PRUEBA DE COOMBS

La prueba de Coombs (también conocida como prueba de antiglobulina) es un examen de sangreque se usa

en inmunología y hematología. Este análisis puede detectar la presencia de anticuerpos ensuero que reaccionan

con antígenos en la superficie de los glóbulos rojos. Hay dos tipos distintos de la prueba de Coombs: el directo y el

indirecto. La prueba de Coombs directa detecta anticuerpos ya unidos a la superficie de los glóbulos rojos, y

la prueba de Coombs indirecta detecta anticuerpos libres que pueden reaccionar in vitro con glóbulos rojos que

tienen antígenos específicos.

Mecanismo

Ambas pruebas de Coombs emplean un antisuero llamado reactivo de Coombs, que contiene anticuerpos de

animales inmunizados dirigidos contra IgG, IgM, y/o complemento humano. Estos anticuerpos se unen a los

anticuerpos humanos que están en la superficie de los glóbulos rojos, causando aglutinación de las células. Esta

aglutinación observada corresponde a un resultado positivo, y la ausencia de aglutinación es un resultado negativo.

Prueba de Coombs directa

Esta prueba se usa para determinar si hay complemento o anticuerpos ya fijados a glóbulos rojos tomados

directamente del paciente. Estas células, alcanzadas de unavenopunción, se lavan y se incuban con reactivo de

Coombs. Los anticuerpos del reactivo se unen a IgG, IgM, o complemento que está unido a la superficie de los

glóbulos rojos. Estos se aglutinan, produciendo grupos de células que indican un resultado positivo.

Trastornos asociados con un resultado positivo

Anemias hemolíticas inducidas por fármacos

Anemias hemolíticas inmunitarias

Reacciones a transfusión

Enfermedad hemolítica del recién nacido

Trastornos linfoproliferativos, como leucemia linfocítica crónica

Mononucleosis infecciosa

Algunas enfermedades pueden causar hemólisis no inmunitaria, como la esferocitosis hereditaria y la talasemia.

Estos trastornos no son asociados con un resultado positivo en la prueba de Coombs porque no son causados por

anticuerpos hemolíticos.

Prueba de Coombs indirecta

Se detectan anticuerpos específicos de ciertos antígenos que no necesariamente están presentados en los

glóbulos rojos del paciente, pero puede estar en glóbulos rojos de otras personas. Si se mezcla suero tomado de

un paciente que contiene estos anticuerpos con glóbulos rojos que sí muestran estos antígenos específicos, los

glóbulos rojos se van a cubrir con anticuerpo. Una vez cubiertas, las células se van a aglutinar después de una

exposición al reactivo de Coombs. Por ejemplo, en el diagnóstico de eritroblastosis fetal, el suero tomado de la

madre Rh- no reacciona con su propia sangre, sino con la de su feto Rh+. El suero de la madre, que contiene

anticuerpos específicos del factor Rh, se mezcla con glóbulos rojos Rh+. Los anticuerpos del suero se unen a las

células. Luego, se agregan anticuerpos antihumanos para aglutinar los glóbulos rojos. Se puede diluir el suero y

hacer la prueba repetidas veces, para cuantificar los anticuerpos en el suero

La eritroblastosis fetal, también llamada enfermedad hemolítica del recién nacido (HDN) es un trastorno

sanguíneo en la que una madre produce anticuerpos durante el embarazo que atacan los glóbulos rojos de su

propio feto, cuando la madre y el bebé tienen tipos de sangre diferentes.2 En la mayoría de estos casos, una

diferencia en el tipo Rh (incompatibilidad Rh) provoca la enfermedad. Esto ocurre sólo cuando la madre tiene

sangre Rh negativo y el feto sangre Rh+, heredada del padre.

La razón de este problema es que el sistema inmune de la madre considera a los eritrocitos Rh positivo del bebé

como "extraños", y dignos de ser atacados por el sistema inmune materno. Si los glóbulos rojos del feto llegan a

estar en contacto con la sangre de la madre, su sistema inmune responde desarrollando anticuerpos para combatir

los glóbulos rojos del bebé. Esto no es un suceso común en el transcurso de un embarazo normal, excepto durante

el parto, cuando la placenta se desprende y la sangre del bebé entra en contacto con la sangre de la madre. El

contacto sanguíneo también se produce durante un aborto, tanto espontáneo como provocado, o durante un

procedimiento de examen prenatal invasivo (por ejemplo, una amniocentesis). Una vez desarrollado el ataque contra

los antígenos Rh positivos el sistema inmune de la madre guarda esos anticuerpos de forma indefinida por si

dichas células extrañas vuelven a aparecer en contacto con la sangre materna, y con esto se produce la

"sensibilización Rh" de la madre. Durante el primer embarazo dicha sensibilización Rh es improbable. Sólo se

vuelve un problema en un embarazo posterior con otro bebé Rh positivo. En este nuevo embarazo los anticuerpos

de la madre cruzan la placenta para combatir los glóbulos Rh positivos del cuerpo del bebé. A medida que los

anticuerpos destruyen los glóbulos rojos, el bebé va enfermándose. Este proceso se denomina eritroblastosis fetal

durante el embarazo. En el neonato, el trastorno se denomina enfermedad hemolítica del recién nacido.

