R S -F E U S T - biochimica.unipr.itbiochimica.unipr.it/home/tesi/att/acdb.testo.pdf · cristalli di emoglobina in cui le forze reticolari impediscono le variazioni ... Teichmann,

ISTITUTO DI SCIENZE BIOCHIMICHE

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA

DOTTORATO DI RICERCA IN BIOLOGIA

E PATOLOGIA MOLECOLARE

IV ciclo (1988-1992)

RELAZIONE STRUTTURA-FUNZIONE

DI EMOGLOBINA UMANA

IN STATO T

Claudio Rivetti

RINGRAZIAMENTI

Alla fine del dottorato desidero ringraziare il Prof. Gian Luigi Rossi

per la disponibilità ad affrontare nuovi esperimenti ed i numerosi

consigli.

Un grazie particolare al Prof. Andrea Mozzarelli per il costante

apporto scientifico, per il continuo incoraggiamento e soprattutto per la

sua amicizia che, forse più di ogni cosa, ha contribuito alla buona

riuscita del lavoro e all'entusiasmo con cui vi ho partecipato.

Voglio ringraziare inoltre: il Dr. William Eaton che ha garantito una

visione globale della problematica, il Dr. Eric Henry per le sofisticate

analisi di calcolo e il Dr. Robert Noble.

Grazie anche a Simona Fontana che mi ha sollevato da molti oneri

burocratici.

Grazie infine a tutti coloro che, in un modo o nell'altro e con pazienza,

mi hanno saputo sopportare.

Indice III

INDICE

SOMMARIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1. INTRODUZIONE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.1. CENNI STORICI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2. STRUTTURA DELL'EMOGLOBINA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3. IL LEGAME DELL'OSSIGENO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.4. MODELLI ALLOSTERICI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.4.1. Modello di Monod, Wyman e Changeux (MWC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.4.2. Modello di Koshland, Nemethy e Filmer (KNF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.4.3. Il modello stereochimico di Perutz. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.4.4. Modello di Ackers. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.5. EFFETTO BOHR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.6. EFFETTORI ALLOSTERICI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.7. EMOGLOBINE MUTATE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.8. PROGETTO DI RICERCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2. MATERIALI E METODI. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.1. TEORIA OTTICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.1.1. Determinazione dei fattori geometrici. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.2. PURIFICAZIONE DELL'EMOGLOBINA A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.3. PREPARAZIONE DELL'EMOGLOBINA ROTHSCHILD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.4. PURIFICAZIONE DEL PEG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.5. PREPARAZIONE DEI CRISTALLI DI HBA PER MICROSPETTROFOTOMETRIA . . . . . 32

2.6. PREPARAZIONE DEI CRISTALLI DI HB ROTHSCHILD PER

MICROSPETTROFOTOMETRIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.7. RIDUZIONE DELLA QUANTITÀ DI METEMOGLOBINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.8. MICROSPETTROFOTOMETRO E APPARATO DI MISURA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.8.1. Stabilità lampada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.8.2. Controllo temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Indice IV

2.9. MISURA DEGLI SPETTRI IN LUCE POLARIZZATA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.10. DETERMINAZIONE DEGLI SPETTRI DI RIFERIMENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.11. PROCEDURA DI FITTING . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.12. SINGULAR VALUE DECOMPOSITION (S.V.D.). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.13. CINETICHE DI OSSIGENAZIONE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.14. SPETTRI NELLA REGIONE VICINO-IR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

2.15. SOFTWARE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3. RISULTATI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

3.1. STABILITÀ DEI CRISTALLI DI HBA DURANTE L'OSSIGENAZIONE . . . . . . . . . . . . . 49

3.2. CURVE DI SATURAZIONE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.3. DIPENDENZA DAL PH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.4. EFFETTORI ALLOSTERICI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

3.5. DIPENDENZA DELLA FRAZIONE DI SATURAZIONE DALLA

TEMPERATURA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

3.6. INEQUIVALENZA αβ NEL LEGAME DELL'OSSIGENO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.7. EMOGLOBINA ROTHSCHILD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

4. DISCUSSIONE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

4.1. EMOGLOBINA A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

4.1.1. L'assenza dell'effetto Bohr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

4.1.2. La saturazione con ossigeno è completa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

4.1.3. L'inequivalenza αβ maschera una piccola frazione di cooperatività . . . . . . . . . . 81

4.2. EMOGLOBINA ROTHSCHILD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

4.3. CONCLUSIONI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

5. BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

APPENDICE 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

APPENDICE 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

PUBBLICAZIONI. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

Sommario 1

SOMMARIO

analisi cristallografica ai raggi X ha evidenziato che l'emoglobina può

esistere in due conformazioni quaternarie definite T ed R. Poichè lo stato R

ha un'alta affinità per l'ossigeno, simile a quella delle subunità α e β isolate, la

maggior parte delle proprietà funzionali e regolative dell'emoglobina hanno

origine dalle interazioni intra- ed inter-subunità presenti nello stato T. La

determinazione della curva di legame dell'ossigeno ad emoglobina in stato T in

soluzione, è complicata dalla progressiva destabilizzazione dello stato T a favore

dello stato R a seguito del legame dell'ossigeno. L'evidenza strutturale che

l'emoglobina A umana, cristallizzata da soluzioni di glicole polietilenico, rimane in

stato T anche a pressione di ossigeno atmosferica (Brzozowski et al., 1984a;

Liddington et al., 1988), suggerisce la possibilità di misurare il legame dell'ossigeno a

cristalli di emoglobina in cui le forze reticolari impediscono le variazioni

conformazionali quaternarie.

In questa Tesi vengono presentate le curve di legame dell'ossigeno a cristalli di

emoglobina in stato T determinate mediante microspettrofotometria in luce

polarizzata. Il metodo permette di distinguere tra il legame dell'ossigeno agli emi α e

quello agli emi β in virtù della loro diversa orientazione rispetto agli assi

cristallografici ed evidenzia la rotazione del piano degli emi conseguente

all'ossigenazione.

I risultati dimostrano che: i) è possibile ossigenare completamente e in modo

reversibile cristalli di emoglobina in stato T; ii) l'affinità dell'emoglobina in stato T nel

cristallo è inferiore a quella misurata per il legame del primo ossigeno in soluzione. A

25 °C, pH 7.0, la p50 nel cristallo è di 298 torr, mentre in soluzione la K1 è di 52 torr

(Lee et al., 1988); iii) il legame dell'ossigeno è non-cooperativo; iv) gli emi α e β legano

l'ossigeno con diversa affinità. Gli emi α hanno una p50 cinque volte inferiore a

quella degli emi β; v) l'effetto Bohr è assente in un intervallo di pH compreso tra 6 e

8.5; vi) gli effettori allosterici (Cl-, IHP e Bzf) non producono effetti paragonabili a

quelli osservati in soluzione.

L'analisi è stata estesa a cristalli di emoglobina Rothschild, un mutante naturale

dell'emoglobina A in cui il triptofano β37 è sostituito da un arginina. In questo caso si

è misurata un'affinità per l'ossigeno dieci volte superiore a quella dei cristalli di HbA

ed inoltre è stata osservata una spiccata dipendenza dell'affinità dalla concentrazione

degli ioni cloruro. Il dato ha permesso l'individuazione cristallografica di un nuovo

sito di legame dei cloruri in corrispondenza dell'aminoacido mutato (Kavanaugh et

al., 1992a).

L'

1. INTRODUZIONE

Introduzione 3

1.1. CENNI STORICI

La transizione dalla vita anaerobica a quella aerobica rappresenta un passo

fondamentale dell'evoluzione perchè ha permesso di sfruttare la grande quantità di

energia ancora contenuta nei prodotti terminali della glicolisi. Per rifornire i tessuti di

un adeguato flusso di ossigeno, i vertebrati, hanno sviluppato un sistema circolatorio

che per diffusione scambia i gas con le cellule, e attraverso l'uso di proteine

trasportatrici di ossigeno (emoglobina e mioglobina) sopperisce alla limitazione

imposta dalla bassa solubilità dell'ossigeno in acqua. La mioglobina, localizzata nel

tessuto muscolare, funge da riserva di ossigeno, l'emoglobina, contenuta nei globuli

rossi del sangue, trasporta l'ossigeno dai polmoni ai tessuti e, in senso opposto, CO2

e H+, prodotti dalla respirazione tissutale.

I primi esperimenti volti alla comprensione della natura del legame dell'ossigeno

al sangue risalgono alla seconda metà del XIX secolo. Nel 1862, Felix Hoppe, che per

primo usò il termine "emoglobina" per descrivere il pigmento rosso del sangue,

osservò, attraverso rudimentali misure spettroscopiche, il caratteristico spettro di

assorbimento dell'ossiemoglobina (Hoppe 1862). Due anni più tardi George Stokes

notò un marcato cambiamento delle proprietà spettrali del sangue quando l'ossigeno

veniva rimosso tramite riduzione chimica con solfato ferroso. La soluzione

riacquistava il colore rosso se riesposta all'aria (Figura 1).

Non appena guardai lo spettro, l'estrema bellezza delle bande di assorbimento

del sangue suscitarono in me un vivo interesse ed io continuai a provare l'effetto

di vari reagenti. ...Mi parve fosse un punto di particolare interesse indagare se

potessimo imitare il cambiamento di colore del sangue da arterioso a venoso

supponendo che esso derivasse da una riduzione. ...Le due caratteristiche bande

scure viste in precedenza (ossiemoglobina) sono ora sostituite da una singola

banda, più ampia e meno risolta rispetto alle due precedenti, occupante la

posizione della banda chiara che separa le due bande scure della soluzione di

origine. ...Se la soluzione porpurea viene esposta all'aria, in un ampio recipiente,

torna velocemente alla sua condizione originale, mostrando, come in precedenza,

le due bande caratteristiche. Il cambiamento avviene immediatamente solo se è

stata usata una piccola quantità di agente riducente e la soluzione viene agitata

all'aria. Aggiungendo un'ulteriore quantità di reagente viene riprodotto l'effetto

iniziale; la soluzione può quindi essere indotta più volte al cambiamento. (Stokes

1864).

Introduzione 4

Fig. 1.

Fig. 2.

Fig. 3.

B D E b F G

a

b

FIGURA 1: (a) Riproduzione degli spettri dei derivati di emoglobina ottenuti da Stokes (1864). "Fig. 1."ossiHb, D e E rappresentano le banda di assorbimento a 576 e 540 nm rispettivamente. "Fig. 2."deossiHb, l'unica banda rappresenta il picco a 555 nm. "Fig. 3." metHb. La banda tra B e Dcorrisponde al picco a 630 nm. (b) Spettri di assorbimento di emoglobina in soluzione nella regionedel visibile. () ossiHb; ( ) deossiHb; (- - - - -) metHb. Le soluzioni contenevanotampone fosfato 10 mM pH 7.2, 20°C

Questo esperimento dimostrò per la prima volta la reversibilità del legame

dell'ossigeno all'emoglobina.

Negli anni che seguirono, Teichmann, Van Slyke, Svedberg (Svedberg & Nichols,

1927), Adair (Adair, 1925a; Adair, 1925b), Bohr (Bohr, 1904; Bohr et al., 1904),

contribuirono ad evidenziare e a descrivere quantitativamente altre proprietà

funzionali e strutturali dell'emoglobina. Quest'ultimo nel 1904 pubblicò la prima

dimostrazione sperimentale dell'andamento sigmoide della curva di dissociazione

dell'ossiemoglobina (Bohr, 1904). Hill collegò la curva sigmoide con la presenza di

una interazione tra unità legate e non legate e introdusse il concetto di cooperatività

(Hill, 1910).

A partire dal 1936 Max Perutz si dedicò all'analisi strutturale di cristalli di

emoglobina tramite diffrazione dei raggi X. Nel 1968 risolse la struttura della

metemoglobina (Perutz et al., 1968) e due anni più tardi quella della

deossiemoglobina mostrando come il legame dell'ossigeno alteri drasticamente la

conformazione dell'emoglobina (Bolton & Perutz, 1970).

L'enorme quantità di dati raccolti nel corso degli anni fa dell'emoglobina un

modello per lo studio della cooperativià e dei cambiamenti conformazionali delle

proteine oligomeriche (Perutz, 1989).

Introduzione 5

1.2. STRUTTURA DELL'EMOGLOBINA

L'emoglobina è una proteina oligomerica (P.M. = 64.500) avente la forma di un

ellissoide (64x55x50 Å) e costituita da quattro subunità, due catene α e due catene β,formate rispettivamente da 141 e 146 aminoacidi. Le subunità sono unite da

interazioni non covalenti e contegnono ciascuna un gruppo prostetico "eme".

Nel 1938, osservando la simmetria dei cristalli, Perutz dedusse che la molecola di

emoglobina è costituita da due identiche metà in relazione attraverso un asse di

simmetria binario. Nel 1960, il completamento della struttura a bassa risoluzione

permise di attribuire alla molecola una simmetria 222 in cui i tre assi di simmetria

binari, mutualmente perpendicolari, si intersecano al centro della proteina.

La struttura tridimensionale delle catene α e β dell'emoglobina è molto simile a

quella della mioglobina in cui i segmenti di alfa elica si ripiegano in modo da

avvolgere la molecola dell'eme. Le catene β sono costituite da otto tratti di alfa elica

destrorsa indicati con le lettere A-B-C-D-E-F-G-H a partire dal terminale aminico e

separati da segmenti non elicoidali. Le catene α invece, sono costituite da sette tratti

di alfa elica mancando il tratto D. Piccoli segmenti non elicoidali sono presenti anche

ai terminali aminico e carbossilico.

La giustapposizione delle subunità (struttura quaternaria) avviene in modo tale

da determinare strette connessioni tra i gruppi laterali delle catene α e β, mentre tali

connessioni non esistono tra α e α o tra β e β. La zona di contatto tra α1 e β1 è più

estesa di quella tra α1 e β2 poichè comprende 34 catene laterali rispetto alle 19

coinvolte nel secondo caso. La natura di queste interazioni è per la maggior parte di

tipo idrofobico, mentre scarsi, ma non meno importanti, sono i legami idrogeno e

interazioni ioniche (ponti salini) (Figura 2).

FIGURA 2: (a) Struttura delle quattro catene dimetemoglobina.(b) Interfaccia α1β2 (Dickerson & Geis, 1983).

Introduzione 6

L'eme (P.M. = 614) è una ferroprotoporfirina IX in cui il ferro, allo stato ferroso, è

in grado di legare reversibilmente una molecola di ossigeno. Le caratteristiche

apolari dell'anello tetrapirrolico e dei gruppi laterali, stabilizzano l'eme nella tasca

idrofobica formata dalle eliche E ed F mentre i residui di acido propionico

interagiscono con la superficie idrofilica della subunità (Figura 3a). L'unico legame

covalente tra l'eme e la globina è quello tra l'atomo di ferro e l'azoto imidazolico

dell'istidina F8 "istidina prossimale".

Fe

N N

NN

CH2

CH2

CH2

CH2

C C

O OO

-O

-

CH3

CHHC

3C

H3C

CHCH

2

CH3

HC

H2C

Nε hisF8

OO

CH

HC

H

a

Fe++

e

t

g

2g

e

t

g

2g

e

t

g

2g

deossiHb ossiHb

∆ 0

∆ 0

∆ 0

b c

d e(alto spin) (basso spin)

FIGURA 3: Struttura del gruppo eme ed effetto dei ligandi sullo stato degli orbitali d del Fe++.

Descrizione nel testo.

Le proprietà fisico-chimiche del ferro dipendono dalla configurazione elettronica

degli orbitali 3d (Figura 3b) il cui livello energetico viene modificato se il ferro fa

parte di un complesso di coordinazione come nel caso dell'eme (Figura 3c).

Nell'emoglobina deossigenata il ferro è penta-coordinato con i quattro azoti

pirrolici della porfirina e l'azoto imidazolico dell'istidina prossimale. Gli orbitali d del

ferro non sono energicamente equivalenti a causa della loro diversa orientazione

rispetto agli orbitali degli atomi del complesso. I cinque orbitali d si separano su due

livelli energetici indicati con eg e t2g (Figura 3d). Per la deossiemoglobina la differenza

di energia che separa tali livelli (∆0) è inferiore a quella necessaria per accoppiare gli

elettroni, quindi i primi cinque elettroni occupano, con spin parallelo, i cinque

orbitali d e solo il sesto elettrone è forzato ad appaiarsi (configurazione ad alto spin).

Introduzione 7

Nella ossiemoglobina il ferro è esa-coordinato e il legame addizionale di una

molecola di ossigeno provoca un aumento di ∆0 e di conseguenza i sei elettroni d si

appaiano ai tre livelli inferiori (configurazione a basso spin) (Figura 3e).

L'ossigenazione dell'emoglobina comporta quindi un passaggio del ferro da alto a

basso spin con variazione delle caratteristiche spettrali e paramagnetiche (Eaton &

Hofrichter, 1981).

1.3. IL LEGAME DELL'OSSIGENO

La cooperatività espressa dall'emoglobina nel legame dell'ossigeno è evidenziata

dall'andamento sigmoide della curva di saturazione (Figura 4). La pressione parziale

di ossigeno a cui si ha il 50% di emi legati, viene definita p50. La p50 dell'emoglobina

in condizioni fisiologiche, è di 26 torr.

Il "plot di Hill" (Figura 4), permette una valutazione diretta del grado di

cooperatività. Infatti, la pendenza della curva quando y = 0.5 (n, coefficiente di Hill)

aumenta al crescere della cooperatività fino ad un valore massimo pari al numero di

siti di legame. Un valore di n = 1, come nel caso della mioglobina, indica assenza di

cooperatività mentre n > 1 indica cooperatività positiva. Valori di n < 1 possono

significare cooperatività negativa oppure una diversa affinità tra i siti α e β. Per

emoglobina in condizioni fisiologiche n = 2.8 (Imai, 1982).

FIGURA 4: Curva di saturazione e plot di Hill determinati su globuli rossi di individuo normale. Le celluleerano sospese in una soluzione di tampone fosfato isotonica, pH 7.4 a 37 °C. Il grafico è statoricostruito dai valori riportati da Imai (1982).

Introduzione 8

1.4. MODELLI ALLOSTERICI

Di seguito vengono riportati alcuni modelli proposti per spiegare le proprietà

allosteriche e cooperative dell'emoglobina.

1.4.1. Modello di Monod, Wyman e Changeux (MWC)

Secondo il modello di MWC (Monod et al., 1965), l'emoglobina può esistere solo

in due diverse strutture quaternarie, una per la forma ossigenata (R) e una per la

deossigenata (T). Le due forme sono in equilibrio termodinamico ed il legame

dell'ossigeno all'interno di ogni struttura quaternaria è di tipo iperbolico, non ci sono

cioè interazioni tra gli emi (Figura 5). La forma T è stabilizzata da ponti salini tra le

subunità che sono responsabili della bassa affinità. Anche i ligandi eterotropici

stabilizzano la forma T abbassando di conseguenza l'affinità dell'emoglobina. In base

al modello MWC, il processo di ossigenazione e di deossigenazione può esseredefinito da due parametri indipendenti: L T R c K KT R= =0 0 e .

FIGURA 5: Diagramma schematico del modello a due stati di MWC.

Il valore di L dà una indicazione della stabilità relativa delle strutture quaternarie

T ed R in assenza di ossigeno mentre c è il rapporto delle costanti di affinità per

l'ossigeno dello stato T (KT) e dello stato R (KR). In condizioni fisiologiche L = 104 e

c = 0.01. La cooperatività deriva dalla transizione conformazionale quaternaria T→R

che avviene in modo concertato mantenendo la simmetria della molecola.

Fra

zio

ne

di s

atu

razi

on

e

Frazione di ossigeno

T

R osservata

Introduzione 9

1.4.2. Modello di Koshland, Nemethy e Filmer (KNF)

Il modello sequenziale proposto da Pauling (Pauling, 1935) assumeva la

presenza di un'unica costante di legame per l'ossigeno e una costante di interazione

tra le subunità. Successivamente, la determinazione della struttura tridimensionale

dell'emoglobina ha escluso la possibilità di interazioni dirette tra i quattro emi. KNF

proposero una forma più generale del modello sequenziale, ipotizzando che

all'interno dello stesso stato quaternario, le variazioni conformazionali terziarie di

una subunità, causate dall'ossigenazione, siano in grado di indurre un aumento

dell'affinità nelle subunità adiacenti (Koshland et al., 1966).

1.4.3. Il modello stereochimico di Perutz

Il meccanismo stereochimico di Perutz (Perutz, 1970; Perutz et al., 1987) unisce

l'evidenza strutturale dell'identificazione di soli due stati quaternari con il concetto T-

R di MWC ma incorpora anche le alterazioni terziarie indotte dal legame

dell'ossigeno ad una subunità, in sintonia con il modello di KNF.

