Muestras. Se obtendrán 30 ml de sangre heparinizada y 10 ml de sangre sin anticoagulante para
la determinación de bioquímicos, citocinas y hormonas. Una vez obtenidas las muestras, se
rotularán con un código asignado para cada paciente, a fin de que el encargado de procesar las
muestras se encuentre cegado acerca del diagnóstico y tratamiento. El suero se obtendrá
mediante centrifugación y se congelará a -70°C. El resto de la sangre se utiliza para la obtención
de células mononucleares (CMN).
Medición de metabolitos y hormonas. Se determinarán concentraciones séricas de glucosa,
colesterol y triglicéridos por métodos convencionales. Se cuantificarán FSH, estradiol, hormona anti-
mülleriana, estrona, SHBG, resistina, cortisol matutino, en una muestra de sangre de ayuno,por
radioinmunoensayo y/o ELISA, según las características de los reactivos disponibles en su momento.
Niveles séricos de citocinas pro-inflamatorias. Se determinarán los niveles séricos de las
citocinas IL-6, TNF-α, IL-1β, IFN-γ mediante ELISA, empleando kits comerciales (Quantikine, R&D
Systems, Minneapolis, MN, USA).
Obtención de CMN. Las células mononucleares (CMN) serán obtenidas de sangre heparinizada
por gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque (densidad 1.077 g/ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Lac
células serán lavadas con buffer de fosfatos de Dulbeco (DPBS) y se resuspenderán en tampón (Miltenyi
Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). La viabilidad celular se determinará por exclusión con azul
tripano.
Obtención del DNA genómico. Se aislará el DNA genómico a partir de sangre completa con
EDTA. Se procederá mediante la técnica de TSNT. Las muestras se centrifugarán para obtener la
fracción de los leucocitos, posteriormente mediante varios pasos de extracción con solventes, se
recogerá la fase acuosa, a la cual se le añadirá alcohol absoluto para precipitar el DNA y se realizarán
lavados.
Extracción de RNA. Una fracción de células mononucleares se congelará en nitrógeno
líquido durante unos segundos y después se almacenará a -70°C hasta la posterior extracción
del RNA. El RNA total se obtendrá a partir de 3 x 106 células, mediante la técnica de TRIzol,
siguiendo las instrucciones del fabricante: precipitando con isopropanol. Después, se realizará
un lavado con etanol al 75% y se resuspenderá en agua tratada con DEPC. La pureza y
concentración del RNA total se realizará por espectrofotometría a una longitud de onda de
260/280 nm.
Síntesis del cDNA. El DNA complementario (cDNA) se sintetizará a partir de una
concentración de 1 µg de ARN total utilizando el iniciador Oligo dT a 1 µg/µl de ARN total y se
incubará a 70°C por 3 minutos. Después, se enfría a 37ºC y se mantiene por 10 minutos, para
después adicionar una mezcla formada por desoxiribonucleótidos (dNTP´s), RNAsin como
inhibidor de RNAsa, y la enzima transcriptasa reversa del virus de leucemia murina de moloney
(MMLVRT) en buffer de reacción. Posteriormente, la reacción se incubará a una temperatura de
37°C por 25 minutos y se realizará una desnaturalización a 85°C por 5 minutos. El cDNA se
amplificará y marcará mediante el uso de una mezcla de LPR, que consiste de los oligos dT,
MgCl2, buffer de reacción, H2O DEPC y la enzima Taq DNA polimerasa. Se llevará a cabo la
reacción en ciclos de temperatura-tiempo, con una desnaturalización 85°C por 5 minutos y 30
ciclos de 85ºC, 1 min; 50ºC, 1 min; 72ºC, 1 min; para terminar con 72ºC 5 min. Se utilizará como
housekeeping el RNAm de la histona H3, la cual se expresa constitutivamente en las células.
PCR de tiempo real para expresión de Per2. Las secuencias de interés en el cDNA
correspondiente se amplificarán con el empleo de oligonucléotidos específicos para Per2
acoplados a VIC, mediante reacción en cadena de polimerasa en tiempo real, con el empleo del
equipo CF96X Touch (Bio-Rad).