La incompatibilidad Rh afecta al 5% de las parejas. Un 10% de las madres Rh negativo se sensibiliza después de

su primer embarazo; el 30% lo hacen después del segundo embarazo, y un 50% con posterioridad al tercero. El

riesgo de sensibilización post aborto es 2%, y después de un aborto provocado es de un 4 a un 5%

Síntomas

Lo más preocupante de este trastorno es que los anticuerpos de la madre atacan y destruyen los glóbulos rojos del

feto (hemólisis), y esto da por resultado que el bebé se vuelva anémico. Como consecuencia el cuerpo del bebé

intenta producir más glóbulos rojos de forma más rápida, para compensar la deficiencia producida por

la hemólisis inmune, esto hace que sus órganos se agranden, siendo perjudicial para su desarrollo. Los nuevos

glóbulos rojos llamados eritroblastos, que no dejan de ser tan solo precursores de eritrocitos, generalmente son

inmaduros e incapaces de cumplir la función de los glóbulos rojos maduros.

Además de esto, la destrucción de tantos glóbulos rojos produce una sustancia llamada bilirrubina que es difícil

eliminar para los fetos. Es posible que la bilirrubina se acumule en su sangre, tejidos y fluidos corporales, trastorno

que se denomina hiperbilirrubinemia. La hiperbilirrubinemia torna la piel, los ojos, y los tejidos del bebé

amarillentos, produciendo un estado llamado ictericia. En casos severos, la bilirrubina también puede acumularse

en el cerebro y provocar una enfermedad neurológica grave que se llama kernicterus.4 En casos extremos, cuando

la cantidad de glóbulos rojos eliminados es muy alta, puede causar la muerte del feto.

Diagnóstico

Se puede hacer el diagnóstico por un análisis de la sangre fetal, la sangre maternal, o el líquido amniótico. 5 Los

tipos sanguíneos del feto y de la madre son rutinariamente determinados en las etapas tempranas del embarazo,

así que cualquier incompatibilidad que exista será fácilmente detectada. Un estudio de la sangre de un feto

afectado por este trastorno mostrará señales de anemia hemolítica, incluyendo un valor bajo de hematocrito, un

nivel alto de bilirrubina, y una abundancia de reticulocitos.4 Dicho exceso de bilirrubina también se presenta en las

muestras del líquido amniótico.4 Además, se pueden realizar pruebas de Coombs usando la sangre maternal para

determinar la cantidad de anticuerpos circulando en la madre.5

La ultrasonografía del feto puede averiguar si hay agrandamiento del bazo (esplenomegalia), hígado

(hepatomegalia), o corazón.3

Causas

La forma más común de eritroblastosis fetal diagnosticada proviene de la incompatibilidad Rh. Otros tipos de esta

enfermedad incluyen reacciones contra los antígenos Duffy, Kell, y Kidd.7 La incompatibilidad ABO genera

hemólisis grave en el feto con muy poca frecuencia porque los antígenos ABO suelen provocar una respuesta

inmune con sólo anticuerpos de isotipo IgM, los cuales no pueden cruzar la placenta y atacar los glóbulos rojos del

feto.9

Incompatibilidad Rh

Esta es la forma mas peligrosa de esta enfermedad, y es una afección que se desarrolla cuando una mujer

embarazada tiene sangre Rh negativo siendo el hijo Rh positivo. Como la madre es Rh negativo, su organismo no

puede tolerar la presencia de glóbulos rojos Rh positivos. En tales casos, el sistema inmunitario de la madre trata a

las células fetales Rh positivas como si fuesen una sustancia extraña y crea anticuerpos de forma IgG contra

dichas células sanguíneas fetales. Estos anticuerpos anti-Rh positivos pueden atravesar la placenta hasta el feto,

donde destruyen los glóbulos rojos circulantes de éste.

Incompatibilidad ABO

Algunas madres tienen una población pequeña de anticuerpos IgG contra los antígenos ABO, así que puede

afectar al bebé la incompatibilidad ABO. Estas reacciones generalmente son ligeras, y menos de 1% causan

hemolísis grave.9

Tratamiento

Durante el embarazo, el tratamiento se basa en transfusiones intrauterinas de glóbulos rojos en la circulación del

bebé, incluso se puede llegar a adelantar el parto si el feto desarrolla complicaciones. La transfusión está indicada

si el feto es menor de 32 semanas y el Ht < 30%, y seguirá siendo necesaria cada cuatro semanas hasta el bebé

nazca.9Y después del nacimiento, el tratamiento puede incluir transfusiones de sangre y/o líquidos por vía

endovenosa, ayuda respiratoria por medio de oxígeno o respirador mecánico y fototerapia para destruir el exceso

de bilirrubina.2 En casos excepcionales, si la incompatibilidad es grave y el bebé se encuentra en peligro, se puede

realizar una serie de transfusiones especiales de sangre (denominadas exanguinotransfusiones) mientras el bebé

está en el útero materno o después del parto.10 Las exanguinotransfusiones reemplazan la sangre del bebé por

glóbulos rojos cuyo factor Rh es negativo. Este procedimiento estabiliza el nivel de glóbulos rojos del bebé,

minimiza el daño que puede causar la circulación de anticuerpos Rh ya presentes en el flujo sanguíneo del bebé, y

reduce los niveles de bilirrubina.

