182 ANWENDUNGEN & PRODUKTE

CAROLA SCHADE

QIAGEN GMBH, HILDEN

Implementing rigorous quality control (QC) steps at appropriate break-points across nucleic acid based workflows enables researchers to eliminate samples that do not meet the quality criteria required for down-stream processes. Such an approach reduces the risk of repeat experi-ments, can result in significant time savings and ensure tighter budgetcontrol.

10.1007/s12268-014-0426-1© Springer-Verlag 2014

ó In den letzten Jahren hat eine Reihe inno-vativer und immer sensitiverer Detektions-technologien in der molekularbiologischenForschung Einzug gehalten. Diese Technolo-gien stellen hohe Ansprüche an die Qualitätund Reinheit von Nukleinsäuren, die in sol-chen Analyseverfahren eingesetzt werden.Darüber hinaus zeichnen sich die entspre-chenden Arbeitsabläufe oft durch eine hoheKomplexität aus. Zumeist handelt es sich umvielstufige Prozesse (Abb. 1), wobei die

Genauigkeit des Endergebnisses entschei-dend von der korrekten Durchführung dereinzelnen Arbeitsschritte beeinflusst wird.Mögliche Fehler, unsachgemäße Handhabungoder Verunreinigungen können die Emp-findlichkeit und Zuverlässigkeit der einge-setzten Nachweistechnologie entscheidendbeeinflussen und zu falsch-positiven oderfalsch-negativen Ergebnissen führen. Quali-tätskontrollverfahren, die sicherstellen, dassProben den Anforderungen des jeweils nach-

gelagerten Prozessschritts genügen, gewin-nen daher immer mehr an Bedeutung [1, 2].Die Etablierung solcher Verfahren bietet eineReihe von Vorteilen:– weniger Wiederholungsexperimente: Pro-

ben minderer Qualität können frühzeitigaus dem Arbeitsablauf ausgeschlossen wer-den, wodurch der Aufwand für möglicheWiederholungsexperimente sinkt;

– effiziente Zeitnutzung: Die aufwendi -ge Wiederholung kompletter Prozessket-ten entfällt, lediglich einzelne Arbeits-schritte werden – sofern notwendig –wiederholt;

– bessere Kostenkontrolle: durch höhereLaboreffizienz und die Reduktion un -ter Umständen teurer Wiederholungs -experimente können laufende Kosten undbestehende Budgets besser gemanagt werden.

Parameter der Nukleinsäure-QualitätskontrolleDie Nukleinsäure-Qualitätskontrolle (QC)umfasst quantitative und qualitative Analy-separameter (Tab. 1). Die zuverlässige Quan-

Kontaminationsdetektion

Qualitätskontrolle von Nukleinsäuren

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˚ Abb. 1: DNA-Qualitätskontrollen in typischen Arbeitsabläufen in der molekularbiologischen Forschung.

tifizierung von Nukleinsäuren ist essenziellfür viele molekularbiologische Anwendun-gen. Der Einsatz von zu wenig Templatekann beispielsweise bei Amplifikationsre-aktionen zu geringen oder gar fehlendenAusbeuten führen [3] und birgt somit dasRisiko falsch-negativer Resultate. Wird dage-gen zu viel Template eingesetzt, kann dieszu unspezifischer Amplifikation führen,eventuell aber auch die Polymerase-Akti-vität durch unzureichende Denaturierungoder die Übertragung von Inhibitoren beein-trächtigen [4].

Faktoren, die sich negativ auf die Kinetikenzymatischer Reaktionen auswirken undderen Empfindlichkeit und Zuverlässigkeitnegativ beeinflussen können, sind chemi-sche Substanzen, wie chaotrope Salze, Phe-nol- oder Ethanolreste, sowie Probenkom-ponenten, wie Hämoglobin, Immunglobu-lin G oder andere Proteine. Chemische Ver-unreinigungen stammen in der Regel ausder Nukleinsäure-Aufreinigung. ChaotropeSalze werden häufig als Denaturierungs-agens und zur Zelllyse eingesetzt. Phenolist ein organisches Lösungsmittel, das zurAbtrennung von Proteinen mittels orga-nisch-wässriger Phasentrennung verwen-det wird. Rückstände entstehen hierbei typi-scherweise bei der Entnahme der wässri-gen aus der organischen Phase, gehen aufunzureichende Waschvorgänge zurück oderhaben ihre Ursache in unzureichenderTrocknung von gefällten Nukleinsäuren vorder Resuspendierung.