Dai dati strutturali è emerso che la distanza tra gli emi (25-37 Å) è troppo grande

per ammettere che interazioni elettromagnetiche siano in grado di variare l'affinità

degli emi durante l'ossigenazione. Questo, unito ad altre evidenze strutturali, ha

suggerito che l'innesco deve essere di tipo stereochimico. La molecola di

deossiemoglobina è mantenuta nella forma T dalla presenza di sei ponti salini

intersubunità, quattro tra le catene α, uno tra le catene α1 e β2 e uno tra le catene α2 e

β1. Inoltre nelle catene β sono presenti anche due ponti salini intrasubunità. L'accesso

dell'ossigeno agli emi α sembra favorito, da un minor ingombro sterico, rispetto agli

emi β. Nella deossiemoglobina il ferro si trova fuori dal piano dell'eme verso

l'istidina prossimale e l'eme assume una forma a cupola ("domed").

Il legame dell'ossigeno ad una subunità provoca delle variazioni conformazionali

terziarie con la rottura dei ponti salini e rilascio di protoni. La rottura di quattro dei

sei ponti salini intersubunità e le variazioni conformazionali terziarie a livello

dell'interfaccia α1β2 modificano la costante dell'equilibrio conformazionale T→R a

favore della struttura quaternaria R (Figura 6).

Il gruppo eme amplifica i piccoli cambiamenti del raggio atomico del ferro

conseguenti alla transizione da alto a basso spin in un relativamente grande

movimento dell'istidina F8. Tramite l'elica F il movimento è trasmesso all'interfaccia

α1β2 causando la destabilizzazione della struttura T rispetto alla R.

Una trattazione matematica di questo modello è stata sviluppata da Szabo e

Karplus (Szabo & Karplus, 1972).

Introduzione 10

T

R

FIGURA 6: Diagramma schematico del modello stereochimico di Perutz in base alle considerazioni diHess & Szabo (1979). I simboli vuoti rappresentano le subunità non legate mentre i simboli pieni lesubunità legate. I quadrati indicano una subunità con una struttura terziaria caratterizzata dai pontisalini intatti ed i cerchi una subunità la cui struttura terziaria ha i ponti salini rotti.

1.4.4. Modello di Ackers

Ackers e collaboratori hanno proposto un modello in cui si ipotizza la presenza

di un terzo stato oltre agli stati T ed R. Questa evidenza deriva principalmente dagli

studi dell'equilibrio di dissociazione tetramero-dimero in emoglobine metallo-

sostituite ed in molecole ibride di cianometemoglobina utilizzate come modelli per

stati intermedi di legame. All'interno dello stato T è presente una considerevole

cooperatività, inoltre, la variazione conformazionale quaternaria T→R avviene

quando almeno un legante è legato ad ogni dimero della molecola. La cooperatività

deriva quindi sia da una transizione terziaria nello stato T che da una transizione

quaternaria concertata (Ackers et al., 1992).

Introduzione 11

1.5. EFFETTO BOHR

L'effetto Bohr è la dipendenza dell'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno in

funzione del pH (Figura 7). L'aumento dell'affinità al crescere del pH nell'intervallo 6-

10 viene definito effetto Bohr alcalino mentre la diminuzione dell'affinità per valori di

pH compresi tra 4 e 6 rappresenta l'effetto Bohr acido.

FIGURA 7: Effetto Bohr alcalino relativo ad emoglobina in soluzione. L'emoglobina, 60 µM (espressa inemi), era in tampone bis-Tris 0.05 M (¡) ed in tampone Tris 0.05 M (l), 25 °C. (Imai et al., 1977).

L'effetto Bohr alcalino ha due funzioni: facilita il rilascio di ossigeno ai tessuti,

dove il pH viene abbassato dal bicarbonato e dall'acido lattico, e neutralizza i protoni

prodotti dal legame della CO2 all'emoglobina. Siccome valori di pH inferiori a 6 non

sono presenti in vivo, l'effetto Bohr acido non ha alcun significato fisiologico.

L'effetto Bohr deriva dal cambiamento di pK di residui aminoacidici ionizzabili

della catena globinica conseguente all'ossigenazione. Quello alcalino deriva da due

componenti: un effetto Bohr terziario ed un effetto Bohr quaternario. Nel primo caso

i gruppi responsabili del fenomeno cambiano il loro pK a seguito del legame

dell'ossigeno (Chu et al., 1984), mentre nel secondo caso il cambiamento di pK è

dovuto alla transizione T→R (Perutz 1970).

In base al meccanismo stereochimico proposto da Perutz (1970), l'effetto Bohr

deriva dalla rottura dei ponti salini che altera il microambiente e provoca la

variazione del pK dei gruppi implicati nella formazione dei ponti salini intra- ed

inter-subunità. All'His146β si attribuisce circa il 50% dell'effetto Bohr totale. Durante

l'ossigenazione, la rottura dei ponti salini intrasubunità dà luogo all'effetto Bohr

Introduzione 12

terziario mentre la rottura dei ponti salini intersubunità produce l'effetto Bohr

quaternario.

1.6. EFFETTORI ALLOSTERICI

L'affinità del sangue per l'ossigeno è inferiore a quella di soluzioni purificate di

emoglobina. Questo è dovuto principalmente alla presenza nel globulo rosso di un

effettore allosterico, il D-2-3difosfoglicerato (DPG) che, avendo una costante di

legame per lo stato T 40-100 volte superiore a quella per lo stato R, altera l'equilibrio

conformazionale T→R a favore dello stato T, producendo, come effetto globale, una

diminuzione di affinità (Benesch & Benesch, 1967). Esistono altri effettori allosterici,

non fisiologici, molto più potenti del DPG. Tra questi i più studiati sono l'inositolo

esafosfato (IHP) (Imai, 1982), il bezafibrato (Bzf) e analoghi di quest'ultimo (LR16,

L35, L345) (Lalezari et al., 1988) (Lalezari et al., 1990) e l'RSR-56 (Abraham, 1992)

(Figura 8).

DPG e IHP si legano nello stesso sito che si trova nella cavità centrale della

molecola ed è formato da residui delle catene β. Tali residui, aventi carica positiva,

sono in grado di interagire con le cariche negative dei gruppi fosforici di DPG e IHP.

Bzf ed analoghi, invece, si legano a siti simmetrici della cavità centrale della molecola

costituiti principalmente da residui delle catene α.

DPG e IHP non solo alterano la p50 dell'emoglobina ma aumentano anche la KT e

la KR (Tabella 1). Inoltre provocano un aumento dell'effetto Bohr acido ed alcalino

incrementando il ∆pK1 ed il ∆pK2 (Kilmartin, 1974). Un simile effetto è provocato

anche da L35 ed L345 (Lalezari et al., 1990).

TABELLA 1: Valori di p50, 1/KT e 1/KR in presenza di effettori allosterici (Marden et al.,1990).

Effettore molecole per

tetramero

Conc.

mM

p50

mmHg

1/KT

mmHg

1/KR

mmHg

-- -- -- 1.9 4.8 0.2

Cl- 3 100 5.4 25 0.3

DPG 1 1.0 15.0 66 0.6

Bzf 2 5.0 16.0 60 0.9

LR 16 4 0.5 19.5 62 1.1

DPG + Bzf 3 1.0 ; 5.0 27.0 133 1.1

L35 4 0.5 46.0 150 1.3

IHP 1 1.0 78.0 166 2.2

IHP + Bzf 3 1.0 ; 5.0 130.0 212 2.2

IHP + L35 5 1.0 ; 0.5 138.0 210 1.8

Introduzione 13

Soluzioni: (In presenza di Cl-) 50 mM Bis Tris, 100 mM NaCl, pH 7.2, 25 °C; (In assenza di Cl-) 10mMHepes, pH 7.2, 25 °C

2,3-Difosfoglicerato (DPG)

Inositolo esafosfato (IHP)

LR35

LR16

Bezafibrato (Bzf)

CH CH

O

C N

H

O C COO-

CH

CH

Cl

CH CH

O

C N

H

O C COO-

CH

CH

Cl

CH CH

O

C N

H

O C COO-

CH

CH

-

-

-

-

-

H

3

3

22

22

3

3

3

3

2 2

Cl

Cl

Cl

O

O

O

O

O

O

PO --

PO --

PO --

PO --

--OP

--OP

3

3

3

3

3

3

C

C

C

O O

O

O

O

O

O

O

O

O

P

PH

H

FIGURA 8: Formule di struttura di alcuni effettori allosterici.

1.7. EMOGLOBINE MUTATE

Per identificare il ruolo svolto dai singoli residui aminoacidici, sono state

investigate emoglobine in cui l'aminoacido di interesse era sostituito naturalmente

(mutanti naturali) o per mutagenesi sito-specifica oppure modificato chimicamente.

Tra le emoglobine mutate, l'emoglobina Rothschild, che presenta una mutazione

in β37 (Trp→Arg) (Figura 2b), è di notevole interesse per lo studio delle interazioni a

livello dell'interfaccia α1β2 presenti nello stato T. I dati in soluzione riportano che in

tampone bis-Tris ed in assenza di fosfati organici questa emoglobina ha un'affinità

Introduzione 14

per l'ossigeno più bassa di quella dell'HbA e lega l'ossigeno con minore cooperatività

(Gacon et al., 1977). Inoltre è stato osservato che in soluzione il tetramero di Hb

Rothschild deossigenata si dissocia in dimeri in seguito all'ossigenazione (Sharma et

al., 1980). Per questo motivo, il legame dell'ossigeno misurato in soluzione non

rappresenta le proprietà della molecola tetramerica. Recentemente è stata

determinata la struttura ad alta risoluzione dell'Hb Rothschild in stato T (Kavanaugh

et al., 1992a), in cui si dimostra la presenza di un nuovo sito di legame dei cloruri in

corrispondenza del sito mutato. La struttura rivela anche piccole variazioni terziarie

nella zona di interfaccia α1β2.

L'emoglobina des-Arg, in cui è stata tolta tramite carbossipeptidasi B l'arginina

terminale delle catene α, è un interessante mutante per lo studio della relazione tra

ponti salini, effetto Bohr, affinità dello stato T e cooperatività. Dalle misure condotte

in soluzione è emerso che l'emoglobina des-Arg presenta una più alta affinità per

l'ossigeno, una minore cooperatività ed un ridotto effetto Bohr. Questi effetti sono di

minore entità in presenza di IHP. In bis-Tris n = 1.5, in fosfato inorganico n = 1.8 ed in

bis-Tris + IHP n = 2.0. In bis-Tris 0.1 M, pH 6.8, 30 °C, la p50 = 1.35 torr, in fosfato

inorganico la p50 = 2.5 torr mentre in bis-Tris + IHP la p50 = 6.75 torr (Bonaventura

et al., 1974). La struttura tridimensionale dell'emoglobina des-Arg deossigenata

presente in cristalli ottenuti da PEG è in corso di determinazione. Da una preliminare

analisi è emerso che le maggiori differenze strutturali tra HbA e Hb des-Arg sono

dovute ad una maggiore mobilità dei terminali aminici e carbossilici delle catene α(Kavanaugh, comunicazione personale).

1.8. PROGETTO DI RICERCA

Per comprendere la relazione tra struttura e funzione nel processo che trasforma

la deossiemoglobina in stato T in ossiemoglobina in stato R, sono stati effettuati

numerosi studi strutturali, cinetici e termodinamici sia di emoglobina A che di

mutanti naturali o ottenuti per mutagenesi sito-specifica. Sono state determinate le

strutture di Hb in stato T, in presenza ed in assenza di ligandi, e di Hb legata in stato

R. In particolare, è stata studiata l'emoglobina in stato T parzialmente ossigenata

presente in cristalli cresciuti da soluzioni contenenti glicole polietilenico (Brzozowski

et al., 1984a; Liddington et al., 1988). Contrariamente a quanto accade per cristalli di

deossiHb cresciuti in soluzioni di alto sale, che si rompono se esposti all'ossigeno

(Haurowitz, 1938; Perutz, 1953; Perutz et al., 1964), cristalli di deossiHb ottenuti in

soluzioni di PEG mantengono la struttura quaternaria T anche a pressione di

ossigeno atmosferica. La struttura cristallografica di questi cristalli esposti all'aria

Introduzione 15

mostra che i ponti salini sono intatti e che l'ossigeno è legato prevalentemente alle

subunità α. Il confronto tra la struttura della Hb legata in stato T e quella

dell'emoglobina deossigenata, indica che il legame dell'ossigeno induce cambiamenti

strutturali terziari, all'interno dello stato T, che tendono a rendere la conformazione

terziaria delle subunità simile a quella dello stato R.

Dal confronto tra la struttura della deossiHb e quella di emoglobine ibride in

presenza di ligandi [(α-Ni+2)2(β-Fe+2CO)2, (α-Fe+2CO)2(β-Mn+2) e (α-Fe+2CO)2(β-

Co+2)2] (le porfirine il cui Fe(II) è sostituito con Ni(II), Mn(II) e Co(II) non legano

l'ossido di carbonio) si è concluso che gli emi α non modificano la loro orientazione

in seguito al legame dell'ossido di carbonio, mentre gli emi β ruotano di circa 10°. Si è

inoltre osservato che i ponti salini sono intatti come evidenziato dalla struttura di Hb

di-legata e tetra-legata presente in cristalli cresciuti da soluzioni di alto sale

contenenti un forte effettore allosterico (Abraham et al., 1992).

La struttura di HbCO, determinata in cristalli cresciuti da soluzioni di PEG, ha

rivelato, nella regione dell'interfaccia α1β2, una conformazione diversa dalla R che è

stata definita R2 (Silva et al., 1992). Una struttura quaternaria diversa da quella T e

da quella R, ma anche in parte diversa dalla R2, è stata determinata da cristalli

cresciuti in soluzioni ad alto sale di Hb Ypsilanti (asp-99β-tyr) saturata con CO

(Smith et al., 1991). Una analisi geometrica dell'interfaccia suggerisce però che questa

struttura quaternaria è una variazione dello stato R piuttosto che uno stato

quaternario intermedio tra T ed R (Janin and Wodak, 1993).

L'effetto sulle proprietà strutturali di emoglobine mutate all'interfaccia α1β2 è

stato analizzato da Perutz (Perutz, 1970; Perutz & TenEyck, 1971; Kavanaugh et al.,

1992a; Kavanaugh et al., 1992b) mentre la caratterizzazione delle proprietà

funzionali di emoglobine umane mutate o modificate chimicamente è stata realizzata

da Ackers (Pettigrew et al., 1982; Turner et al., 1992; Doyle et al., 1992a). Il ruolo

funzionale e strutturale dei legami idrogeno inter- ed intra-subunità è stato

investigato in emoglobine mutate ai residui 37β e 145β (Ishimori et al., 1992). Infine,

sono stati ottimizzati i sistemi di espressione in vitro delle catene α e β (Hernan et al.,

1992) ed è stato verificato che le catene β ricombinanti non modificano le proprietà

funzionali (Doyle et al., 1992b) e strutturali dell'emoglobina (Kavanaugh et al.,

1992b).

La struttura ai raggi X della mioglobina e della emoglobina ha evidenziato che i

residui His E7 e Val E11 bloccano l'accesso all'eme per cui sono richiesti dei

movimenti transienti della proteina per permettere all'ossigeno di legarsi al ferro. Per

comprendere il ruolo svolto da questi aminoacidi nel controllare l'affinità

dell'ossigeno, sono stati analizzati alcuni mutanti ottenuti per mutagenesi sito-

specifica. Le sostituzioni His-α-Gly e His-β-Gly causano, rispettivamente, un

aumento di circa 80 e 70 volte della velocità di reazione dell'ossido di carbonio. La

Introduzione 16

sostituzione Val-11α-Ile non ha effetto sull'affinità dell'ossigeno, ma diminuisce di tre

volte la velocità di reazione dell'ossido di carbonio. Una analoga sostituzione nelle

catene β provoca una diminuzione della velocità di reazione dell'ossido di carbonio

di 23 volte (Tame et al., 1991; Mathews et al., 1991).

Malgrado l'enorme quantità di dati spettroscopici, cinetici e termodinamici

ottenuti sull'emoglobina, i meccanismi molecolari che stanno alla base della

cooperatività non sono completamente chiariti. Rimangono ancora alcune domande

la cui risposta è indispensabile per la comprensione delle proprietà di legame

dell'emoglobina.

- Quali sono le interazioni presenti all'interno della struttura T che la rendono a

bassa affinità per l'ossigeno?

- In che misura l'espressione della cooperatività può essere attribuita alle variazioni

conformazionali terziarie e a quelle quaternarie?

- Attraverso quale meccanismo i ligandi eterotropici influenzano l'affinità per

l'ossigeno?

- Quale è il ruolo svolto dai ponti salini nell'effetto Bohr?

- Quale è il grado di inequivalenza tra emi α ed emi β?

L'interpretazione dei dati ottenuti in soluzione è resa complessa dalla presenza

di diverse specie intermedie, la cui distribuzione dipende dal grado di ossigenazione

e dalle condizioni sperimentali (Perrella et al., 1992). Inoltre la relazione tra struttura

e funzione è spesso dedotta dall'inferenza dei dati funzionali, misurati in soluzione,

con quelli strutturali, derivati dalla diffrazione dei raggi X nel cristallo.

Una metodologia idonea per una diretta correlazione struttura-funzione fu

inizialmente applicata per lo studio delle proprietà catalitiche della chimotripsina nel

cristallo (Rossi & Bernhard, 1970) e successivamente in altri sistemi enzimatici

(Mozzarelli et al., 1989; Rossi et al., 1992). Il metodo permette di caratterizzare le

proprietà funzionali della proteina, nello stesso stato fisico in cui è determinata la

struttura, mediante microspettrofotometria in luce polarizzata.

In questa Tesi sono presentati i risultati dello studio delle proprietà di legame

dell'ossigeno a cristalli di emoglobina A, in assenza ed in presenza di effettori

allosterici, di emoglobina des-Arg ed emoglobina Rothschild cresciuti da soluzioni di

PEG.

2. MATERIALI E METODI

Materiali e Metodi 18

2.1. TEORIA OTTICA

Per gli studi spettroscopici di emoglobina in soluzione, la Densità Ottica o

Assorbanza (OD), è definita dalla legge di Lambert-Beer come:

∑=i

iiefclOD (1)

dove c è la concentrazione totale in eme, l è il cammino ottico, fi è la frazione di specie

i (ossiHb, deossiHb, metHb) e εi è il coefficiente di estinzione molare alla lunghezza

d'onda della misura. In teoria bisognerebbe aggiungere ulteriori termini per tenere in

considerazione la differenza dei coefficienti di estinzione e la dipendenza del

coefficiente di estinzione dallo stato di legame del tetramero. Questi effetti,

investigati solo recentemente, sono comunque trascurabili. (Ownby & Gill, 1990).

Per gli studi spettroscopici di cristalli di emoglobina l'equazione corrispondente

è:

∑=i

iifclOD µµ ε (µ = a, b, c) (2)

dove ODµ è la densità ottica misurata per la luce linearmente polarizzata con il

vettore elettrico parallelo all'asse cristallografico µ, c è la concentrazione di emi nel

cristallo, che può essere calcolata dal numero di molecole nella cella unitaria e dalla

sua dimensione, l è lo spessore del cristallo, fi è la frazione di specie i e εiµ è il

coefficiente di estinzione molare delle specie i utilizzando luce polarizzata con il

vettore elettrico parallelo all'asse cristallografico µ.

La simmetria della cella unitaria dei cristalli utilizzati in questo studio è

ortorombica con gruppo spaziale P21212 (Brzozowski et al., 1984a; Liddington et al.,

1988). Per cristalli ortorombici, gli assi cristallografici sono perpendicolari tra di loro

e corrispondono alle direzioni ottiche principali del cristallo. Tutti gli spettri sono

stati misurati con il raggio della luce incidente perpendicolare alla faccia (010) (ac) del

cristallo e con il vettore della luce polarizzata parallelo agli assi a e c del cristallo.

Il coefficiente di estinzione della soluzione (isotropico) ε , di una specie, è dato

dalla media dei coefficienti di estinzione relativi ai tre assi molecolari. Nel cristallo, ε

corrisponde anche alla media dei coefficienti di estinzione lungo gli assi

cristallografici (Hofrichter & Eaton, 1976; Eaton & Hofrichter, 1981).

( ) ( )zyxcba εεεεεεε ++=++=3

1

3

1

oppure (3)


∑∑==

==zyxk

kcba ,,,, 3

1

3

1εεε

µµ

La Figura 9b mostra la perfetta corrispondenza tra lo spettro isotropico, ottenuto

dalla media degli spettri nelle tre direzioni cristallografiche (a, b, c) (Figura 9a), e lo

spettro misurato in soluzione.

FIGURA 9: (a) Spettri di assorbimento di cristalli di deossiHb misurati con il vettore elettrico della lucepolarizzata parallelo ai tre assi cristallografici (a, b, c). Gli spettri sono stati ottenuti su due cristallidiversi cresciuti sulla faccia ac e bc. Per eliminare il contributo del diverso spessore del cristallo, glispettri sono stati normalizzati rispetto allo spettro lungo l'asse c. (b) Confronto tra lo spettroisotropico, ottenuto dalla media dei tre spettri in (a) (equazione (3)), e quello misurato in soluzione. Glispettri sono stati normalizzati a 555 nm.