Fenotipo de células NK. La detección de marcadores de superficie de NK se llevará a cabo de
la siguiente manera: se realizarán cuadruples marcajes de superficie en la fracción de CMN. Se
utilizarán los siguientes anticuerpos: anti-CD45-APC/Cy7 (Biolegend®), anti-CD3-PerCP, anti-CD56-APC
(eBioscience®), anti-CD16-FITC (eBioscience®), anti-NKG2C (R&D Systems®), anti-KIR (anti-
KIR2DL1/2DS1, -KIR2DL1/2DS1/2DS3, -KIR3DL1, -KIR2DL2/2DS2). Se determinará mediante los
parámetros FSC y SSC la población de leucocitos CD45+ y a partir de ésta, se seleccionará la población
de células NK como CD3-CD56bright y CD3-CD56dim. Todas las células serán analizadas en el citómetro
de flujo FACSCanto II de Becton Dickinson, y los resultados se expresarán como el % e intesidad media
de fluorescencia (IMF).
Determinación de haplotipos. Se utilizarán primers específicos para cada uno de los KIRs y se
realizará la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con las condiciones establecidas para cada uno
de los genes que se deseen amplificar (KIR2DL1/DS1, KIR3DL1, etc.), empleando el termociclador
CFX96 Touch (BioRad). Se correrá un gel de agarosa para verificar el tamaño de los amplicones y se
verificarán en una base de datos para conocer el haplotipo de cada individuo.
Análisis de resultados. Para el estudio basal se tomarán para la prueba de hipótesis se
tomarán los bochornos como la variable dependiente, como variables independientes se tomarán los
indicadores de receptores inhibitorios y estimuladores. Como variables confusoras se tomarán la edad
tiempo desde la última menstruación obesidad, indicadores de exposición a estrógenos, (niveles de FSH
y estrógenos), y los indicadores de estrés: depresión, ansiedad, y las escalas de dominancia, sumisión,
y desbalance esfuerzo recompensa. El análisis de efectuará mediante procedimientos multivariados:
Regresión múltiple paso a paso y regresión logística.
Consideraciones éticas. El estudio no representa para las participantes un riesgo superior al
mínimo. Se garantiza la confidencialidad de los resultados de cada individuo. Las participantes firmarán
carta de consentimiento informado. El proyecto será sometido al comité de ética institucional. (Anexo 1)
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GRUPO DE TRABAJO
El grupo de trabajo está conformado por tres investigadores (1 Endocrinólogo y experto en
Reproducción Humana, 2 Inmunólogos y 1 Genetista y Biólogo Molecular).
El presente Proyecto de Investigación pretende consolidar este Grupo de Investigación Aplicada
y contribuir al Fortalecimiento del Cuerpo Académico: Reproducción y Metabolismo, para continuar y
ahondar en el estudio de la menopausia y la comprensión del origen o causas de la diversidad en la
sintomatología e incidencia en riesgos de enfermedades cardiovasculares principalmente. Además, se
planea fortificar la colaboración con el Dr. Roberto González Amaro, quien es un Inmunólogo reconocido
a nivel Nacional, con amplia trayectoria en este campo y con quien se mantiene ya una estrecha
colaboración. El Dr. González-Amaro pertenece al Cuerpo Académico: Inmunología.
PARTICIPANTES DE Universidad de Guanajuato Campus Leon Departamento de Ciencias Médicas.
Dra. Nicte Guadalupe Figueroa Vega Profesor Investigador Tiempo Completo Asociado C SNI Nivel I Inmunóloga con amplia experiencia en todas las técnicas requeridas para los experimentos planteados. Y dentro del proyecto, participará en: Elaboración de protocolo Recogida de protocolos clínicos de pacientes Entrenamiento a estudiantes de posgrado en las diferentes técnicas inmunológicas y de biología molecular que se utilizarán para llevar a cabo el proyecto Así como también, la participación en: Comunicación constante entre diversos grupos de investigación para el correcto análisis de resultados del proyecto Análisis de datos Elaboración de manuscritos Difusión del conocimiento generado y la posibilidad de acceder a recursos adicionales por diversas agencias nacionales e internacionales Presentación del trabajo en Congresos Nacionales e Internacionales Difusión del conocimiento en revistas médicas
Dra. Elva Leticia Pérez Luque Profesor Investigador Tiempo Completo SNI Nivel II Investigadora experta en polimorfismos poblacionales aplicados a enfermedades metabólicas y reproducción. Posee conocimientos en las técnicas de aislamiento de DNA genómico, RNA total, retro transcripción, RT-PCR en punto final y tiempo real, detección de polimorfismos, micro-satélites, ensayos de restricción. Y dentro del proyecto, participará en: Elaboración de protocolo
Entrenamiento a estudiantes de posgrado en las diferentes técnicas inmunológicas y de biología molecular que se utilizarán para llevar a cabo el proyecto Presentación del trabajo en Congresos Nacionales e Internacionales Difusión del conocimiento en revistas médicas
