Pruebas Serológicas Para El Diagnostico en Equinos

8/17/2019 Pruebas Serológicas Para El Diagnostico en Equinos

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RUEBAS SEROLÓGICAS ARA EL DIAGNOSTICO EN

EQUINOS

ruebas serológicas:

Debe recogerse !ues"ras #e sagre #e los ai!ales e los $ue se sos%ec&a #e ua

ele'a#a coce"ració #e a"icuer%os( El icre!e"o #el ")"ulo #e a"icuer%os e las

!ues"ras #e suero recogi#as e la *ase #e co'alececia i#ica $ue el ai!al &a es"a#o

e+%ues"o al %a"ógeo( Los resul"a#os #e es"a %rueba #ebe co!%le"arse co &alla,gos

cl)icos - co el aisla!ie"o #el %a"ógeo e l)$ui#os o "e.i#os %ara %o#er e!i"ir u

#iagos"ico e"iológico #e*ii"i'o(

RUEBAS SEROLÓGICAS UTILI/ADAS EN EQUINOS ARA EL DIAGNOSTICO

ANEMIA INFECCIOSA EQUINA:

Debido a la persistencia del virus de la AIE en los équidos infectados, la detección

serológica de anticuerpos frente al virus de la AIE conrma el diagnóstico de la

infección por dicho virus.

A) PRUEBA DE INMUNO-DIFUSIÓN EN GEL DE AGAR (PRUEBA PRESCRITA

PARA EL COMERCIO INTERNACIONAL).

Los anticuerpos precipitantes se producen rpidamente como resultado de la

infección por la AIE ! se pueden detectar mediante la prueba A"ID. Las

reacciones espec#cas se indican por las l#neas de precipitación entre el ant#geno

de la AIE ! el suero problema ! se conrman por ser idénticas a la reacción que

se da entre el ant#geno ! el suero estndar positivo. "eneralmente, en las

primeras $%& semanas después de la infección, los caballos presentarn

reacciones serológicas negativas. En algunos casos, el tiempo posterior a la

infección previo a la aparición de anticuerpos detectables puede durar hasta '(

d#as.

Estn disponibles comercialmente reactivos para A"ID de diversas compa)#as.Alternativamente, el ant#geno A"ID ! el suero de referencia se pueden preparar

como se describe a continuación.

* +reparación del ant#geno

El ant#geno espec#co para la AIE se puede preparar a partir del bao de caballos

infectados e-perimentalmente con enfermedad aguda '/, del cultivo de te0idos



de caballos infectados 1(/, de una l#nea celular de timo canino con infección

permanente &/ o de prote#nas recombinantes e-presadas en bacterias o en

baculo2virus utiliando la técnica del AD3 recombinante $,4/. La preparación del

ant#geno a partir de cultivos infectados o mediante la técnica de AD3

recombinante, proporciona un resultado ms uniforme que utiliando las células

del bao, ! permite una me0or estandariación de los reactivos.

+ara obtener un ant#geno satisfactorio a partir del bao, debe infectarse un

caballo con una cepa mu! virulenta del virus de la AIE. El per#odo de incubación

resultante deber#a durar entre 5 ! 6 d#as, ! el bao debe recogerse 4 d#as

después de la inoculación, cuando ms alto es el t#tulo del virus ! antes de que se

produca cualquier cantidad de anticuerpos precipitantes. La pulpa del bao, sin

diluir, se utilia como ant#geno en la prueba de inmunodifusión'/. La e-tracción

del ant#geno del bao con una solución salina ! una concentración con sulfato

amónico, no proporciona un ant#geno tan satisfactorio como una selección de

baos con un t#tulo alto del ant#geno de la AIE.

Alternativamente, se infectan células de ri)ón fetal equino, células dérmicas o

células del timo canino con una cepa del virus de la AIE adaptado para crecer en

cultivo de te0ido American 7!pe 8ulture 8ollection/. El virus se recoge de los

cultivos por precipitación con polietilenglicol al 9:, por confección en pellets opor ultra2centrifugación. El ant#geno de diagnóstico, p$', se separa del virus por

tratamiento con detergente o éter. Las prote#nas del n;cleo del virus de la AIE,

e-presadas en bacterias o baculo2virus estn disponibles comercialmente ! se

utilian como ant#genos de alta calidad para el diagnóstico serológico. E-isten

evidencias de variación de la cepa en la secuencia del aminocido p$'< sin

embargo no ha! evidencias de que esta variación in=u!a en ninguna de las

pruebas de diagnóstico 14/.