Tras dos décadas de uso de transfusiones intraperitoneales para corregir la anemia, se pasó al más preciso y

eficaz método de transfundir tras funiculocentesis directamente en la vena umbilical fetal. Los resultados han

mejorado sensiblemente (doble supervivencia) respecto a cuando se empleaba en peritoneo.

Prevención

En el pasado, la incompatibilidad Rh era un problema muy serio. Afortunadamente, se han logrado avances

médicos significativos para prevenir las complicaciones asociadas con la incompatibilidad Rh y tratar al recién

nacido afectado por este problema. Casi todas las mujeres con sangre Rh negativa se identifican en los primeros

meses de su primer embarazo detectado, mediante un simple análisis de sangre. Si una mujer es Rh negativa y no

está sensibilizada los médicos le administran dos inyecciones de globulina hiperinmune Rh (RhIg), también

conocida como RhoGAM, durante el primer embarazo. La primera inyección se da alrededor de las 28 semanas de

embarazo y la segunda, dentro de las 72 horas después del parto.5 La globulina hiperinmune Rh provoca la

destrucción rápida de los glóbulos rojos del feto que han entrado en la circulación maternal, impidiendo que el

cuerpo de la madre genere anticuerpos peligrosos Rh que pueden causar complicaciones serias en el recién

nacido o complicar futuros embarazos. También se puede inyectar esta dosis de inmunoglobulina Rh en una mujer

que acaba de tener un aborto espontáneo, una amniocentesis o algún tipo de hemorragia durante el embarazo. Si

el médico determina que la mujer ya ha desarrollado los anticuerpos Rh, entonces, el embarazo será controlado

muy de cerca para asegurarse de que los niveles de Rh no sean muy elevados.

INTRODUCCIÓN

La sífilis es una enfermedad de transmisión sexual (ETS), que ha afectado al hombre durante siglos. Fue en 1905, que se descubrió que era producida por un espiroqueta, el Treponema pallidum, a la que originalmente se le denominó Spirochaeta pallida. El géneros Treponema tiene tres especies, el T pallidum que produce la sífilis, el T pertenece que produce el plan y el T endemicum que produce el bejel.

La primera prueba diagnóstica para esta enfermedad, fue el test de Wassermann, que se desarrolló en 1906, valiéndose de una extracción alcohólica a partir de tejidos sifilíticos. Lo que se pretendía demostrar con esta prueba, era la presencia de anticuerpos séricos mediante una técnica de fijación de complemento, más tarde se demostró que estas reacciones eran inespecíficas y se producían con extractos de otros tejidos. Años después se purificó dos sustancias reactivas, a partir de músculo de corazón de vacunos, la cardiolipina y la lecitina, lo cual condujo a la obtención de un antígeno más específico, que es utilizado desde 1946 en la prueba de VDRL Venereal Disease Research Laboratory.

Para el diagnóstico de la sífilis, tradicionalmente, se cuenta con tres grupos de pruebas. Por examen directo mediante microscopía en campo oscuro y por fluorescencia directa, mediante serología y por cultivo en células epiteliales de conejo. Por serología se tienen dos tipos de pruebas, las pruebas no treponémicas como VDRL y RPR (Rapid plasma reagin) y las pruebas treponémicas como FTAABS (Fluorescent treponemal antibody absorption) o como MHA-TP (Microhemaglutinación para T pallidum)1.

Las nuevas pruebas diagnósticas para la sífilis, incluyen enzimo inmunoensayo (ELISA), Western bloty Reacción en cadena a la polimerasa (PCR).

MICROSCOPIA DE CAMPO OSCURO

La microscopía de campo oscuro es la prueba de elección para la sífilis primaria sintomática. Los treponemas, morfológicamente, son espiroquetas muy delgadas y helicoidales, que miden 0,1 por 5 a 15 mm; estos gérmenes son tan delgados, que no pueden ser observadas en un microscopio de luz a campo normal, y es necesario un microscopio que tenga campo oscuro. El T. pallidum se diferencia de otros microorganismos espiralados porque son más delgados, sus espirales son muy regulares y presentan un movimiento característico en tirabuzón. Cuando se obtiene hallazgos positivos al campo oscuro, se debe reportar como organismos con morfología y características de T pallidum, debiéndose realizar obligatoriamente pruebas serológicas confirmatorias. Se debe tener en cuenta que el campo oscuro puede ser positivo antes que las pruebas serológicas.

Un examen de campo oscuro negativo no descarta la sífilis, ya que, podrían haber muy pocos gérmenes en la lesión o haberse producido alteraciones debido a algún tratamiento recibido ya sea tópico o sistémico, y, por último, se debe considerar otra enfermedad de transmisión sexual2-4.