Dr. Juan Manuel Malacara Profesor Investigador Tiempo Completo Titular SNI Nivel III Endocrinólogo reconocido con amplia experiencia en menopausia Y dentro del proyecto, participará en: Elaboración de protocolo Elaboración de encuestas Comunicación constante entre diversos grupos de investigación para el correcto análisis de resultados del proyecto Elaboración de manuscritos
Estudiantes
El Estudiante de maestría Mauricio Sánchez Barajas, participará en la aplicación de cuestionarios psicológicos y conductuales y datos clínicos. Enfoque principal en la influencia de factores psicosociales en los síntomas en la menopausia. Participará en conjunto con el equipo en el análisis y la interpretación de los resultados. El estudiante Sánchez-Barajas recibe beca del programa de PNP
La Estudiante de Doctorado Alejandra Caballero Briones, participará en la realización de las diversas técnicas a utilizar, análisis e interpretación de los datos. Alejandra Caballero Briones, iniciará su Doctorado en Agosto de 2013 y es candidato a Beca del programa PNP. Y este proyecto de Investigación formará parte de su Tesis Doctoral. PARTICIPANTE DE Universidad Autónoma de San Luis Potosí Facultad de Medicina Departamento de Inmunología. Dr. Roberto González Amaro Profesor Investigador Tiempo Completo Titular SNI Nivel III Inmunólogo con amplia experiencia en todas las técnicas requeridas para los experimentos planteados. Y dentro del proyecto, participará en: Comunicación constante entre diversos grupos de investigación para el correcto análisis de resultados del proyecto Análisis de datos Elaboración de manuscritos Difusión del conocimiento en revistas médicas
INFRAESTRUCTURA DISPONIBLE
Cabe señalar, que el presente Proyecto se realizará en su totalidad en el Departamento de Ciencias
Médicas de la Universidad de Guanajuato, campus León. Solamente, se acudirá al Laboratorio del
Departamento de Inmunología a estandarizar algunas técnicas y en su defecto a utilizar algún equipo
que por alguna razón de fuerza mayor no se pueda disponer de éste en Dpto Ciencias Médicas.
Departamento de Ciencias Médicas, Ugto campus León
Física. El Departamento de Ciencias Médicas de la Universidad de Guanajuato, campus León,
cuenta con parte de la infraestructura necesaria para la realización del proyecto, lo cual incluye 5
laboratorios de investigación:
Laboratorio Clínico: equipado con espectrofotómetro, autoanalizador bioquímico, microscopio
de luz blanca, congelador de -20°C, procesador y lector de placas de ELISA.
Laboratorio de radioinmunoensayo: que cuenta con contador de radioactividad gamma, barras
de plomo, dos refrigeradores.
Laboratorio de Biología Molecular I: Equipado con una campana de flujo laminar, un
incubador, un microscopio óptico, un termociclador, equipos de RT-PCR en Tiempo Real, equipo
bidimensional de geles.
Además este laboratorio cuenta con un contador celular de uso propio.
Laboratorio de Biología Molecular II: Equipado con HPLC, 1 termociclador, cámaras de
electroforesis horizontal y vertical, cuantificador de ácidos Nucleicos.
Laboratorio de Biología Celular: equipado con bomba de vacío, 1 microscopio óptico,
incubador, máquina de hielo, así como equipo de uso general como centrífugas, microcentrífugas,
fuentes de poder, baños, agitadores.
Laboratorio de Citometría: equipado con un citómetro FACSCanto II con su equipo de cómputo
para la adquisición y el análisis de datos.
Laboratorio de Inmunología: equipado con centrífugas refrigeradas, refrigeradores,
congeladores, termociclador en tiempo real, cuarto de cultivo con campana de flujo laminar con filtros
HEPA.
Cubículos Clínicos. Se cuenta con los cubículos clínicos necesarios para el estudio.
Departamento de Inmunologia, UASLP
La infraestructura con la que se cuenta en los laboratorios deL Dr. González-Amaro incluye: 4 termocicladores de gradiente, 1 termociclador en tiempo real, dos centrífugas refrigeradas, una centrifuga de mesa, dos microcentrifugas, un espectofotómetro para microplacas, área de cultivo equipado con sistema de filtración de aire HEPA, dos campanas de flujo laminar y dos incubadoras de CO2, microscopio invertido y microscopio óptico para histoquímica (Eclipse Ci-L, Nikon), un sistema de fotodocumentación, cosechador de células semiautomático, autoclave, ultracongelador de -80°, dos congeladores de -20°, congeladores y refrigeradores. También se cuenta con una balanza granataria y una analítica, una incubadora para hibridación, un entrecruzador por luz ultravioleta, un horno de convección y una incubadora de 37°C. Cuatro sistemas de electroforesis para separación de proteínas,
dos cámaras de electrotransferencia semihúmeda, tres cámaras para electroforesis horizontal, tres fuentes de poder. Así como con computadoras, impresoras, equipos para escáner, acceso a internet. En conjunto, la infraestructura con la que se cuenta, garantiza el cumplimiento de los objetivos propuestos en el proyecto.