La p$' es una prote#na estructural interna del virus que est codicada por el gen

gag. Este gen es estable ! no se han encontrado variaciones entre las cepas 11/.

* +reparación del antisuero estndar

>e debe recoger un antisuero positivo conocido procedente de un caballo

previamente infectado con el virus de la AIE. Este suero debe producir una ;nica



l#nea de precipitación densa, que es espec#ca para la AIE, tal como se ha

demostrado mediante una reacción idéntica a la de un suero estndar conocido.

Es esencial equilibrar las concentraciones de ant#geno ! de anticuerpos, con el n

de garantiar la sensibilidad óptima de la prueba. Las concentraciones del

reactivo deben a0ustarse para formar una l#nea de precipitación estrecha

apro-imadamente equidistante de los dos pocillos que contienen el ant#geno ! el

suero.

* +rocedimiento de la prueba 1, ', 1&/

i/ Las reacciones de inmuno2difusión se llevan a cabo en una capa de agar en

placas de +etri. +ara placas de +etri de 1(( mm de dimetro, se utilian 15%16 ml

de agar 3oble al 1:. >e perforan

' pocillos en el agar en torno a un pocillo central del mismo dimetro. Los pocillos

sern de 5,& mm de dimetro ! con una separación de $,?mm. 8ada pocillo debe

contener el mismo volumen de reactivo.

ii/ >e coloca el ant#geno en el pocillo central ! el antisuero estndar en uno de

cada dos pocillos e-teriores. Las muestras del suero problema se colocan en los

tres pocillos restantes.

iii/ >e mantienen las placas a temperatura ambiente en un ambiente h;medo.

iv/ 7ranscurridas $?%$9 horas, se e-aminan las reacciones de precipitación con unha estrecho de lu oblicua e intensa frente a un fondo negro. Las l#neas de

referencia deben ser claramente visibles a las $? horas !, en ese momento,

cualquier suero problema que sea fuertemente positivo también puede haber

formado l#neas idénticas a las que se dan entre los reactivos estndar. @na

reacción positiva débil puede tardar ?9 horas en formarse, ! se indica mediante

una peque)a inclinación de la l#nea de precipitación del suero entre el pocillo del

ant#geno ! el pocillo del suero problema. Los sueros con t#tulos de anticuerpos de

precipitación altos, pueden formar bandas anchas de precipitina que tienden a

e-tenderse. 7ales reacciones pueden conrmarse como espec#cas de la AIE por

dilución al o B antes del contra ensa!o< éstas pueden ofrecer una l#nea de

identidad ms marcada. Los sueros libres de anticuerpos de la AIE no formarn



l#neas de precipitación ! no tendrn efecto sobre las l#neas de reacción de los

reactivos estndar.

v/ Interpretación de los resultadosC Los caballos que estn en las primeras etapas

de la infección pueden no dar una reacción serológica positiva en la prueba

A"ID. 7ales animales deber#an sangrarse de nuevo después de &%? semanas. 8on

el n de realiar un diagnóstico en un potro 0oven, es necesario determinar el

estado de los anticuerpos procedentes de la madre. >i la !egua posee alg;n

anticuerpo de la AIE, entonces ser necesario un per#odo de ' meses o ms

después del nacimiento para que el anticuerpo materno disminu!a< se somete al

potro a una nueva prueba para determinar si una reacción positiva inicial se

debió al anticuerpo materno o a la infección.

B) ENZIMOINMUNOENSAYO

E-isten tres tipos de ELI>A que han sido aprobados por el Departamento de

Agricultura de los Estados @nidos para el diagnóstico de la anemia infecciosa

equina ! que estn disponibles internacionalmente< un ELI>A competitivo ! dos

ELI>A> no competitivos. El ELI>A competitivo ! uno de los ELI>As no

competitivos detectan los anticuerpos producidos contra el ant#geno proteico del

n;cleo p$'. El otro ELI>A no competitivo incorpora la prote#na del n;cleo p$' !

los ant#genos gp?5 prote#na transmembrana v#rica/.Los protocolos del ELI>A t#picos se utilian en todas las pruebas. >i los materiales

comerciales del ELI>A no estn disponibles, puede emplearse un ELI>A no

competitivo utiliando ant#geno p$' puricado procedente del material de cultivo

de células 1?/.