La probalità che la luce venga assorbita da un cromoforo è proporzionale aE M( )⋅ →m n 2 dove E rappresenta il vettore campo elettrico della luce ed M( )m n→ è

il vettore momento di dipolo della transizione m n→ . Considerando, per esempio,

l'asse molecolare x e l'asse cristallografico a si ha che:

2∧∧⋅= axxa εε (4)

Sviluppando il prodotto scalare dei due vettori direzionali x ed a si ottiene:

)(cos2 xaxa ⋅= εε (5)


dove xa rappresenta l'angolo compreso tra la direzione dell'asse molecolare x e

quella dell'asse cristallografico a. Generalizzando la (5) rispetto agli assi

cristallografici si ha:

( )∑=

⋅+⋅+⋅=n

jjjzjjyjjx zyx

n 1

222 )(cos)(cos)(cos1

µεµεµεε µ (6)

dove n è il numero di emi nella cella unitaria che non sono correlati da operazioni di

simmetria. Generalizzando la (6) rispetto agli assi molecolari:

∑ ∑= =

=n

j xyzkjk

n 1

2 )(cos1

µε µ (7)

Sostituendo la (7) nella (2) e tenendo presente che in questi cristalli n=4 otteniamo:

∑∑ ∑= =

=i j xyzk

ijijkij kfcl

OD4

1

2 )(cos4

µεµ (µ = a, b, c) (8)

L'indice i rappresenta le specie ossiHb, deossiHb e metHb, l'indice j i quattro emi

dell'emoglobina (α1, α2, β1, β2) e l'indice k gli assi molecolari dell'eme (x, y, z).

L'equazione (7) implica che gli spettri in luce polarizzata ottenuti sui cristalli

devono essere misurati con il vettore elettrico della luce parallelo ad una direzione

ottica principale del cristallo per garantire che esso rimanga linearmente polarizzato

durante la propagazione all'interno del cristallo. Se questa condizione non viene

rispettata la legge di Lambert-Beer non è valida. Inoltre l'equazione (7) indica che ci

sono due tipi di informazioni negli spettri in luce polarizzata misurati sui cristalli,

rispetto a quelli in soluzione. Primo, gli emi α e β contribuiscono in modo diverso

all'assorbimento lungo gli assi a e c (Tabella 2, Figura 10) e questo rende possibile il

calcolo delle loro affinità relative. Secondo, un cambiamento dell'orientazione

dell'eme, dovuto a variazioni conformazionali associati con il legame dell'ossigeno,

produce una modificazione del coefficiente di estinzione del cristallo in quanto variail termine cos ( )2 kijµ (Makinen & Eaton, 1974; Eaton & Hofrichter, 1981). L'analisi di

questi effetti è più accurata per le regioni spettrali dove la simmetria dell'eme

produce una semplificazione delle relazioni tra i coefficienti di estinzione molecolari.

L'eme è un cromoforo che possiede un asse di rotazione quaternario. La

direzione del momento di dipolo delle transizioni elettroniche può essere

perpendicolare al piano dell'eme (transizioni z-polarizzate), oppure parallela al

piano dell'eme (transizioni x,y-polarizzate). Per le transizioni x,y-polarizzate,

l'assorbimento è massimo e costante per tutte le direzioni del vettore elettrico della


luce linearmente polarizzata perpendicolare alla normale dell'eme, e zero per quelleparallele. In questo caso si ha che ε ε ε εz x y= = =0 3 2, e si dice che l'eme si

comporta come un assorbitore circolare della luce linearmente polarizzata. Per le

transizioni z-polarizzate, l'assorbimento è massimo quando il vettore elettrico è

parallelo alla normale dell'eme ed è zero quando è perpendicolare;ε ε ε εx y z= = =0 3, .

La maggior parte degli assorbimenti nella regione spettrale (450-700 nm) sono

x,y-polarizzati. Il coefficiente di estinzione, relativo a transizioni x,y-polarizzate, di

una singola specie può essere ricavato dalla (6).

∑=

+=

4

1

22 )(cos2

3)(cos

2

3

4

1

jjj yx µεµεε µ (9)

da cui:

( )∑=

+=4

1

22 )(cos)(cos8

3

jjj yx µµεε µ (10)

Poichè la somma dei quadrati dei coseni direttori è uguale ad uno,

1)(cos)(cos)(cos 222 =++ µµµ zyx (11)

si ha che:)(sen)(cos1)(cos)(cos 2222 µµµµ zzyx =−=+ (12)

Per cui la (10) diventa:

∑=

=4

1

2 )(sen8

3),(

jjzyx µεε µ (13)

Sostituendo la (13) nella (2) si ottiene, per una singola specie:

∑=

=4

1

2 )(sen8

3),(

jjzclyxOD µεµ (14)


TABELLA 2: Proiezioni dei piani dell'eme e rapporto di polarizzazione di cristalli di HbA instato T.

Subunità sen2ziaa sen2ziba sen2zica P(x,y)calcb P(x,y)oss

Soretc Visibiled

DeossiHbe

α1 0.754 0.527 0.718

α2 0.787 0.815 0.398 1.69 1.69 ± 0.01 1.77

β1 0.884 0.856 0.260

β2 0.795 0.675 0.530

"SemiossiHb"f

α1 0.739 0.535 0.726

α2 0.779 0.824 0.397 1.63

β1 0.875 0.860 0.265

β2 0.784 0.651 0.565

"OssiHb"g

α1 0.739 0.535 0.726

α2 0.779 0.824 0.397 1.49 1.47 ± 0.01 1.41

β1 0.825 0.848 0.327

β2 0.748 0.624 0.628

MetHbh

α1 0.731 0.556 0.713

α2 0.774 0.819 0.407 1.60 1.56 ± 0.01 1.61

β1 0.855 0.873 0.271

β2 0.769 0.670 0.561

Fattori Geometrici calcolati dall'equazione (21)i

ndeossiHb,a 0.479

ndeossiHb,c 0.586

nossiHb,a 0.491

nossiHb,c 0.541

ndeossiHb,a 0.481

nmetHb,c 0.574


Commento alla TABELLA 2:

azia, zib e zic sono gli angoli tra la normale al piano dell'eme e l'asse del cristallo, a, b o c. Il pianodell'eme è stato calcolato come il migliore piano dal fitting dei minimi quadrati attraverso i 24 atomidella porfirina. bCalcolati dall'equazione (15). cCalcolati dal rapporto delle aree sotto le bande di Soretda 1/e a 1/e dell'altezza del picco. dCalcolati dalla struttura di Liddington P21212 (dati non pubblicati).fCalcolati dalla struttura di Liddington et al. (1988). gI valori dei sen2 degli emi α sono calcolatidall'orientazione degli emi α (ossigenati) della "semiossiHb" (Liddington et al., 1988). sen2 degli emi βusando la struttura dell'emoglobina nickel-ferro ibrida, α(Ni)2β(Fe-CO)2, in cui gli atomi di ferro degliemi α sono sostituiti da atomi di Ni(II) e gli emi β sono legati con il monossido di carbonio (Luisi et al.,1990). Questa molecola cristallizza da PEG in un gruppo spaziale differente (P21) rispetto alla"semiossiHb". hCalcolati dalla struttura P21212 di Liddington (dati non pubblicati). iFattori geometricidefiniti come nell'equazione (21) e sono calcolati dai sen2 riportati precedentemente. Essirappresentano la frazione di proiezione e quindi il contributo degli emi α all'assorbimento lungo gli assicristallografici a e c in regioni dello spettro dove l'eme si comporta come un assorbitore circolare.

FIGURA 10: Proiezione dei quattro emi di deossiemoglobina nell'unità asimmetrica del cristallo sullafaccia ac (101). La proiezione dei quattro emi è maggiore lungo l'asse a rispetto all'asse c. Lungol'asse a la proiezione degli emi α e β è circa uguale mentre lungo l'asse c la proiezione degli emi α èmaggiore di quella degli emi β (Tabella 2).


Si è assunto che gli spettri di tutti i 4 emi del tetramero presente nell'unità di cellaasimmetrica, siano identici (Approssimazione di un gas orientato) (Hofrichter andEaton, 1976).

Il rapporto di polarizzazione, definito come il rapporto delle densità ottiche

relative a due assi ortogonali del cristallo, dà informazioni strutturali molto utili, in

quanto dipende solo dall'orientazione degli emi. Per la faccia ac del cristallo è dato

da:

∑

∑

=

==≡4

1

2

4

1

2

)(sen

)(sen

),(

),(),(

jj

jj

c

a

cz

az

yxOD

yxODyxP (15)

I valori dei termini sen ( ) sen ( )2 2z a z cj j e , relativi all'orientazione dell'eme, sono

ottenuti dai dati strutturali e sono riportati in Tabella 2.

Per più specie l'equazione (14) diventa:

∑∑=

=i j

ijiij zfclyxOD4

1

2 )(sen8

3),( µεµ (16)

Se le frazioni di ogni specie sono le stesse per i due emi α e per i due emi β( f f f f f fi i i i i i, , , , , ,α α α β β β1 2 1 1= ≡ = ≡ e ), elaborando l'equazione (16) in funzione della (14) si

ha:

( )∑=

+=

2

1,

2,

2 )(sen)(sen8

3

),(

jjiji

ii

zzcl

yxOD

µµε

βα

µ (17)

sostituendo la (17) nella (16) si ricava:

( )∑

∑∑

=

=

+=

2

1,

2,

2

24

1

)(sen)(sen8

3

)(sen),(8

3

),(

jjiji

ijii j

ij

zzcl

zyxODfcl

yxOD

µµ

µ

βα

µ

µ (18)

Semplificando i termini comuni e distinguendo tra emi α e β:

( )

( )∑

∑ ∑

=

=

+

+=

2

1,

2,

2

2

1,

2,

2

)(sen)(sen

)(sen)(sen),(

),(

jjiji

i jjiijiii

zz

zfzfyxOD

yxOD

µµ

µµ

βα

ββααµ

µ (19)


da cui deriva che:

( ) ( )∑

∑

∑

∑

∑

++

+=

=

=

=

=

i

jjiji

jjii

jjiji

jjii

i

zz

zf

zz

zf

yxODyxOD2

1,

2,

2

2

1,

2

2

1,

2,

2

2

1,

2

)(sen)(sen

)(sen

)(sen)(sen

)(sen

),(),(

µµ

µ

µµ

µ

βα

ββ

βα

αα

µµ (20)

Indicando con:

( )∑

∑

=

=

+=

2

1,

2,

2

2

1,

2

)(sen)(sen

)(sen

jjiji

jji

i

zz

z

n

µµ

µ

βα

α

µ (21)

e, come si può dimostrare, se na

a b

b

a bn=

+ += − allora 1 si può scrivere che:

( )( )∑ −+=i

iiiii nfnfyxODsyxOD µβµαµµ 1),(),( (22)

dove ODiµ è la densità ottica delle specie i pure, s è un fattore di scala per

normalizzare lo spessore del cristallo usato per le misure, in funzione di quello su cui

sono stati ottenuti gli spettri di riferimento(ODiµ), niµ sono i fattori geometrici che

rappresentano la proiezione frazionale degli emi α e β della specie i sull'asse

cristallografico µ (Tabella 2).

L'equazione (22) è utilizzata per ottenere la composizione del cristallo in termini

di specie ossiHb, deossiHb e metHb. Questa composizione viene ottenuta facendo

variare simultaneamente il valore di 6 parametri (fiα e fiβ, con i=ossiHb, deossiHb,

metHb con il vincolo che 0 < fij < 1) in un aggiustamento ("fitting") dei minimi

quadrati, in cui le densità ottiche misurate con il vettore della luce parallelo ad

entrambi gli assi a e c (ODµ(x,y)) rappresentano le variabili e gli spettri di riferimento

ossiHb, deossiHb e metHb (ODiµ(x,y)) le costanti. Il fitting è stato effettuato

utilizzando le regioni spettrali in cui le transizioni delle tre specie sono x,y-

polarizzate (vedi sezione Determinazione dei fattori geometrici).

La frazione di saturazione degli emi ridotti è definita come:

ββ

ββ

αα

αα

,,

,

,,

, , deossiHbossiHb

ossiHb

deossiHbossiHb

ossiHb

ff

fy

ff

fy

+≡

+≡ (23)

Nel caso che non ci sia ossidazione degli emi, oppure, la frazione di emi ossidati

sia la stessa nelle subunità α e β (fmet,α = fmet,β) è possibile ottenere una relazione tra la

frazione di saturazione apparente lungo a e c (ya e yc) e la frazione di saturazione

degli emi α e β (yα e yβ). Tale relazione è rappresentata da:


( )( ) ( ) ( )( )

( )( ) ( ) ( )( )

−−+−+−+

−+=

−−+−+−+

−+=

cdeossiHbcdeossiHbcossiHbcossiHb

cossiHbcossiHbc

adeossiHbadeossiHbaossiHbaossiHb

aossiHbaossiHba

nynynyny

nynyy

nynynyny

nynyy

,,,,

,,

,,,,

,,

1111

11111

1

βαβα

βα

βαβα

βα

(24)

definendo con:( )( )cdeossiHbcossiHbccossiHbc

adeossiHbaossiHbaaossiHba

nnyn

nnyn

,,,

,,,

−−≡

−−≡

ϑ

ϑ(25)

la (24) diventa:( ) ( )

−−

=

−−−−

=

ac

acca

ac

caac

yyy

yyy

ϑϑϑϑ

ϑϑϑϑ

β

α

11

(26)

Se il legame dell'ossigeno ad ogni subunità è di tipo non cooperativo (n di Hill = 1), si

può scrivere che:

ββ

αα 50

, 50 2

2

2

2

ppO

pOy

ppO

pOy

+=

+= (27)

Sostituendo la (27) nella (24) ed esprimendo la p50 delle α e delle β in funzione in

funzione delle p50 apparenti lungo a e lungo c, si ottiene:

( ) ( )( )( )

−

+−+++±

−−

=

2/1

222

222222

,5050

505050505050411

5050

5050

2

150

ac

caaccaccca

ccaa

ac

pp

hhpphhpppp

hphp

ppp βα

(28)

dove, per semplificare la scrittura è stato definito:

1

1

,,

,,

−+≡

−+≡

cdeossiHbcossiHbc

adeossiHbaossiHba

nnh

nnh(29)

Il segno meno, nel simbolo ± si applica per la p50α ed il segno più per la p50β.

Per calcolare la composizione delle specie nel cristallo, senza tener conto dei

fattori geometrici, può essere utilizzata la seguente equazione:


∑=i

ii ODgsOD µµµ (30)

dove giµ rappresenta la frazione di specie i (ossiHb, deossiHb, metHb) per spettri

misurati con il vettore elettrico della luce parallelo all'asse µ (a, b, c). Per ogni spettro

viene calcolato anche un "rms" definito come:

( )

∑

∑=

−

=

ii

n

llmlc

gsn

ODOD

rmsµ

µµ

µ

1

2

(31)

dove: ODlcµ e ODlmµ rappresentano le densità ottiche ad ogni lunghezza d'onda dello

spettro calcolato c e dello spettro misurato m ed n è il numero di densità ottiche di cui

è composto lo spettro (per spettri tra 450-700 nm n=251). Il termine al denominatore

rappresenta il fattore di scala per normalizzare l'rms rispetto alla dimensione del

cristallo in modo che il suo valore sia confrontabile in cristalli diversi.

La frazione di saturazione apparente è definita come:

cdeossiHbcossiHb

cossiHbc

adeossiHbaossiHb

aossiHba gg

gy

gg

gy

,,

,

,,

, , +

=+

= (32)

Per ogni asse µ, il valore dei 3 parametri (gi con i=ossiHb, deossiHb, metHb con il

vincolo che 0 < gi < 1) è ottenuto dal fitting dei minimi quadrati dello spettro

misurato con gli spettri di riferimento ossiHb, deossiHb e metHb, usando l'intera

regione spettrale tra 450 e 700 nm (paragrafo Procedura di fitting).

2.1.1. Determinazione dei fattori geometrici

Nella sezione TEORIA OTTICA è stato mostrato come sia possibile utilizzare la

piccola differenza nelle proiezioni degli emi α e β lungo gli assi del cristallo a e c per

ottenere le saturazioni individuali delle subunità α e β (eq. 22, 23, 26). E' necessario

conoscere l'orientazione dei quattro emi in modo da calcolare l'intervallo di

lunghezze d'onda in cui gli emi si comportano da assorbitori circolari della luce

linearmente polarizzata. Tale condizione è rispettata nella regione di Soret (380-450

nm) (Eaton & Hochstrasser, 1967; Eaton & Hochstrasser, 1968; Makinen e Eaton,

1974; Hofrichter & Eaton, 1976; Eaton & Hofrichter, 1981). La Figura 11 mostra gli

spettri nella regione di Soret di ossiHb, deossiHb e metHb ed il rapporto di

polarizzazione ad ogni lunghezza d'onda. Nella Tabella 2 viene confrontato il


rapporto di polarizzazione ottenuto dal rapporto delle aree della banda di Soret, con

il valore calcolato in base all'orientazione degli emi (eq. 15) determinato per

diffrazione dei raggi X.

Per deossiHb e metHb c'è una buona corrispondenza tra il rapporto di

polarizzazione osservato e quello calcolato. Nel caso della ossiHb invece, è più

complicato predire le proprietà ottiche dell'eme in quanto manca la struttura

dell'ossiHb in stato T. Per superare questo problema, il rapporto di polarizzazione è

stato calcolato utilizzando le coordinate degli emi α con O2 legato (Brzozowski et al.,

1984a Liddington et al., 1988) e le coordinate degli emi β con CO legato (Luisi et al.,

1990).

FIGURA 11 Spettri di assorbimento e rapporto di polarizzazione nella regione di Soret. La linea

tratteggiata è il valore di una transizione x-y-polarizzata calcolata dall'orientazione degli emi

determinata tramite cristallografia a raggi X. (a) Spettro di MetHb misurato dopo ossidazione del

cristallo con ferricianuro di potassio e successivo lavaggio con PEG al 36% w/v, fosfato di potassio

10 mM a pH 6.2. (b) Spettro di deossiHb ottenuto dopo riduzione dello stesso cristallo con ditionito di

sodio. (c) Spettro di ossiHb misurato sullo stesso cristallo dopo lavaggio con PEG al 36% w/v,

fosfato di potassio 10 mM, a pH 7.2. Il cristallo è stato esposto ad una atmosfera di ossigeno a 8°C.

Allo spettro è stata sottratta una frazione degli spettri (a) e (b) uguale alla frazione di metHb e di

deossiHb ottenuta dal fitting nella regione 450-700 nm.

Nella struttura dell'emoglobina parzialmente ossigenata (Brzozowski et al.,

1984a; Liddington et al., 1988) è riportata una piccola variazione dell'orientazione del

piano dell'eme in seguito all'ossigenazione. Un simile risultato è stato trovato nel

legame dell'ossido di carbonio agli emi α di molecole ibride di emoglobina in stato T

(Luisi & Shibayama, 1989). In queste molecole il ferro degli emi β è stato sostituito


con cobalto o nichel: α(FeCO)2β(Co)2 e α(FeO2)2β(Ni)2 (le cobalto-porfirine non

legano il CO e le nichel porfirine non legano l'O2).

La situazione per gli emi β è meno chiara. Utilizzando le coordinate ottenute

dall'emoglobina parzialmente ossigenata per entrambi gli emi α e β (Brzozowski et

al., 1984a; Liddington et al., 1988), il rapporto di polarizzazione calcolato è

significativamente più alto di quello osservato per cristalli completamente ossigenati.

Utilizzando invece, per gli emi α le coordinate ottenute dall'emoglobina parzialmente

ossigenata, o quelle degli ibridi sopra descritti (Luisi & Shibayama, 1989), e per gli

emi β le coordinate ottenute dalla struttura T legata, di ibridi ferro-nichel(II)

( α(Ni)2β(FeCO)2 ), si ha una migliore corrispondenza. Il calcolo delle proiezioni del

piano dell'eme riportato in Tabella 2 è stato eseguito con queste orientazioni.

Nella regione del visibile (450 700 nm), l'eme non si comporta da assorbitore

circolare a lunghezze d'onda inferiori a 525 nm nella ossiHb (Eaton & Hofrichter,

1981; Makinen & Churg, 1983) e sopra i 580 nm nella deossiHb (Eaton & Hofrichter,

1981). La metHb si comporta da assorbitore circolare in tutto lo spettro visibile. Per

avere una misura sensibile della frazione di emi ossidati sono state incluse anche

lunghezze d'onda prossime alla banda a 630 nm della metHb dove la deossiHb si

comporta ancora da assorbitore circolare. Per il calcolo della saturazione degli emi αe β abbiamo quindi scelto le regioni 525-580 nm e 630-650 nm. Nella Tabella 2 sono

mostrati anche i rapporti di polarizzazione calcolati dal rapporto delle aree in queste

regioni.