PROGRAMA DE ACTIVIDADES A) PRIMER SEMESTRE
Para la primera parte de este Proyecto de Investigación se incluirá a los 2 estudiantes de Posgrado para que participen y lleven a cabo tanto la toma de muestra como los experimentos. Se colectarán la edad, escolaridad en años, historia menstrual e información de patología relevante para los criterios de inclusión. Se aplicará el cuestionario sobre síntomas físicos y emocionales frecuentes en la menopausia. Se aplicará un cuestionario sobre factores psicológicos asociados a los síntomas. Se tomará una muestra de sangre para medir metabolitos y hormonas, para la determinación de haplotipos y estudios citoflurométricos. Se asistirá a Congreso para presentar los resultados.
B) SEGUNDO SEMESTRE Se completará el tamaño de muestra. Se medirán las hormonas mediante RIA y ELISA. Se realizarán los marcajes de citometría de flujo para determinar las poblaciones de células NK y la expresión de sus receptores. Se terminará de llevar a cabo los haplotipos. Se realizará el análisis estadístico e interpretación de resultados. Se asistirá a Congreso para presentar los resultados. Finalmente, se escribirán las Tesis de Posgrado de los estudiantes que participaron en la realización de ambas etapas y se elaborará el manuscrito
PRESUPUESTO Fondo concurrente: Gasto corriente Material de consumo de uso directo: $ 65,000.00 Inscripción y Viáticos Congreso $ 20,000.00 Total de presupuesto: $ 100,000.00
Justificación presupuesto Primer semestre:
a) Para la adecuada y correcta realización del presente Proyecto de Investigación es necesario contar con el material y reactivo necesario, como son placas de cultivo, flask, (Paquetes de 100 de Corning), pipetas serológicas, pipetas pasteur, racks, puntas (bolsas de 100 ó 1000), puntas con filtro para RT-PCR (bolsas de 1000), tubos eppendorf (bolsas de 1000 de Axygen), criotubos (bolsas de 1000 de Corning), frascos para preparar soluciones, filtros. También es necesario los oligonucléotidos específicos para amplificar las moléculas de interés, así como las enzimas para llevar a cabo la retrotranscripción (2 juegos de enzima con buffer y dNTPs, de Promega) y PCR en tiempo real (2 kits de 96 reacciones de Roche) y las enzima de restricción. Así como también es importante contar con medio de cultivo (RPMI, 2 cajas de 12 botellas de 500 ml c/u de Cambrex o Lonza), suero bovino fetal (1 caja de 12 botellas de 500 ml c/u, de Cambrex o Lonza), antibióticos, glutamina, albúmina sérica (1 frasco de Sigma-Aldrich), buffers como DPBS (2 caja de 12 botellas de 1 L, de Cambrex) y HSBB (2 cajas de 10 sobres de Dako Cytomation). La cantidad solicitada para la compra del material y reactivos es de $40,000.00.
Segundo semestre:
a) Para terminar el Proyecto, se van a utilizar tubos para citometría (paquete de 1000 de BD), así como también los anticuerpos monoclonales purificados para realizar los ensayos de citometría de flujo (anti-CD45-APC/Cy7 (Biolegend®), anti-CD3-PerCP, anti-CD56-APC (eBioscience®), anti-CD16-FITC (eBioscience®), anti-NKG2C (R&D Systems®), anti-KIR (anti-KIR2DL1/2DS1, -KIR2DL1/2DS1/2DS3, -KIR3DL1, -KIR2DL2/2DS2). Kits de RIA para determinar los niveles de hormonas como estradiol, AMH, cortisol, FSH. También es requerido para este proyecto los kits de ELISA para determinar las concentraciones séricas de las moléculas IL-6, TNF-α, IL-1β, IFN-γ (3 kits de cada uno, de R&D Systems).Se solicita la cantidad de $40,000.00
b) Pago de inscripción a los diversos Congresos Nacionales y/o Internacionales para presentación de resultados en poster o conferencias. Se plantea que con el monto se cubra la inscripción de al menos 2 de los Participantes de este Proyecto. y además apoyo para viáticos (transporte y hospedaje) Monto a cubrir $20,000.00.