@n resultado positivo obtenido mediante ELI>A debe comprobarse de nuevo

utiliando la prueba A"ID para conrmar el diagnóstico, debido a que se han

detectado algunos resultados positivos falsos mediante

ELI>A. 7ambién se puede conrmar el resultado por la técnica inmuno2bloting. Los

Laboratorios de

eferencia de la IE tienen disponible un antisuero estndar para inmuno2

difusión que contiene una cantidad m#nima de anticuerpo que deber#a detectarse

en los laboratorios. Féase el cuadro que aparece en la parte & de este Ganual



para Animales 7errestres/. >e han publicado métodos uniformes para el control de

la AIE 16/.

GRIPE EQUINA

Las infecciones se pueden detectar mediante pruebas serológicas con sueros

pareados para demostrar un aumento en el t#tulo de anticuerpos. Estas pruebas

se deben realiar tanto si se ha intentado, como si no, el aislamiento del virus.

E-isten dos métodos sencillos, la IH ! la hemolisis radial simple >H/, cada uno

igualmente eca ! de amplio uso. 7ambién se puede aplicar la prueba de 0ación

de complemento 8/, pero no es de uso general. Las muestras de ambos sueros

pareados deben probarse 0untas al mismo tiempo para minimiar la variabilidad.

Los ant#genos estndares se han descrito anteriormente >ección J.1.c./. >e

deber#an incluir aislados de casos recientes, si estuvieran disponibles. En el

Laboratorio de eferencia de la IE, en GeKmaret ver 8uadro de la +arte & de

este Ganual/ se dispone de antisueros equinos lioliados contra

AMeqM3eKmarrtM66 H636/, AMeqM3eKmaretM1M4& H&39 NAmericano/ !

AMeqM3eKmaretM$M4& H&39 NEuropeoN/ ! de un suero equino negativo para la

gripe. Estos sueros tienen designación de valor >H en estudios de colaboración

internacional ! se pueden utiliar como sueros de referencia en este ensa!o.a/ +rueba de la inhibición de la hemoaglutinación

+ara incrementar la sensibilidad de la prueba se trata primero el ant#geno con

7Keen 9(Méter, en particular para virus H&39. Esta prueba se realia me0or en

placas de microtitulación con un equipo adecuado de dilución. >e puede utiliar

una macroprueba, donde el ant#geno se dilu!e a un t#tulo nal de HA de 1M9 por

pocillo ! los vol;menes de +J>, sueros ! ant#geno son (.5 ml. Los sueros se pre2

tratan para eliminar hemo2aglutininas no espec#cas ! se inactivan a 5'O8

durante &( minutos. Los pre2tratamientos inclu!en la utiliación de alguno de los

siguientes procedimientosC a/ adsorción por caol#n ! eritrocitos, b/ periodato

potsico, o c/ enima de Fibrio cholerae destructor de receptores. Los tres

procesos dan resultados similares. Los sueros tratados se dilu!en con +J>, se



a)ade una dosis estndar de ant#geno t#tulo HA de 1M? por pocillo en el ensa!o

de microtitulación/ ! éstos se mantienen a $$O8 P $O8/ durante &( minutos.

Después de meclar ligeramente, se a)aden eritrocitos ! la prueba se lee a los &(

minutos. Los t#tulos HI son la dilución ms alta de suero que produce una

inhibición completa de la hemoaglutinación. >e pueden utiliar eritrocitos de pollo

1: QvMvR de células empaquetadas/ en placas de microtitulación con pocillos de

fondo en F, o eritrocitos de coba!a (.5: QvMvR de células empaquetadas/ en

placas con pocillos de fondo en F o en @. >i se utilian eritrocitos de pollo, las

placas pueden leerse inclinndolas 6(O de modo que las células no aglutinadas

ScorranT al fondo del pocillo. Las células no aglutinadas de coba!a forman un

botón en la parte inferior del pocillo ! la sedimentación puede llevar ms tiempo.