Eine Überprüfung der Nukleinsäure-Inte-grität wird zumeist für RNA durchgeführt;DNA gilt generell als robust und wenigeranfällig für Degradierungen. Die Integritätbeschreibt die „Intaktheit“ und damit Unver-sehrtheit der RNA-Transkripte und erlaubtsomit auch einen Rückschluss auf die Sta-bilität der Probe unter der Annahme, dassintakte RNA RNAse-frei ist.

Methoden zur Qualitätskontrollevon NukleinsäurenIm Wesentlichen stehen vier verschiedeneMethoden zur Erfassung einer oder mehre-rer der genannten QC-Parameter zur Verfü-gung, wobei jedoch keine der Methoden dieErfassung aller Parameter erlaubt: (1) Gele-lektrophorese, (2) UV/VIS-Spektralphoto-metrie, (3) Fluoreszenzspektroskopie und(4) μ-Fluidik-basierende bzw. Kapillarelek-trophorese-basierende Methoden.

Die beiden am häufigsten eingesetztenMethoden zur Nukleinsäure-Quantifizierung

sind die UV/VIS-Spektralphotometrie unddie Fluoreszenzspektroskopie. Fluoreszenz-basierende Techniken zeichnen sich durcheine hohe Spezifität und Sensitivität aus.Sie erfordern jedoch im Vorfeld der Mes-sung die Inkubation der Proben mit geeig-neten Fluores zenzfarbstoffen sowie dieErstellung von Standardkurven, wodurchzusätzliche Arbeitsschritte notwendig sind.Darüber hinaus gibt dieses Verfahren kei-nen Aufschluss über mögliche Verunreini-gungen innerhalb der Probe, die nachfol-gende Arbeitsschritte beeinflussen können.

Die UV/VIS-Spektralphotometrie machtsich zunutze, dass Nukleotide ultraviolettesLicht absorbieren. Aus der Absorption bei260 Nanometer kann nach dem Lambert-Beer-Gesetz auf die Konzentration der ver-messenen DNA- oder RNA-Moleküle zurück-geschlossen werden. Des Weiteren erlaubtdiese Methode durch den Vergleich derAbsorption bei 260 Nanometer mit der bei280 und 230 Nanometer eine Bewertung derReinheit der Nukleinsäure-Probe. Proteinezeigen ein Absorptionsmaximum bei280 Nanometer, viele chemische Verunrei-nigungen absorbieren stark bei 230 Nano-meter (z. B. Phenol, EDTA, Guanidinhydro-chlorid, Glykogen).

Da jedoch alle Nukleotide ihr Absorp-tionsmaximum bei 260 Nanometer haben,ist es bislang mit konventionellen UV/VIS-Spektralphotometern nicht möglich, zwi-schen z. B. DNA und RNA zu unterschei-den. Diese Möglichkeit ergibt sich erst mit Spektralphotometern der neueren Genera-tion, wie beispielsweise dem QIAxpert-Sys-tem (QIAGEN).

Differenzierung vonunterschiedlichenLösungskomponentenDie QIAxpert-Analysesoftware verfügt überspezielle mathematische Algorithmen, dieden Anteil, den verschiedene Inhaltskom-ponenten zur gemessenen Gesamtabsorp-tion beitragen, ermitteln. Neben demGesamtspektrum werden die Einzelspek-tren dieser Komponenten – DNA/RNA ver-sus chemische Verunreinigungen versusabsorbierende Partikel – separat durch dasSystem dargestellt. Zur Verifikation dieserAnalysemöglichkeit wurde der RNeasy MiniKit (QIAGEN) eingesetzt, um Gesamt-RNAaus Jurkatzellen aufzureinigen. Je zweiMikroliter des reinen Eluats sowie Proben,die zu unterschiedlichen prozentualenAnteilen mit käuflich erworbener genomi-

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scher DNA (gDNA, Promega) versetzt wur-den, wurden mit einem QIAxpert-System ver-messen. In den erhaltenen Analyseprofilenwird die in der Probe enthaltene RNA in Hell-blau dargestellt, während detektierte Verun-reinigungen und Nicht-RNA-Nukleinsäurenzusammen in einer orangefarbenen Kurvegezeigt werden. Entsprechend den Erwar-tungen steigt mit zunehmendem Anteil angDNA-Verunreinigungen in den Proben dieAbsorption bei 260 Nanometer, die durchdie orangefarbene Kurve angezeigt wird(Abb. 2).