RESULTADOS ENTREGABLES PUBLICACIÓN DE ARTÍCULOS ORIGINALES Como productos de la investigación se publicará en revistas internacionales de impacto al menos dos manuscritos. Informar también, a través de revistas científicas de divulgación en las áreas de Medicina y Salud, los nuevos hallazgos sobre la génesis de los síntomas vasomotores y emocionales en la menopausia con la posibilidad de diseñar estrategias terapéuticas para bloquear los efectos de las moléculas inflamatorias. RECURSOS HUMANOS FORMADOS Con el presente Proyecto de Investigación podrán obtener su Grado de Maestro en Ciencias y Doctor en Ciencias 2 estudiantes de los Programas de Posgrado en Ciencias Médicas de este Departamento. BASES DE DATOS Este Proyecto de Investigación, permitirá la creación de bases de datos de mujeres en menopausia que podrán servir para tener información vital para futuros Proyectos. Además, se generarán bancos de sueros y genómicos.
OTROS
Presentación de trabajos en Congresos Científicos. Con los datos que se generen de este proyecto de Investigación se pretende poder asistir a Congresos de reconocido prestigio como el Endocrine Society Meeting, International Congress of Endocrinology y el Congreso de la Sociedad Mexicana de Nutrición y Endocrinología. Originalidad y relevancia. Debido a que no se conoce con precisión el origen del fenómeno depresión-ansiedad y síntomas vasomotores, y existe una asociación con el sistema inmune, resulta de interés explorar el papel del repertorio de los receptores de las células NK como posibles causas u origen del desarrollo de depresión, ansiedad y bochornos en las mujeres menopáusicas. Asimismo, el conocimiento anterior permitirá conocer mejor y profundizar en la fisiopatogenia de estos síntomas asociados a la menopausia. Además es importante mencionar que los grupo de trabajo de los diversos Centros de Investigación que participan en la realización de este Proyecto de Investigación, está conformado por investigadores con experiencia tanto básica como en el estudio de la patogenia de la menopausia y el sistema inmune, así como también con trayectoria en la investigación traduccional, es decir, integración entre la ciencia básica y el conocimiento clínico. Lo anterior asegura que los esfuerzos del grupo de trabajo irán en esa dirección, es decir, la generación de conocimiento básico de frontera y su posterior traslado a la sociedad en la forma de nuevas modalidades terapéuticas en enfermedades inflamatorias crónicas. A este respecto, es importante mencionar que los integrantes del proyecto consideran al mismo como una excelente oportunidad para incubar a un grupo de investigación que en los siguientes 10 años debería de convertirse en un grupo líder a nivel mundial en el área básica y aplicada del sistema inmune y su implicación en la sintomatología de la menopausia. Es evidente que una vez conformado, este grupo tendría asegurada su actividad futura mediante la gestión de recursos para investigación, algo en lo que sus integrantes tienen amplia experiencia.
Anexo 1
Hoja de información y consentimiento de participación voluntaria en el Proyecto de
Investigación:
“Estudio del repertorio de los receptores de células NK en mujeres durante la peri y postmenopausia y su relación con los síntomas”
Por medio del presente escrito, doy mi consentimiento a los investigadores del Departamento de
Ciencias Médicas de la Universidad de Guanajuato para tomar parte en el presente estudio.
Acepto cooperar plenamente con el investigador ya que me ha dado una explicación completa de
los propósitos, beneficios, naturaleza y riesgo del estudio (ésta investigación no tiene riesgo superior al
mínimo categoría I).
Entiendo que estoy en libertad de declinar a participar en el estudio o retirarme en cualquier
momento, sin que esto me implique perjuicio.
Acepto que para propósito de verificar los resultados de este estudio se pueda mostrar mi archivo
médico bajo los términos de estricta confidencia.
Entiendo que mi nombre no aparecerá en ningún reporte del estudio y que en ninguna forma
podré restringir el sudo de los resultados de éste.
NOMBRE DEL PACIENTE__________________________________ FIRMA_____________________
NOMBRE DEL TESTIGO___________________________________ FIRMA_____________________
FECHA____________________________
Confirmo haber dado una explicación completa de los propósitos, beneficios, naturaleza y riesgos
del estudio al paciente arriba firmante, quien ha aceptado participar.
