Raccomandazioni per la diagnosi neonatale delle emoglobinopatie

116 biochimica clinica, 2015, vol. 39, n. 2

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PREMESSALa crescente necessità di definire lo stato genetico alla

nascita per accertare la presenza di eventualiemoglobinopatie ha portato alla stesura di questeraccomandazioni, che nascono a completamento di quelleprodotte dalla Società Italiana Talassemie edEmoglobinopatie (SITE) per la diagnosi di 1° livello deidifetti dell’emoglobina in soggetti in età adulta1. Alla stesuradi questo documento hanno partecipato appartenenti alla

SITE, alla SIBioC e all’Associazione Italiana di Ematologiae Oncologia Pediatrica (AIEOP), con l’intento diarmonizzare e condividere i percorsi di laboratorio per ladiagnosi neonatale delle emoglobinopatie.

La diagnosi dei difetti dei geni globinici o, come puòaccadere nella maggior parte dei casi, l’accertamento dellostato fisiologico è compito che coinvolge e impegnaprevalentemente il laboratorio. Nella definizionedell’assetto genetico dell’emoglobina il laboratorio svolge,infatti, un ruolo centrale e insostituibile e ciò vale ancor più

Raccomandazioni per la diagnosi neonatale delle emoglobinopatie

Giovanni Ivaldi1, Giuseppina Barberio2, Vincenzo Caruso3, Anna Caldini4, Andrea Mosca5, Giovanna Russo6, DanielaLeone1, Rita Mancini7, Martina Zaninotto8, Francesco A. Zanolli9, Piero C. Giordano101Laboratorio di Genetica Umana, Ospedali Galliera, Genova - Società Italiana Talassemie ed Emoglobinopatie (SITE)2UO Medicina di Laboratorio, Azienda ULSS n.9, Treviso - SITE3UO Talassemia, Azienda Ospedaliera Garibaldi, Catania - SITE4Laboratorio Generale, Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi, Firenze - SIBioC5Centro Interdipartimentale per la Riferibilità Metrologica di Laboratorio (CIRME) e Dipartimento di Fisiopatologia medico-chirurgica e dei trapianti, Università degli Studi di Milano - SIBioC6Dipartimento di Scienze Mediche e Pediatriche, Università di Catania, Catania - Associazione Italiana di Ematologia eOncologia Pediatrica (AIEOP)7Laboratorio Centralizzato, Azienda Ospedaliero–Universitaria Policlinico S.Orsola-Malpighi, Bologna8Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera-Università di Padova, Padova9Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, A.O. Santa Maria degli Angeli, Pordenone10Hemoglobinopathies Laboratory, Human and Clinical Genetics, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands

ABSTRACTRecommendations for the diagnosis of hemoglobinopathies at birth. The laboratory plays an important role in thediagnosis of hemoglobin defects at any age. At the time of birth its role is particularly significant, considering thatfrequently the newborn has not clinical signs, even when he is carrying thalassemia or other structural defects ofhemoglobin. The diagnostic precocity in the affected newborn will help to predict risk, determine appropriate prophylaxisand prevent complications. It may also be helpful for programming treatment and parent control, and planning aprevention for a future pregnancy. In Italy, there have been important demographic and social health changes over thepast decade that have suggested the implementation of hemoglobinopathy screening at birth. In addition, the need toknow the hemoglobin pattern of the cord blood for possible biobank storage should be regarded as another relevanttarget. Therefore, it seems timely to define pathways, scope and limits of a correct thalassemia diagnosis at birth throughspecific recommendations. The Italian Society of Thalassemias and Haemoglobinopathies (SITE) had already publishedrecommendations for first level thalassemia diagnosis, which were primarily focused on preconceptional prevention. Thisnew document provides essential guidance about laboratory methods, pre- and post-analytical information flows andabout the most appropriate approach to be followed.

Corrispondenza a: Giovanni Ivaldi, Laboratorio di Genetica Umana, Ospedali Galliera, Via A. Volta 6, 16128 Genova. Tel. 0105634379,Fax 01057481261, E-mail [email protected]: 14.12.2014 Accettato: 17.12.2014

1Ivaldi G, Barberio G. Raccomandazioni per la diagnostica di primo livello delle emoglobinopatie della Società Italiana Talassemie ed Emoglobinopatie.Collana Scientifica SITE N.1, 2012. http://www.site-italia.org.

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alla nascita. Infatti, il neonato, anche quando risultaportatore di difetti talassemici o strutturali o compostieterozigoti dell’emoglobina, nella maggior parte dei casinon presenta ancora evidenti segni clinici. La precocitàdella diagnosi nel neonato affetto può permettere in molticasi di prevedere rischi, stabilire adeguate profilassi,prevenire complicanze, programmare controlli e terapie eper i genitori pianificare un’eventuale prevenzione primarianella prospettiva di una prossima gravidanza. INTRODUZIONE

L’identificazione di soggetti a rischio per difetti dei geniglobinici rappresenta uno degli obiettivi dei piani diprevenzione nelle aree tropicali, subtropicali emediterranee o comunque nelle popolazioni con maggiorincidenza di emoglobinopatie (1-3). Da alcuni anni sonostati sviluppati programmi di screening neonatali (universalio mirati), in particolare in Paesi che originariamente nonpresentavano le condizioni per un’elevata frequenza didifetti emoglobinici, ma che avevano avuto nel passatointensi rapporti e scambi con le loro colonie in Africa e inAsia. Molti di questi Paesi, in tempi più recenti, sono statianche interessati da nuovi flussi migratori di milioni disoggetti provenienti dalle aree ad alta prevalenza diemoglobinopatie (β-talassemie e comuni variantidell’emoglobina clinicamente significative, quali HbS, HbCe HbE) (4-7).

In Italia la prevenzione dei difetti dell’emoglobina hainteressato inizialmente le popolazioni delle regionimeridionali, insulari e del delta del fiume Po,conseguentemente alla presenza della malaria che hafunestato per secoli questi territori, prima che venisseestirpata definitivamente alla fine della II guerra mondialedai piani di bonifica (8). A partire dalla metà del secoloscorso il processo di industrializzazione delle regionisettentrionali e la successiva migrazione interna dal Sudsoprattutto verso Ovest, ha poi fatto sì che programmi diprevenzione della β-talassemia venissero incentivati anchenelle regioni settentrionali (9). Sensibilizzazione in etàscolare o in epoca preconcezionale e prevenzione nelleprime settimane di gravidanza sono stati e rimangonotuttora gli obiettivi di molti centri e laboratori su tutto ilterritorio nazionale, in alcuni casi con veri e propriprogrammi di screening (10). Tale strategia di prevenzionedella β-talassemia o delle emoglobinopatie in genere hasempre riguardato il soggetto giovane-adulto e non si èmai rivolta al neonato con screening mirati.

Nell’ultimo decennio, l’Italia ha conosciuto cambiamentidemografici e socio-sanitari che hanno suggerito, in alcunerealtà, uno screening neonatale delle emoglobinopatie (11,12). Inoltre, l’esigenza di dover conoscere l’assettoemoglobinico del sangue cordonale in vista di unapossibile conservazione nelle banche dedicate, siaggiunge ad altri obiettivi diagnostici rendendo urgente eimportante definire i modi, gli ambiti e i limiti di una correttadiagnosi neonatale delle emoglobinopatie attraversospecifiche raccomandazioni. Come è accaduto con leraccomandazioni per la diagnostica delle emoglobinopatie

di 1° livello pubblicate dalla SITE (13), prevalentementeorientate alla prevenzione in epoca preconcezionale,anche queste raccomandazioni mirano a offrire indicazioniessenziali sui metodi di laboratorio, sui flussi diinformazioni pre- e post-analitici e sulle azioni più efficaci eappropriate. Da sottolineare anche i corretti rapporti tra idiversi livelli diagnostici e la clinica, alla luce delleesperienze maturate e delle evidenze scientifiche riportatein letteratura (14).

Queste raccomandazioni per la diagnostica neonatalenon entrano nel merito di eventuali decisioni prese in ambitiregionali, territoriali o locali, che potrebbero suggerire, o alcontrario ritenere non appropriato, uno screening ol’esame stesso per le emoglobinopatie alla nascita.

Le diverse finalità con cui si eseguono gli esami allanascita comportano livelli di approfondimento analitico elimiti decisionali distinti; pertanto, oltre agli aspetti di 1°livello, questo documento accenna a possibili esami di 2°livello, biochimici o molecolari, prevalentemente eseguiti inlaboratori specialistici. Questo documento vuole inoltreribadire e dimostrare che la diagnostica neonatale, comequella in età adulta, deve poter sempre fare riferimento aessenziali informazioni anamnestiche sul soggetto inesame e la sua famiglia, che consentano dicontestualizzare e ottimizzare i diversi percorsimetodologici.APPROPRIATEZZA DELLA RICHIESTA EASPETTI PREANALITICI

La decisione di procedere a una indagine geneticaalla nascita finalizzata alla ricerca di difettidell’emoglobina può essere presa in vari ambiti e daspecialisti diversi (neonatologo, pediatra, ginecologo,ematologo, genetista) e l’appropriatezza della richiestapuò nascere proprio dalla collaborazione fattiva tra lospecialista di laboratorio e il clinico. Prima di procedereall’esame di laboratorio è quindi importante definire ilcontesto nel quale si colloca la richiesta, evidenziandonele eventuali controindicazioni e le non conformità delcampione da esaminare. Appare anche importante chealmeno uno dei genitori sia informato sugli obiettivi e suilimiti di un esame eseguito così precocemente, nonchésui tempi di risposta conseguenti ai percorsi diagnostici,che potranno variare da caso a caso. E’ opportuno poiche l’informativa si traduca in un consenso firmato dauno o entrambi i genitori, che il clinico prescrittore e/oconsulente dovrà acquisire e condividere con illaboratorio.