Los aumentos de cuatro veces o ms en el t#tulo entre sueros pareados indican

una infección reciente $1/.

a/ Hemolisis radial simple

En esta prueba, los ant#genos v#ricos se acoplan con eritrocitos 0ados que se

suspenden en agarosa que contiene complemento de coba!a 8U/. Los pocillos se

forman en la agarosa ! se llenan con los sueros de ensa!o. Los anticuerpos

contra la gripe ! el 8U lisan los J8s recubiertos de ant#geno, originando una

ona hemol#tica clara alrededor del pocillo< el tama)o de esta ona esdirectamente proporcional al nivel de anticuerpo espec#co contra la cepa en la

muestra de suero 1(, 14, $(/.

+ara el ensa!o se pueden utiliar placas especiales de inmunodifusión H!land,

Giles >cientic/, pero también son adecuadas las placas de +etri. Los eritrocitos

de ove0a recogidos en solución de Alsever se lavan tres veces. El 8U se puede

obtener comercialmente, o se puede utiliar suero normal de coba!a. Los

ant#genos son l#quidos alantoideos o preparaciones puricadas< las cepas usadas

son las mismas que para las pruebas HI. Los virus se acoplan a los J8s con

periodato potsico o con cloruro crómico. Las preparaciones acopladas de

ant#genoMJ8s se meclan con 8U, 0unto con una solución de agarosa al 1: de

grado de fusión ba0o/ en +J>. Debe cuidarse que la temperatura no e-ceda de

?$O8 en ning;n caso. La mecla se vierte en placas ! se de0an toda la noche a



?O8. >e perforan en la agarosa solidicada pocillos de & mm de dimetro

separados durante 1$ mm, por lo menos a ' mm del borde de la placa. Estas

placas se pueden guardar a ?O8 por 1$ semanas. Las placas se preparan para

cada ant#geno ! se prueban previamente con antisueros positivos ! negativos.

Los sueros se inactivan a 5'O8 durante &( minutos, pero no es necesario ms

tratamiento. Los sueros pareados deben ensa!arse por duplicado en la misma

placa. 8omo m#nimo, deber#a incluirse un antisuero espec#co de subtipo como

un control de suero en un pocillo de cada placa. 7odos los sueros se ensa!an en

una placa control que contenga todos los componentes e-cepto virus para

controlar la lisis inespec#ca.

Alternativamente, se puede utiliar en la placa control un virus no relacionado, tal

como el

AM+M9M&? H131/. Los sueros que muestran actividad hemol#tica con eritrocitos

de ove0a deben someterse a pre2absorción con eritrocitos de ove0a. Las onas de

lisis deben ser claras ! no difusas o trasl;cidas. >e deben medir todas las onas

claras ! calcular las reas de hemolisis.

ARTRITIS VIRAL EQUINA

+ara detectar anticuerpos anti2 EAF se han usado varias pruebas serológicas queinclu!en la neutraliación microneutraliación Q5$R, ! reducción de placas o

calvas Q?1R 3F/, la prueba de la 0ación del complemento 8/$$/, la

inmuno=uorescencia 1'/, la inmunodifusión en medio sólido 1'/ ! las pruebas

ELI>A 11, 1?, &(, &1, &5, ?9/ ! el inmunoensa!o de microesferas =uorescentes

GIA comunicación personal/.

Actualmente, la prueba de ma!or uso internacional para el diagnóstico de la

infección, para realiar estudios sobre prevalencia, ! para e-aminar caballos para

e-portación, es una prueba de micro2neutraliación en presencia de

complemento. 7ambién se ha utiliado para el e-amen de sangre de coraón fetal

para el diagnóstico retrospectivo de casos de aborto asociados a la AFE 5'/.

Adems de la prueba 3F, la prueba 8 se ha utiliado para diagnosticar

infecciones recientes por el EAF, puesto que los anticuerpos que 0an el



complemento son de una duración relativamente transitoria $$/. En contraste,

los t#tulos de anticuerpos neutraliantes anti2EAF pueden persistir con frecuencia

durante a)os después de la infección natural 54/.