2.2. PURIFICAZIONE DELL'EMOGLOBINA A

L'emoglobina umana da individuo non fumatore era purificata secondo il

metodo descritto da Dozy et al. (Dozy et al., 1968; Williams & Tsay, 1973). 50 ml di

sangue trattato con anticoagulante (eparina) veniva centrifugato a 3000 rpm per

separare i globuli rossi (pellet) dal plasma (sopranatante). I globuli rossi erano

risospesi 4 volte in un egual volume di una soluzione di NaCl 0.9% w/v (soluzione

fisiologica), facendo seguire ad ogni lavaggio una centrifugazione a 3000 rpm per 5

minuti. La lisi dei globuli rossi era ottenuta unendo al pellet 2 volumi di soluzione

tampone Tris 50 mM, EDTA 1 mM, pH 8 e dializzando per un ora contro un litro del

medesimo tampone. Per separare le membrane ed i corpuscoli cellulari

dall'emoglobina, la sospensione veniva centrifugata a 11000 rpm per 30 minuti. Il

sopranatante, contenente la proteina, era diluito con un pari volume di tampone Tris

50 mM, EDTA 1 mM, pH 8 e centrifugato a 11000 rpm per 30 minuti. Il sopranatante

(circa 60 ml) era caricato su una colonna di DEAE-Sephadex A50 (4x60 cm)

equilibrata con Tris 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7.6 ed eluito con il medesimo tampone

con un flusso di 120 ml/h. Tale colonna permette di separare l'HbA dai fosfati

organici e da altre emoglobine presenti nel globulo rosso (HbA=92%, HbA1=4.5%,

HbA2=2.5%, HbF=1%). I 230 ml circa di soluzione raccolti venivano concentrati in

Amicon e dializzati contro un litro di tampone fosfato 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.2

con tre cambi per un totale di 22 ore. La soluzione di emoglobina (15% w/v) veniva

congelata in azoto liquido e conservata a -80 °C. Tutte le operazioni di purificazione

erano condotte a 4 °C.

2.3. PREPARAZIONE DELL'EMOGLOBINA ROTHSCHILD

L'emoglobina Rothschild naturale fu gentilmente donata dal Dr Arthur Arnone

(Università di Iowa), mentre quella sintetica, ottenuta per mutagenesi sito-specifica,

esprimendo la globina β in Escherichia coli per mezzo di un sistema di espressione T-

7, fu preparata dal Dr Robert Noble (Università di Buffalo). Le catene β isolate, unite

a catene α umane e cianoemi, erano state utilizzate per ricomporre la molecola di

emoglobina Rothschild come descritto da Hernan (Hernan et al., 1992). Il prodotto

risultante era ridotto con ditionito e purificato su DE52 (Whatman). L'emoglobina

Rothschild ricombinante contiene, oltre alla sostituzione β37 Trp→Arg, anche un

residuo di metionina addizionale al terminale aminico delle catene β. La proteina


naturale e ricombinante sono omogenee per HPLC e PAGE e mostrano proprietà

funzionali simili.

L'emoglobina A umana, utilizzata come controllo, fu preparata come

precedentemente descritto da Fowler (Fowler et al., 1992).

2.4. PURIFICAZIONE DEL PEG

Per ridurre la formazione di metHb durante gli esperimenti, il PEG è era

purificato secondo il metodo descritto da Ray & Puvathingal (1985). 500 g di PEG

P.M. 8000 (Sigma) erano sciolti in 820 ml di acqua. In atmosfera di azoto, alla

soluzione venivano aggiunti 20 g di resina Dowex 50.H+ pretrattata (vedi oltre) e

posta in agitazione per 12 ore sempre in flusso di azoto. Gradualmente venivano

aggiunti 1.5 g di NaBH4 e si lasciava in agitazione, a temperatura ambiente, fino a

che era terminato lo sviluppo di idrogeno gassoso ed il pH di un'aliquota diluita 20

volte era superiore a 8. Dopo filtrazione la soluzione veniva fatta passare attraverso

una colonna di Amberlite MB-1 (Sigma) per rimuovere cationi ed anioni. Dopo aver

scartato i primi 150 ml di soluzione, il PEG era liofilizzato e conservato a -20 °C in

recipiente scuro e deossigenato. La resina Dowex 50.H+ era pretrattata nel seguente

modo: 100 g di resina erano posti in sospensione in un eccesso di NaOH 2 N e si

aggiungevano, per due volte, 3 ml di bromo. La resina era poi lavata, su carta da

filtro, con NaOH 1 N fino a che la soluzione di lavaggio appariva incolore e

successivamente con acqua distillata fino a neutralità.

2.5. PREPARAZIONE DEI CRISTALLI DI HBA PER MICROSPETTROFOTOMETRIA

Circa 10 ml di soluzione di emoglobina venivano deossigenati con azoto. Le

soluzioni per la cristallizzazione erano preparate come precedentemente descritto

(Ward et al., 1975), mescolando la soluzione di deossiemoglobina con diversi volumi

di una soluzione deossigenata di glicole polietilenico purificato (Tabella 3). La

soluzione stock di PEG era composta da 50 g di PEG sciolto in 100 ml di tampone

fosfato 14 mM, 1.4 mM EDTA per dare una concentrazione finale di 36% w/v PEG,

10 mM fosfato, 1 mM EDTA. Il pH finale era aggiustato a 7.2 con un'identica

soluzione contenente acido fosforico al posto del fosfato di potassio. Al fine di

garantire una completa deossigenazione della soluzione ed impedire la formazione

di metemoglobina, ogni tubo di cristallizzazione conteneva ditionito di sodio solido


in quantità tale da dare una concentrazione finale di 30 mM. I tubi, chiusi con tappi a

tenuta (Septa, Aldrich) venivano deossigenati con azoto prima e durante ogni

aggiunta. Tutte le operazioni di prelievo erano effettuate con siringhe gas-tight

(Hamilton). I tubi venivano posti in un contenitore a tenuta a 4 °C. I cristalli

apparivano in 2-3 giorni nei tubi con rapporti emoglobina/PEG compresi tra 8.3/1.7

e 8.7/1.3. Rapporti inferiori provocavano la precipitazione della proteina, mentre

rapporti superiori non davano cristalli. Mediante analisi ai raggi X fu stabilito che i

cristalli usati in questo lavoro appartenevano allo stesso gruppo spaziale (P21212)

(Padlan, comunicazione personale), con le stesse dimensioni della cella unitaria come

precedentemente riportato da Liddington (Liddington et al., 1988). I cristalli erano

ortorombici ed avevano la forma di piastre rettangolari sviluppati nella faccia (010)

(Figura 21a). Gli assi della cella unitaria a e c erano paralleli ai lati del cristallo. Le

dimensioni dei cristalli, usati per la microspettrofotometria, erano di circa 150 × 200

µm con uno spessore di circa 20 µm (calcolato sulla base dei coefficienti di estinzione

in soluzione).

I cristalli così ottenuti erano trasferiti in anaerobiosi a 4 °C in una soluzione di

PEG al 20% w/v contenente 30 mM ditionito. Il ditionito e l'emoglobina precipitata

venivano rimossi sedimentando e risospendendo i cristalli, almeno 6 volte, in una

soluzione di PEG al 36% w/v o superiore senza ditionito. Per minimizzare la

formazione di metHb, la soluzione di PEG usata per lavare i cristalli conteneva anche

30-90 µg/ml di catalasi (Sigma).

TABELLA 3: Condizioni di cristallizzazione di emoglobina A.

Tubo HbA 10% w/v

(µl)

PEG 36% w/v

(µl)

Ditionito 1 M

(µl)

1 170 24 6

2 168 26 6

3 166 28 6

4 164 30 6


2.6. PREPARAZIONE DEI CRISTALLI DI HB ROTHSCHILD PER MICROSPETTROFOTOMETRIA

I cristalli di deossiHb Rothschild e deossiHbA furono cresciuti a temperatura

ambiente in soluzione di PEG modificando il metodo di Ward (Ward et al., 1975), dal

Dr Robert Noble. Le concentrazioni di emoglobina e PEG sono riportate nella

Tabella 4. Si ottenevano buoni cristalli per microspettrofotometria nei tubi contenenti

soluzioni di PEG 8000 tra il 10 e 14% w/v con tampone fosfato 10 mM, 1 mM EDTA,

30 mM ditionito di sodio, pH 7.2 ed emoglobina 1 mM espressa in equivalenti eme.

Tutti i componenti erano deossigenati e mescolati in tubi a tenuta (8×30 mm). Il

volume finale della soluzione era di 100 µl. Cristalli ortorombici (gruppo spaziale

P21212) aventi la forma di piastre rettangolari apparivano in 24 ore. La soluzione

madre, che appariva limpida, era sostituita con una simile soluzione degassata, in cui

la concentrazione di PEG era aumentata prima al 20 e poi al 36% w/v. I cristalli

venivano conservati in un secondo contenitore deossigenato a 4 °C.

TABELLA 4: Condizioni di cristallizzazione di emoglobina Rothschild.

Tubo HbA 3 mM (µl) PEG 36% w/v

(µl)

Pi 0.1 M,

dit. 0.3 M (µl)

H2O

(µl)

1 30 30 10 30

2 30 32.5 10 27.5

3 30 35 10 25

4 30 37.5 10 22.5

5 30 40 10 20

2.7. RIDUZIONE DELLA QUANTITÀ DI METEMOGLOBINA

Uno dei primi problemi emersi durante la misura degli spettri di assorbimento di

cristalli di emoglobina sospesi in soluzioni di PEG non contenenti ditionito era la

formazione di una notevole quantità di metemoglobina. Contrariamente a quanto

avviene in soluzione, il sistema enzimatico per la riduzione del Fe+3 a Fe+2 (Hayashi

et al., 1973) non aveva alcun effetto, probabilmente perchè la ferrodossina,


responsabile di tale riduzione, non penetrava all'interno del cristallo. Anche il

sistema blu di Metilene, NADPH, e ferrodossina-NADP-reduttasi (Rossi-Fanelli,

1958), non riduceva la metemoglobina nel cristallo. I riducenti chimici del ferro come

l'acido Ascorbico e la Cisteina, non potevano essere utilizzati in presenza di ossigeno

in quanto avrebbero ridotto anche quest'ultimo.

I fattori che più influenzano l'ossidazione del ferro sono:

- Gli agenti ossidanti quali i metalli, i perossidi e i radicali liberi. I perossidi sono

normalmente presenti nelle soluzioni di PEG esposte alla luce e la purificazione del

PEG ha lo scopo di eliminarli. La catalasi presente nelle soluzioni in cui sono immersi

i cristalli ha la funzione di ridurre al minimo la quantità di perossidi che si formano

nel corso degli esperimenti. L'EDTA rimuove i metalli bivalenti, specialmente il Cu++.

La Figura 12 mostra i risultati di una serie di esperimenti condotti per individuare le

condizioni meno favorevoli alla formazione di metHb.

- La temperatura. Un aumento di temperatura accelera notevolmente l'ossidazione

del ferro per cui la maggior parte degli esperimenti sono stati condotti a temperature

comprese tra 5 e 15 °C.

- Il pH. La diminuzione del pH favorisce la formazione di metHb; con eccezione per

gli esperimenti riguardanti l'effetto Bohr, le titolazioni sono state effettuate a pH 7.2.

- L'alta forza ionica. Negli esperimenti condotti in presenza di alte concentrazioni di

NaCl si aveva un notevole incremento della formazione di metHb, per questo motivo

la maggior parte delle titolazioni sono state condotte in fosfato 10 mM.

FIGURA 12: Velocità di formazione di metHb in diverse condizioni sperimentali. I cristalli eranoconservati in una soluzione di PEG al 36% w/v degasata a 4 °C. (¡) PEG non purificato; (l) PEGpurificato; (∆) PEG non purificato + catalasi.


2.8. MICROSPETTROFOTOMETRO E APPARATO DI MISURA

La strumentazione utilizzata per la misura delle curve di legame dell'ossigeno a

cristalli di emoglobina consisteva in un apparato per la preparazione di miscele di

gas, un "reattore" che permetteva di esporre i cristalli a diverse pO2, un

microspettrofotometro ed un rivelatore di ossigeno (Figura 13).

He

O2

Aria

Flussimetro a Mass-Flow

UmidificatoriOssimetro

Microspettrofotometro

Cella a Flusso

Scarico

FIGURA 13: Rappresentazione schematica dell'apparato di misura.

Le miscele di elio e ossigeno a diversa pO2 erano preparate per mezzo di due

"mass flow controllers" (Environics, Serie 200) che garantivano elevata precisione e

riproducibilità (Tabella 5). Tutti i gas, puri almeno al 99.95% (Rivoira Torino),

venivano trasportati in tubi di acciaio inossidabile 316 (Alltech-Europe) (Mills el al.,

1976). La miscela veniva umidificata per gorgogliamento in due cilindri a tenuta

contenenti circa 120 ml di una soluzione di PEG analoga a quella in cui erano sospesi

i cristalli. Una goccia (10 µl circa) di soluzione in cui erano immersi i cristalli veniva


posta sul vetrino inferiore di una cella a flusso Dvorak-Stotler (Dvorak & Stotler,

1971) e coperta con una membrana di silicone (General Electric MEM 213) (Gill,

1981). Tale membrana è gas permeabile e non depolarizza la luce linearmente

polarizzata. La cella era poi completata secondo lo schema in Figura 14a.

L'operazione veniva compiuta all'aria o in una camera a tenuta saturata con azoto. Il

collegamento con al linea del gas era ottenuto con connettori in teflon (Hamilton) ed

il gas era fatto fluire ad una velocità di 50 ml/min.

TABELLA 5: Corrispondenza tra il valore di pO2 calcolato sulla base della miscela ottenuta con ilflussimetro a Mass-Flow e quello misurato tramite l'ossimetro.

Miscele %O2

(mass flow)

pO2 attesa torr pO2 misurata torr

(ossimetro)

20.93 160.5 160.4

15.00 115.0 113.0

10.00 76.7 75.0

4.88 37.4 37.0

40.00 307 293

60.00 460 438

80.00 614 579

100.00 767 748

La pressione di ossigeno veniva misurata sul gas di uscita dalla cella per mezzo

di un elettrodo polarografico tipo Clark, termostatato a 15 o 20 °C e montato su un

ossimetro (OXYAN 2, Advanced Products) (Rossi-Bernardi et al., 1977). L'elettrodo

era calibrato all'inizio e nel mezzo di ogni esperimento con due miscele a

concentrazione nota di ossigeno (4.88 e 21.23% ossigeno/elio) e alla fine

dell'esperimento con ossigeno puro al 99.95%. Le pressioni di ossigeno erano

calcolate sottraendo alla pressione barometrica la pressione parziale dell'acqua a

quella temperatura (Appendice 2) e moltiplicando per la concentrazione

dell'ossigeno dei gas standard. La deviazione dalla linearità e l'errore dell'elettrodo

erano inferiori a 1% e 0.3% rispettivamente.

Gli spettri di assorbimento in luce polarizzata su cristalli singoli di emoglobina

sono stati effettuati con un microspettrofotometro Zeiss MPM03 (Figura 15-16)

equipaggiato con obiettivi 10X ultrafluar-pol e un polarizzatore tipo Glan-Thompson


per produrre luce linearmente polarizzata. Gli obiettivi erano relativamente "strain-

free" e non depolarizzavano significativamente la luce (il rapporto tra luce trasmessa

con i polarizzatori paralleli e incrociati era maggiore di 8000:1). La lampada allo

xenon (XBO 75 Watt, OSRAM) era in grado di emettere luce con intensità sufficiente

per misure spettrali, a lunghezze d'onda comprese tra 250 e 1000 nm. Il

monocromatore a reticolo con una banda passante regolata su 3 nm era stato tarato

rispetto ad un spettrofotometro Cary 219. Per le misure venivano usati due fototubi

HAMAMATSU, uno per l'intervallo 250-800 nm (R928), l'altro per l'intervallo 700-

1000 nm (R2658).

Durante l'esperimento i cristalli erano termostatati per contatto della cella a

flusso con il piattino del microspettrofotometro a sua volta termostatato per

circolazione d'acqua (Figura 16). La cella era isolata sopra e sotto con materiale

isolante Armaflex (Armstrong). Le temperature erano misurate con un termistore a

contatto con il piattino del microscopio e corrette in funzione del gradiente termico

(< 4 °C) (vedi paragrafo Controllo temperatura). Per misure su cristalli in presenza di

ditionito o di ferricianuro oppure per misure su uno stesso cristallo immerso in

soluzioni di PEG a diverso pH veniva usata una seconda cella, non a tenuta, detta "a

scambio di soluzioni" (Figura 14b).

Contenitore

Guarnizione di teflon




Vetrino

Vetrino

Spaziatore

Membrana di silicone

Piatto premente

Anello di compressione

Supporto in metallo

Vetrino superiore

Vetrino inferiore

Spessore

Molla di chiusuraa

b

FIGURA 14: (a) Cella a flusso Dvorak & Stotler; (b) Cella a scambio di soluzioni.


Fotomoltiplicatore

Diaframma di misura

Oculari

Polarizzatore mobile

Obiettivo 10x

Obiettivo 10x

Polarizzatore

Specchio

Diaframma di campo

LenteBanda passante

Monocromatore

Lampada

Hp9816

Stampante Plotter

Cella a flusso

Piattino termostatato

Unità di

controllo

FIGURA 15: Schema del microspettrofotometro Zeiss MPM03.


FIGURA 16: Riproduzione fotografica del microspettrofotometro e particolare della cella a flussomontata sul piattino.


2.8.1. Stabilità lampada

La stabilità dell'emissione della lampada del microspettrofotometro è stata

verificata confrontando spettri di emissione (450-700 nm) raccolti ad intervalli di

tempo crescenti. La diminuzione del segnale era di circa lo 0.3% ogni ora. Durante gli

esperimenti la variazione era ulteriormente ridotta dal fatto che lo spettro del bianco

e quello del campione erano misurati a pochi minuti uno dall'altro.

2.8.2. Controllo temperatura

La calibrazione della temperatura all'interno della cella a flusso, è stata effettuata

ponendo un termistore a contatto con il piattino del microspettrofotometro e un altro

nella cella, immerso in una goccia di PEG 36% e coperto dalla membrana al silicone.

La temperatura del termostato era variata tra 3 e 26 °C e dopo 30 minuti di

equilibramento venivano lette le temperatura del piattino, la temperatura ambiente e

la temperatura all'interno della cella. Mettendo in grafico la temperatura del piattino

in funzione di quella della cella è possibile, attraverso una regressione lineare dei

punti, ricavare l'equazione che correla le due temperature. In questo modo, durante

l'esperimento si risaliva alla temperatura dell'interno della cella misurando quella del

piattino (Figura 17).

FIGURA 17: Calibrazione della temperatura all'interno della cella a flusso in funzione della temperaturadel piattino. In base ai coefficienti della retta di regressione si ricava che :Tcella = 0.94Tpiattino + 1.10.


2.9. MISURA DEGLI SPETTRI IN LUCE POLARIZZATA

Gli spettri di assorbimento in luce polarizzata di cromofori orientati devono

essere misurati in modo che il vettore elettrico della luce sia parallelo ad un asse

ottico del cristallo (a o c). Per questo motivo, prima di ogni spettro, il piattino del

microspettrofotometro era ruotato in modo che, con analizzatore e polarizzatore

incrociati, il cristallo fosse uniforme con il campo circostante cioè non trasmettesse

luce. L'analizzatore veniva poi rimosso dal cammino ottico. Un diaframma posto

prima del campione selezionava in modo variabile le dimensioni del raggio incidente

mentre una maschera circolare, anch'essa variabile, selezionava parte della luce

trasmessa dal cristallo (I). La regione adiacente al cristallo veniva utilizzata per

misurare la luce incidente (I0). Le densità ottiche definite come log(I0/I) erano

registrate con passo di 1 nm su un calcolatore Hp9816 (Hewlett-Packard).

In un tipico esperimento per determinare una curva di legame dell'ossigeno, gli

spettri di assorbimento (450-700 nm), per le due direzioni di polarizzazione,

venivano misurati a 7-12 differenti pressioni di ossigeno tra 0 e 760 torr. Gli spettri

erano raccolti dopo che i valori di pO2 e densità ottica erano stabili. Ogni punto

richiedeva circa un'ora: 30-45 minuti per l'equilibramento della soluzione contenente

i cristalli con il gas che fluiva nella cella e 15-20 minuti per la registrazione degli

spettri. La durata della titolazione variava così dalle 7 alle 10 ore.