Indicazioni per gli esami delle emoglobinopatiealla nascitaScreening delle emoglobinopatie alla nascita peranemia falciforme e altre condizioni assimilabili

La definizione di screening riportata nelleraccomandazioni AIEOP per la gestione della malattiadrepanocitica in età pediatrica in Italia recita: “Lo



screening costituisce un servizio di pubblica sanità nelcontesto del quale vengono sistematicamente applicati auna popolazione definita un test o un’indagine. Obiettivodello screening è identificare individui che sianosufficientemente a rischio per una specifica malattia,così da giustificarne i successivi controlli e trattamenti”(15). Tale definizione contiene le indicazioni e i principiespressi nel documento prodotto dall’OMS nel 1968(16), successivamente aggiornato nel 2008 (17), e ponele condizioni per finalizzare correttamente ogni propostadi screening.

Uno screening neonatale per le emoglobinopatie,così come da definizione, acquista significato nei varicontesti solamente quando è orientato a identificareindividui con anemia falciforme (“sickle cell disease”,SCD) (18). Le indagini possono essere estese anche atutti i bambini sotto l’anno di età o comunque nonesaminati alla nascita (19). È stato riconosciuto chel’identificazione precoce della SCD, nelle sue diverseforme, ne riduce la mortalità e la morbilità (20), cosìcome la conoscenza precoce dello stato di β-talassemiamajor può essere utile per programmare la gestioneclinica del piccolo paziente.

In Italia sono note tre esperienze di screeningprevalentemente orientate all’accertamento della SCD,in regioni del Nord: Friuli Venezia Giulia, Modena eFerrara (21-23). In queste realtà socio-sanitarie è statadimostrata la necessità e la conseguente efficacia discreening universali o mirati, conseguenti aicambiamenti della popolazione, condotti alla nascita. Ilfenomeno immigratorio, quando è costituito da soggettiprovenienti da aree a elevata incidenza diemoglobinopatie (HbS in particolare) e con una scarsaconoscenza degli aspetti della prevenzione in epocapreconcezionale, può determinare la nascita di soggettiportatori e di malati in misura crescente. Occorre ancheconsiderare l’alto numero di gravidanze, soprattutto indonne africane, più che doppio rispetto a quello delledonne italiane (24), nonché la consanguineità nel caso digravidanze in donne mussulmane.

In Europa i Paesi a più alta prevalenza stimata diconcepiti con SCD (>0,2/1000) sono Gran Bretagna,Olanda, Belgio, Francia, Portogallo, Grecia, Albania eCipro, e in questi Paesi vengono attuati da diversi annipercorsi specifici di prevenzione (1). Esperienze discreening sono state segnalate anche in altri Paesieuropei come la Spagna (25). In Africa e nel MedioOriente, dove l’incidenza di SCD è prevalente rispetto alresto del mondo, gli screening stentano a trovareattuazione per motivi socio-politici e culturali (26-28).

Per i criteri e le motivazioni di uno screeningfinalizzato alla SCD, che può essere mirato o universale,si rimanda a quanto riportato nelle raccomandazioniAIEOP (15). Le indagini eseguite nel corso di talescreening possono consentire di osservare la presenzadi altri difetti emoglobinici non meglio definibili con imetodi di base utilizzati e che potranno suggerireulteriori e specifiche indagini biochimiche o molecolarisuccessivamente illustrate.

Esame su sangue destinato alla conservazionenelle banche di sangue cordonale

La donazione autologa (dedicata) o allogenica(solidale) del sangue cordonale del neonato, e quindi lasua crioconservazione nelle banche pubbliche [a oggi sicontano in Italia 19 banche collegate a 319 punti nascita(29)], deve rispondere a una serie di condizioni tra cuil’assenza di difetti genetici importanti dell’emoglobina.Pertanto, le unità di sangue cordonale nel percorso diidoneità vengono in tal senso testate come previsto daglistandard IBMDR (“Italian Bone Marrow Donor Registry”)(30), dalle norme internazionali della NetCord-FACT(“Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy”)(31), dalla rete delle Banche del Sangue di CordoneOmbelicale Italiane (ITCBN, “Italian Cord BloodNetwork”) e dalle linee guida per l’accreditamento dellebanche di sangue da cordonale ombelicale (29).

La banca che gestisce il sangue cordonale è tenutaa promuovere esami per la ricerca di emoglobinopatiealla ricezione (preferibilmente) o al rilascio dell’unità, peraccertare in primo luogo la presenza di HbS e dei suoicomposti con difetti β-talassemici o varianti dei geniβ globinici clinicamente significativi. Deve inoltre essereaccertata la presenza di β-talassemie allo statoomozigote o di composti β-talassemici. Tutte questecondizioni, se presenti, rendono l’unità di sangueraccolta non eleggibile per il trapianto. Altri difetti allostato omozigote o eterozigote evidenziati dall’esame discreening dovranno comunque essere documentati. E’prevista la possibilità di procedere a tali accertamentianche su sangue periferico del neonato, come indicatodai più recenti standard internazionali (31). Esami in neonati non diagnosticati in epoca fetalecon genitori entrambi portatori

In Italia gli esami specifici per accertare la condizionegenetica della coppia nei riguardi delle emoglobinopatiesono eseguiti prevalentemente in epocapreconcezionale. Le linee guida sulla gravidanzafisiologica dell’Istituto Superiore di Sanità attribuisconovalore ai favorevoli rapporti benefici/rischi ebenefici/costi dello screening universale in aree conelevata prevalenza di emoglobinopatie, come quella delbacino del Mediterraneo (32). Pertanto è raccomandatoche in epoca preconcezionale e/o in gravidanza(idealmente entro 10 settimane) siano assicurati“counselling” ed esami in grado di identificare le portatricidi emoglobinopatie (anemia falciforme e talassemia) atutte le donne e che, qualora la donna sia identificatacome portatrice di un’emoglobinopatia, “counselling” edesami specifici debbano essere tempestivamente offertianche all’uomo (32). Talvolta però accade che i duegenitori giungano a conoscere il proprio stato di portatoridi un tratto β-talassemico o di difetti clinicamentesignificativi in un periodo avanzato della gravidanza,oltre il tempo utile per un’eventuale diagnosi prenatale.Sempre più frequentemente ci sono anche genitori che,pur sapendo da prima della gravidanza di poter generare

un figlio affetto, scelgono con diverse motivazioni di nonsottoporre il feto a indagini per determinarne l’assettogenetico. Può anche accadere che la madre sia aconoscenza della propria condizione di portatrice manon sia nota quella del padre, non più presente; in talicircostanze l’esame alla nascita può risolvere lo stato diansia della madre durante la gravidanza, escludendo inprimo luogo una condizione di malattia nel neonato. Nelcaso in cui il neonato dovesse risultare portatore diun’emoglobinopatia allo stato omozigote o di uncomposto eterozigote, l’esame alla nascita rappresentasempre un elemento di conoscenza utile alla gestioneprecoce del suo stato di salute.Esami a conferma della diagnosi prodotta inepoca fetale

Il risultato degli esami molecolari eseguiti su DNAestratto da villi coriali o da cellule del liquido amniotico inepoca fetale può essere confermato alla nascita, nellamaggior parte dei casi, da esami specifici di 1° livello.Ciò è possibile grazie alla conoscenza dell’assettogenetico conseguente alla diagnosi prenatale. Tuttavia,in alcuni casi i margini di incertezza degli esamibiochimici alla nascita possono suggerire di eseguiresubito approfondimenti di 2° livello o essere dilazionatitra i 6 e i 12 mesi.Esami in neonati con anemia marcata

Alla nascita il neonato può presentare uno stato dianemia, talvolta associata a ittero. Indagini specifiche perdeterminare l’assetto emoglobinico possono essererichieste innanzi tutto per stabilire l’eventuale passaggiodi sangue dal feto alla madre durante la gravidanza. Taleevento non è mai facile da prevedere e quantificare epotrà richiedere l’esame del sangue materno. Uneventuale difetto genetico dell’emoglobina del neonatopotrebbe essere un marcatore utile di tale passaggio. Lapresenza di difetti globinici che rendono instabili le cateneα o le catene γ possono produrre anemia emolitica nelneonato, mentre le varianti instabili delle catene β, nonessendo ancora sufficientemente espresse, raramenteproducono emolisi alla nascita (33-35). Contrariamente,delezioni che eliminano più geni del “cluster” β globinicopossono provocare nel feto anemie emoliticheabbastanza severe da richiedere trasfusioni intrauterine(36). La presenza di rare anemie nel neonato possonoessere accertate mediante esami specifici per leemoglobinopatie dopo aver escluso comunque altrecause di emolisi più frequenti, come deficit enzimatici esferocitosi ereditaria. Inoltre, l’osservazione di itteromarcato, con elevate concentrazioni plasmatiche dibilirubina non coniugata, può suggerire la ricerca dimutazioni del gene UGT1A1. Le variazioni di tale genesono state riconosciute essere causa di modificazionifenotipiche significative in presenza di malattie emoliticheereditarie e in molte emoglobinopatie clinicamenterilevanti anche allo stato eterozigote (37, 38).