Aunque se han desarrollado varias pruebas ELI>A 11, 1?, &(, &1, &5, ?9/,

ninguna se ha validado tan ampliamente como la 3F, pese a que algunas parecen

ofrecer una sensibilidad ! especicidad casi iguales 11, &(, &1, ?9/. A diferencia

de la prueba 3F, una reacción positiva por ELI>A no re=e0a necesariamente el

estado de protección inmune de un caballo individual anti2EAF !a que estn

implicados anticuerpos neutraliantes ! no neutraliantes.

Gediante protocolos convencionales de inmuniación se han preparado en

caballos ! en cone0os antisueros antiEAF no puricado. Adems, se han

desarrollado en ratón anticuerpos monoclonales ! en cone0o anticuerpos mono2

espec#cos para la prote#na de la nucleo2cpsida 3/, la glicoprote#na principal de

la envoltura "+5/ ! la prote#na de la envoltura no glicosilada G/ del EAF 6, 16,

$9, &4, ?(/.

La IE dispone de sueros estandariados para el EAF$ que pueden facilitar la

estandariación de la prueba de la micro2neutraliación ! la del ELI>A.

Hasta la fecha solo se ha reconocido un serotipo importante ?1, 54/. Este est

representado por la cepa prototipo Juc!rus A788 F 64'/. El virus de referenciautiliado en la prueba de 3F para el EAF es la cepa del 8FL2Juc!rus Ve!bridge/.

El stoc de virus se obtiene en la l#nea celular W21&, se clarica de restos

celulares por centrifugación a ba0a velocidad ! se guarda en al#cuotas a %6(O8. >e

descongelan varias al#cuotas ! se determina la infectividad del virus por titulación

en células W21&.

a/ 3eutraliación del virus prueba prescrita para el comercio internacional/

La prueba de 3F se utilia para e-aminar sementales por si ha! evidencia de

infección por el EAF ! para determinar si se necesita detectar el virus en semen

mediante cultivo celular o por una prueba 72+8. >e utilia también con nalidad

diagnóstica para conrmar la infección en casos sospechosos de AFE. El

procedimiento de la prueba de la 3F de uso ms difundido es el desarrollado por

los Laboratorios del



>ervicio 3acional Feterinario del Departamento de Agricultura de los EE. @@. 5$/.

Es importante obtener una muestra de sangre estéril para evitar que la

contaminación bacteriana interera en el resultado de la prueba. >e recomienda

realiar la prueba en células W21& utiliando como virus de referencia la cepa

aprobada 8FL2Juc!rus Ve!bridge/&$(/.

La historia completa de pases de la cepa 8FL Ve!bridge/ no est documentada

aunque deriva originalmente de la cepa Juc!rus prototipo del virus. La

sensibilidad de la prueba de la 3F para detectar anticuerpos anti2EAF est mu!

in=uenciada por varios factores, especialmente por el origen ! la historia de

pases de la cepa v#rica utiliada $(, $1/. La cepa 8FL2Juc!rus

Ve!bridge/ ! la cepa vacunal GLF mu! atenuada del EAF son de sensibilidad

seme0ante para detectar sueros positivos de t#tulo ba0o, especialmente en

caballos vacunados contra AFE. >e contin;an realiando esfueros para lograr

una ma!or uniformidad en el protocolo de la prueba ! los resultados serológicos

entre los laboratorios que utilian la prueba 3F u otras pruebas serológicas

comparables para esta infección.

b/ Enimo2inmunoensa!o

+ara detectar anticuerpos anti2EAF se han desarrollado varios ELI>A directos o

indirectos 11, 1?, &(, &1, &5, ?9/. Estos se basan en la utiliación de viruspuricados o de ant#genos recombinantes derivados de los virus. La utilidad de