2.10. DETERMINAZIONE DEGLI SPETTRI DI RIFERIMENTO

La determinazione della frazione di saturazione, come evidenziato dalle

equazioni (22, 30), richiede la conoscenza degli spettri delle specie pure (deossiHb,

ossiHb e metHb), chiamati "spettri di riferimento". I coefficienti di estinzione assoluti

per l'emoglobina in stato cristallino non sono noti e non sono facilmente

determinabili data l'imprecisione nella misura dello spessore del cristallo. Sono stati

quindi determinati i coefficienti di estinzione di deossiHb, ossiHb e metHb relativi,

cioè riferiti allo stesso cristallo. Gli spettri di riferimento di deossiHb e metHb sono

stati ottenuti sullo stesso cristallo secondo la seguente procedura. Dapprima i cristalli

venivano ossidati con ferricianuro di potassio ( K3[Fe(CN)6] ) 5 mM in una soluzione

di PEG al 36% w/v. Utilizzando la cella a scambio di soluzioni, l'agente ossidante

veniva rimosso con una soluzione di PEG al 36% w/v 10 mM fosfato, 1 mM EDTA,

pH 7.2 e veniva registrato uno spettro (450-700 nm) per ogni direzione di

polarizzazione. Sempre all'interno della cella, il cristallo era risospeso in una


soluzione degasata dello stesso PEG contenente ditionito di sodio (Na2S2O4) 30 mM

per determinare lo spettro di deossiHb. Il cambiamento dello stato di ossidazione

non provoca variazioni della concentrazione degli emi o del cammino ottico in

quanto le dimensione della cella unitaria nei cristalli di metHb e deossiHb sono

identiche (Liddington et al., 1988). Essendo noto dagli studi in soluzione che lo

spettro della metHb varia in funzione del pH (Brunori et al., 1968), a causa del

cambiamento di spin indotto dello stato di ionizzazione della molecola d'acqua

legata al Fe+3, sono stati misurati spettri di assorbimento su uno stesso cristallo di

metHb immerso in soluzione di PEG al 36% w/v a diversi pH. Questi esperimenti

sono stati condotti sia in tampone fosfato che in tamponi Tris e bis-Tris 0.2 M KCl per

avere una forza ionica costante. Il pH variava da 6.0 a 8.5 con intervalli di 0.2-0.4

unità. pH inferiori non erano necessari perchè a pH 6 l'acqua legata al ferro è

completamente protonata; pH superiori a 8.5 causavano la rottura del cristallo. Per

ottenere una serie di spettri di riferimento di metHb che coprissero in modo più

accurato l'intervallo di pH in cui venivano effettuate le titolazioni, gli spettri sono

stati interpolati in modo da avere uno spettro di metHb per ogni 0.1 unità di pH.

La determinazione dello spettro di riferimento di ossiHb era complicata

dall'ossidazione e dalla incompleta saturazione degli emi ridotti a 760 torr di

ossigeno. Per ottenere uno spettro di pura ossiHb è stata eseguita una titolazione a 5-

8 °C (58% w/v PEG, 5 mM tampone fosfato, pH 7.2) dove l'affinità dell'emoglobina è

relativamente alta (p50=70 torr). Gli spettri misurati a pressioni comprese tra 300 e

750 torr sono stati estrapolati a pressione di ossigeno infinita per mezzo di una

regressione lineare dei plots dei reciproci di ∆OD, per ognuna delle 251 lunghezze

d'onda da 450 a 700 nm, verso il reciproco della pO2. Il ∆OD era definito come la

differenza delle densità ottiche ad ogni pressione meno le densità ottiche a pressione

di ossigeno di zero torr. Tale procedura è approssimata per due motivi. Primo, la

dipendenza dell'ossidazione e della ossigenazione è diversa ma nella estrapolazione

è stato assunto che abbia la stessa dipendenza dalla pO2. Secondo, il plot dei doppi

reciproci presuppone che la curva di legame sia perfettamente iperbolica. Questi

fattori dovrebbero comunque avere un piccolo effetto sulla precisione dello spettro di

riferimento in quanto l'estrapolazione fu eseguita per un intervallo di pO2 in cui la

saturazione con ossigeno variava meno del 10% e la metHb di circa il 2%. Al fine di

rimuovere il contributo della metHb nello spettro estrapolato, sono state sottratte

diverse frazioni dello spettro di riferimento di metHb fino a che la banda a 630 nm

non era più discernibile. La quantità di metHb sottratta era del 4% con un'incertezza

inferiore al 2%. Lo spettro di pura ossiHb così ottenuto è stato normalizzato


relativamente agli spettri di deossiHb e metHb utilizzando la densità ottica a 555 nm

delle spettro a zero torr di ossigeno.

La stessa procedura è stata adottata per ottenere gli spettri di riferimento relativi

all'emoglobina Rothschild. Per l'emoglobina desArg, lo spettro di riferimento di

ossiHb è stato ottenuto sottraendo, allo spettro misurato a 760 torr di ossigeno, 8 °C,

una adeguata frazione di metHb secondo il criterio sopra esposto.

2.11. PROCEDURA DI FITTING

Per calcolare la saturazione apparente di ciascuna specie, ad ogni pressione di

ossigeno e per ogni direzione di polarizzazione, ciascuno spettro è stato confrontato

con uno spettro ottenuto per composizione lineare dei tre spettri di riferimento

(deossiHb, ossiHb e metHb) utilizzando l'equazione (30). Per compensare piccole

variazioni della linea di base, il fitting considerava anche un offset che era comunque

inferiore del 2%. Le differenze nella linea di base potevano derivare da irregolarità

della superficie del cristallo o della membrana al silicone o da piccole fluttuazioni

della lampada allo Xenon. Dal fitting si otteneva la frazione di emi ossigenati sul

totale degli emi ridotti e la frazione di emi ossidati sugli emi totali. Per ogni spettro, la

precisione del fitting era indicata dal valore dell'rms calcolato con l'equazione (31).

Tutti i risultati riportati in questo lavoro si riferiscono ad esperimenti in cui l'rms

medio era inferiore a 0.007. Tale valore corrispondeva a tre volte la deviazione

standard della media degli rms di tutti gli esperimenti accettati in base ai criteri di

qualità spettrale, stabilità dell'elettrodo di ossigeno, integrità del cristallo e

reversibilità del processo di ossigenazione.

2.12. SINGULAR VALUE DECOMPOSITION (S.V.D.).

La procedura S.V.D. (Golub & Reinsch, 1970; Shrager & Hendler, 1982;

Hofrichter et al., 1983; Henry & Hofrichter, 1992) permette di determinare, dalla

variazione spettrale conseguente all'ossigenazione dell'emoglobina, la curva di

legame dell'ossigeno, indipendentemente dagli spettri di riferimento.

Tale procedura trasforma la matrice dei dati A m n× costituita da n spettri

differenza (spettro ad una certa pO2 sottratto dello spettro a pO2 zero torr) di m

lunghezze d'onda, nel prodotto di tre matrici tali per cui: A U S V T= × × .

U è una matrice m n× di n componenti spettrali ortonormali.


S è una matrice diagonale n n× , detta i valori singolari di A, che decresce

monotonicamente dall'elemento (1,1) all'elemento (n,n).

V è una matrice n n× e VT la sua trasposta, in cui ogni colonna di V rappresenta

l'ampiezza della corrispondente componente spettrale (colonna di U).

Gli n valori singolari (diagonale di S) sono una misura del contributo della

rispettiva componente spettrale, nello spettro osservato (colonna di A). Quindi, la

prima colonna di U moltiplicata per il suo valore singolare, rappresenta la

componente spettrale più significativa che varia nel corso dell'ossigenazione.

L'ampiezza di tale variazione è data dalla prima colonna di V. L' S.V.D. estrae n

componenti dalla matrice A (m n× ) ma generalmente le informazioni più significative

sono contenute nelle prime componenti, le altre sono da attribuirsi a rumore di

fondo.

Per trasformare le ampiezze della colonna V1 in frazioni di saturazione è

necessario ottenere, dal grafico dei doppi reciproci, 1/V1 contro 1/pO2, il valore di V a

pressione di ossigeno infinita (1/pO2 = 0).

2.13. CINETICHE DI OSSIGENAZIONE

Per verificare i fattori che stabilizzano la struttura cristallina dalla rottura, sono

stati eseguiti alcuni esperimenti in cui si registrava la cinetica di ossigenazione dei

cristalli di emoglobina. I cristalli venivano caricati nella cella a flusso Dvorak-Stotler

secondo la procedura vista in precedenza e posti in flusso di elio. Nel frattempo in

una seconda linea di gas veniva preparata una miscela al 21% di ossigeno. Quando,

in base alle caratteristiche spettrali, il cristallo era deossigenato, la cella veniva

inserita nella seconda linea di gas. Contemporaneamente, iniziava la misura della

densità ottica del cristallo ad una determinata lunghezza d'onda in funzione del

tempo. Per i primi 30-40 minuti i valori di densità ottica erano raccolti ogni secondo,

dopo di che la cinetica di ossigenazione era seguita spettralmente (uno spettro ogni

5-10 minuti) fino al raggiungimento del "plateau". Collegando la cella al flusso di elio

veniva quindi seguita, per punti e per spettri, la cinetica di deossigenazione, al

termine della quale la cella veniva inserita nuovamente nella linea con ossigeno al

21% per seguire la cinetica di "riossigenazione".


2.14. SPETTRI NELLA REGIONE VICINO-IR

Dato l'elevato coefficiente di estinzione dell'emoglobina intorno a 550 nm, è

impossibile misurare spettri nella regione 450-700 nm su cristalli di emoglobina di

dimensioni adatte per cristallografia in quanto l'assorbimento è troppo elevato. Al

fine di poter condurre misure spettrali sullo stesso cristallo esposto ai raggi X, il

microspettrofotometro è stato attrezzato con un fototubo Hamamatsu (tipo R2658)

idoneo per misure a lunghezze d'onda tra 700 e 1000 nm dove i coefficienti di

estinzione dell'emoglobina sono notevolmente più bassi (vedi Appendice 1). Gli

spettri caratteristici delle tre specie, ossiHb, deossiHb e metHb sono mostrati in

Figura 18. In questo modo gli spettri possono essere misurati direttamente su cristalli

contenuti nei capillari per raggi X.

FIGURA 18: (b) Spettri di assorbimento di un cristallo di emoglobina nella regione del vicino IR e (a)relativo rapporto di polarizzazione. Il cristallo, di dimensioni idonee per cristallografia, è stato sospesoin una soluzione di PEG al 62%, fosfato 10 mM, ditionito di sodio 30 mM, pH 7.2 (). Il ditionitoè stato poi rimosso con un'analoga soluzione di PEG ed il cristallo è stato esposto ad una pressionedi ossigeno di 760 torr ( - - ). Un secondo spettro di deossiHb è stato ottenuto risospendendoil cristallo nella soluzione di PEG con ditionito ( ). Le curve superiori si riferiscono agli spettrilungo a mentre quelle inferiori agli spettri lungo c. La corrispondenza dei rapporti di polarizzazionedella deossiHb prima e dopo l'ossigenazione indica la reversibilità del processo di ossigenazione.


2.15. SOFTWARE

La registrazione degli spettri è stata effettuata tramite l'interfacciamento del

microspettrofotometro con un calcolatore Hp9816. Il software di gestione, "λ-scan"

(Zeiss), immagazzina gli spettri in un file chiamato "L_DATA". Nel file ogni spettro è

rappresentato da una "header" che contiene alcune informazioni tra cui la lunghezza

d'onda iniziale, quella finale ed il passo, e dalla serie di valori in percentuale di

trasmittanza. Per la parte relativa alle cinetiche è stata sviluppata una subroutine che

permette di memorizzare i valori di assorbanza, ad una definita lunghezza d'onda,

in funzione del tempo.

Il calcolo della composizione del cristallo, degli spettri di riferimento,

dell'inequivalenza αβ e delle proiezioni dell'eme è stato condotto con procedure

scritte dal Dr Eric Henry (NIH, Bethesda). La procedura S.V.D. è contenuta nel

pacchetto "Matlab" (Mathworks). L'analisi dei dati ottenuti sull'emoglobina

Rothschild è stata effettuata dal Dr Robert Noble (Università di Buffalo).

3. RISULTATI

Risultati 49

3.1. STABILITÀ DEI CRISTALLI DI HBA DURANTE L'OSSIGENAZIONE

Dagli studi cristallografici era emerso che i cristalli di deossiemoglobina, sospesi

nella soluzione di cristallizzazione, contenente PEG al 5-6% w/v, si scioglievano se

esposti all'aria. Lo scioglimento era impedito se i cristalli venivano sospesi in una

soluzione deossigenata di PEG al 36% w/v (Grabowski et al., 1978; Brzozowski et al.,

1984b). Questo aumento della concentrazione del PEG diminuisce la solubilità

dell'emoglobina, in aria a 4 °C, da 10 mg/ml a circa 0.02 mg/ml.

All'inizio di questo lavoro le curve di legame sono state ottenute su cristalli

sospesi in soluzioni di PEG al 36% w/v. In alcuni casi, i cristalli si rompevano e come

conseguenza si aveva un notevole incremento dell'affinità (Figura 21d). Per capire

quali fossero i fattori che influenzavano la stabilità dei cristalli, sono state misurate le

cinetiche di ossigenazione e deossigenazione di cristalli di emoglobina in diverse

condizioni sperimentali (Figura 19 a, b, c).

FIGURA 19: Effetto della concentrazione di PEG e del contenuto di metHb sulla stabilità dei cristalli diHbA. (a) Cinetica di ossigenazione incrementando la pressione di ossigeno da 0 a 160 torr in unsingolo passaggio a 7 °C. (¡) cristallo con un iniziale contenuto di metHb del 3.0% in PEG 36% w/v,fosfato di potassio 10 mM, pH 7.3; (o) cristallo con un iniziale contenuto di metHb del 3.0% in PEG54% w/v, fosfato di potassio 10 mM, pH 7.3; (∆) cristallo con un iniziale contenuto di metHb del14.3% in PEG 36% w/v, fosfato di potassio 10 mM, pH 7.3. (b) Cinetica di deossigenazionediminuendo la pressione di ossigeno da 160 a 0 torr in un singolo passaggio a 7 °C. (c) Cinetica diriossigenazione incrementando la pressione di ossigeno da 0 a 160 torr in un singolo passaggio a 7°C.

Un cristallo con un contenuto di metHb minore del 3%, era sospeso in una

soluzione di PEG al 36% w/v. La cinetica di ossigenazione (Figura 19a) risulta

complessa, con una fase iniziale rapida ed una seconda fase molto più lenta in cui il

cristallo si rompe e la saturazione aumenta fino al 100%. Incrementando la

concentrazione di PEG al 54% w/v oppure utilizzando un cristallo con un maggiore

Risultati 50

contenuto di metHb (metHb 14%) si ottengono delle cinetiche di ossigenazione

monofasiche e la saturazione raggiunge un valore stabile del 70%. Nei primi 15-20

minuti, il processo limitante è la diffusione dell'ossigeno nella soluzione in cui sono

sospesi i cristalli e all'interno dei cristalli stessi mentre la seconda fase che si osserva

nel cristallo rotto può essere attribuita ad un cambiamento conformazionale

quaternario della molecola di emoglobina, enormemente rallentato dagli

impedimenti del reticolo cristallino. La cinetica osservata nei cristalli in alto PEG o ad

alto contenuto di metHb, indica che la transizione quaternaria non avviene. Anche

l'andamento delle rispettive cinetiche di deossigenazione conferma tale ipotesi

(Figura 19b). La cinetica di riossigenazione di questi cristalli (Figura 19c) è uguale a

quella di ossigenazione (Figura 19a) mentre quella relativa al cristallo rotto risulta

ora monofasica, raggiungendo il 100% di saturazione dopo 30 minuti.

E' evidente, quindi, che sia la presenza di metHb che l'elevata concentrazione di

PEG prevengono la rottura del cristallo (Figura 21c). Gli esperimenti successivi

furono perciò condotti alla massima concentrazione possibile di PEG (62% w/v).

Poichè a questa concentrazione il PEG è al limite della solubilità, la soluzione diventa

torbida facilmente, per cui, in seguito sono state utilizzate soluzioni di PEG al 54%

w/v.

Al fine di verificare se la concentrazione del PEG avesse un'influenza sulla

frazione di saturazione è stato condotto un esperimento in cui, utilizzando la cella a

scambio di soluzioni, uno stesso cristallo veniva sospeso in soluzioni di PEG a

concentrazioni comprese tra 36 e 62% w/v. Tutte le soluzione contenevano fosfato

10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.2, erano equilibrate all'aria ed il piattino era termostatato

a 21 °C. Come mostrato dalla Figura 20 non vi è dipendenza della frazione di

saturazione dalla concentrazione di PEG nell'intervallo considerato.

FIGURA 20: Dipendenza della frazione di saturazione dalla concentrazione di PEG. Il cristallo erasospeso in diverse soluzioni di PEG equilibrate all'aria contenenti fosfato 10 mM, EDTA 1 mM, pH7.2, T 21 °C. A concentrazioni di PEG inferiori al 30% w/v il cristallo si rompe con un aumento tempo-dipendente della saturazione. Il limite superiore del 62% è determinato dalla solubilità del PEG inacqua.

Risultati 51

FIGURA 21: Riproduzione fotografica di cristalli di emoglobina ottenuti in soluzioni di PEG. (a)DeossiHb; il cristallo era in una soluzione contenente ditionito di sodio. (b) MetHb; il cristallo era statoossidato con ferricianuro di potassio. (c) OssiHb; il cristallo è stato posto in atmosfera di ossigenoimmerso in una soluzione di PEG al 54% w/v. (d) OssiHb (cristallo rotto); il cristallo è stato posto inatmosfera di ossigeno immerso in una soluzione di PEG al 36% w/v.

Risultati 52

3.2. CURVE DI SATURAZIONE

Nella Figura 22 sono riportati gli spettri di assorbimento in luce polarizzata

ottenuti da una titolazione condotta a 15 °C su un cristallo equilibrato a 9 diverse pO2

tra 0 e 760 torr. Gli spettri sono stati misurati con il vettore elettrico della luce

parallelo agli assi cristallografici a e c. La presenza dei punti isosbestici indica che nel

corso dell'ossigenazione vi sono solo due forme (ossiHb e deossiHb) che si

interconvertono senza intermedi spettrali. Nel cristallo, inoltre, la presenza dei punti

isosbestici indica che c'è una sola orientazione per gli emi ossigenati ed una sola

orientazione per gli emi deossigenati. La piccola deviazione da un perfetto

isosbestico è dovuta alla variazione della frazione di metHb e da oscillazioni della

linea di base.

FIGURA 22. Spettri di assorbimento di cristalli di HbA a crescenti pressioni di ossigeno tra 0 e 760torr. I cristalli erano sospesi in una soluzione di PEG 62% w/v fosfato di potassio 10 mM, EDTA 1mM, pH 7.2 a 15 °C. Gli spettri della serie superiore sono stati misurati con il vettore elettrico dellaluce polarizzata parallelo all'asse a mentre quelli della serie inferiore con il vettore elettrico paralleloall'asse c.

Analizzando ciascuno spettro sulla base dei tre spettri di riferimento (Figura 23)

si ottengono le frazioni di saturazione in HbO2 e metHb. La prima è espressa come

frazione degli emi ossigenati sul totale degli emi ridotti mentre la seconda come

frazione degli emi ossidati sul totale degli emi. Come mostrato in Figura 24 è

praticamente impossibile distinguere lo spettro osservato da quello calcolato.

Risultati 53

FIGURA 23: Spettri di riferimento misurati su cristalli di HbA e rapporto di polarizzazione. Questi sonospettri delle specie pure misurati con il vettore elettrico della luce polarizzata parallelo all'asse a(curva superiore) e all'asse c (curva inferiore). Il rapporto di polarizzazione ad ogni lunghezza d'onda,è plottato sopra gli spettri. La linea tratteggiata è il valore di una transizione x,y-polarizzata calcolatadalle orientazioni degli emi determinate con la cristallografia a raggi X. (a) Spettri di deossiHb a pH7.2, 20°C. (b) Spettri di MetHb a pH 7.2, 20°C. (c) spettri osservati a pH 7.2, 7°C ed una atmosfera diossigeno ( ) e spettri estrapolati a pressione di ossigeno infinita () come descritto neltesto. (d) Spettri di OssiHb ottenuti dopo sottrazione del contributo della metHb dagli spettriestrapolati.

Riportando in grafico le frazioni di saturazione calcolate rispetto ai due assi

cristallografici, in funzione della pressione di ossigeno, si ottengono le curve di

saturazione (Figura 25). La perfetta sovrapposizione delle due curve stabilisce la

reversibilità del processo di ossigenazione.

La Figura 26 mostra i plots di Hill relativi ai dati della Figura 25. Per entrambi gli

assi l'n di Hill è prossimo all'unità ed i valori di p50 lungo gli assi a e c sono

rispettivamente di 155 ±1 e 141 ±1 torr.

Risultati 54

FIGURA 24: Fitting degli spettri osservati (Figura 22) con una combinazione lineare degli spettri diriferimento di ossiHb, deossiHb e metHb (Figura 23). Le due figure si riferiscono a spettri misurati conil vettore elettrico della luce polarizzata parallelo all'asse a e all'asse c. All'interno di ciascun pannelloè riportato il valore di pressione di ossigeno a cui è stato misurato lo spettro. () spettriosservati; (- - - - -) componenti dei tre spettri di riferimento (ossiHb, deossiHb e metHb), risultanti dalfitting, la cui somma determina lo spettro calcolato ( ). Nella parte alta di ciascun spettro èriportata la differenza tra lo spettro calcolato e quello osservato.

Risultati 55

FIGURA 25: Curva di saturazione di cristalli di HbA. (Simboli vuoti) frazione di saturazione di HbO2calcolata sul totale degli emi ridotti; (Simboli pieni) frazione di metHb calcolata sul totale degli emi. Idue pannelli si riferiscono ai dati ottenuti lungo gli assi a e c. Le saturazioni sono state ottenute dalfitting degli spettri mostrati in Figura 24. (¡ ¡) frazioni di HbO2 e (l l) frazioni di metHbottenute a pressioni di ossigeno crescenti. (o o) frazioni di HbO2 e (n n) frazioni dimetHb ottenute a pressioni di ossigeno decrescenti.