Esami in nati da genitori portatori di α-talassemiaL’esame alla nascita può essere consigliato nel caso

in cui i genitori siano portatori di difetti α-talassemici, chepotrebbero determinare nel neonato una condizione diemoglobinosi H (HbH) (39); infatti, un ritardo diagnosticoin soggetti provenienti da zone ad alta frequenza di α0−talassemia (--/αα) può comportare la mancata diagnosidi coppie a rischio per HbH (--/-α) o per idrope fetale (--/--). Per tali coppie in Cina e in altri paesi del Sud EstAsiatico è prevista la diagnosi prenatale (40). E’ quindibuona norma non sottovalutare il fatto che la presenza diHb Bart alla nascita può rappresentare una sicuraindicazione di α-talassemia nel neonato a termine,indicazione disponibile a basso costo e certamente utilese opportunamente segnalata. Alla luce di taliconsiderazioni, la richiesta alla nascita di esamimolecolari specifici per i difetti α talassemici può essereconsiderata appropriata solo quando, conoscendol’assetto genetico dei genitori o in presenza di valorielevati di Hb Bart (>10%), esiste la possibilità cheun’emoglobinosi H possa essere stata trasmessa.Raccomandazione 1

L’esame per le emoglobinopatie alla nascita èappropriato quando sussistono le motivazioniprecedentemente riportate e, in particolare, in tuttele situazioni per le quali è dimostrato che l’esamepuò produrre un risultato utile alla gestione clinicadel neonato o determinare un effetto psicologicopositivo verso i genitori. Richieste inappropriate di esami per leemoglobinopatie alla nascita

Il particolare assetto emoglobinico del neonato,rilevato dai sistemi separativi disponibili e normalmentein uso, non possiede caratteristiche tali da poterconsentire le stesse conclusioni diagnostichedell’assetto emoglobinico riscontrabile nell’adulto. Ciòdipende sostanzialmente dall’assenza di catene δglobiniche e dalla prevalenza di emoglobina fetale (HbF)alla nascita. La totale assenza di catene δ alla nascitanon consente di quantificare l’HbA2, rendendo quindiimpossibile definire lo stato di portatore di β-talassemiacon esami di 1° livello, secondo i canoni previsti dallelinee guida e dalle raccomandazioni per i soggetti in etàadulta (13, 41). Con analoghe motivazioni, non potràessere ipotizzata la presenza di Hb Lepore, di varianti δo di difetti δ-β talassemici.

Alternativamente, la diagnosi di portatore diβ-talassemia potrà essere sospettata dalla ridottapresenza di HbA rispetto all’età fetale. Quindi, laquantificazione relativa di HbA alla nascita puòrappresentare un valido elemento diagnosticopresuntivo. Tale possibilità sarà trattata esaustivamentein seguito per ipotizzare in particolare la presenza diβ-talassemia alla nascita senza dover ricorrere sempreall’analisi del DNA.

L’analisi alla nascita finalizzata alla sola ricerca



dell’α-talassemia (α° o α+ talassemia) non è giustificatase non dal fatto che l’informazione passata al medicocurante può evitare inutili e ripetute terapie marzialiprima che sia finalmente presa in considerazione lapossibile presenza di un’α-talassemia. Tuttavia, pursapendo che la quantificazione di Hb Bart (tra 2% e10%) indica con buona probabilità una presenzagenerica di α-talassemia, la conferma del difettospecifico richiede sempre l’analisi dei geni α globinicicon esami molecolari, come nell’individuo adulto (42).

Occorre ricordare che, pur non potendone supporre lapresenza, non è rilevante accertare o definire alla nascitala presenza di una variante delle catene δ o di unaδ-talassemia. Anche le persistenze ereditarie di HbF(HPFH puntiformi) difficilmente possono esseresospettate alla nascita con gli esami di 1° livello, mentrequelle da delezione, che in realtà sono delle vere e proprieδ-β-talassemie, possono essere presunte alla nascita peri ridotti valori di HbA. La presenza di questi difetti allo statoeterozigote, così come quella delle δ-β-talassemiepropriamente dette, non è comunque distinguibile da unaclassica β-talassemia eterozigote se non attraversol’analisi, anche di 1° livello, dei genitori. Pertanto, se non èurgente o clinicamente motivato, in molti casi è opportunodifferire l’esame di 1° livello per le emoglobinopatie oltre 6-12 mesi d’età, quando potrà essere valutato l’assettoemoglobinico in condizioni più favorevoli, con lo “switch”dell’HbF fisiologicamente completato.Raccomandazione 2

Il laboratorio è tenuto a valutare l’appropriatezzae segnalare, quando sussistono, condizioni o quesitinon appropriati nella richiesta di esami alla nascita,suggerendo eventualmente indagini specifiche daeseguire a distanza di tempo o, in alternativa, suigenitori (se non già eseguite in precedenza).

Informazioni pre-test ai genitori e sul neonato econsenso informato

Gli esami di 1° e 2° livello per le emoglobinopatie, inquanto genetici, prevedono un’adeguata e specificainformazione sul significato e sui meccanismi ditrasmissione dei difetti che vengono analizzati, sugliaspetti associati alla prevenzione di tali difetti, nonché suilimiti analitici delle indagini previste (13). E’ evidente che,nel caso del neonato, queste notizie dovranno esserefornite ai genitori o ad almeno uno dei due. I genitoridovranno firmare il consenso agli esami e all’eventualeconservazione del DNA; con tale atto dichiarano anche diaver compreso il significato delle indagini (43). I genitoridovranno essere informati che il risultato degli esamipotrebbe richiedere ulteriori approfondimenti o chepotrebbe essere utile o necessario estendere l’analisigenetica anche a loro o ad altri membri della famiglia. Unmodello del consenso da acquisire è riportato inAppendice a questo documento.

Un aspetto da sottolineare in vista dell’analisi allanascita per la ricerca di difetti emoglobinici, da

considerare ancor più importante rispetto al significato chetale presupposto ha per la diagnosi in età adulta (13), è laconoscenza del soggetto in esame, vale a direl’acquisizione da parte del laboratorio di alcuneinformazioni utili, minime ma essenziali, all’interpretazionedei risultati, alla conclusione certa o presuntiva e per potercorrettamente rispondere al quesito diagnostico posto(Tabella 1). In particolare, l’età gestazionale alla nascita siè dimostrata utile per poter interpretare più correttamenteil valore relativo di HbA. Infatti, anche in assenza di difettidei geni globinici, nei neonati prematuri (l’OMS definisceprematuro il nato vivo partorito prima della 37a settimanadi gestazione) il valore di HbA risulta sensibilmente ridotto(44). Significative differenze nei valori relativi di HbA sonopresenti comunque anche tra 37a e 42a settimana(periodo definito a termine) (45) e ciò contribuirà a rendereampi gli intervalli di riferimento di HbA, HbF e delleeventuali altre frazioni emoglobiniche, di seguito riportati.

I cambiamenti a livello ematopoietico conseguentialla nascita caratterizzano il momento di passaggio dalperiodo fetale a quello perinatale. Tali cambiamentipossono essere influenzati dalla presenza di difetti deigeni globinici, ma anche da altri fattori genetici presentinei genitori e quindi potenzialmente trasmessi al feto.L’eventuale conoscenza di tali fattori da parte dei genitoridovrebbe essere comunicata durante la gravidanza ocomunque nell’imminenza della nascita.Raccomandazione 3

I genitori devono essere informati sulle finalità ecaratteristiche degli esami eseguiti dal laboratorio,dei limiti di tali esami e dell’eventualità di doverproseguire le indagini con esami molecolari. Siconsiglia in tal senso di acquisire il consenso dientrambi i genitori quando possibile. E’raccomandata l’acquisizione di notizie sul neonatodai genitori o dal clinico che richiede l’esame.

Caratteristiche del campione ematico e del prelievoPossono essere previste diverse tipologie di prelievo.

L’esame dei risultati e delle esperienze in molti laboratori



Tabella 1Notizie essenziali su neonato e genitoriEtà gestazionale in settimaneGenerePresenza di ittero neonatale GemellaritàEventuali trasfusioni alla nascita o comunque prima del prelievoOrigini/etnia del ceppo familiare di entrambi i genitoriEsami per le emoglobinopatie eseguiti dai genitoriConsanguineità dei genitoriQuesito diagnostico che ha prodotto la richiesta di esami alla nascita

suggerisce di ridurre al massimo le variabili associate a taliaspetti per un’accuratezza maggiore dei risultati analitici. Campione di sangue cordonale

Deve essere prelevato correttamente onde evitarecontaminazione con il sangue materno, così comerichiamato anche dalle norme internazionali (31). Laraccolta deve avvenire in EDTA-K3 o EDTA-K2 comeanticoagulante in quanto tale molecola è ritenuta ottimaleper gli esami emocromocitometrici, cromatografici edelettroforetici, ma soprattutto nel caso in cui si utilizzi lastessa provetta anche per l’estrazione del DNA destinatoall’analisi molecolare. Il sangue prelevato in litio eparinapuò essere considerato di seconda scelta, risultandosufficientemente idoneo solo per alcuni sistemicromatografici. Il sangue deve essere preferibilmente nontrattato con agenti conservanti o congelato.Campione di sangue venoso o capillare

Deve essere prelevato entro il 3° giorno dalla nascitaal fine di poter riferire correttamente i valori dellaquantificazione delle frazioni emoglobiniche agli intervallidi riferimento che, normalmente, fanno riferimento allanascita. La raccolta deve avvenire in EDTA-K3 o EDTA-K2come anticoagulante per le motivazioni illustrate inprecedenza. Il volume di sangue previsto è di almeno 1mL; volumi minori (400 mL) potranno essere sufficientinel caso in cui si prevede di eseguire solamente l’esamedell’assetto emoglobinico.