NOMBRE DEL INVESTIGADOR_____________________________ FIRMA_____________________
FOLIO________________________
Nombre:________________________________________________ Edad: ________ Fecha:___________
Fecha de Nacimiento:_________________ Dirección: ____________________________________
Teléfono:___________________ Peso (kg) ________ Talla: ________ Circ. Cintura (cm):_________
Circ. Cadera (cm):_________ TA sistólica_________________ TA diastólica __________________
Vive sola o con su pareja 0= Sola 1= Pareja ____
Tiene hijos 0= Si 1= No ____
ESTILO DE VIDA
1. Ejercicio físico regular_____________ veces por semana, durante____________ min
2. Tipo de ejercicio 1 Caminata___ 2 Correr___ 3 Nadar___ 4 Aeróbics___ 5 Gimnasio___
6 Juego deportivo___ 7 otro___ ____
3. N° de cigarrillos por día___ (0 = no) ____
4. N° de bebidas alcohólicas por semana ___ (0 = no) ____
ANTECEDENTES GINECO-OBSTÉTRICOS 1.- Edad de menarca _____________ años ___
2.- Regularidad de ciclos menstruales Si 1) ___ No 0) ___ ___
3.- Longitud del ciclo menstrual __________ días ___
4.- Duración del Sangrado ____________ días ___
5.- Tipo de Sangrado 1) Leve ____ 2) Moderado ____ 3) Abundante ____ ___
6.- Tiempo última de menstruación (años) _________________________ ___
7.- N° de embarazos ______________ ___
8.- N° de partos __________________ ___
9.- N° de abortos _________________ ___
10.- N° de cesáreas _______________ ___
11.- Amamantó a sus hijos? Si 1)___ No 0)___ por cuanto tiempo en meses 1_2_3_4_5_6_7_>10_ ___ 12.- Fecha de última regla______________________
SÍNTOMAS VASOMOTORES Experimenta bochornos u oleadas de calor (sí / no), __0
¿con qué frecuencia la experimenta?
_____ años
_____ min/semana
"cada hora o más frecuente" ____8. "cada 2-5 horas" ____7, "de 6-11 horas " ___6, "de 12-23 horas"____,5 "1 a 2
días por semana" ____4, "3-4 días por semana”____3, “5-6 días por semana”______2 “menos de una vez a la
semana”____1.
Frecuencia de bochornos (1-8) ___
Duración del bochorno Transitorio (menos de 1 min)1 ___; Duradero (más de un minuto)2____;
Duración___
Intensidad del bochorno Experimenta bochornos Leve1 _____ moderado2 ____severo3,_____
Intensidad ___
Sudoraciones nocturnas 0) Nunca____ 1)Algunas veces____ 2)Con frecuencia____3)muy frecuentemente____ ___
SEQUEDAD VAGINAL Ha sentido resequedad en su vagina
0) No____ 1)escasa____ 2)moderada____ 3)severa____ ___
Comezón vaginal
0) No____ 1)escasa____ 2)moderada____ 3)severa____ ___
DISPAREUNIA Tiene dolor al tener relaciones sexuales? Si____ No____ ___
PÉRDIDA DEL INTERÉS SEXUAL Ha perdido el interés sexual
0) No____ 1)ligeramente____ 2)moderadamente ____ 3)severamente____ ___
PERCEPCIÓN DEL ESTRÉS
Se le aplicarán algunas preguntas acerca de los sentimientos e ideas experimentados durante el último mes. En
cada situación usted deberá indicarme la frecuencia se sus sentimientos, para lo que deberá elegir entre las
siguientes alternativas:
0 – NUNCA
1 – CASI NUNCA 2 – ALGUNAS VECES 3 – POCO FRECUENTE
4 – MUY FRECUENTE
Con que frecuencia en este último mes
1.- Se preocupa por algún suceso inesperado? ___
2.-Es incapaz de controlar las cosas importantes de la vida? ___
3.-Se ha sentido nerviosa y estresada? ___
4.- Le han ocurrido sucesos molestos o irritantes? ___
5.- los cambios importantes de su vida los ha enfrentado satisfactoriamente? - ___
6.- confía en su capacidad para manejar sus problemas? ___
7.- Ha sentido que las cosas estaban tomando un buen camino? ___
8.- Ha sentido que no podía enfrentarte a todas las cosas que tenía que hacer? ___
9.- Controla su enojo? ___
10.- Ha sentido que ya no puede más en los asuntos de la vida diaria? ___
11.- Se has molestado por sucesos fuera de su control? ___