FIGURA 26: Plots di Hill dei dati in Figura 25 relativi agli assi a e c. (¡) frazioni di HbO2 ottenute apressioni di ossigeno crescenti; (¨) frazioni di HbO2 ottenute a pressioni di ossigeno decrescenti. Lelinee rappresentano la retta di regressione dei dati dalla quale si ricava che n = 0.99 e p50 = 155 torrlungo a e n = 0.99 e p50 = 141 torr lungo c.

Risultati 56

Per valutare l'attendibilità di un analisi dei dati che prescinde dall'uso degli

spettri di riferimento, la stessa titolazione è stata analizzata con la procedura S.V.D.

Come si può vedere dalla Figura 27, per entrambe le direzioni di polarizzazione, la

prima componente ha un valore singolare (S1) che è circa venti volte più grande delle

altre componenti. In base alle caratteristiche spettrali della componente 1 (U1), questo

valore è stato attribuito alla specie ossiHb. Il valore singolare S2, potrebbe indicare la

presenza di una seconda componente, attribuita alla formazione di metHb nel corso

dell'ossigenazione.

a b

FIGURA 27: (a) Componenti spettrali (colonne di U) determinate attraverso la procedura S.V.D. dellamatrice degli spettri differenza, lungo l'asse a, mostrati in Figura 22. In ogni pannello è riportato ilrelativo valore singolare di S. (b) Ampiezze relative (colonne di V) delle componenti spettrali (colonnedi U) in funzione della pO2. In ogni pannello è riportato il relativo valore singolare di S.

Risultati 57

La Figura 28 mostra la curva di saturazione ed il plot di Hill, della titolazione

riportata in Figura 22, ottenuti con l'S.V.D.. Per semplicità viene riportata solo

l'analisi relativa all'asse a dove n = 1.02 e p50 = 136.1 torr mentre lungo l'asse c

n = 1.07 e p50 = 148.2 torr. La corrispondenza dei i valori di n e di p50 ottenuti con i

due metodi indica che, qualora non fosse possibile disporre di spettri di riferimento

accurati, l' S.V.D. potrebbe rappresentare un'ottima alternativa per l'interpretazione

del dato spettrale.

ba

FIGURA 28: (a) Curva di saturazione e (b) plot di Hill relativi all'esperimento riportato in Figura 22determinati tramite la procedura S.V.D. Le frazioni di saturazione sono state ottenute normalizzando ivalori di ampiezza rispetto ad una frazione di saturazione di 1 calcolata estrapolando a pO2 infinita(inserto di (a)) i valori di ampiezza. Dal plot di Hill degli stessi dati si ottiene che n = 1.02 ep50 = 136.1 torr. I dati sono relativi a spettri misurati lungo l'asse a.

Gli studi cristallografici riportano che durante l'ossigenazione avvengono dei

movimenti conformazionali terziari della molecola di emoglobina che comportano la

rotazione del piano dell'eme di circa 10° (Luisi et al., 1990). Tale rotazione è

evidenziata spettroscopicamente dalla diminuzione del rapporto di polarizzazione

che si verifica passando dalla deossiHb alla ossiHb. La Figura 29 mostra l'andamento

del rapporto di polarizzazione calcolato nella regione 525-580, 630-650 nm in

funzione della frazione di saturazione, relativo ai dati della Figura 22. Il valore del

rapporto di polarizzazione decresce durante l'ossigenazione e ritorna al valore

iniziale nella deossigenazione confermando la reversibilità del processo.

La reversibilità della curva di legame non è importante solo per soddisfare il

criterio di equilibrio, ma indica anche che la formazione di una discreta frazione di

metHb non influenza la curva di legame. Questo risultato è stato confermato da una

serie di esperimenti in cui si è studiata la dipendenza della frazione di saturazione

dalla concentrazione di emi ossidati (Figura 30).

Risultati 58

FIGURA 29: Andamento del rapporto di polarizzazione relativo agli spettri in Figura 22. Il rapporto dipolarizzazione è stato calcolato dal rapporto delle aree comprese tra 525 e 580 nm e tra 630 e 650nm lungo gli assi a e c. (¡ ¡) fase di ossigenazione (¨ ¨) fase di deossigenazione.

FIGURA 30: Effetto dell'ossidazione sull'affinità di cristalli di HbA per l'ossigeno. La frazione disaturazione di HbO2 è plottata verso la frazione di metHb. I dati sono stati ottenuti tramite esposizionedei cristalli ad una pressione di ossigeno costante a 25°C e misurando gli spettri, in funzione deltempo, per periodi superiori alle 10 ore. (¨) 530 torr, PEG 62 % w/v, fosfato di potassio 10 mM pH7.2-7.4; (¡) 530 torr, PEG 62 % w/v, fosfato di potassio 10 mM pH 7.0-7.2; (∆) 153 torr, PEG 62%w/v, Tris 50 mM, NaCl 0.1 M, pH 7.0; (n) 153 torr, PEG 62% w/v, bis-Tris 50 mM, NaCl 0.1 M, pH8.0; (l) 92 torr, PEG 62% w/v, bis-Tris 50 mM, NaCl 0.1 M, pH 6.5.

Risultati 59

Al fine di evidenziare il ruolo dei ponti salini nel determinare la bassa affinità

dell'emoglobina A in stato cristallino per l'ossigeno, è stata misurata l'affinità di

cristalli di emoglobina des-Arg in soluzioni di PEG 54% w/v, fosfato 10 mM, EDTA 1

mM, pH 7.2, 15 °C.

La misura di curve di legame dell'ossigeno a cristalli di emoglobina des-Arg era

complicata dalla presenza, a basse pressioni di ossigeno, di lente cinetiche di

ossigenazione. Erano infatti necessarie alcune ore per raggiungere valori di

saturazione costanti nel tempo. Le lente cinetiche non sono dovute alla diffusione

dell'ossigeno nel PEG e nel cristallo in quanto cristalli di HbA esposti alle stesse

pressioni di ossigeno raggiungono valori di saturazione stabili in 30-45 minuti. I

valori di saturazione sono stati calcolati dagli spettri di assorbimento lungo gli assi a

e c utilizzando le equazioni (30) e (32) e specifici spettri di riferimento. Il t½ della

cinetica diminuisce al crescere della pO2. Per valori di pO2 superiori a 36 torr, la

cinetica di ossigenazione diventa identica a quella osservata nel caso di HbA. I plots

di Hill sono stati costruiti utilizzando i valori di saturazione a fine cinetica. Lungo

l'asse a è stata calcolata una p50 di 8.9 torr con un n di Hill di 0.81 mentre lungo l'asse

c la p50 è di 7.4 torr e l'n di Hill è di 0.85 (Figura 31).

FIGURA 31: Plots di Hill relativi ad HbA des-Arg lungo gli assi a e c. I punti si riferiscono ai valori disaturazione misurati all'equilibrio su cristalli sospesi in una soluzione di PEG al 54% w/v, fosfato 10mM, EDTA 1 mM, pH 7.2 a 15 °C. Dai coefficienti della retta di regressione si ricava che lungo l'assea n = 0.79 e p50 = 8.8 torr mentre lungo l'asse c n = 0.83 e p50 = 6.9 torr.

Risultati 60

3.3. DIPENDENZA DAL PH

L'effetto Borh ed il ruolo dei ponti salini sono un punto centrale nella

comprensione della relazione struttura-funzione dell'emoglobina. Partendo dal dato

cristallografico che a pH 7 ± 0.2, l'emoglobina parzialmente ossigenata rimane in forma

T e che i ponti salini non si rompono (Brzozowski et al., 1984a; Liddington et al., 1988),

si è investigato l'effetto del pH sulla curva di legame.

Per verificare che il pH all'interno del cristallo sia lo stesso di quello misurato nella

soluzione circostante, è stato condotto un esperimento in cui sono state simulate le

condizioni del cristallo. Una soluzione di emoglobina al 35% w/v in tampone Tris 50

mM, NaCl 0.1 M, pH 8.1, ed una soluzione di PEG 8000 al 62% w/v in tampone Tris 50

mM, NaCl 0.1 M, pH 8.1, sono state poste in un recipiente separate da una membrana

semipermeabile (membrana da dialisi benzoilata, SIGMA). Questa membrana permette

la libera diffusione di molecole con P.M. < 1200 e quindi è impermeabile al PEG ed

all'emoglobina. La differenza di pH tra la soluzione proteica e quella di PEG rimaneva

inferiore a 0.05 per circa un ora. Non era possibile andare oltre questo tempo in quanto

la sottrazione di acqua da parte del PEG causava la precipitazione dell'emoglobina.

Sono state determinate due serie di curve di legame in funzione del pH. Una serie è

stata ottenuta utilizzando una soluzione di PEG al 36% w/v, fosfato 10 mM, EDTA 1

mM, 21 °C in modo da riprodurre le condizioni degli studi cristallografici (Grabowski

et al., 1978; Liddington, 1986). La seconda serie è stata ottenuta usando una soluzione

di PEG al 36% w/v, bis-Tris o Tris 50 mM, NaCl 0.1 M, EDTA 1 mM, 25 °C.

Quest'ultimo tampone fu utilizzato per gli studi della dipendenza dell'affinità di

emoglobina in stato T in soluzione, in funzione del pH (Lee et al., 1988). Si assume che

per l'emoglobina in soluzione l'affinità dello stato T corrisponda a quella del legame del

primo ossigeno al tetramero (4/K1). Affinchè le condizioni sperimentali fossero simili a

quella della soluzione, la concentrazione del tampone nelle soluzioni di PEG è stata

calcolata sul volume dell'acqua in quanto si assume che il PEG non penetri all'interno

del cristallo (McPherson, 1976; 1985; 1990).

Nella Figura 32 sono riportati i plots di Hill relativi ad undici titolazioni a diverso

pH condotte nelle condizione della seconda serie. I valori dell'n di Hill sono prossimi

all'unità e sono riportati, unitamente ai valori di p50, in Figura 33. Nella stessa Figura è

riportato anche l'andamento della 4/K1 in funzione del pH per gli esperimenti su

emoglobina in soluzione (Lee et al., 1988). E' evidente come, in contrasto con quanto

osservato in soluzione, la p50 dell'emoglobina nel cristallo sia indipendente dal pH.

Inoltre la p50 del cristallo è molto più alta di quella in soluzione per il legame del primo

ossigeno. Questi risultati sono confermati anche dagli esperimenti condotti in tampone

fosfato (Figura 34). La Figura 35 mostra la frazione di saturazione in funzio-ne del pH

di uno stesso cristallo sospeso in soluzioni di PEG a diverso pH ed equili-brate all'aria.

Risultati 61

FIGURA 32: Plots di Hill delle curve di legame determinate a pH compresi tra 6.0 e 8.4 a 25°C.(∆) Cristalli sospesi in una soluzione di PEG al 36% w/v, bis-Tris 50 mM, NaCl 0.1 M. (¡) Cristalliimmersi in una soluzione di PEG al 62%, Tris 25 mM, NaCl 0.05 M. I simboli pieni rappresentano ivalori di saturazione ottenuti alla fine dell'esperimento che indicano la reversibilità della curva dilegame. La concentrazione di PEG più elevata, usata per i pH più alcalini, era necessaria perimpedire la rottura dei cristalli. La saturazione è stata determinata dagli spettri in luce polarizzatalungo l'asse c.

FIGURA 33: Dipendenza dal pH dell'affinità dell'HbA per l'ossigeno nel cristallo e in soluzione e a 25 °C.(a) Log p50 verso pH. Valori di p50 relativi ai dati della Figura 32: (∆) in PEG al 36% w/v, bis-Tris 50mM, NaCl 0.1 M; (¡) in PEG al 62%, Tris 25 mM, NaCl 0.05 M. La linea continua è il dato di Lee etal. (1988) per il legame della prima molecola di ossigeno all'emoglobina, 4/K41. (b) n di Hill verso pHrelativo agli esperimenti in Figura 32.

Risultati 62

FIGURA 34: Dipendenza dell'affinità di cristalli di HbA per l'ossigeno dal pH. (a) Valori di Log p50; (b)valori di n di Hill verso il pH determinati da curve di legame dell'ossigeno a cristalli di HbA sospesi inuna soluzione di PEG al 36% w/v, fosfato di potassio 10 mM 21 °C.

FIGURA 35: Saturazione di HbO2 di cristalli di HbA in funzione del pH a pressione di ossigenoatmosferica (155 torr), 25°C. (¡) frazioni di saturazione misurate in PEG 62% w/v, Tris 25 mM, NaCl0.05 M, frazione di metHb compresa tra 0.07 e 0.23. (¡) frazioni di saturazione misurate in PEG 36%w/v, bis-Tris 50 mM, NaCl 0.1 M, frazione di metHb compresa tra 0.13 e 0.52. (¨) frazioni disaturazione misurate in PEG 36% w/v, fosfato di potassio 10 mM, frazione di metHb compresa tra 0.1e 0.35.

Risultati 63

Lo spettro di metHb cambia in funzione del pH a causa della variazione dello

stato di protonazione dell'acqua legata al Fe+3. E' stata quindi determinata la

dipendenza dal pH delle proprietà spettrali di metHb nel cristallo in tampone fosfato

ed in tampone bis-Tris, Tris (Figura 36). Questo ha permesso di determinare spettri di

riferimento di metHb, idonei per l'analisi dei dati riguardanti l'effetto Bohr. Inoltre,

dalla variazione spettrale nella regione 555-625 nm, è stato calcolato che il pK della

titolazione è di 8.03 in tampone fosfato e di 7.52 in tampone bis-Tris, Tris (Figura 37).

a

b

FIGURA 36: Variazione spettrale di cristalli di metHbA in funzione del pH. (a) I cristalli erano sospesi inuna soluzione di PEG al 36% w/v, potassio fosfato 10 mM, EDTA 1 mM, 21°C. (b) I cristalli eranosospesi in una soluzione di PEG al 62% w/v, 50 mM Tris, 50 mM bis-Tris, NaCl fino ad una forzaionica di 200 mM, 21°C.

Risultati 64

a b

c d

FIGURA 37: Calcolo del pK dell'acqua legata al Fe+3 della metHb. (a)(b) I punti si riferiscono ai valori di∆OD nella regione 555-625 nm degli spettri in Figura 36a. La linea rappresenta il fitting dei dati da cuiè stato determinato un pK di 7.93 lungo l'asse a ed un pK di 8.13 lungo l'asse c. (c)(d) I punti siriferiscono ai valori di ∆OD degli spettri in Figura 36b. Dal fitting dei dati (linea) è stato determinato unpK di 7.42 lungo l'asse a ed un pK di 7.62 lungo l'asse c.

3.4. EFFETTORI ALLOSTERICI

E' stata studiata l'influenza degli ioni cloruro, dell'inositolo esafosfato (IHP) e del

bezafibrato (Bzf) sull'affinità per l'ossigeno di emoglobina in stato cristallino. Sono

stati scelti questi effettori in quanto si legano a siti diversi dell'emoglobina.

La Figura 38 riporta la frazione di saturazione di un cristallo di emoglobina in

funzione della concentrazione di NaCl. Il cristallo era sospeso in una soluzione di

PEG al 62%, bis-Tris 25 mM, pH 7.4, equilibrata all'aria (pO2 = 154 torr), contenente

concentrazioni crescenti di NaCl. Dall'andamento risulta evidente come la frazione

di saturazione sia indipendente dalla concentrazione di cloruri nell'intervallo 0-1 M

NaCl. Concentrazioni di NaCl maggiori provocavano la rottura del cristallo.

Risultati 65

FIGURA 38: Effetto della concentrazione di cloruro di sodio sulla saturazione di HbO2 a 154 torr e21°C. I cristalli erano sospesi in una soluzione di PEG al 62% w/v, bis-Tris 25 mM a pH 7.4.

Per gli esperimenti con IHP e Bzf è stata utilizzata emoglobina cristallizzata in

presenza dell'effettore allosterico. I tubi di cristallizzazione contenevano

rispettivamente 2 mM IHP e 2 mM Bzf. Nella Tabella 6 sono riportati i valori di n e

p50 determinati dalle curve di legame.

TABELLA 6: valori di n e p50 relativi a cristalli di HbA in presenza di effettori allosterici.

Effettore Conc.

mM

n //a n //c p50 //a

mmHg

p50 //c

mmHg

-- -- 0.99 0.99 155 141

IHP 2 0.92 0.94 138.5 131.5

Bzf 2 0.95 0.98 141.3 130.9

I valori sono la media di due esperimenti con IHP e tre esperimenti con Bzf. Le curve di legamesono state ottenute a 15 °C in PEG al 54% w/v, fosfato 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.3.

Risultati 66

3.5. DIPENDENZA DELLA FRAZIONE DI SATURAZIONE DALLA TEMPERATURA

Sono state condotte curve di legame a diverse temperature e la dipendenza della

p50 dalla temperatura è riportata nel plot di van't Hoff (Figura 39).

Il ∆H della reazione:

Hb(cristallo) + O2(gas) → HbO2(cristallo)

calcolato dalle p50 è di -13.3 ± 0.8 kcal/mole di O2. Imai (1979) determinò un ∆H di -

12.1 kcal/mole dal plot di van't Hoff per il legame del primo O2(gas) ad

Hb(soluzione) a 25 °C, 0.1 M NaCl, pH 7.4. Dopo la correzione per il calore del

legame di protoni e ioni cloruro (Antonini et al., 1965), fu determinato un ∆H

intrinseco per il legame della prima molecola di O2(gas) di -18.1 kcal/mole (Imai,

1979; Chu et al., 1984). La Tabella 7 riporta i valori di ∆H e ∆G calcolati.

FIGURA 39: Plot di Van't Hoff per valori di p50 ottenuti su cristalli di HbA. Le p50 sono la media dei datilungo gli assi a e c. (¡) cristalli sospesi in una soluzione di PEG 36-62% w/v, fosfato di potassio10mM, pH 7.2; (l) cristalli sospesi in una soluzione di PEG 62% w/v, bis-Tris 50 mM, NaCl 0.1M, pH7.4. Il ∆H calcolato dalla pendenza della retta di regressione usando l'equazione di Van't Hoff:dlnp50/d(1/T) = ∆H/R, è 13.3 ±0.8 kcal/mole.

Risultati 67

TABELLA 7: Confronto dei parametri termodinamici apparenti per il legame dell' ossigeno ademoglobina nel cristallo ed in soluzione a 25 °C, pH 7.4.

p50 (torr) ∆G (kcal/mole)a ∆H (kcal/mole)b T∆S (kcal/mole)c

Cristallod

286 ± 15 -0.58 ± 0.03 -13.3 ± 0.8 -12.7 ± 0.8

Soluzionee

46f -1.7 -12.1

-18.1g

-10.4

aCalcolato dalla relazione ∆G = -RTln(1/p50), usando uno stato standard per l'ossigeno gassoso di760 torr. bCalcolato usando la relazione di van't Hoff. cCalcolato dalla relazione T∆S = ∆H - ∆G. dDaidati della Figura 39. eDa Imai (1979). fp50 = 1/K1, dove K1 è la costante di associazionemicroscopica per il legame del primo ossigeno al tetramero di emoglobina, ed è una buonaapprossimazione dell'affinità dello stato T nel modello allosterico a due stati (Imai, 1982). gCorretta,come riportato dall'Imai (1979) per il calore del legame di protoni e ioni cloruro (Antonini et al., 1965).

3.6. INEQUIVALENZA αβ NEL LEGAME DELL'OSSIGENO

Da tutte le curve di legame considerate in questo studio è emerso che la p50

calcolata lungo l'asse a è sempre maggiore di quella calcolata lungo l'asse c. Al fine di

determinare quantitativamente la differenza di affinità tra emi α e β, è stata misurata

la saturazione di 32 cristalli in condizioni simili a quelle cristallografiche (PEG 62%

w/v, fosfato 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.3, T=15 °C, pO2=156 torr). Il rapporto della

saturazione misurata lungo l'asse c e quella misurata lungo l'asse a è di 1.04 ± 0.01.

Assumendo che il legame sia di tipo non cooperativo (n Hill = 1.0) sono stati ricavati i

rispettivi valori di p50, il cui rapporto (p50a/p50c) è 1.09 ± 0.04. Lungo l'asse c gli emi αcontribuiscono all'assorbimento per il 57% e gli emi β per il 43% mentre lungo l'asse a

il loro contributo all'assorbimento è uguale (Tabella 2, Figura 10). Quindi la p50 degli

emi α è minore di quella degli emi β.

Una valutazione quantitativa della differenza di affinità tra emi α ed emi β può

essere ottenuta usando le equazioni (25) e (26). Una analisi più dettagliata, che tenga

cioè in considerazione eventuali differenze di ossidazione, può essere fatta

utilizzando l'equazione (22) e (23) in un fitting dei minimi quadrati dello spettro

osservato rispetto ai tre spettri di riferimento. Il rapporto delle saturazione e delle

p50 calcolate in questo secondo modo è più grande rispetto al precedente e ciò indica

Risultati 68

una maggiore ossidazione degli emi α. Dai calcoli è emerso che l'affinità degli emi α è

circa 5 volte più grande di quella degli emi β.