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

Mediante este examen, se puede detectar la presencia de subespecies de T pallidum en tejidos, fluidos corporales, secreciones y exudados de lesiones. Se necesita un microscopio de fluorescencia, equipado con condensador de campo oscuro y con lámpara para iluminación de fluorescencia. La prueba permite diferenciar treponemas patógenos de no patógenos, por una reacción de antígeno-anticuerpo.

La muestra debe ser secada al aire y fijada con acetona, metano¡ o calor, luego es marcada con anticuerpos humanas o de conejo o monoclonales conjugados con el colorante fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las muestras de tejidos se trabajan de manera similar, pero deben ser fijadas por dos horas con formol neutro, luego deben ser parafinadas.

Un hallazgo positivo se reporta como treponemas inmunológicamente específicos para T pallidum, observados por inmunofluorescencia directa2. Esta prueba es comparable en sensibilidad con la microscopia de campo oscuro, pero de mayor especificidad5.

INOCULACIÓN DE ANIMALES

A este método, se le denomina RIT (Rabbit infectivity test) y consiste en la inoculación del T pallidum en

los testículos de un conejo. Esta prueba es el estándar de oro, que determina la sensibilidad y especificidad de las otras pruebas para el diagnóstico de sífilis. Además es el método más antiguo para detectar una infección por T. pallidum. Este método no se utiliza de rutina por que es costoso y representa una dificultad técnica mayor3.

CULTIVO

El cultivo de T pallidum sólo se ha logrado en células epiteliales de conejo, La multiplicación de los gérmenes es muy lenta, siendo el tiempo promedio de duplicación de 30 a 33 horas2, aunque algunos autores comunican que a temperatura de 33° C, el crecimiento es mas rápido6. El T pallidum se ha tratado de cultivar en medios acelulares microaerofílicos con poco éxito7-9. Este método no es adecuado para el trabajo de rutina del laboratorio pero sí se realiza en los laboratorios de referencia.

PRUEBAS SEROLÓGICAS

Las pruebas serológicas son de dos tipos: no-treponémicas y treponémicas. Las pruebas no treponémicas son usadas para despistaje, son económicas y, también, sirven para evaluar la eficacia del tratamiento. Sus limitaciones consisten en baja sensibilidad en sífilis primaria temprana, con prueba de campo oscuro positiva, en sífilis tardía y la posibilidad de fenómeno de prozona o de resultados falsos positivos. Las pruebas treponémicas emplean como antígeno al T. pallidum subespecie pallidum y detectan anticuerpos específicos antitreponémicos. Se le utiliza para verificar cuando las pruebas no-treponémicas son reactivas o como pruebas confirmatorias cuando el cuadro clínico es sugestivo, pero la serología es negativa, como ocurre en la sífilis tardía. En el 85% de los pacientes con sífilis con tratamiento exitoso, estas pruebas se mantienen reactivas por varios años2.

PRUEBAS NO TREPONÉMICASLas pruebas no-treponémicas incluyen el VDRL (Venereal Disease Research Laboratory, RPR (Rapid plasma reagin), USR (Unheated-serum reagin) y TRUST (Toluidine red unheated-serum test), de estas las más usadas son RPR y VDRL.

Todas estas pruebas están basadas en antígenos en solución alcohólica, que contienen cardiolipina, colesterol y lecitina purificada en cantidad adecuada para producir reacciones estándares.

Se denomina reagina a una proteína similar a un anticuerpo, que se une a un antígeno, como pueden ser la cardiolipina y la lecitina en las pruebas no-treponémicas, y se denomina anticuerpos reagínicos a anticuerpos no-treponémicos, producidos por un individuo infectado con T pallidum, contra sus propios tejidos o contra células de mamíferos. Estos anticuerpos reagínicos, no son exclusivos de la sífilis y también son producidos en otras enfermedades infecciosas como son el sarampión, varicela, hepatitis, mononucleosis infecciosa, lepra, tuberculosis, malaria, leptospirosis, tripanosomiasis, linfogranuloma venéreo, o por personas con enfermedades autoinmunes, drogadictos, individuos que han recibido alguna inmunización recientemente, embarazo y en edad avanzada3.

VDRLEn la prueba de VDRL, el suero del paciente es inactivado a 56° C por 30 minutos, si se usa liquido cefalorraquídeo (LCR) sólo se debe centrifugar Luego la muestra se mezcla con un antígeno, que es una solución buffer salina de cardiolipina y lecitina adosadas a partículas de colesterol. Esta prueba se puede realizar en lámina y ser observada al microscopio como un precipitado de partículas finas (floculación), o se puede realizar en un tubo de ensayo y ser leída macroscópicamente.

Los resultados de VDRL en lámina son comunicados como no reactivos (no hay floculación, débilmente reactivos (ligera floculación, y reactivos floculación definitiva. Todos los sueros reactivos se diluyen seriadamente, a cada dilución se le realiza la prueba de VDRL y se registra el titulo máximo obtenido. Rara vez se tiene un paciente con título elevado en las diluciones y con VDRL no reactivo en la muestra sin diluir (fenómeno de prozona), si ocurriera es más frecuente en la sífilis secundaria1,10.