Il sangue venoso prelevato entro il 3° giorno dallanascita e il sangue cordonale non differisconosignificativamente tra loro dal punto di vista qualitativo equantitativo in merito alle frazioni emoglobiniche separate.

Il campione destinato principalmente all’esamedell’assetto emoglobinico deve essere analizzato entro 6giorni dal prelievo, conservato a 4 °C e non deve aversubito congelamento. Nel caso in cui si debba procederea esami molecolari, il sangue intero deve essere invececonservato congelato (fino a 3 mesi a -20 °C o per periodisuperiori a -80 °C) in attesa dell’estrazione del DNA.Campione proveniente da sangue essiccato dopoprelievo dal tallone (“Guthrie card”)

Occorre prevedere una conservazione, in ambientenon umido, a 4 °C del cartoncino destinato a esserespedito o non esaminato entro 24 ore. Il campione eluitodal cartoncino secondo i metodi previsti dalle rispettivetecniche di separazione deve essere esaminato entro 1ora dalla completa eluzione.

Nel caso sia necessario procedere a esame diconferma mediante test di falcizzazione il sangue eluitoda cartoncino è lisato e quindi non idoneo. Perprocedere ad altri test separativi, il sangue eluito dacartoncino non presenta caratteristiche di conservazioneottimali a causa di un più rapido invecchiamento.Dovendo procedere a esami molecolari, la quantità dimateriale ematico così prodotto dal quale estrarre il DNA

potrebbe risultare insufficiente. In generale, nel caso di esami di conferma, è

opportuno disporre di un campione di sangue venoso inEDTA di almeno 1 mL.Raccomandazione 4

E’ raccomandato l’utilizzo di sangue cordonale operiferico prelevato entro il 3° giorno dalla nascita,conservato a 4 °C e processato per gli esami di 1°livello entro un periodo massimo di 6 giorni. Sisconsiglia l’uso di sangue congelato per ladefinizione dell’assetto emoglobinico. Per eventualiesami molecolari successivi è possibile conservareil sangue intero anche per più anni a -80 °C.

ASPETTI ANALITICIPercorsi diagnostici alla nascita

Un percorso di laboratorio che consenta di osservareo definire la presenza di difetti dell’emoglobina allanascita può essere applicato in tutti i laboratori chenormalmente si occupano della diagnosi delleemoglobinopatie in età adulta, avendo però ben presenteche i criteri applicati per l’interpretazione dei risultati,nonché le conclusioni diagnostiche, differiscono in modosignificativo. Tutto ciò dipende dalla finalità dell’esamealla nascita, dai valori di riferimento che presentanovariabilità molto ampia, dall’urgenza di una conclusionetempestiva e definitiva. Inoltre, qualora tale diagnosticasia estesa a una popolazione numerosa di soggetti, comenel caso degli screening, occorre considerare anche icosti complessivi dell’intero percorso.

Al centro del percorso diagnostico alla nascita si deveporre, come per l’adulto, la valutazione dell’assettoemoglobinico dal punto di vista qualitativo e quantitativo,mentre l’assetto marziale e gli indici emocromocitometricialla nascita ricoprono un ruolo marginale (46).

Nella Figura 1 è riportato il flusso degli eventi valido intutti i casi che richiedano una diagnosi di emoglobinopatiaalla nascita, mentre nella Figura 2 sono riportati i criteridiagnostici per la conferma o la caratterizzazione nei casinon risolti con gli esami di 1° livello. L’urgenza,l’approfondimento e le conseguenze di questa diagnosiprecoce dipenderà dai quesiti specifici posti al laboratoriodai clinici prescrittori con i quali dovrà essere costruito unrapporto di fattiva collaborazione per un approcciodiagnostico appropriato nell’interesse del paziente.

Come per l’adulto gli esami molecolari potrannoessere eseguiti presso i centri di riferimento a cui fannocapo normalmente i laboratori di 1° livello, secondoaccordi consolidati o che potranno essere stabiliti di voltain volta. I percorsi applicati o concordati devono entrare afar parte dei sistemi di certificazione delle singolestrutture di laboratorio.Metodi di identificazione delle emoglobinopatiealla nascita

Quelli dell’emoglobina sono tra i pochi difetti geneticiper i quali l’individuazione del portatore eterozigote è



possibile, talvolta preferibile o vantaggiosa dal punto divista economico e pratico, mediante esami biochimici edematologici. Ciò vale nell’individuo adulto, così come nelneonato. Dopo un’identificazione presuntiva alla nascita,la caratterizzazione di questi difetti mediante analisi delDNA è comunque necessaria in molte circostanze, perescludere o confermare particolari assetti emoglobinici ein seguito a quesiti e finalità diagnostiche cheimpongano una conclusione definitiva senza poterrimandare un approfondimento analitico in condizioni più

favorevoli, di solito dopo la completa sostituzione di HbF. 1° livello diagnostico

Assetto emoglobinico. Il percorso analitico che portaalla diagnosi di 1° livello dei difetti emoglobinici alla nascitasi basa principalmente sulla definizione dell’assettoemoglobinico ottenuto con una o più tecniche separative,per una valutazione quali-quantitativa ottimale dellefrazioni emoglobiniche fisiologiche o patologiche. Ai vari



Figura 1 Percorso diagnostico di 1° livello e intermedio per i difetti dell’emoglobina alla nascita. Hb, emoglobina.

Figura 2 Percorso diagnostico di 2° livello per i difetti dell’emoglobina alla nascita sulla base delle informazioni sull’assetto emoglobinico dei genitori.

sistemi analitici commerciali è richiesta una risoluzioneottimale nella separazione quali-quantitativa di HbF e diHbA, anche in considerazione degli elevati valori di HbFtipici del periodo neonatale. Attualmente, HPLC edelettroforesi capillare (CE) sono le metodiche che megliorispondono alle esigenze analitiche per la definizionedell’assetto emoglobinico alla nascita (47-50).Nondimeno, si possono riscontrare alcune differenze nellasensibilità analitica tra metodi separativi simili e ciòpotrebbe contribuire alla variabilità dei risultati e quindiall’ampiezza degli intervalli di riferimento. Non è inveceproponibile oggi l’utilizzo dell’isoelettrofocalizzazione (IEF)per esami isolati o di screening alla nascita o nell’adultoper la diagnostica delle emoglobinopatie, in quantocomplessa e non direttamente quantitativa (51). Riguardoalla più laboriosa tecnica della spettrometria di massa -tandem (MS/MS) non vi sono ancora evidenze sufficientiche possano suggerire un impiego vantaggioso di questometodo nella diagnostica delle emoglobinopatie. Risultatia livello sperimentale non eguagliano comunque laspecificità del sequenziamento del DNA (52-54). Si ritieneinoltre che le esperienze in MS/MS maturate con i difettimetabolici nei programmi di medicina preventivasecondaria attivati su larga scala nei primi giorni di vitanon possano essere considerate direttamente applicabilinella diagnostica delle emoglobinopatie, prevalentementea causa della numerosità e variabilità dei fenotipi,qualitativi e quantitativi noti o ancora da definire, checaratterizzano queste patologie e che sono direttamenteevidenziabili con HPLC o CE (55, 56).

Altri esami. Il test di falcizzazione al metabisolfito disodio (Test di sickling) costituisce ancora oggi, a distanzadi molti anni dalla sua introduzione, la conferma nonmolecolare e riconosciuta, della presenza di HbS allostato eterozigote, omozigote o nei composti (13, 57). Allanascita, l’elevata presenza di HbF e il limitato numero dieritrociti ”postnatali” con HbS possono rendere menoevidente la positività a questo test. Allungando i tempi direazione e utilizzando una soluzione di metabisolfito disodio al 2% sempre fresca o conservata pronta a 4 °C perun tempo massimo di 2 settimane (sigillandoopportunamente la camera di reazione e ponendo ilvetrino a 37 °C, prima della lettura al microscopio), lapresenza di sporadiche “sickle cells” viene rilevata anchein presenza di HbF elevata e quantità di HbS <10%. Unesame di conferma per HbS sovente citato in letteratura èquello di Itano, anche noto come “solubility test” (58).Questo esame è però sconsigliato alla nascita perl’elevata interferenza prodotta da HbF (19). Il test difalcizzazione, se risulta negativo in presenza di unavariante che in HPLC o in elettroforesi si separa inposizione “S”, implica un approfondimento medianteesami di 2° livello nei genitori o nel soggetto stesso (59).

E’ evidente che alla nascita anche le resistenzeosmotiche eritrocitarie, cosi come avviene per l’adulto, macon motivazioni diverse (13), non potranno essereutilizzate, in questo caso prevalentemente per i falsipositivi dovuti alla presenza di HbF elevata.