Diese Funktion ermöglicht es Forschern,auf einfache Weise die Nukleinsäure-Quanti-fizierung mit der Detektion von gDNA in RNA-Proben – oder RNA in gDNA-Proben – zu kom-binieren und ggf. solche Proben von weiterenAnalysen auszuschließen. Diese Möglichkeitkann beispielsweise für Real-Time-RT-PCR-Analysen entscheidend sein, bei denen gDNA-Kontaminationen zu einer Amplifikation vonsowohl cDNA- als auch gDNA-Sequenzen füh-ren können. Hierdurch entstehen in der Regel

falsch-positive Signale mit niedrigeren CT-Werten.

FazitDie UV/VIS-Spektralphotometrie hat sich seitvielen Jahren für die Nukleinsäure-Quantifi-zierung und -Qualitätskontrolle bewährt. Neu-artige Analysesysteme, wie beispielsweise dasQIAxpert System, erlauben neben der ge -nauen und reproduzierbaren Konzentrations -bestimmung auch, zwischen verschiedenenNukleinsäuretypen wie DNA/RNA zu unter-scheiden. Damit erhalten Forscher ein umfas-senderes Verständnis der Qualität undZusammensetzung ihrer Proben und könnenbesser fundierte Entscheidungen bezüglichder Nutzung dieser Proben in nachfolgendenProzessschritten treffen. ó

Literatur[1] Valentine-Thon E (2002) Quality control in nucleic acidtesting – where do we stand? J Clin Virol 25:13–21[2] Bustin SA, Benes V, Garson J et al. (2009) The MIQEguide lines: minimum information for publication of quantita-tive real-time PCR experiments. Clin Chem 55:611–622

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Mengen- und Konzentrationsbestimmung ✓ ✓ ✓ ✓

Chemische Verunreinigungen ✓ – – –

Proteinrückstände ✓ – – –

Probenintegrität/Fragmentgrößenbestimmung – – ✓ ✓

Unterscheidung zwischen Nukleinsäuretypen ✓a – – –

Tab. 1: Analyseparameter in der Nukleinsäure-Qualitätskontrolle und verfügbare Messmethoden.

a nur mit speziellen UV/VIS-Systemen möglich

QC-Parameter UV/VIS-Absorptions- Fluoreszenz- Gelelektrophorese Lab-on-a-chip/messung spektroskopie CE-Systeme

˚ Abb. 2: Detektion verschiedener Probenkomponenten. Gesamt-RNA wurde aus Jurkatzellen mit RNeasy Mini Kit (QIAGEN) aufgereinigt. Je zweiMikroliter des reinen Eluats (A) sowie einer Probe, die zu zehn Prozent mit käuflich erworbener gDNA (Promega) versetzt wurde (B), wurden mithilfedes QIAxpert-Systems vermessen. Schwarze Linie: Gesamt-UV/VIS-Spektrum; hellblaue Linie: RNA-Profil, das über die Software-Algorithmen ermitteltwurde; orange Linie: Profil aller detektierten Verunreinigungen; gelbe Linie: Anteil der Absorption, die keiner der vormals genannten Komponentenzugeordnet werden konnte.

A B

[3] Chandler DP, Fredrickson JK, Brockman FJ (1997) Effect ofPCR template concentration on the composition and distribu-tion of total community 16S rDNA clone libraries. Mol Ecol 6:475–482[4] Kennedy S, Oswald N (Hrsg) (2011) PCR Troubleshootingand Optimization – The Essential Guide. Caister Academic Press, Norfolk

Korrespondenzadresse:Dr. Carola SchadeQIAGEN GmbHQIAGEN Straße 1D-40724 HildenTel.: 02103-290carola.schade@qiagen.comwww.qiagen.com