Se obtiene falsos negativos en ciertas condiciones, tales como fenómeno de prozona, bajo título de anticuerpos, presencia de sustancias inhibidoras en el suero del paciente, VIH, la temperatura ambiental fuera del rango de 23-29° C o error técnico. Los falsos positivos pueden llegar a 10 a 30%, y han sido reportados en casos de síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, lupus eritematoso sistémico (LES), fiebre reumática, neumonía vira¡, neumonía neumocócica, mononucleosis infecciosa, hepatitis infecciosa, lepra, malaria, artritis reumatoide, infecciones por otros treponemas, embarazo, ancianos, y muestras

hemolisadas o contaminadas3.

RPREl RPR es una prueba diseñada para detectar reagina en el suero de manera rápida, no requiere inactivación por calor La muestra se mezcla con una suspensión que posee cardiolipina, lecitina y colesterol en partículas de carbón. Si la muestra es positiva se observa pequeños grumos negros (floculación). El resultado se reporta como reactivo o no reactivo; todos aquellos reactivos deben ser diluidos seriadamente para realizar la titulación, y se reporta la dilución más alta que exhibe reacción.

Los falsos negativos se pueden producir por errores técnicos y los falsos positivos son los mismos que para la prueba de VDRL.

Se ha desarrollado variantes de esta prueba en las que la muestra puede ser plasma sin que se pierda su sensibilidad y especificidad3,11.

TRUST Y USREstas pruebas son menos usadas que el VDRL y la RPR. El TRUST (Toulidine red unheated serum test) es una prueba desarrollada para el despistaje de la sífilis, el principio es similar al del VDRL, pero no es necesario inactivar el suero y el rojo de toluidina se encarga de dar color a la reacción. La sensibilidad y especificidad son similares a la prueba de RPR.

La USR (Unheated serum reagin) tiene la ventaja que es poco costosa, tampoco requiere de inactivación de suero por calor y, al igual que otras pruebas no treponémicas, tiene buena sensibilidad y especificidad14-15.

PRUEBAS TREPONÉMICAS

Las pruebas treponémicas comprenden FTA-ABS (Fluorescent treponemal antibody absorption), y sus variantes FTA-ABS-DS (FTA-double staining), 19S-IgM-FTA-ABS; MHA-TP (Microhemaglutinación para T. pallidum), y TPI (T pallidum immobilization), de los cuales el último es obsoleto por su baja sensibilidad en la sífilis primaria3.

FTA-ABSLa FTA-ABS es un método de observación directo, que se utiliza como confirmación cuando una de las pruebas no-treponémicas es positiva. Es el método de elección para el diagnóstico de la sífilis primaria a partir de las dos semanas después del contagio.

Se utiliza suero inactivado por calor, el que se coloca sobre una lámina donde se encuentra el Treponema pallidum es suspensión (por lo menos 30 microorganismos por campo). El conjugado consiste en antiglobulina humana (IgG o IgM) con isotiocianato de fluoresceína, el que se diluye seriadamente hasta 1/800 ó más. Luego de un tiempo de incubación, se observa al microscopio de fluorescencia en una habitación oscura. La reacción se reporta en cruces de 1+ a 4+.

La 19S-IgM-FTA-ABS es una variante de la FTA-ABS que usa IgM de 19S que es obtenida por ultracentrifugación y tiene como ventaja una mayor especificidad. La 19S-IgM permanece por corto tiempo en la sangre después del tratamiento y su reaparición determina una reinfección, en cambio, la IgM total se puede detectar hasta un año después16-18. La 19S-IgM-FTA-ABS es de gran utilidad en los siguientes casos: confirmación de la sífilis muy temprana, determinar el éxito terapéutico y diagnosticar una reinfección; no es de utilidad en la sífilis terciaria, porque da falsos negativos19-20.

La FTA-ABS-DS tiene una sensibilidad de 100% para la sífilis secundaria y la sífilis latente, y 95% para la sífilis tardía21-24 porque utiliza en su proceso doble conjugado fluorescente; el primero anti-IgG humana conjugada con rodamina y el segundo fluoresceína antitreponémica que tiene función de contracolor y facilita la visualización.

Tabla 1. Criterio para el

diagnóstico de sífilis61

Prue

% sensibilidad

% especif

ba

icidad

 

Primaria

Secundaria

Latente

Tardía

No sífilis

No treponémica

VDRLRPRUSRTRUST

78(74-87)86(77-100)80(72-88)85(77-86)

100100100100

95(88-100)98(95-100)95(88-100)98(95-100)

71(37-94)73

98(96-99)98(93-99)9999(98-99)

Treponémicas

FTA-ABS

84(70-100)

100

100

96

97(94-100)

HemaglutinaciónEste método utiliza glóbulos rojos de pollo o carnero como fase sólida los cuales están sensibilizados con Treponema pallidum, que se encuentran adheridos a la membrana del hematíe. Tiene la ventaja de alta especificidad, la cual es comparable con FTA-ABS, da pocas reacciones falso positivas, es una prueba semicuantitativa al usar diluciones seriadas, se puede utilizar suero y LCR25, y además el requerimiento de equipos es mínimo, La desventaja de esta prueba es que tiene menor sensibilidad en sífilis temprana, sífilis latente y sífilis tratada26-27. Se puede realizar bajo dos modalidades, MHA-TP (Microhemagglutination treponema pallidum) que utiliza eritrocitos de carnero y HATTS o TPHA (Hemagglutination treponemal test), ambos de sensibilidad y especificidad similar28-30.