3.7. EMOGLOBINA ROTHSCHILD

La Figura 40 mostra la variazione spettrale conseguente all'ossigenazione di un

cristallo di Hb Rothschild a 21 °C, in PEG 8000 36% w/v, fosfato 10 mM, EDTA 1

mM, pH 7.2. Il cristallo era equilibrato con nove diverse pressioni di ossigeno

comprese tra 0 e 760 torr e gli spettri in luce polarizzata sono stati misurati con il

vettore elettrico della luce parallelo agli assi cristallografici a e c. La frazione di

saturazione ad ogni pO2 è stata calcolata fittando ciascun spettro con i tre spettri di

riferimento di ossiHb, deossiHb, metHb (Figura 41) utilizzando l'equazione (30) e

(32).

FIGURA 40: Variazione spettrale dicristalli di emoglobina Rothschild nelcorso dell'ossigenazione. La titola-zione è stata ottenuta normalizzandogli spettri misurati su due cristallidiversi rispetto agli spettri diriferimento. Il primo cristallo, sospesoin una soluzione di PEG al 36% w/v,fosfato 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.221 °C era equilibrato a pO2 crescentiin un intervallo compreso tra 0 e 36torr mentre il secondo, nelle stessecondizioni sperimentali, era equi-librato a pO2 comprese tra 36 e 760torr. La pO2 è in scala logaritmica inmodo che la distanza sia proporzio-nale al potenziale chimico. Gli spettrisono stati misurati con il vettoreelettrico della luce polarizzata paralle-lo agli assi cristallografici a (a) e c(b).

Risultati 69

La Figura 42 mostra i plots di Hill relativi a cristalli di emoglobina Rothschild

naturale e ricombinante ed emoglobina A, cresciuti come descritto nella Tabella 4,

(MATERIALI E METODI). L'affinità dei cristalli di HbA (n Hill = 0.99, p50 = 199 torr),

aventi funzione di controllo, è identica a quella dei cristalli cresciuti nelle condizioni

riportate nella Tabella 3. I cristalli di Hb Rothschild, naturale e ricombinante, hanno

un'uguale affinità per l'ossigeno che è circa dieci volte maggiore di quella dei cristalli

di HbA. La p50 misurata lungo gli assi a e c è di 22 e 17 torr con un coefficiente di Hill

n di 0.80 e 0.88 rispettivamente. Un valore di n inferiore all'unità indica una notevole

differenza di affinità tra gli emi α e β.

FIGURA 41: Spettri di riferimento erapporto di polarizzazione di cristalli diemoglobina Rothschild. Gli spettri dellespecie pure sono misurati con il vettoreelettrico della luce polarizzata paralleloall'asse a (curva superiore) e all'asse c(curva inferiore). Nella parte alta di ognispettro è riportato il rapporto dipolarizzazione ad ogni lunghezzad'onda. (a) deossiHb, (b) ossiHb, (c)metHb. Gli spettri di deossiHb e metHbsono stati misurati sospendendo ilcristallo in soluzioni di PEG al 36% w/vcontenenti ditionito di sodio eferricianuro di potassio rispettivamente.Lo spettro di ossiHb è stato ottenutoper estrapolazione a pressione diossigeno infinita secondo la proceduradescritta nel testo (sezione MATERIALI EMETODI).

Risultati 70

L'andamento del rapporto di polarizzazione in funzione della frazione di

saturazione (Figura 43) indica che nel corso dell'ossigenazione si ha una rotazione

del piano dell'eme.

In accordo con i dati ottenuti su cristalli di HbA, cristalli di Hb Rothschild non

presentano effetto Bohr in un intervallo di pH compreso tra 6.2 e 9.0 (Figura 44).

La Figura 45 mostra la variazione spettrale di cristalli di metHb Rothschild

ricombinante conseguente alla variazione di pH. I cristalli erano sospesi in una

soluzione al 36% w/v, fosfato 10 mM, EDTA 1 mM, 21 °C. Tali spettri sono stati

utilizzati come spettri di riferimento per il calcolo delle frazioni di saturazione in

HbO2 a diversi pH. Il pK dell'acqua coordinata al Fe+3 dell'eme è di 7.95 lungo a e 7.97

lungo c (Figura 46).

FIGURA 42: Plots di Hill relativi ad Hb Rothschild naturale (∆), Hb Rothschild ricombinante (¨) ed HbA (¡). I cristalli erano sospesi in una soluzione di PEG al 36% w/v, fosfato 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.2a 21 °C. I valori di n sono rispettivamente di 0.80, 0.79, 0.98 lungo l'asse a (a) e di 0.88, 0.88, 0.99lungo l'asse c (b). La frazione di metHb nel corso dell'esperimento variava da 0.03 a 0.26.

Risultati 71

FIGURA 43: Andamento del rapporto di polarizzazione relativo agli spettri in Figura 40. Il rapporto dipolarizzazione è stato calcolato dal rapporto delle aree comprese tra 525 e 580 nm e tra 630 e 650nm degli spettri lungo gli assi a e c.

FIGURA 44: Dipendenza della frazione di saturazione di Hb Rothschild dal pH. I cristalli di Hb Rothschilderano sospesi in una soluzione di PEG al 36% w/v, EDTA 1 mM, 23 °C in tampone fosfato 10 mM(simboli vuoti) ed in tampone borato 10 mM (simboli pieni). I cerchi corrispondono ai valori disaturazione lungo l'asse a mentre i quadrati a quelli lungo l'asse c. La frazione di metHb variava da0.05 a 0.3.

Risultati 72

FIGURA 45: Variazione spettrale di cristalli di metHb Rothschild in funzione del pH. I cristalli eranosospesi in una soluzione di PEG al 36% w/v, potassio fosfato 10 mM, EDTA 1 mM, 21°C a pHcompresi tra 6 e 9.

FIGURA 46: Calcolo del pK dell'acqua legata al Fe+3 della metHb. I punti si riferiscono ai valori di ∆ODnella regione 555-625 nm degli spettri in Figura 45. Dal fitting dei dati () è stato determinato unpK di 7.96 lungo l'asse a (a) ed un pK di 7.94 lungo l'asse c (b).

Risultati 73

In contrasto con quanto osservato nel caso di HbA, gli anioni cloruro

influenzano notevolmente l'affinità dei cristalli di Hb Rothschild (Figura 47). Ad una

pressione di ossigeno di 14.2 torr a 21 °C, la frazione di saturazione di cristalli di Hb

Rothschild sospesi in una soluzione di PEG al 36% w/v, fosfato 10 mM, EDTA 1 mM,

pH 7.2 decresce di circa 3 volte passando da 0 a 1 M NaCl.

FIGURA 47: Dipendenza della frazione di saturazione di emoglobina Rothschild dalla concentrazione diNaCl. I cristalli erano sospesi in soluzioni di PEG al 36% w/v, potassio fosfato 10 mM, EDTA 1 mM,pH 7.2, contenenti concentrazioni crescenti di NaCl. La concentrazione dei cloruri era calcolatarispetto al volume totale della soluzione. Il volume occupato dall'acqua è 1,4 volte inferiore. Lasoluzione contenente i cristalli era equilibrata a 14.2 torr di ossigeno a 21°C. (¨) valori di saturazionecalcolati lungo l'asse a; (¡) valori di saturazione calcolati lungo l'asse c.

Per meglio caratterizzare l'effetto dei cloruri, sono state determinate le curve di

legame dell'ossigeno a diverse concentrazioni di NaCl. L'alta forza ionica favorisce la

rottura dei cristalli a seguito dell'ossigenazione, perciò le titolazioni sono state

effettuate in soluzioni di PEG al 62% w/v. La Figura 48 mostra i plots di Hill, nelle

due direzioni di polarizzazione, relativi a curve di legame misurate su cristalli di Hb

Rothschild naturale a diverse concentrazioni di NaCl.

Risultati 74

FIGURA 48: Plots di Hill relativi alle curve di legame di emoglobina Rothschild in presenza di cloruri. Icristalli erano sospesi in una soluzione di PEG al 36% w/v (simboli pieni) o al 62% w/v (simboli vuoti)contenente fosfato 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.2, 21 °C in assenza di cloruri (l)(¡) ed in presenza di100 mM (∇), 200 mM (¨) e 500 mM (∆) cloruro di sodio. (a) e (b) si riferiscono ai dati raccolti lungol'asse a e c rispettivamente.

L'aggiunta di NaCl riduce la frazione di saturazione a tutte le pressioni di

ossigeno ma tale effetto non è uniforme. Infatti, la riduzione dell'affinità per

l'ossigeno è maggiore ai bassi livelli di saturazione rispetto agli alti. Questa diversa

risposta ai cloruri produce il fenomeno della cooperatività nel legame dell'ossigeno

come indicato dal cambiamento della pendenza del plot di Hill. A concentrazioni di

NaCl superiori a 100 mM, il coefficiente di Hill, a metà saturazione, diventa maggiore

di uno.

4. DISCUSSIONE

Discussione 76

4.1. EMOGLOBINA A

L'ossigenazione dei cristalli di HbA a basse concentrazioni di PEG e con una

bassa frazione di emi ossidati provoca la rottura dei cristalli, probabilmente causata

da una transizione della struttura quaternaria da T ad R, con un conseguente

aumento, tempo-dipendente, dell'affinità. E' possibile stabilizzare i cristalli

aumentando la concentrazione del PEG o la frazione di metHb. In questo caso la

cinetica di ossigenazione risulta monofasica e la curva di legame dell'ossigeno

reversibile. L'aumento della concentrazione di PEG favorisce la fase cristallo

dell'emoglobina rispetto alla fase soluzione, prevenendo la solubilizzazione dei

cristalli. La diminuzione della solubilità è presumibilmente dovuta all'aumento del

coefficiente di attività dell'emoglobina in soluzione conseguente all'effetto di

esclusione di volume del PEG.

L'effetto stabilizzante della metHb può essere dovuto al fatto che l'ossidazione

favorisce la struttura R meno dell'ossigenazione (Perutz et al., 1974; Perutz et al.,

1976). Inoltre l'analisi cristallografica di deossiHb cristallizzata in condizioni

deossigenate e successivamente ossidata con ferricianuro ha stabilito che la struttura

quaternaria è T, dimostrando quindi che la metHb è compatibile con una

conformazione T (Liddington et al., 1988; Perutz et al., 1987).

Altre evidenze indicano che la struttura quaternaria T è mantenuta in cristalli

intatti di emoglobina ossigenata. Gli studi cristallografici di cristalli di emoglobina

parzialmente ossigenata (PEG 36% w/v, fosfato 10 mM, pH 7.0 ±0.2, in aria a

temperatura ambiente) mostrano che la struttura quaternaria è T (Brzozowski et al.,

1984a; Liddington, 1986; Liddington et al., 1988). Il rapporto di polarizzazione di

cristalli di emoglobina completamente ossigenata è in buon accordo con il valore

calcolato usando i parametri strutturali ottenuti da emoglobine di-legate in stato T

(Tabella 2). Infine, la qualità del fitting ottenuta nell'analisi degli spettri di

assorbimento e la presenza dei punti isosbestici (Figura 24 e 22) non indicano

l'esistenza di intermedi spettrali e suggeriscono che l'emoglobina legata e non legata

ha una sola conformazione.

La reversibilità dell'ossigenazione è dimostrata dalla perfetta sovrapposizione

dalle curve di legame ottenute aumentando e diminuendo la pO2 nell'intervallo 0-760

torr (Figura 25 e 26). Il coefficiente di Hill, prossimo all'unità, indica che il legame

dell'ossigeno ad emoglobina bloccata in stato T dal reticolo cristallino è di tipo non

cooperativo, come predetto dal modello a due stati di Monod, Wyman e Changeux.

L'affinità misurata in cristalli di emoglobina A è inferiore a quella osservata in

soluzione per il legame del primo ossigeno (Lee et al., 1988). In presenza di forti

effettori allosterici, è stata determinata una K1 di 210 torr, paragonabile con la p50

misurata nel cristallo (Lalezari et al., 1990; Marden et al., 1990).

Discussione 77

4.1.1. L'assenza dell'effetto Bohr

La dipendenza dal pH dell'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno è

completamente diversa tra cristallo e soluzione (Figura 33, 34 e 35). In un intervallo

di pH compreso tra 6 e 8.5 la p50 del cristallo non cambia mentre l'affinità dello stato

T in soluzione, assunta essere quella del legame della prima molecola di ossigeno,

varia di un fattore 7. La struttura ai raggi X di cristalli di emoglobina parzialmente

ossigenata riporta che i ponti salini non sono rotti (Brzozowski et al., 1984a;

Liddington, 1988). Inoltre gli studi cristallografici di emoglobine ibride in stato T,

mostrano che i ponti salini delle subunità α legate con CO sono intatti (Arnone et al.,

1986; Perutz et al., 1987; Luisi & Shibayama, 1989; Luisi et al., 1990; Abraham et al.,

1992). Questo è vero anche per le catene β, in stato T, legate con CO (Luisi,

comunicazione personale).

La mancanza dell'effetto Bohr nel cristallo è quindi interpretabile con il modello

stereochimico di Perutz secondo il quale il legame dell'ossigeno causa la rottura dei

ponti salini con conseguente rilascio di protoni (Perutz, 1970). Questa conclusione si

basa sull'ipotesi che i ponti salini sono intatti in tutto l'intervallo di pH e di pO2 delle

misure.

L'interpretazione più ovvia è che l'effetto Bohr richieda una transizione

conformazionale quaternaria che nel cristallo è impedita dal reticolo cristallino. Tale

conclusione non spiega però l'esistenza di un effetto Bohr terziario per il legame

dell'ossigeno ad emoglobina in stato T in soluzione (Johnson et al., 1984; Lee et al.,

1988). Un'interpretazione alternativa può derivare dal modello di Szabo e Karplus

secondo il quale le singole subunità presentano due stati, a diversa affinità, all'interno

della struttura quaternaria T. Lo stato a più bassa affinità corrisponde alla struttura

terziaria con i ponti salini intatti mentre lo stato ad alta affinità corrisponde alla

struttura terziaria con i ponti salini rotti. Sia nel cristallo che in soluzione la

conformazione terziaria più stabile per una subunità deossigenata, in stato T, è quella

con i ponti salini intatti. Nel caso di una subunità ossigenata invece, la

conformazione terziaria più stabile è quella con i ponti salini intatti, nel cristallo, e

con i ponti salini rotti in soluzione. L'ossigenazione di emoglobina in soluzione

provoca la rottura dei ponti salini all'interno dello stato T con conseguente rilascio di

protoni che sono responsabili dell'effetto Bohr terziario (Figura 49). Tale fenomeno

non avviene nel cristallo e questo spiega l'assenza di effetto Bohr e la bassa affinità

dello stato T nel cristallo rispetto alla soluzione. Attraverso questo modello può

essere spiegata la variabilità riscontrata nella determinazione delle costanti di legame

dell'ossigeno ad emoglobina in stato T in soluzione (Minton & Imai, 1974; Imai 1982).

Infatti gli effettori allosterici come i cloruri ed i fosfati organici potrebbero spostare

l'equilibrio delle subunità legate, in stato T, verso la conformazione quaternaria con i

ponti salini intatti.

Discussione 78

FIGURA 49: Confronto del legame alla struttura quaternaria T nel cristallo ed in soluzione. Il diagrammamostra in modo semplificato la relazione tra ponti salini, conformazione terziaria e stato di legamenella struttura quaternaria T. I quadrati rappresentano la conformazione a bassa affinità, con pontisalini intatti, mentre i cerchi rappresentano la conformazione ad alta affinità con i ponti salini rotti. Isimboli vuoti corrispondono alle subunità non legate, mentre simboli pieni corrispondono alle subunitàlegate. Nel cristallo solo la popolazione con ponti salini intatti è popolata ed il legame avviene senzarotture dei ponti salini e non c'è effetto Bohr. In soluzione possono esistere tutte le combinazioni diconformazione possibili, ma le specie più popolate a pH neutro sono quelle che stanno lungo ladiagonale. Il legame cambia la conformazione terziaria da una con i ponti salini intatti a una con pontisalini rotti, producendo in questo modo un effetto Bohr terziario.

Discussione 79

La mancanza di effetto da parte degli effettori allosterici (Cl-, IHP, Bzf) osservata

nel cristallo (Figura 38 e Tabella 6) è giustificata dal fatto che gli effettori allosterici

stabilizzano la conformazione con i ponti salini intatti che nel cristallo è già presente

al 100%.

La necessità di un terzo stato a diversa affinità fu riconosciuta da Minton e Imai

(1974). Inoltre, la possibilità di legame a subunità in stato T senza la rottura dei ponti

salini fu considerata da Lee e Karplus (Lee & Karplus, 1983; Lee et al., 1988)

(Figura 49).

Se ammettiamo, sia pure in mancanza del dato cristallografico, che l'emoglobina

des-Arg sia priva di parte dei ponti salini, l'affinità relativamente alta, determinata

nei cristalli di emoglobina des-Arg, è in accordo con il modello.

Utilizzando la funzione di partizione del modello di Szabo e Karplus (Hess &

Szabo, 1979) è stata stimata una p50 a 25 °C per ognuno dei tre stati di affinità. La p50

per lo stato T con i ponti salini intatti è di circa 300 torr che corrisponde a quella

determinata nel cristallo. La p50 per lo stato T con i ponti salini rotti è inferiore ai 10

torr, valore che è in accordo con i 6-7 torr misurati sui cristalli di emoglobina des-Arg

a 15 °C. La p50 per lo stato R è circa 0.3 torr (Imai, 1982).

4.1.2. La saturazione con ossigeno è completa

Dagli studi cristallografici di cristalli di emoglobina A, parzialmente ossigenati, è

emerso che l'ossigeno è legato solo agli emi α (Brzozowski et al., 1984a; Liddington et

al., 1988). La mappa di densità elettronica del sito di legame dell'ossigeno sulle catene

α era completamente occupata mentre non si osservava ossigeno legato agli emi β(Brzozowski et al., 1984a).

In base ai dati qui presentati è possibile investigare l'inequivalenza tra emi α ed

emi β. A pressione di ossigeno di 760 torr, 8 °C, una frazione di saturazione di

0.91 ± 0.01 indica che anche le subunità β legano l'ossigeno. Le curve di legame

(Figura 25) non mostrano bifasicità come sarebbe atteso nel caso di una grande

differenza di affinità tra emi α e β. Inoltre la linearità del plot di Hill con una

pendenza unitaria pone dei limiti all'inequivalenza αβ se si assume che il legame

dell'ossigeno sia non cooperativo. La Figura 50 mostra il paragone tra il plot di Hill

dei dati e quelli ottenuti simulando, per un legame non cooperativo, rapporti

crescenti dell'affinità degli emi α rispetto a quella degli emi β. La linearità dei dati nel

plot di Hill è sufficiente per suggerire che il rapporto tra le affinità è inferiore a 5.

Discussione 80

FIGURA 50: Simulazione dell'inequivalenza αβ. I punti sono la media dei dati lungo l'asse a e c dallaFigura 10. Le linee sono i plots di Hill, ottenuti dal fitting dei punti utilizzando le equazioni (24) e (27) incui veniva imposto un rapporto di p50 di 1, 5 e 10.

Sfruttando le diverse proiezioni degli emi α e β lungo i due assi cristallografici

(Figura 10, Tabella 2) è possibile, utilizzando l'equazione (26), determinare la

saturazione dei singoli emi α e β. L'equazione presuppone la conoscenza

dell'orientazione dei quattro emi per le tre specie (ossiHb, deossiHb e metHb) e che

nell'intervallo di lunghezze d'onda considerato, gli emi si comportino da assorbitori

circolari della luce linearmente polarizzata (vedi TEORIA OTTICA). E' stato anche

assunto che non ci siano differenze nella saturazione tra i due emi α (o i due emi β)

causate dal fatto che hanno diversi contatti intermolecolari nel cristallo. I risultati

dell'analisi, per una serie di esperimenti condotti in condizioni simili a quelle

cristallografiche, sono riportati in Tabella 8. A 15 °C e a pressione di ossigeno

atmosferica, la saturazione delle subunità α è del 70% mentre quella delle subunità βè del 37%. Assumendo che il legame sia non cooperativo e che la dipendenza della

p50 dalla temperatura sia la stessa per entrambe le subunità e corrisponda a quella

riportata in Figura 39, la saturazione, a temperatura ambiente delle subunità α e β, è

stata calcolata essere del 60% e 27% rispettivamente.

Se le ipotesi adottate sono corrette, si può tentare di spiegare la discordanza tra il

dato cristallografico e quello ottico. L'occupanza dei siti α potrebbe essere stata

sovrastimata, da parte dei cristallografi, a causa della presenza di una certa frazione

Discussione 81

di metHb (il Fe+3 lega una molecola di acqua). L'assenza di densità elettronica al sito

di legame delle subunità β potrebbe essere dovuta alla diversa orientazione che la

molecola di ossigeno può assumere. Questo renderebbe l'atomo di ossigeno

"invisibile" ai raggi X.