12.- Piensa con cuidado las cosas que tiene que realizar? ___
13.- Controla bien el uso de su tiempo? ___
14.- Ha sentido que las dificultades se le acumulan tanto que no puede superarlas? ___
Total estrés____
ESCALA DE ANSIEDAD (si=1, no = 0)
1.- Dolor en el pecho si___, no____
2.- Palpitaciones si___, no____
3.- Mareos (vértigo) si___, no____
4.- Falta de aire si___, no____
5.- Zumbido en los oidos si___, no____
6.- Sudoración si___, no____
7.- Sensación de desmayo si___, no____
8.- Dolor de cabeza si___, no____
9.- Ansiedad si___, no____
10.- Bochornos si___, no____
11.- Miedo si___, no____
12.- Inestabilidad si___, no____
13.- Hormigueos en manos y en pies si___, no____
14.- Temblores si___, no____
TOTAL ANSIEDAD___________
DEPRESIÓN
1.- Se siente triste, que le falta ayuda o que vale poco? ____
0No____ 1Solo cuando lo preguntan____ 2Con frecuencia____ 3Casi siempre____
4Siempre____
2.- Interés y vitalidad en el trabajo y la ocupación ____
0No tiene problemas____ 1Se siente cansada o deprimida ____
2Le falta interés en sus actividades y requiere de esfuerzo para concentrarse____
3No puede trabajar más de 3 horas al día____
3.- Siente fatiga ____
0No ____ 1Sus fuerzas están disminuidas____ 2Tiene sensación de malestar corporal____
3Se siente muy débil____
4.- Padece frecuentemente dolores de cabeza, espalda, muscular o abdominal? (dolores) ____
0No____ 1Ocasionalmente____ 2A menudo____
5.- Sentimientos de culpa ____
0No tiene____ 1Se culpa por haber defraudado a alguien____
2 Tiene sentimientos de culpa____ 3Siente que sus molestias son un castigo____
4Tiene alucinaciones (oye que lo acusan o amenazan)____
6.- Disminución de la capacidad verbal ¿le cansa hablar o que le hablen? ____
0No____ 1En ocasiones____ 2A menudo____ 3Casi siempre____ 4Siempre____
7.- Pensamientos suicidas ____
0Nunca ____ 1En ocasiones____ 2Constantemente (Deseos de morir)____
3 Siempre (ideas suicidas)____ 4Ha intentado suicidarse____
8.- Lentitud de pensamiento y al hablar, dificultad para concentrarse, actividad
motora disminuida ____
0Su lenguaje y pensamientos son normales____ 1En ocasiones es lenta para hablar o
pensar___ 2Frecuentemente es lenta para hablar o pensar____
Depre (26) _____
PROBLEMAS DEL SUEÑO
1.- Tiene problemas para conciliar el sueño? ____
0Ninguno____ 1Ocacionales de más de 30 min.____ 2Constantes____
2.- Problemas con el sueño interrumpido ____
0Ninguno____ 1Su sueño es interrumpido e inquieto____
2Despierta a media noche y no puede conciliar el sueño____
3.- Alteraciones del sueño por la mañana ____
0No____ 1Despierta muy temprano y vuelve a dormir____
2Despierta muy temprano y no puede volver a dormir____
Sueño (6) ____
SÍNTOMAS NO ESPECÍFICOS
1.- Problemas digestivos (falta de apetito, agruras, dolor estomacal, estreñimiento) ____
0Ninguno____ 1Moderados____ 2Severos
2.- Pérdida de peso reciente (último mes) sin tratamiento ni enfermedad ____
0No____ 1Pérdida leve (menos de 2 kg)____ 2Severa (2 kg o más)____
No esp. _____
ESCALA DE DOMINANCIA
La mayor parte del tiempo me siento:
A B C D A B C D
1. Optimista [ ] __
2. con miedo [ ] __
3. Triste [ ] __
4. Relajado [ ] __
5. Admirado [ ] __
6. Fuerte [ ]__
7. Agresivo [ ]__
8. Agradecido [ ] __
9. Cruel [ ] __
10. Excitado [ ] __
11. Humillado [ ] __
12. Desesperado [ ] __
13. Confundido [ ] __
14. Arrogante [ ] __
15. Problemático [ ] __
16. Amable [ ]__
17. Dominante [ ]__
18. Digno [ ]__
19. Aburrido [ ] __
20. Alegre [ ] __
21. Capaz [ ] __
22. Tímido # [ ] __
23. Cariñoso [ ] __
24. Audaz [ ]__
25. Alerta [ ] __
26. Aterrorizado [ ] __
27. Desanimado [ ] __
28. Afligido [ ] __
29. Controlador [ ]__
30. Libre [ ] __
31. Amistoso [ ] __
32. Inseguro [ ] __
33. Deprimido [ ] __