NUEVAS PRUEBAS EN El DIAGNÓSTICO DE LA SÍFILIS

ELISA (Enzyme-Linked lmmunoabsorbent Assay)

Durante la infección por Treponema pallidum se producen anticuerpos inespecíficos, contra antígenos comunes a todas las espiroquetas y anticuerpos específicos contra Treponema pallidum. En la enfermedad temprana los anticuerpos son IgM, luego rápidamente aparecen anticuerpos IgG que son los predominantes durante el tiempo.

La técnica de ELISA es un método de cuantificación inmunológica que evalúa la reacción antígeno-anticuerpo mediante una reacción enzimática, de acuerdo al diseño de la prueba se puede detectar una o más inmunoglobulinas o se puede detectar antígenos específicos- para lo cual se utiliza un conjugado, formado por un antianticuerpo o un antígeno, el cual se ha marcado con una enzima (peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, etc.). El antígeno o anticuerpo que se utiliza, es inmovilizado sobre un soporte sólido, que es generalmente una placa de poliestireno, por lo que la reacción antígeno-

anticuerpo que se produce también queda inmovilizada en el soporte sólido. A esto se ¡e adiciona un sustrato (enzima) marcado con un cromógeno que produce una reacción de color, que es directamente proporcional a¡ analito (antígeno o anticuerpo a ser detectado) y que es cuantificado con un lector de ELISA que es un espectrofotómetro modificado.

Los ELISA para sífilis que se introdujeron en la década de los ochenta, usaban extracto treponémico como antígeno32-36, y no estaban aprobadas para el diagnóstico de sífilis, en los noventa se introdujeron pruebas que utilizaban antígenos recombinantes de las proteínas de membrana del Treponema pallidum y otras que utilizaban anticuerpos monoclonales, las cuales detectan tanto IgM como IgG o ambas37-39 con una sensibilidad del 99-100% y con una especificidad de 94-99%. La sensibilidad para IgM disminuye en sífilis avanzada, En la actualidad tienen aceptación clínica las pruebas de ELISA marca Captia-G, Immune-Capture y BIO-ELISA Sífilis

Western blot

El Western Blot, también denominado inmunoblot, es una técnica que detecta anticuerpos para epítopes específicos en antígenos, previamente separados por electroforesis de alta resolución. La electroforesis separa los componentes antigénicos por sus diferentes pesos moleculares. Luego estos son transferidos a una membrana de nitrocelulosa reteniendo su posición electroforética y reaccionan con el suero del paciente, si los anticuerpos específicos estuviesen presentes, estos son revelados usando un antianticuerpo conjugado con una enzima a la que se le agrega un sustrato cromogénico, dando como resultado bandas coloreadas en la tira de nitrocelulosa. Esta técnica se utiliza para confirmar los anticuerpos detectados previamente por alguna otra prueba serológica de despistaje3.

Recientemente se ha secuenciado el genoma del Treponema pallidum, también se ha identificado mediante electroforesis de alta resolución que sus factores de virulencia radican en un grupo de 12 proteínas de la membrana externa de diferentes pesos moleculares45-47.

De estas proteínas se ha estudiado un grupo de cinco proteínas que poseen determinantes antigénicos comunes, conocidas como TROMPs, de 17, 28, 31, 45 y 65 Kd. Las proteínas de 17 y 45 Kd. son lipoproteínas y se encuentran también en grandes cantidades en la membrana interna del Treponema pallidum. Las otras proteínas se encuentran exclusivamente en la membrana externa, a la de 31 Kd. se le denomina Tromp1 y tiene actividad de porina, la de 28 Kd. se denomina Tromp2 y se le encuentra también en la membrana externa de E. coli, y a la de 65 Kd. se le denomina Tromp3.

También esta en estudio una proteína de 26 Kd., se ha identificado que en su porción N-terminal, constituida por 25 aminoácidos, posee una región polipeptídica denominada TpLRR (Treponema pallidum leucine-rich repeat protein) que tiene poca capacidad antigénica y cuya función aún es desconocida48-49.

En el Western Blot para Treponema pallidum, los antígenos pueden reaccionar con IgG, IgM o IgA presentes en el suero de pacientes con sífilis, la IgG reacciona fuertemente con una proteína de membrana de 47 Kd., pero es menos sensible y específica que la prueba de FTA-ABS. En cambio, cuando la prueba detecta IgM, es de gran utilidad en el diagnóstico de la sífilis secundaria y congénita, con una sensibilidad del 83%. Esto se reduce cuando el Western blot detecta IgA, donde la sensibilidad disminuye al 67%2,50-53.