Raccomandazione 5Per la determinazione quali-quantitativa

dell’assetto emoglobinico sono raccomandati isistemi in HPLC o in CE. Le varianti più comunirilevate dai sistemi separativi in uso devono essereconfermate con un secondo esame anche nonmolecolare, specifico e dedicato.Livello diagnostico intermedio

La possibilità di poter fruire di più metodi biochimicibasati su principi diversi per la diagnosi delle più comunivarianti (HbS, HbC, HbE) configura un livello diagnosticointermedio, che pur non utilizzando metodichemolecolari, porta a conclusioni diagnostiche definitive.Pertanto i numerosi laboratori che si occupano di questadiagnostica di base possono trovare alcune conferme, inalcuni casi soprattutto per le varianti emoglobiniche piùfrequenti, senza dover demandare la conclusione ailaboratori specialistici che eseguono esami geneticimolecolari (2° livello).

Test di conferma non molecolari. L’utilizzo combinatodei due metodi, HPLC e CE, può consentirel’identificazione di alcune varianti allo stato eterozigote(HbE, HbC ed eventualmente HbS in aggiunta al test difalcizzazione), come dimostrato ampiamente per l’adulto(60, 61), senza rendere necessario il ricorso a indaginimolecolari più onerose rispetto agli esami biochimici. Lascelta dei metodi dipende sostanzialmente dalleinformazioni anamnestiche e dai risultati degli esami di1° livello già eseguiti sul sangue cordonale o prelevato alneonato (secondo il diagramma di flusso riportato nellaFigura 1) e che devono essere resi noti al laboratorio di2° livello per lo studio molecolare. 2° livello diagnostico

Esami molecolari: l’analisi del DNA. Il ricorsoall’analisi del DNA rappresenta un evento che può esserepiù frequente alla nascita rispetto a quanto avviene per ladiagnostica delle emoglobinopatie nell’adulto.Principalmente per la variabilità dei parametri diriferimento, emoglobinici, ematologici e biochimicidisponibili per il neonato, si avranno più frequentementeconclusioni diagnostiche presuntive. L’approccio analiticomediante esami molecolari è quindi, nella maggior partedei casi, conseguente a conclusioni diagnostiche di 1°livello che non possono essere considerate certe edefinitive. Le presenti raccomandazioni dedicateprevalentemente alla diagnostica di 1° livello non entranodettagliatamente nel merito dei metodi molecolari propridei laboratori di 2° livello. Di seguito vengono riportaticenni sulle metodiche più comuni e sui loro principalicriteri di utilizzo nella diagnostica.

Come schematizzato nella Figura 2, le decisioni suimetodi da utilizzare per l’analisi molecolare dipendonoanche dalla conoscenza degli eventuali difetti riscontratinei genitori e sul livello di approfondimento diagnostico acui sono stati sottoposti in vista della gravidanza, in epoca



preconcezionale o in occasione di una diagnosi prenatale.Un esame molecolare in “reverse dot blot” (RDB)costituito da un pannello limitato a una ventina dimutazioni β-talassemiche può essere insufficiente (62). Inquesti casi, il sequenziamento nucleotidico diretto delgene β, promotore e poli-A compresi, è il metodo piùopportuno per l’analisi delle emoglobinopatie nellepopolazioni multietniche (63). Altrettanto vale per i geni αnei quali occorre escludere almeno 6 delle più frequentidelezioni mediante la tecnica separativa elettroforetica, disolito su gel di agarosio, del prodotto della reazione acatena polimerasica specifica (Gap-PCR) (64); inalternativa, può essere utilizzato un pannello più esteso didifetti mediante RDB che comprenda sia le delezioni chele mutazioni puntiformi α globiniche più frequenti. Infine,non riscontrando alcun difetto con le suddette metodiche,l’analisi di ampie delezioni dei geni globinici può trovare unvalido contributo dalla “multiplex ligation-dependent probeamplification” (MLPA) (65).

Nell’analisi molecolare dei geni globinici occorreconsiderare che l’approfondimento diagnostico riguardaprevalentemente la ricerca di difetti dei geni β per i fenotipiclinici a essi associati. A tale proposito si parla di vantaggiogenetico nell’avere più copie dello stesso gene; ciò lo sipuò evidenziare nel fatto che difetti sui due soli geni βpossono produrre effetti molto più rilevanti rispetto a quellisui 4 geni α. Le numerose mutazioni del gene β hannogenerato una vasta gamma di difetti in gran parterecessivi, alcuni semidominanti, potenzialmente gravi informa omozigote o emizigote (quando sono combinati conla β-talassemia). Tuttavia, esclusi i difetti talassemici e levarianti comuni (HbS, C, E, D), la gran parte dei difetti notidei geni globinici sono rari e asintomatici. Sono comunquemolti i difetti clinicamente importanti, compreso i composti,che devono essere considerati e che, soprattutto in certepopolazioni, si presentano con particolare frequenza (66).In Europa e in Italia, in particolare, l’immigrazione haprodotto una maggior variabilità genetica, che si èaggiunta a quella autoctona, generando così un’ampiavarietà di difetti globinici, che presentano un’altrettanto

ampia varietà di caratteristiche fenotipiche. La lorocaratterizzazione richiede approcci analitici dedicati edestesi all’analisi di intere sequenze nucleotidiche delleregioni esoniche e introniche di più geni globinici (67).

L’approccio molecolare per l’individuazione e lacaratterizzazione completa delle variazioni dei geniglobinici e/o di geni modificatori, soprattutto in mancanzadi indicatori biochimici, attualmente può essere ancoralaborioso e richiedere tempi d’analisi abbastanza lunghi.Nuove tecnologie, con potenzialità a largo spettro e tempidi risposta minori, si stanno imponendo nel panoramadella diagnostica. E’ il caso della “next generationsequencing” che potrebbe a breve cambiare l’approcciodiagnostico, anche alla nascita, dei difetti emoglobinici edella consulenza genetica (68).Risultati, valori di riferimento e livelli di decisionalitàEsami di 1° livello

Gli esami di 1° livello per le emoglobinopatie susangue cordonale o su sangue venoso prelevato entro iprimi 3 giorni di vita forniscono molte indicazioni econsentono di giungere sovente a conclusioni definitivesenza dover fare ricorso a ulteriori indagini. I risultati,proprio per la variabilità delle condizioni del neonato, manon solo, dovranno essere validati e interpretati tenendoconto dell’intero percorso diagnostico e non unicamentedel dato analitico. Il confine tra risultati fisiologici epatologici non appare univoco e può dipendere danumerosi fattori che ogni laboratorio deve considerare alfine di armonizzare i limiti di riferimento da riportare nelreferto finale. Nella Tabella 2 è riportato un elencoesemplificativo dei fattori di variabilità riconducibili alneonato (cause intrinseche) e di fattori non dipendentidal neonato, che il laboratorio dovrà controllare perridurne gli effetti negativi (cause estrinseche). Tali fattoridi variabilità agiranno in senso positivo oppure negativosul valore relativo di HbA, delle eventuali componentiemoglobiniche patologiche e quindi di HbF. HbA2 allanascita non è di solito quantificabile e comunque è non



Tabella 2 Fattori che possono incidere sulla variabilità dei risultati nella determinazione quantitativa dell’assetto emoglobinico Cause di variabilità intrinseca (riconducibili al neonato)

Età gestazionale alla nascitaPassaggio di o contaminazione con sangue maternoPresenza di emolisi o anemia dovute anche a cause non dipendenti dai geni globinici

Cause di variabilità estrinseca (non riconducibili al neonato)Prelievo in neonato di età >3 giorniCampione ematico conservato per troppo tempo Tecniche di prelievo ed emolisi in vitroModalità di conservazione del campioneAggiunta di conservanti al campione ematico prima dell’esameDiversa risoluzione e quantificazione nell’ambito dei sistemi dedicati HPLC o di elettroforesi capillare

significativa; qualora però risultasse in quantità >0,5% incombinazione con HbA diminuita, accertata l’etàgestazionale, questo potrebbe far sospettare unaβ-talassemia eterozigote. Quando invece HbA risultasseaumentata rispetto ai valori medi di riferimento,occorrerà verificare un’eventuale contaminazione consangue materno.

Nella Tabella 3 sono riportati gli assetti e i limiti diriferimento relativi alla quantificazione delle frazioniemoglobiniche, riscontrabili in presenza dei più frequentie significativi composti genetici riconducibili alla SCD.Simili dati, in relazione ai difetti talassemici e ad alcunevarianti emoglobiniche, sono riportati nelle Tabelle 4 e 5.I valori soglia per ciascuna delle frazioni emoglobinichee i livelli di decisionalità sono posti a confronto con quellirelativi alla condizione fisiologica. I dati riportati sono ilrisultato del confronto di separazioni eseguite sustrumentazioni diverse, ricavati dalla diretta esperienzadegli autori in laboratori diversi e, in parte, ricavati dallaletteratura (69-71). Questi risultati si riferiscono a neonatia termine, nati tra la 37a e la fine della 41a settimana dietà gestazionale (tra 259 e 293 giorni), senza unavalutazione puntuale delle settimane di gestazione.

Per i fattori di variabilità indicati nella Tabella 2, ivalori riportati nelle Tabelle 3-5 risultano compresi inintervalli piuttosto ampi, che potrebbero quindi esseredefiniti di “sicurezza”. Nelle stesse Tabelle sono riportati,oltre ai limiti e agli intervalli dei valori delle singolefrazioni emoglobiniche, anche i livelli di decisionalità. Ilsignificato di tali livelli è in relazione alla possibilità diprodurre conclusioni certe e non presuntive,individuando così anche il grado di complessitàdiagnostica e l’impegno di risorse necessarie alraggiungimento di un risultato definitivo. In particolare,nelle Tabelle 3-5, il livello 1 indica che la conclusione puòessere definitiva con il livello diagnostico di base, mentreil livello 2 indica che la conclusione può ritenersidefinitiva solo mediante l’utilizzo di esami biochimici diconferma o l’analisi del DNA.