las pruebas iniciales estaba limitada por la frecuencia de reacciones positivas

falsas 15/, que se asociaban con la presencia de anticuerpos contra varios

ant#genos de los cultivos de te0idos en los sueros de caballos que hab#an sido

vacunados con ant#genos derivados de cultivos de te0idos 15/. La identicación

del importante papel de la prote#na "+5 en la estimulación de la respuesta

inmune humoral contra el EAF condu0o al desarrollo de varios ELI>A que emplean

una porción de ella, o la prote#na recombinante completa producida en un

sistema de e-presión bacteriano o de baculovirus 1?, 16, &(/. Gs

recientemente, se ha utiliado un péptido sintético con0ugado con ovoalb;mina

que presenta los aminocidos 91%1(' de la prote#na "+5 ?9/. Algunas de estas

pruebas parecen presentar una sensibilidad ! especicidad casi idénticas a las de



la prueba 3F ! pueden detectar anticuerpos anti2EAF antes de que se pueda

obtener una reacción positiva por la prueba de la 3F 11. >in embargo, pueden

ocurrir reacciones negativas falsas en algunas de estas pruebas. El anlisis al

aar de una bater#a de péptidos fgicos con sueros policlonales de caballos

infectados por el EAF permitió la identicación de ligandos, que se puricaron !

emplearon como ant#genos en un ELI>A para el EAF &1/. >in embargo, no se

encontró correlación entre los valores de absorbancia obtenidos con este ensa!o

! los t#tulos de anticuerpos neutraliantes, lo que indica que los anticuerpos

detectados estaban dirigidos fundamentalmente contra ep#topos no superciales

del virus. @n ELI>A basado en el uso combinado de las prote#nas estructurales

"+5, G o 3 del EAF, e-presadas por baculovirus recombinantes, detectó con é-ito

los anticuerpos en caballos infectados natural o e-perimentalmente, pero no en

animales vacunados contra AFE &(/.

especto a cualquier ELI>A para EAF basado en la prote#na "+5 es mu!

importante considerar el hecho de que la sensibilidad de la prueba var#a en

función de la secuencia del dominio o región supercial que se utilice en el

ensa!o de esta prote#na v#rica. Entre aislamientos del EAF ?6/ se ha encontrado

una considerable variación en la secuencia de aminocidos de este dominio ?/.

+ara aumentar la sensibilidad de un ELI>A basado en "+5 puede ser necesarioincluir varias secuencias del dominio supercial que representen diferentes

aislamientos fenot#picos de EAF en ve de depender de una ;nica secuencia

supercial. tros dos ELI>A de descripción ms reciente parecen ofrecer un

diagnóstico ms prometedor ! able de las infecciones por el EAF 1?, ?9/. >e ha

descrito un ELI>A bloqueante que utilia GAbs producidos contra la prote#na "+5

con una sensibilidad del 44.?: ! una especicidad del 46.6: en comparación

con la prueba 3F 1?/. tra prueba, que es un ELI>A con un péptido sintético de

"+5 con0ugado a ovoalb;mina, tiene una sensibilidad ! especicidad del 4'.65:

! 45.':, respectivamente, utiliando una referencia de ?(( sueros positivos por

3F ! ?(( muestras negativas por 3F ?9/. Es posible que se disponga en breve

de un ELI>A con una sensibilidad ! especicidad similar a la de la prueba 3F.



ENCEFALITIS EQUINA VENEZOLANA

El diagnóstico de la infección por el virus de la EEF requiere la demostración de la

presencia de anticuerpos espec#cos en pares de muestras de suero recogidas

en las fases aguda ! convaleciente. Después de la infección, los anticuerpos

detectados en la prueba de +3 aparecern entre los d#as 5%6, los anticuerpos de

la 8 entre los d#as '%4, ! los anticuerpos de la HI entre los d#as '%6. La segunda

muestra de suero de la fase de convalecencia se deber#a tomar a los ?%6 d#as

posteriores a la recogida de la primera muestra de la fase aguda o en el

momento de la muerte. En el 8ap#tulo $.5.& se describen con detalle los

procedimientos serológicos que se deben seguir. +ara interpretar cualquiera de

los resultados de las pruebas serológicas de la EEF se tendr#a que tener en

cuenta la historia de la vacunación. En el caso de caballos que no se han

vacunado recientemente con una cepa del virus vivo atenuado, la demostración

de la presencia de anticuerpos séricos del tipo IgG espec#cos de la EEF en una

muestra simple de suero conrma una e-posición reciente al virus.

>e deber#a considerar con cierta cautela cualquier diagnóstico de la EEF en un

individuo que se base en la seroconversión en ausencia de una epiootia. A pesar

de que los subtipos ! variantes enoóticos no son patogénicos para los équidos,

la infección estimular la producción de anticuerpos frente a las variantesepioóticas del virus de la EEF.

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