TABELLA 8: Determinazione multipla delle saturazioni degli emi α e β in ari a 15 °Ca.

Osservatob

Frazione di saturazione p50 (torr)c

asse a 0.527 ± 0.014 140 ± 8

asse c 0.549 ± 0.021 129 ± 10

rapporto 1.040 ± 0.015 1.09 ± 0.04

Calcolato

Frazione di saturazione p50 (torr)

Metodo Id Metodo IIe Metodo If Metodo IIf

emi α 0.66 ± 0.06 0.70 ± 0.05 82 ± 21 68 ± 16

emi β 0.40 ± 0.03 0.37 ± 0.04 239 ± 44 275 ± 53

rapporto 1.7 ± 0.4 1.9 ± 0.4 3.4 ± 2.3 4.5 ± 2.2

aOssigeno 156 torr, tampone fosfato 10 mM, pH 7.3 PEG 63% w/v. Per il calcolo dellefrazioni di saturazione sono state incluse solo le regioni a lunghezza d'onda 525-580 nm e630-650 nm. bI risultati sono la media di misure fatte in 32 differenti cristalli. Le incertezzesono deviazioni standard dai valori medi. In questi esperimenti il contenuto medio di metHbera compreseo tra 0 e 8%. cCalcolati dall'equazione di Hill. dCalcolati dall' equazione (27).eCalcolati dall'equazione (23). fCalcolati dalle saturazioni (d) ed (e) utilizzando l'equazione(28).

4.1.3. L'inequivalenza αβ maschera una piccola frazione di cooperatività

Un coefficiente di Hill unitario indica che il legame dell'ossigeno è non

cooperativo. E' stato però dimostrato che la cooperatività all'interno del tetramero

può essere mascherata da un'inequivalenza tra le affinità degli emi α e β. Secondo il

modello del "cooperone" (Brunori et al., 1986; Gill et al., 1986) è possibile introdurre

cooperatività nel legame dell'ossigeno allo stato T assumendo che il dimero sia l'unità

cooperativa. Il polinomio di legame per il tetramero è (Hess & Szabo, 1979; Gill,

1981):

(33)( )[ ]221 pKKpKKQ βαβα δ+++=

Discussione 82

dove: Kα e Kβ sono le costanti di legame per le subunità α e β rispettivamente e δ è un

parametro di interazione che produce cooperatività. Le curve di legame per le

subunità α e β calcolate da d ln Q/d ln p sono:

(34)

e per il tetramero:

(35)

La pendenza del plot di Hill, a metà saturazione, per la curva di legame del tetramero

è data da (Szabo & Karplus, 1975):

(36)

Questa relazione mostra che esiste un intervallo continuo di valori di δ e di q che

produce un coefficiente di Hill n = 1 a tutte le pressioni. Quindi, in base a questo

modello, qualsiasi cooperatività (determinata dal valore di δ) può essere mascherata

da un'inequivalenza αβ (determinata dal valore di q) in modo da produrre una curva

di legame del tetramero con coefficiente di Hill unitario.

La Figura 51 mostra le curve di legame relative alle subunità α e β e il fitting dei

dati usando l'equazione (34). Il rapporto delle affinità (q=Kα/Kβ) è 4.6 ± 0.4 ed il

parametro di interazione (δ) è 1.8 ± 0.3. L'incertezza rappresenta la deviazione

standard dalla media delle tre titolazioni in Figura 51. L'incertezza reale è più grande

di questa in quanto i valori di q e di δ sono sensibili ad errori nella determinazione

delle coordinate degli emi. Infatti mentre tali orientazioni sono state determinate

cristallograficamente per le subunità α e β deossigenate e per le subunità αossigenate, quelle delle subunità β ossigenate non sono note con esattezza

(Tabella 2). In assenza di cooperatività e con un valore di q = 4, il coefficiente di Hill

del tetramero dovrebbe essere di 0.89. L'aver determinato un n di Hill di 1.0, significa

che l'inequivalenza αβ compensa una piccola quantità di cooperatività che è stata

stimata essere circa il 10% della cooperatività generata dalla transizione quaternaria

T→R in soluzione.

Discussione 83

FIGURA 51: Curve di legame relative ai soli emi α e ai soli emi β. Le saturazioni sono state calcolatedalle equazioni (22) e (23). La curva di legame del tetramero è stata calcolata dalla somma dellecurve di legame α e β. Le curve attraverso i dati nei pannelli (a), (c), e (e), sono ottenuti dai fittingsusando l'equazione (34). Nei pannelli (b), (d), e (f), gli n di Hill per le curve di legame del tetramero(triangoli) sono 0.96 ± 0.01, 1.01 ± 0.01 e 1.05 ± 0.02 rispettivamente. (a), (b) Sono i datidell'esperimento mostrato in Figura 10; (c), (d) ed (e), (f) sono i dati di altri due esperimenti nellestesse condizioni dell'esperimento in Figura 10.

Discussione 84

La bassa cooperatività potrebbe essere dovuta ad un aumento dell'affinità di tutte

le molecole di emoglobina del cristallo oppure ad un aumento di affinità circoscritto

alle molecole con maggiori gradi di libertà, come potrebbero avere quella degli strati

superficiali del cristallo.

Il mancato effetto dell'IHP e del Bzf sulla p50 dell'emoglobina non è sorprendente

in quanto l'emoglobina nel cristallo è al 100% nella conformazione T con i ponti salini

intatti che è la più stabile. Il coefficiente di Hill del tetramero determinato in presenza

di effettori allosterici (IHP o Bzf) è però inferiore all'unità con un valore medio di 0.95.

Questo potrebbe indicare che gli effettori allosterici riducano la cooperatività

osservata in loro assenza.

4.2. EMOGLOBINA ROTHSCHILD

Se l'interpretazione dei dati sull'emoglobina A è complicata dalla mancanza di

una vera struttura della ossiHb in stato T, l'interpretazione dei dati sull'emoglobina

Rothschild è ancor più complessa poichè si può avvalere della sola struttura

deossigenata (Kavanaugh et al., 1992a). Inoltre la caratterizzazione funzionale in

soluzione non è stata sviluppata in modo approfondito per la tendenza del tetramero

di Hb Rothschild a dissociarsi in dimeri.

Il rapporto di polarizzazione calcolato dai dati strutturali, utilizzando

l'equazione (15), ha un valore di 1.62, paragonabile con il valore di 1.68 determinato

dal rapporto degli spettri di assorbimento lungo a e c. E' quindi legittimo supporre

che i cristalli di Hb Rothschild usati in questo lavoro siano identici a quelli utilizzati

da Kavanaugh per la determinazione della struttura tridimensionale (Kavanaugh et

al., 1992a). Questa struttura è analoga a quella ottenuta da Fermi et al. (1984) in

cristalli di deossiHbA cresciuti in soluzioni ad alta forza ionica, comunemente

assunta come struttura dell'emoglobina in stato T.

La sovrapposizione delle curve di legame di emoglobina Rothschild naturale e

ricombinante indica che la metionina addizionale presente al terminale aminico delle

catene β, espresse in E. coli, non influenza l'affinità. Inoltre il dato cristallografico

riporta che non ci sono differenze strutturali tra i due tipi di mutante (Kavanaugh et

al., 1992b). Cristalli di HbA ottenuti a temperatura ambiente, utilizzati come

controllo, hanno gli stessi valori di n e p50 di quelli cresciuti a 4 °C.

In soluzione, l'unione dei dimeri αβ deossigenati a formare il tetramero, cambia

drasticamente le caratteristiche di legame dell'ossigeno. E' quindi ragionevole

dedurre che una mutazione all'interfaccia α1β2 influenzi le proprietà funzionali dello

stato T in soluzione. L'affinità per l'ossigeno dell'emoglobina Rothschild nel cristallo è

Discussione 85

dieci volte superiore a quella dell'HbA, ciò indica che anche l'emoglobina allo stato

cristallino risente di piccole alterazioni all'interfaccia α1β2. La più alta affinità

dell'emoglobina Rothschild rispetto a quella dell'emoglobina A, conferma il risultato

di misure cinetiche in cui la mutazione Trp→Arg aumenta l'affinità per l'ossigeno

dello stato T in soluzione (Sharma et al., 1980).

L'assenza dell'effetto Bohr anche nei cristalli di emoglobina Rothschild è

interpretabile mediante considerazioni analoghe a quelle fatte per l'HbA.

Contrariamente a quanto osservato nel caso di HbA, gli anioni cloruro

influenzano notevolmente l'affinità dei cristalli di Hb Rothschild (Figura 47). Questo è

stato messo in relazione con la determinazione cristallografica di un nuovo sito di

legame di cloruri introdotto dalla mutazione. Le mappe di densità elettonica riportate

da Kavanaugh et al. (1992a) mostrano chiaramente un picco di densità elettronica a

livello dell'interfaccia α1β2. La sostituzione di un triptofano con una arginina,

introduce uno ione guanidinio carico positivamente che altera l'idrofobicità del sito.

Non è quindi sorprendente che la neutralizzazione della carica positiva con i cloruri

riduca in qualche modo la perturbazione funzionale introdotta dalla mutazione

diminuendo l'affinità per l'ossigeno dei cristalli di emoglobina Rothschild fino ad un

valore che si approssima a quello osservato nel caso di cristalli di HbA.

Poichè il legame dei cloruri diminuisce l'affinità per l'ossigeno, in modo analogo il

legame dell'ossigeno diminuisce l'affinità per i cloruri (Wyman, 1964). Questa

reciprocità offre una spiegazione della cooperatività osservata nel legame

dell'ossigeno ai cristalli di emoglobina Rothschild in presenza di ioni cloruro.

Qualitativamente il fenomeno può essere descritto come segue. Il legame dei cloruri

abbassa l'affinità per l'ossigeno ma, di contro, mentre il tetramero viene

progressivamente saturato con ossigeno gli ioni cloruro si dissociano. Questo

significa che l'effetto dei cloruri è maggiore alle basse saturazioni di HbO2 rispetto

alle alte. Il fenomeno dovrebbe scomparire a concentrazioni di cloruro per cui il sito

di legame sia sempre saturato ma ciò richiederebbe valori di concentrazione

inaccettabili. Un analisi dettagliata del modello, che tiene conto anche di eventuali

differenze di affinità tra emi α ed emi β è riportata da Rivetti el at. (1993b). Dall'analisi

è emerso che la costante di dissociazione dei cloruri è di 33 ± 8 mM e che la

differenza di affinità tra subunità α e β è di circa 7. Tale differenza di affinità potrebbe

spiegare un valore del coefficiente di Hill pari a 0.80 lungo a e 0.88 lungo c.

Il diverso comportamento osservato tra cristalli emoglobina A e cristalli di

emoglobina Rothschild può essere spiegato anche con la seguente ipotesi. Il

triptofano β37 connette tra loro i dimeri αβ e permette la trasmissione di

informazioni strutturali che, nel caso di cristalli intatti, produce la piccola

cooperatività discussa in precedenza. Se le condizioni non sono stringenti (PEG 36%

w/v e basso contenuto di metHb) la trasmissione dei movimenti molecolari

Discussione 86

conseguenti all'ossigenazione porta alla rottura dei cristalli, presumibilmente causata

dalla transizione quaternaria T→R. Nell'emoglobina Rothschild questa connessione

viene a mancare e, come conseguenza della diminuita interazione tra i dimeri, in

soluzione essi dissociano e nel cristallo si ha un aumento dell'affinità. Inoltre, in

assenza di cloruri, non è mai stata osservata la rottura di cristalli di emoglobina

Rothschild in seguito all'ossigenazione anche in condizioni di basso PEG (36% w/v)

e basso contenuto di metHb. Un coefficiente di Hill medio tra a e c di 0.84,

confrontato con un coefficiente di Hill di 1.0 osservato nei cristalli di HbA è stato

giustificato da una maggiore inequivalenza αβ nell'Hb Rothschild ma potrebbe

essere dovuto anche ad una minore o assente cooperatività. Come discusso in

precedenza per l'HbA, in assenza di cooperatività ed ammettendo una differenza di

affinità tra emi α e β di 4, è stato calcolato un n teorico di 0.89.

In presenza di ioni cloruro viene ristabilita la connessione tra i dimeri αβ e come

conseguenza si ha una diminuita affinità, un aumento dell'n di Hill e la rottura dei

cristalli durante l'ossigenazione se la concentrazione del PEG non è elevata.

4.3. CONCLUSIONI

Curve di legame dell'ossigeno ad emoglobina in soluzione sono state misurate a

partire dal 1904 (Bohr et al., 1904) e cristalli di emoglobina di varie specie sono stati

ottenuti a partire dal 1909 (Reichert & Brown, 1909). In questa Tesi viene presentata

la misura di curve di legame dell'ossigeno ad emoglobina in stato T nel cristallo in

cui la struttura quaternaria è definita dalla cristallografia ai raggi X. Attraverso

l'analisi degli spettri di assorbimento, ottenuti mediante microspettrofotometria in

luce polarizzata di cristalli singoli, è stato possibile determinare le frazioni di

ciascuna specie (ossiHb, deossiHb e metHb) in un intervallo di pressioni di ossigeno

compreso tra 0 e 760 torr.

I dati mostrano che il legame dell'ossigeno a cristalli di emoglobina in stato T è

essenzialmente non cooperativo, come predetto dal modello allosterico a due stati di

Monod, Wyman e Changeux. Le diverse proiezioni degli emi α e β lungo gli assi

cristallografici a e c hanno permesso di calcolare curve di legame distinte per le

subunità α e β, dalle quali è emerso che le subunità α hanno un' affinità cinque volte

superiore a quella delle β. Tale inequivalenza compensa una piccola cooperatività

producendo un n di Hill apparente di 1.0.

L'assenza di un effetto sull'affinità da parte di H+, Cl-, IHP e Bzf suggerisce

un'interessante interpretazione che potrebbe spiegare anche la diversa affinità

Discussione 87

osservata tra lo stato T in soluzione e nel cristallo. In soluzione, l'emoglobina in stato

T, è presente in entrambe le conformazioni con alta e bassa affinità che

corrispondono rispettivamente alle strutture con i ponti salini rotti e con i ponti salini

intatti. Mentre in soluzione la conformazione più stabile è quella con i ponti salini

rotti, nel cristallo l'unica conformazione presente è quella con i ponti salini intatti. La

mancata rottura dei ponti salini nel corso dell'ossigenazione impedisce l'esprimersi

dell'effetto Bohr e gli effettori allosterici non possono stabilizzare ulteriormente una

conformazione che è già la più stabile. Una p50 di circa 8 torr osservata in cristalli di

emoglobina des-Arg è a sostegno questa ipotesi.

La relativamente alta affinità misurata su cristalli di emoglobina Rothschild

(β37 Trp→Arg) è stata messa in relazione con una diminuita interazione tra i dimeri,

interazione che può essere simulata dal legame dei cloruri al nuovo sito introdotto

dall'arginina. Infatti, la saturazione diminuisce al crescere dalla concentrazione di Cl-

fino a tendere ad un valore simile a quello osservato per cristalli di HbA. Un

coefficiente di Hill inferiore all'unità potrebbe essere spiegato con una maggiore

inequivalenza αβ rispetto all'emoglobina A oppure con una minore cooperatività.

In base ai dati ottenuti sulle tre diverse forme di emoglobina è possibile trarre

considerazioni di carattere più generale: emoglobine diverse in stato T presenti in

cristalli aventi lo stesso gruppo spaziale e lo stesso impacchettamento presentano

proprietà funzionali molto diverse. E' presumibile quindi, che il reticolo cristallino

non congeli la proteina in una conformazione ma selezioni e stabilizzi una delle

conformazioni presenti in soluzione.

I risultati di questo lavoro sono oggetto di recenti pubblicazioni: Mozzarelli et al.,

1991; Rivetti et al., 1993a; Rivetti et al., 1993b.

5. BIBLIOGRAFIA

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Appendice 93

APPENDICE 1

Coefficienti di estinzione ε espressi in: (OD mM-1 cm-1) per alcuni derivati dell'HbA.

Coefficienti di Estinzione di Hb

λ (nm) €ε λ (nm) €ε λ (nm) €ε

1000 0.08 759.5 (max) 0.43 540 10.28

980 0.12 740 0.38 528.5(metHb) 7.71

960 0.16 736 (min) 0.37 522 (HbO2) 6.42

940 0.20 720 0.38 520 6.27

920 0.22 700 0.54 506.5 (HbO2) 4.81

910 (max) 0.23 680 0.74 500 4.09

900 0.22 660 0.80 480 3.31

880 0.21 640 0.91 478 (min) 3.31

860 0.21 620 1.23 460 5.15

850 (min) 0.20 600 (metHb) 3.20 450 14.5

840 0.21 586 (HbO2) 7.23 440 70.0

820 0.21 579 (HbCO) 8.86 431 (max) 140.0

815 (HbO2) 0.22 569 (HbO2) 11.27 420 109.5

800 0.23 561.5 (HbCO) 12.54 410 80.0

780 0.28 555 (max) 13.04 400 59.0

760 0.43 548.5 (HbO2) 12.40 390 50.5

547.5 (HbCO) 12.37

In corsivo sono indicati i punti isosbestici ed in grassetto i massimi di assorbimento.

Appendice 94

Coefficienti di Estinzione di HbO2


1000 0.26 690 (min) 0.07 525.3(metHb) 7.72

980 0.28 680 0.08 522 (Hb) 6.42

960 0.30 660 0.08 520 5.88

940 0.30 640 0.11 510 (min) 4.76

930 (max) 0.31 620 0.23 506.5 (Hb) 4.81

920 0.31 600 0.80 500 5.05

900 0.30 592 (HbCO) 2.13 497 (HbCO) 5.16

880 0.29 590.7(metHb) 3.62 480 6.84

860 0.27 586 (Hb) 7.23 472.4(metHb) 8.01

840 0.26 580 13.73 460 11.26

820 0.23 577 (max) 15.37 450 17.00

815 (Hb) 0.22 572.5 (HbCO) 13.50 440 26.50

800 0.20 569 (Hb) 11.27 430 60.0

780 0.18 560 (min) 8.47 420 118.0

760 0.15 549.3 (HbCO) 12.06 415 (max) 131.0

740 0.11 548 (Hb) 12.46 410 118.5

720 0.09 542 (max) 14.37 400 67.5

700 0.08 540 (HbCO) 14.27 390 40.0


Coefficienti di Estinzione di HbCO


700 0.02 568.5 (max) 14.31 496 (min) 5.14

680 0.04 561.5 (Hb) 12.54 480 5.54

660 0.07 560 12.08 460 7.59

640 0.15 555 (min) 11.33 450 10.0

620 0.33 549.3 (HbO2) 12.06 440 17.5

600 1.04 547.5 (Hb) 12.37 430 60.0

585.5(metHb) 3.79 540 (HbO2) 14.27 420 (max) 192.0

580 8.02 539 (max) 14.36 410 77.5

579 (Hb) 8.86 519.7(metHb) 8.02 400 40.0

572.5 (HbO2) 13.50 497 (HbO2) 5.16 390 21.0

Appendice 95


Coefficienti di Estinzione di metHb (pH 7.0 - 7.4)


1000 0.68 700 0.15 525.3 (HbO2) 7.62

980 0.67 690 (min) 0.13 520 7.99

960 0.66 680 0.18 519.7 (HbCO) 8.02

940 0.64 660 0.81 500 (max) 9.04

920 0.61 640 3.18 480 8.07

900 0.57 630 (max) 3.70 476 (min) 8.04

880 0.52 610 3.08 460 9.03

860 0.49 608 (min) 3.06 450 9.95

840 0.45 600 (Hb) 3.10 440 15.5

820 0.40 590.7 (HbO2) 3.62 430 31.5

800 0.36 585.5 (HbCO) 3.79 420 63.5

780 0.28 580 4.12 410 147.5

760 0.24 560 4.40 406 (max) 162.0

740 0.20 540 7.14 400 131.5

720 0.17 528.5 (Hb) 7.31 390 84.5


Coefficienti di Estinzione di metHbCN


710 0.01 560 9.40 450 22.0

700 0.03 540 (max) 10.99 440 37.0

680 0.10 520 8.34 430 83.0

660 0.20 504 (min) 6.83 421 (max) 122.5

640 0.35 500 6.91 420 122.0

620 0.82 480 9.03 410 88.5

600 2.62 460 15.30 400 59.0

580 6.04 390 44.5


Appendice 96

APPENDICE 2

Tensione di vapore dell'acqua a diverse temperature.

T °C torr T °C torr

0 4.579 17 14.530

5 6.543 18 15.477

10 9.209 19 16.477

11 9.844 20 17.535

12 10.518 21 18.650

13 11.231 22 19.827

14 11.287 23 21.068

15 12.788 24 22.377

16 13.634 25 23.766

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R S -F E U S T - biochimica.unipr.itbiochimica.unipr.it/home/tesi/att/acdb.testo.pdf · cristalli di emoglobina in cui le forze reticolari impediscono le variazioni ... Teichmann,