Alla luce di tali considerazioni si ritiene che gli esamidi 1° livello, prevalentemente l’assetto emoglobinico,consentano di definire “altamente probabile” lacondizione di assenza di difetti globinici quando laquantità relativa di HbA risulti >22% (69). Con valori diHbA <22% la presenza di una β-talassemia “silente” nonpuò essere esclusa. Questi difetti possono presentarealla nascita HbA “borderline”, così come nell’adultopossono presentare HbA2 “borderline”. In accordo conMantikou et al. (69), i neonati di 40 settimane, con HbA<10%, hanno una probabilità significativamente >50% ditrovarsi nello stato di portatori eterozigoti diβ-talassemia. Con questi presupposti, può esserecomunque sospettata la condizione di portatoreeterozigote di β-talassemia per valori di HbA <12% inneonati a termine oltre la 40a settimana. Per quantoriguarda le varianti, in presenza di HbA e di unaemoglobina anomala pari a ~10% migrante in posizione“S” e un test di falcizzazione positivo, la conclusione saràcerta per HbS allo stato eterozigote. Nel caso poi disospetto di HbC o HbE allo stato eterozigote, la

probabilità di poter concludere per una di queste variantipuò considerarsi >95%, anche perché questi difettiemoglobinici sono molto comuni, rispettivamente, inafricani e asiatici. Nel caso non vi sia corrispondenzaetnica con le presunte HbS, C o E, occorre un adeguatoapprofondimento (72). Nel caso di sospetta HbD, il livellodi specificità diventa <90%. Non vi è in questo caso unparticolare riferimento etnico, se non quello dei Sick delPunjab (India), in quanto la variante sembra riscontrarsiin diversi gruppi etnici (73).

Gli esami di 1° livello su sangue cordonale o susangue periferico alla nascita consentono di poterdescrivere i fenotipi emoglobinici associati alle piùimportanti condizioni cliniche, che richiedono specificheprofilassi e trattamenti clinico-terapeutici (Tabella 6) (15).

Occorre precisare che l’esame molecolare ècomunque indicato per una diagnosi certa quando sisospetta la presenza di un’emoglobinopatia allo statoeterozigote e si debba rispondere a eventuali vincolinormativi, come nel caso di esami destinati allaconservazione nelle banche di sangue cordonale, neicasi in cui non siano disponibili notizie sui genitori ocomunque non si possa rimandare, per motivi diversi, laconclusione diagnostica. Raccomandazione 6

Si raccomanda di valutare i risultati ottenuti congli esami di 1° livello alla luce dei fattori di variabilitàindicati nella Tabella 2 e dei limiti riportati nelleTabelle 3-5. Si raccomanda particolare attenzionenella gestione dei fenotipi emoglobinici che fannoprevedere condizioni cliniche rilevanti, come quelleriportate nella Tabella 6.

Si raccomanda il 2° livello diagnostico ogniqualvolta sia necessaria una diagnosi definitiva inmancanza di adeguate informazioni pre-test equando non risulta possibile procrastinare nel tempola conclusione diagnostica.

Il laboratorio che gestisce il 1° livello diagnosticoè tenuto a consolidare rapporti diretti dicollaborazione con il laboratorio di riferimentoprevisto dalla rete regionale o con altro laboratoriospecialistico nella prospettiva di eventualiapprofondimenti diagnostici. Esami di 2° livello

Come già ampiamente detto, l’esame di 2° livello puòrendersi necessario in determinate circostanze e inseguito alle conclusioni presuntive al termine degli esamidi 1° livello. Anche nel neonato con una diagnosi di 1°livello indicativa della presenza di un doppio difetto acarico dei geni β (HbA assente o <5%), lacaratterizzazione molecolare è imperativa per lanecessaria conferma, per la correlazione genotipo-fenotipo, per la valutazione della prognosi e per iltrattamento, nonché per l’eventuale prevenzioneprimaria retrospettiva.

La correlazione del fenotipo ematologico edemoglobinico con il genotipo molecolare costituisce





Tabella 3Assetti rilevabili in un programma di screening neonatale in condizioni clinicamente significative e più frequenti, assimilabili all’anemiafalciforme. I valori soglia per ciascuna delle frazioni emoglobiniche alla nascita (tutti espressi in percentuale) sono posti a confrontocon la condizione fisiologica e di eterozigosi per HbSQuadro emoglobinico HbF HbA HbS HbC HbD Punjab HbO Arab Hb Lepore HbE Livello di decisionalitàQuadro fisiologico 70-86 14-30 - - - - - - 1 (per HbA >22)HbS/HbS >80 0 <20 - - - - - 2HbS/β° talassemia >80 0 <20 - - - - - 2HbS/β+ talassemia >80 <5 <15 - - - - - 2HbS/HbC >72 0 <13 <15 - - - - 1*HbS/HbD Punjab >74 0 <14 - <12 - - - 2HbS/HbO Arab >74 0 <13 - - <13 - - 2HbS/Hb Lepore >80 0 <20 - - - 0 - 2HbS/δβ talassemia >80 0 <20 - - - - - 2HbS/HbE >75 0 <15 - - - - <10 1*HbS eterozigote >70 >10 <10 - - - - - 1**Se confermato con test diverso e specifico rispetto al primo utilizzato.

Tabella 4Intervalli delle frazioni emoglobiniche (in percentuale) alla nascita in presenza di alcuni difetti talassemici e relativi livelli di decisionalitàQuadro emoglobinico HbF HbA Hb Bart Hb Lepore Livello di decisionalitàQuadro fisiologico 70-86 14-30 <1 - 1 (per HbA >22)α+ talassemia >68 14-28 <4 - 2α° talassemia >62 12-26 <10 - 2HbH >58 12-24 8-18 - 2β+ o β° talassemia eterozigote >82 5-17 - - 1 (per HbA <10)β+/β° o β+/β+ talassemia >95 <5 - - 2β°/β° talassemia 100 0 - - 2Hb Lepore eterozigote >82 6-16 - 0 2Hb Lepore/β+ talassemia >95 <5 - 0 2Hb Lepore/β° talassemia 100 0 - 0 2δβ-talassemia eterozigote >82 8-16 - - 2δβ-talassemia omozigote 100 0 - - 2

Tabella 5Intervalli delle frazioni emoglobiniche (in percentuale) alla nascita in presenza di alcune varianti emoglobiniche più frequenti e relativilivelli di decisionalitàQuadro emoglobinico HbF HbA HbC HbD HbE Hb Hasharon Livello didecisionalitàQuadro fisiologico 70-86 14-30 - - - - 1 (per A >22)HbC eterozigote 66-80 <20 5-14 - - - 1*HbC omozigote >80 0 <20 - - - 2HbC/β+ talassemia >80 <5 <18 - - - 2HbE eterozigote >70 <20 - - <10 - 1*HbE omozigote >85 0 - - <15 - 2HbD eterozigote >65 <20 - <16 - - 2HbD omozigote >75 0 - <25 - - 2Hb Hasharon eterozigote >70 <20 - - - <8 2*Se confermato con test diverso e specifico rispetto al primo utilizzato.

anche nel neonato uno degli aspetti di maggior impegnoe interesse per lo specialista del laboratorio, per il clinicoe il genetista. E’ evidente che l’esame molecolare nonpuò essere inteso come lo studio di tutte le possibilivariazioni dei geni globinici, che a oggi ammontano aoltre 1500, anche se molte di più sono quelleteoricamente possibili e non ancora descritte ocomprese in una vasta gamma di composti emoglobinici(74). Come per gli esami di 1° livello, anche quellimolecolari richiedono un commento conclusivo specificoche il professionista di laboratorio deve produrre avantaggio del corretto uso del risultato da parte delclinico che ha posto il quesito.

Nella Tabella 7 sono riportati gli aspetti salienti deipercorsi che caratterizzano gli esami per la ricerca didifetti dell’emoglobina alla nascita, i quesiti, gli obiettivi ei livelli di approfondimento. Ciascuno di questi aspettideve essere condiviso e conosciuto dagli arteficidell’approccio diagnostico quale presupposto per unacorretta interpretazione dell’esito analitico, nonché agaranzia dell’appropriatezza dell’intero percorso.

Raccomandazione 7Quando il laboratorio di 2° livello è chiamato a

eseguire esami di conferma o di caratterizzazione didifetti emoglobinici deve conoscere il quesito postoin prima istanza dal clinico, i livelli diapprofondimento delle indagini molecolari daeseguire e i risultati a cui il 1° livello è già pervenutoper consentire la scelta di tecniche diagnosticheappropriate ed evitare inutili ripetizioni di esami.