El conocimiento del genoma completo, el estudio de las proteínas de membrana del Treponema pallidum y especialmente del grupo TROMPs, en un futuro cercano, nos permitirán el desarrollo de nuevas pruebas para el diagnóstico de la sífilis.

Reacción en Cadena a la Polimerasa (PCR)La técnica de reacción en cadena a la polimerasa (PCR), amplifica o replica varias veces secuencias específicas de ADN de una muestra, Se utiliza dos porciones cortas de ADN denominados cebadores o iniciadores o "primers", estos son oligonucleótidos sintéticos de ADN o ARN cuya secuencia es conocida, que luego de fusionarse (hibridizarse) a un ADN complementario, actúan como una plantilla para sintetizar nuevo ADN, esto es un proceso enzimático repetido en varios ciclos térmicos. El proceso se inicia con la separación del ADN de doble cadena mediante calor (desnaturalización), al bajar la temperatura se produce recombinación o emparejamiento de los primers con el ADN original de una sola cadena, se prolongan las secuencias de ADN cebado y por medio de una incubación con la polimerasa de ADN se sintetiza una nueva cadena complementaria de ADN. Cada proceso denominado ciclo va duplicando la cantidad de ADN de manera exponencial y por lo general se llevan a cabo unos 30 o 40 ciclos. Al final del

proceso se habrán obtenido 230 o 240 moléculas del producto deseado, según el numero de ciclos realizados. Esta técnica tiene diferentes variantes, dependiendo del ADN a amplificar, que consiste en modificaciones de alguno de los pasos del proceso básico3.

La prueba de PCR que detecta ADN de Treponema pallidum tiene 785 de sensibilidad y 100% de especificidad, es de gran utilidad en el diagnóstico de aquellas sífilis cuyo diagnóstico representa dificultad como son sífilis congénita, la sífilis tardía2,54-55 y en detectar infección persistente en individuos que han recibido tratamiento ineficaz56.

La ventaja del PCR es que al amplificar ADN específico de Treponema pallidum, se elimina la posibilidad de detectar falsos positivos, además que puede realizarse en gestación temprana, mediante el estudio del líquido amniótico57.

OtrosExisten dos pruebas rápidas de látex para el diagnóstico de sífilis, la primera denominada FAST que usa tres antígenos recombinantes y tiene una sensibilidad mayor al 99%58; y la otra prueba denominada MCA-TP (Microcapsule agglutination for Treponema pallidum), utiliza microcápsulas sensibilizadas con antígeno de Treponema pallidum y es muy sensible para detectar sífilis primaria59. También se desarrolló una prueba de Radioinmunoensayo (RIA) para la detección de Treponema pallidum. Ninguna de estas pruebas logró amplia difusión60.

CRITERIOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE SÍFILISDurante la sífilis primaria los exudados de las lesiones tienen abundantes treponemas, detectables por campo oscuro o inmunofluorescencia directa. Los anticuerpos no se detectan por pruebas no treponémicas convencionales sino hasta 1-4 semanas de aparecido el chancro. En la sífilis secundaria, el organismo ha invadido todos los órganos y virtualmente todos los fluidos del cuerpo. Con pocas excepciones todos las pruebas serológicas son reactivas y los treponemas se encontraran con facilidad por examen directo en las lesiones. En la sífilis primaria latente las pruebas treponémicas y no treponémicas son reactivas en un paciente asintomático. En la sífilis latente tardía la mayoría de pacientes tienen las pruebas no treponémicas reactivas y el título de estos disminuye. La sífilis tardía o terciaria ocurre entre 10 a 20 años de la infección inicial. Aproximadamente 71% de los individuos presentan reactividad a las pruebas no treponémicas, sin embargo las pruebas treponémicas son siempre reactivas, pudiendo ser la base del diagnóstico, El diagnóstico de sífilis cardiovascular se basa en el cuadro clínico y el de la neurosífilis se basa en criterios clínicos y de laboratorio debiendo realizarse la prueba de VDRL, y determinación de proteínas y citología en LCR.

Sífilis temprana

Sífilis primariao Definitivo: Identificación de Treponema pallidum por examen directo.o Presuntivo: (requiere de ítem 1 y de ítem 2 ó 3)1. Lesión típica.2. Prueba no treponémica reactiva c, historia negativa de sífilis.3. Si se tiene historia de sífilis, incremento del título en 4 veces de una prueba no treponémica, en relación a pruebas anteriores.o Sugestivo: (requiere de 1 y 2)1. Lesión que asemeja chancro.2. Contacto sexual dentro de 90 días previos con individuo con sífilis primaria, secundaria o latente temprana.Sífilis secundariao Definitivo: Identificación de Treponema pallidum por examen directo.o Presuntivo: (requiere de ítem 1 y de ítem 2 o 3)1. Lesiones en piel o mucosas típicas de sífilis secundaria.a. Macular, papular, folicular, papuloescamosa o pustular.b. Condilomata lata región anogenital o boca)c. Manchas en mucosas (orofaringe o cérvix)2. Prueba no treponémica reactiva con título ³ _ e historia negativa de sífilis3. Si se tiene historia de sífilis, incremento del título en 4 veces de una prueba no treponémica, en relación a pruebas anteriores.- Sugestivo: (requiere de 1 y 2, y sólo cuando no se puede realizar las pruebas serológicas)1. Presencia de manifestaciones clínicas como las descritas anteriormente.