34. Temido [ ] __
35. Influyente [ ]__
36. Vigoroso [ ]__
37. Despreocupado [ ] __
38. Protegido [ ] __
39. Débil [ ] __
40. Temeroso [ ] __
41. Dolor [ ] __
42. Orgulloso [ ] __
43. Serio [ ] __
44. Quieto [ ] __
45. Abrigado [ ] __
46. Alterado [ ] __
47. Culpable [ ] __
48. Aplastado [ ] __
49. Con suerte [ ] __
50. Responsable [ ] __
51. Poderoso [ ]__
52. Rechazado [ ] __
53. Frustrado [ ] __
54. Satisfecho [ ]__
55. Indefenso [ ] __
56. Útil [ ] __
57. Concentrado [ ] __
58. Experto [ ]__
59. Placer [ ] __
60. Derrotado [ ] __
61. Inhibido [ ] __
62. Triunfante [ ]__
63. Feliz [ ] __
64. Solo con responsabilidad [ ] __
Totales: A___ B___ C___ D___
Conversión: A___ B___ C___ D ____
ESCALA DE CONDUCTA SUMISA
0 – NUNCA
1 – CASI NUNCA
2 – ALGUNAS VECES
3 – MUY FRECUENTE
4 - SIEMPRE
1. Acepto estar equivocado, aunque sé que no lo estoy (
)
2. Hago cosas porque otras personas las hacen, aunque no me parezca bien (
)
3. Saldría de una tienda sin reclamar aunque le hubieran dado menos cambio (
)
4. Dejo que otros me critiquen o me menosprecien sin defenderme (
)
5. Hago que lo se espera de mí, aunque no lo desee ( )
6. Sí trato de hablar y otros interrumpen, me callo ( )
7. Continuamente pido disculpas por mis pequeños errores ( )
8. Escucho callada, sí personas con autoridad, hablan cosas desagradables de mí ( )
9. No soy capaz de decirles a mis amigos cuando estoy enojado con ellos ( )
10. En las reuniones, dejo que otros monopolicen la conversación (
)
11. No me gusta que la gente me mire directamente a los ojos, cuando ellos hablan (
)
12. Doy las gracias con entusiasmo y repetidas veces, cuando alguien me ha hecho un favor
pequeño( )
13. Evito el contacto directo con los ojos (
)
14. Evito iniciar conversaciones en reuniones sociales ( )
15. Me ruborizo cuando alguien me mira (
)
16. Me finjo enfermo cuando rechazo una invitación ( )
Sum _____
ESCALA DESBALANCE ESFUERZO-RECOMPENSA
1= No
2= Sí pero no me afecta
3= Me afecta moderadamente
4= Me afecta mucho
5= Me afecta muchísimo
1. Ritmo apurado ( )
2. Interrupciones frecuentes ( )
3. Mucha responsabilidad ( )
4. Horas extras ( )
5. Esfuerzo físico ( )
6. Cada vez más trabajo ( )
7. Reconocimientos de los superiores/esposo ( )
8. Reconocimiento de los compañeros/hijos ( )
9. Apoyo en situaciones difíciles ( )
10. Trato injusto ( )
11. Escasa promoción ( )
12. Empeoramiento del trabajo ( )
13. inseguridad en el puesto ( )
14. reconocimiento del esfuerzo ( )
15. oportunidades de promoción adecuadas ( )
16. Salario adecuado ( )
17. Falta de tiempo ( )
18. Pienso en el trabajo al despertar ( )
19. En casa me olvido del trabajo ( )
20. Dicen que me sacrifico mucho ( )
21. No puedo olvidarme del trabajo ( )
22. No duermo bien si aplazo algo ( )
SÍNDROME DEL NIDO VACÍO
Si No
1.- Ha perdido el apoyo de su esposo o familia
2.- Ha perdido ilusiones o metas en su matrimonio
3.- Siente que ya no recibe cariño por parte de su esposo
4.- Se siente poco satisfecho de su familia
5.- Siente un vacío dejado por sus hijos
6.- Siente temor por la economía familiar
7.- Siente que no aprovechó las oportunidades de la vida
8.- Siente que desperdicia su tiempo
9.- Se siente poco preparada para el futuro 10.- Siente que vive sin ilusiones 11.- Considera que la separación de los hijos, daña la estabilidad de la familia
TOTAL NIDO VACÍO______________
1a.- Szmuilowicz ED, Manson JE, Rossouw JE, Howard BV, Margolis KL, Greep NC, et. al.
Vasomotor symptoms and cardiovascular events in postmenopausal women. Menopause
2011;18:603-10.
1b.- 1c.- Thurston RC, Sutton-Tyrrell K, Everson-Rose SA, Hess R, Powell LH, Matthews KA. Hot
flashes and carotid intima media thickness among midlife women. Menopause 2011;18:352-8.