VEQ per gli esami di 1° e 2° livello delleemoglobinopatie alla nascita

La partecipazione a un sistema di VEQ nel settoredelle emoglobinopatie è non solo raccomandabile, madoverosa dato l’alto significato diagnostico degli esami el’alto valore predittivo. Tuttavia, tale pratica non risultasufficientemente consolidata. Il CQI è utile permonitorare la precisione del dato analitico, mentre laVEQ informa sull’accuratezza e offre la possibilità di unconfronto utile tra i vari laboratori. Nel caso specificodelle emoglobinopatie alla nascita, una VEQ può



Tabella 6Emoglobinopatie rilevabili su sangue cordonale o su sangue periferico alla nascita. Nella tabella viene riportato il dato più rilevanterappresentato dall’assenza o dalla marcata riduzione di HbA rispetto alla condizione fisiologicaDifetti strutturali o talassemici dell’emoglobina HbAHbS/HbS (“sickle cell anemia”) AssenteHbS/β° talassemia AssenteHbS/HbC disease AssenteHbS/HbD Punjab AssenteHbS/HbO Arab AssenteHbS/Hb Lepore AssenteHbS/δ-β talassemia AssenteHbS/HbE AssenteHbS/HPFHa Assenteβ-talassemia major Assenteβ-talassemia intermedia <5%b

β-talassemia/HbE <5%b

β-talassemia/Hb Lepore AssenteHbS/β+ talassemia <5%b

β-talassemia/HbC <5%b

β-talassemia/HbD Punjab <5%b

HbC/HbC Assenteβ-talassemia/varianti Hb (β instabili) QVc

HbH disease <20%d

HPFH, persistenza ereditaria di HbF; QV, quantità variabile.aHPFH rara dovuta ad ampie delezioni coinvolgenti i geni δ e β globinici.bLa quantità di HbA dipende dal difetto β talassemico.cLa quantità di HbA dipende dal difetto β talassemico e dall’instabilità della variante β.dLa quantità di HbA e di Hb Bart dipende dalla tipologia dei difetti dei geni α coinvolti.

assumere grande rilievo anche nella verificadell’appropriatezza degli intervalli di riferimento adottati.Un futuro impegno deve essere anche quello dipromuovere adeguati programmi di VEQ nell’ambitodelle fasi preanalitica e post-analitica.

Per il 2° livello diagnostico sono già disponibiliprogrammi di VEQ ai quali i laboratori specializzatipartecipano. E’ importante che la VEQ rispecchil’operare quotidiano; per questo motivo deve fornire nonsolo il campione biologico (sangue intero o carta diGuthrie), ma anche notizie cliniche relative al neonato dacui proviene il prelievo (nato a termine opre/post-termine, gemellarità, sofferenza neonatale operinatale) e valori relativi a esameemocromocitometrico, reticolociti, eventualmentebilirubinemia e aptoglobinemia. Si raccomanda inoltre,dove previsto o possibile, la discussione dei casipreferibilmente sui siti dedicati.Raccomandazione 8

E’ raccomandata l’adesione a VEQ dedicate per gliesami di 1° e 2° livello. In particolare, per la VEQ di 1°livello si dovrebbero preferire schemi che utilizzanosangue fresco in EDTA-K3. La VEQ deve valutare nonsolo le prestazioni delle tecniche separative utilizzate,ma anche le conclusioni diagnostiche raggiunte,mimando così in modo completo la pratica clinicaquotidiana.

ASPETTI POST-ANALITICILa tempistica del laboratorio

Nei percorsi diagnostici di laboratorio un aspetto nonsecondario da considerare è rappresentato dal temponecessario all’esecuzione dell’esame. Gli esamidestinati alla ricerca di difetti dell’emoglobina allanascita richiedono tempi che dipendonosignificativamente dalla complessità dei metodi

impiegati, dall’approfondimento diagnostico, ma anchedalle variabili preanalitiche riportate nella Tabella 2.Tuttavia, nel caso di esami eseguiti alla nascita, sulsangue proveniente dal cordone ombelicale o susangue periferico, i tempi del laboratorio potrannorisultare senza dubbio inferiori se già si conoscel’assetto genetico dei genitori. Nella maggior parte deicasi la conoscenza preventiva dei fenotipi ematologicidei genitori, il loro assetto emoglobinico o genetico,potrà contribuire a più rapide conclusioni e a un minorcosto dell’intero percorso analitico. E’ auspicabilepertanto che i genitori in vista di una gravidanzaprocedano, anche in mancanza di particolari indicazioni,a esami specifici e completi di 1° livello per leemoglobinopatie in epoca preconcezionale o comunquenel primo trimestre della gravidanza.Referto e comunicazione del risultato

Gli esami sul sangue cordonale o sul sangueprelevato al neonato nei primi giorni di vita sono di solitorichiesti da uno specialista al quale si dovrà indirizzareil referto con la conclusione presuntiva o definitivadell’indagine. Il primo destinatario del risultato degliesami è quindi il clinico che utilizzerà direttamente ilrisultato e informerà i genitori. A questo proposito è utileosservare che l’esame genetico per le emoglobinopatiealla nascita può avere un valore aggiunto. Genitoriinconsapevoli possono essere informati dagli esami sulfiglio neonato della presenza di importanticaratteristiche riconducibili a uno status genetico a lorocollegato e tutto ciò potrà dimostrarsi utilenell’eventualità di altre gravidanze. Occorre anchesottolineare che nel caso di esami eseguiti alla nascita,il soggetto interessato non è nelle condizioni diconoscerne il risultato, né di recepirne il significato.Secondo le norme sull’informazione genetica il minorepotrà essere informato sul suo patrimonio genetico, inmodo responsabile, solo alla maggiore età o a



Tabella 7Quesiti specifici, obiettivi e livelli di approfondimento nella diagnostica neonatale delle emoglobinopatieQuesito diagnostico Obiettivo 1° livello 2° livelloPossibile presenza di anemia falciforme (SCD) Esami di screening X Xa

SCD e composti emoglobinici X Xb

β-talassemia omozigote Validazione del sangue cordonalefinalizzata alla conservazione X Xb

HbS eterozigote X Xb

Altri difetti talassemici e/o strutturali allo stato eterozigotecon HbA comunque presente X Xb

Neonato con genitori entrambi portatori Escludere la condizione di neonato affetto X -Monitoraggio dopo diagnosi fetale Conferma della diagnosi X Xa

Neonato con marcata anemia Escludere che la causa dell’anemiapossa essere riconducibile alla presenzadi difetti dei geni globiniciX Xa

aIl 2 °livello (molecolare) in molti casi non è necessario per una conclusione diagnostica definitiva.bPer una conclusione diagnostica definitiva risulta necessario procedere con il 2° livello (molecolare) in relazione ai tempi previstidal percorso per la conservazione del sangue cordonale.

discrezione dei genitori. Può essere utile ricordarequesto aspetto ai genitori stessi, che dovranno pertantoconservare memoria della diagnosi acquisita allanascita del loro figlio.

Alla nascita può essere più o meno urgenteconcludere con certezza una diagnosi, ma possonoanche sussistere dei limiti dovuti ai percorsi e ai metodiutilizzabili. Nel caso di possibili β emoglobinopatie gravi,la conoscenza certa di una diagnosi deveabbondantemente precedere l’inizio dello statopatologico. Pertanto, quando non è possibile pervenirecon certezza e in tempi brevi a una diagnosi mediantegli esami di 1° livello, dovrà essere chiaramenteriportata nel referto una conclusione presuntivasegnalando la necessità di affidare a esami successivi,preferibilmente a esami molecolari, eseguiti a breve

termine la possibilità di una diagnosi conclusiva.Quando i tempi e le circostanze invece lo consentono,si può rimandare (preferibilmente al completamentodello “switch” dell’HbF) il compito di una diagnosidefinitiva, nella maggior parte dei casi mediante esamibiochimici e, quando occorre, mediante analisimolecolari.

Nella Tabella 8 sono riportati, a titolo esemplificativo,alcuni commenti a conclusioni diagnostiche cherispondono a specifici quesiti. Un referto deverispondere in modo accurato, comprensibile e concisoal quesito diagnostico armonizzando la comunicazionedel risultato con la corretta interpretazione del dato dilaboratorio (75). L’obiettivo diagnostico, le circostanze eil risultato degli esami eseguiti alla nascitacontribuiranno pertanto a produrre un referto che nel



Tabella 8 Esempi di quadri emoglobinici rilevabili alla nascita e possibili conclusioni relative agli esami di 1° livelloEsempio Informazionidisponibili Risultati Conclusione con commento

1 - Nato a termine- Familiarità per HbS- Origini: SiciliaHbA = 26%HbF = 74% Assetto emoglobinico compatibile con lo stato fisiologico(assenza di difetti globinici)

2 - Nato a termine- Genitori: NIG - Origini: NigeriaHbA = 16%HbF = 84% L’assetto emoglobinico non consente di escludere la presenza di“trait” talassemici la cui definizione è possibile tra 6-8 mesi ecomunque al completamente dello “switch” dell’HbF. Se laconclusione certa è urgente, è necessario un esame di 2° livello

3 - Nato a termine- Genitori: NIG - Origini: Albania/ItaliaHbA = 10%HbF = 82%HbX = 8%“sickling” positivo

Presenza di HbS allo stato eterozigote

4 - Nato a termine- Familiarità per talassemia- Origini: Italia HbA = 8%HbF = 92% Assetto emoglobinico compatibile con la presenza di β-talassemiaeterozigote

5 - Nato a termine- Genitori: NIG- Origini: Albania/SiciliaHbA = 5%HbF = 95% I risultati ottenuti potrebbero configurare la presenza di un doppiodifetto a carico dei geni β globinici per la cui esatta definizionesono necessari esami di 2° livello

6 - Nato a termine- Genitori hanno eseguitodiagnosi prenatale: fetocon β-talassemia eterozigote -Origini: Albania

HbA = 10%HbF = 90% Conferma del risultato della diagnosi prenatale: il neonato risultaportatore eterozigote di β-talassemia