2. Exposición sexual dentro 6 meses previos con individuo con sífilis temprana.Sífilis temprana latente- Definitivo: no existe por no haber lesiones presentes.- Presuntivo: (requiere de ítem 1 y de ítem 2 y de ítem 3 ó 4)1. Ausencia de signos y síntomas.2. Prueba no treponémica y treponémica reactivas3. Prueba no treponémica no reactiva un año antes.4. Aumento del título en 4 veces de pruebas no treponémicas para personas con historia de sífilis o síntomas compatibles con sífilis temprana.- Sugestivo: (requiere de 1 y 2)1. Pruebas no treponémicas reactivas.2. Exposición sexual un año antes.

Sífilis tardíaBenigna y cardiovascular- Definitivo: Presencia de treponemas en tejidos por inmunofluorescencia directa.- Presuntivo:1. Prueba treponémica reactiva.2. No historia previa de recibir tratamiento para sífilis.3. Síntomas característicos de sífilis benigna o cardiovascular.

Neurosífiliso Definitivo: (requiere de ítem 1 y de ítem 2 ó 3).1. Prueba treponémica en suero reactiva.2. VDRL reactivo en LCR.3. Identificación de Treponema pallidum en LCR o tejidos por exámenes microscópicos o inoculación a animales.o Presuntivo: (requiere de ítem 1 y de ítem 2 ó 3)1. Prueba treponémica en suero reactiva.2. Signos clínicos de neurosífilis.3. Proteínas elevadas en LCR (> 40 mg/dL) o recuento de leucocitos (> 5 mononucleares/ml) en ausencia de otras causas.

Sífilis congénita neonatalo Definitivo: demostración de Treponema pallidum por examen directo en cordón umbilical, placenta, descarga nasal, o lesiones dérmicas.o Presuntivo: (requiere de ítem 1, 2 y 3)1. Determinación de que el infante nació de una madre que no recibió tratamiento o fue tratada inadecuadamente para sífilis.2. Infante con pruebas treponémicas reactivas.3. Uno de los siguientes criterios adicionales:a. Signos v síntomas clínicos de sífilis congénitab. LCR anormal sin otro hallazgo.c. VDRL reactivo en LCR.d. Prueba de anticuerpos IgM específicos para sífilis.

RECUENTO DE RETICULOCITOS

También conocido como: Índice de reticulocitos, reticulocitos corregidos.

Esta prueba mide el número y el porcentaje de reticulocitos en sangre y sirve como indicador de la correcta

producción de hematíes en la médula ósea. Los reticulocitos son glóbulos rojos jóvenes o inmaduros.

Este examen sirve para evaluar la capacidad de la médula ósea de generar nuevos hematíes y para diferenciar la

anemia debida a pérdidas de sangre (ferropénica) o a destrucción de hematíes (hemolítica) de la anemia

consecuencia de un descenso en la producción de glóbulos rojos (aplásica); para ayudar a monitorizar la respuesta

de la médula ósea y la vuelta a la normalidad en su funcionalidad después de tratamiento con quimioterapia,

transplante de médula ósea o para el seguimiento después del tratamiento de una anemia por deficiencia de hierro.

El recuento de reticulocitos es un reflejo de la actividad reciente de la médula ósea. Si la médula responde

adecuadamente al incremento de la demanda de hematíes, ésta permite una liberación temprana de glóbulos rojos

inmaduros (reticulocitos) y se observa un aumento en el recuento de reticulocitos. Si un paciente sufre hemorragias

(sangrados), el número de reticulocitos aumentará unos días después para compensar la pérdida de hematíes. Si

un paciente sufre de hemorragias crónicas, el número de reticulocitos quedará aumentado de forma permanente,

ya que la médula está tratando de mantener la demanda constante de glóbulos rojos. Si la médula es incapaz de

mantener esta demanda o no funciona correctamente, el número de reticulocitos será normal o ligeramente

elevado a pesar de la demanda. Si el número de reticulocitos no se encuentra elevado en un paciente anémico,

probablemente estaremos ante algún grado de disfunción de médula ósea y/o deficiencia de eritropoyetina.

El recuento de reticulocitos indica que es lo que puede estar sucediendo, pero no es un parámetro diagnóstico de

ninguna enfermedad concreta. Es un signo claro de que hay que seguir haciendo pruebas y que en algunos casos

puede ser una herramienta necesaria para monitorizar tratamientos.

Reticulocitos (%) = [Número de Reticulocitos / Número de Glóbulos Rojos] X 100

Índice de Reticulocitos = Recuento de Reticulocitos (%) X [Determinación de hematocrito / Hematocrito normal]