7 - Nato a termine- Genitori: NIG- Origini: ItaliaHbA = 0%HbF = 100% L’assetto emoglobinico è compatibile con la presenza di undoppio difetto a carico dei geni β globinici per la cuicaratterizzazione sono necessari esami di 2° livello

8 - Nato a 32 settimane- Genitori: NIG - Origini: ItaliaHbA = 12%HbF = 84% L’assetto emoglobinico non consente di escludere la presenza di“trait” β talassemico la cui definizione è possibile tra 6-8 mesi ecomunque al completamento dello “switch” dell’HbF

9 - Nato a termine- Genitori: madre conmicrocitosi non accertata,padre non esaminato-Origini: Italia

HbA = 14%HbF = 82%HbX = 6%“sickling” negativo Hb Bart = 4%

Presenza di variante emoglobinica presumibilmenteappartenente alle α catene globiniche. L’Hb Bart rilevata lasciasupporre la presenza di α-talassemia. Per una conclusione certasi consigliano esami di 2° livello

10 - Nato a termine- Genitori: NIG- Origini: ItaliaSu sangue cordonale:HbA = 35%HbF = 64%HbA2 = 0,8%

Occorre escludere eventuali contaminazioni con sangue materno

NIG, nessuna informazione genetica.

caso di esami di 1° livello conterrà parametri eriferimenti diversi da quelli riportati nel referto prodottoper il soggetto in età adulta, particolarmente inriferimento a HbA, HbF e all’assenza di HbA2. Leprincipali sezioni e i relativi contenuti del referto di 1°livello sono riportati nella Tabella 9. Ai contenuti delreferto di 2° livello dedica invece una particolareattenzione un recente documento prodotto dalla SocietàItaliana di Genetica Umana (76). Raccomandazione 9

Si raccomanda di refertare gli esami di 1° livellocorredando i risultati con opportune conclusioni.Destinatario dei risultati degli esami è il clinicorichiedente. Tuttavia, è opportuno che leconclusioni del laboratorio siano prodotte in modosintetico e comprensibile anche per i genitori cheavranno il compito di conservarne memoria per illoro figlio. A tal fine può essere utile consigliare alclinico richiedente di apporre l’annotazione sul“libretto sanitario pediatrico” dell’avvenutoscreening neonatale per le emoglobinopatie el’indicazione della struttura presso la quale si sonoeseguiti gli esami, affinchè anche il pediatra difamiglia ne possa essere informato e, in caso dinecessità, chiederne il risultato.

ASPETTI GENERALIFormazione del personale di laboratorio

È importante che anche il personale addetto alladiagnostica delle emoglobinopatie nel laboratorio di 1° e2° livello riceva un’adeguata formazione così comeprevisto dal sistema qualità. I corsi dovranno esserededicati e periodici, con un’offerta formativa continuarispondente all’avvicendamento del personale, conparticolare attenzione alle iniziative formative dellaSITE. L’aggiornamento dovrà riguardare l’evoluzione deimetodi e dei percorsi diagnostici, nonché gli aspettigenetici e fenotipici a essi riconducibili.

Formazione/informazione per il clinicoA un aggiornamento specifico periodico sulle

emoglobinopatie dovranno essere chiamati anche iclinici che richiedono gli esami, nonchè quelli destinataridei risultati. L’informazione dovrà essere particolarmentecurata al fine di consentire corrette prescrizioni,permettere che il risultato analitico sia correttamenteinterpretato e contribuire a una corretta e adeguataprevenzione. Occorre promuovere la collaborazione tralaboratoristi e clinici, anche per l’aggiornamento deinomenclatori regionali delle prestazioni.



Tabella 9Contenuti e indicazioni per la stesura del referto di 1°livelloAnagrafica Identificazione del paziente: - Cognome, nome e data di nascita- Sesso, luogo di nascita- Origine etnicaData accettazione amministrativa Nella maggior parte dei casi coincide con la data di inizio del percorso diagnosticoMateriale biologico ricevuto Sangue periferico con anticoagulante, sangue congelato con dimetilsulfossido,“Guthrie card”, altroReferente Nome del medico specialista che ha posto il quesito diagnostico (è preferibileindicare anche l’eventuale struttura di appartenenza).Nel caso dell’esame alla nascita è quasi sempre il clinico che gestirà il risultato elo riferirà, commentandolo, ai genitoriIndicazione all’esame Finalità principale dell’esame richiestoMetodi utilizzati Con particolare riguardo alle metodiche utilizzate per la definizione dell’assetto quali-quantitativo delle componenti emoglobiniche e agli esami biochimici di conferma Risultati Vedere Tabelle 3-6Riportare le frazioni emoglobiniche presenti (compresa HbA) e le rispettivequantificazioni, interpretando il dato fornito dalle strumentazioni utilizzateRisultati di altri eventuali esami eseguitiLimiti di riferimento Vedere Tabelle 3-5Conclusione e interpretazione Vedere Tabelle 7 e 8Indicare se la conclusione è presuntiva o definitiva, se è opportuno o necessarioun approfondimento di 2°livello e se è necessaria una consulenza genetica Partecipazione a VEQ Riportare in calce al documento se il laboratorio sta partecipando a VEQ

Informazione alla popolazioneQueste raccomandazioni potranno comunque

produrre maggiori effetti sulla prevenzione, profilassi eterapia delle emoglobinopatie se sarà possibile farconvergere i vari operatori nella direzione di unaadeguata, chiara e sintetica informazione allapopolazione in età fertile o in gravidanza, nei luoghi, neitempi e nei modi richiesti dall’eterogeneità delle culture,dalla disponibilità delle risorse e dalle sensibilità eopportunità locali. A tale proposito può risultare utilel’esperienza condotta da anni in popolazioni multietnichein Gran Bretagna e in Olanda (77-79).

Raccomandazione 10Il laboratorio per le emoglobinopatie deve

specificatamente perseguire la formazione einformazione continua diretta ai clinici nell’otticadell’appropriatezza prescrittiva e di una correttainterpretazione del risultato. E’ altrettantoimportante che il laboratorio assolva il suo ruoloanche collaborando a un’informazione adeguatarivolta alla popolazione sugli esami specifici per leemoglobinopatie.Rete di laboratori per la diagnostica delle emo-globinopatie

Come già affermato all’inizio di questo documento, illaboratorio svolge un ruolo centrale e insostituibile nelladefinizione dell’assetto genetico dell’emoglobina, sia pura diversi livelli e con diversi ruoli. Nelle varie realtàregionali i piani di riorganizzazione dei laboratori, inprogetto o in parte già attuati, sono destinati a modificaremolti dei riferimenti e dei percorsi che nel passato hannocontribuito alla gestione della diagnostica e allaprevenzione delle emoglobinopatie. La diagnostica di 1°livello delle emoglobinopatie collegata al neonato risentemolto della presenza sul territorio dei principali Centrinascita o, come già detto, delle esigenze diagnostichedelle banche di sangue del cordone ombelicale. Ilaboratori di riferimento per il 2° livello diagnostico, innumero limitato (mediamente uno per regione o pocopiù), sono nella maggior parte dei casi inseriti in realtàdiverse da quelle di 1° livello e talvolta non direttamentecollegate ai servizi di consulenza genetica né ai centriclinici. Un numero ancora più limitato di questi laboratoridi 2° livello, meno di 10 su tutto il territorio nazionale, èdi riferimento anche per la diagnostica prenatale. Ciòdetto, appare evidente, nel tempo presente ricco dicambiamenti nella popolazione e nelle normative, che sidebba contribuire, ciascuno per la propria parte, alladefinizione e costruzione di reti territoriali, regionali osovraregionali sulla base delle opportunità edesperienze maturate. Tutto ciò al fine di aumentare lesinergie, le collaborazioni e i rapporti, in genere, tra iprofessionisti a diversi livelli e tra le diverse strutture peruna buona ed efficace diagnostica delleemoglobinopatie.

CONCLUSIONIQueste raccomandazioni sono destinate ai laboratori

che si occupano della diagnosi genetica alla nascitadelle emoglobinopatie mediante la definizionedell’assetto emoglobinico con esami biochimici e/omolecolari. Il risultato di tali indagini, che potrannoessere richieste con finalità diverse, è destinato a esserecondiviso da specialisti clinici e da genitori e familiari deineonati in ambiti diversi. Le raccomandazioni potrannocontribuire a una migliore interpretazione e a unapuntuale definizione dei numerosi difetti patognomonicidiscriminandoli dalle numerose variazioni “innocenti”dell’emoglobina se verranno calate nelle decisioni e neicomportamenti del laboratorio. L’intento è quello diarmonizzare e di condividere i percorsi più corretti nelcampo di una diagnostica che vieppiù si sta diffondendoin Italia e che, se non controllata, è suscettibile diprodurre comportamenti, ma soprattutto risultatidissonanti e non confrontabili.

Obiettivo di questo documento è anche quello direndere fruibile un risultato di laboratorio per un correttoinquadramento diagnostico al fine di produrre azioni neiriguardi di prevenzione, profilassi e terapia. Il contenutodi questo documento potrà coinvolgere anche quantisono impegnati nella gestione del sangue cordonaledestinato alla conservazione nelle banche dedicate, ilCentro Nazionale Sangue (CNS) e il Centro NazionaleTrapianti (CNT), fornendo indicazioni utili ai relativilaboratori di riferimento per i difetti emoglobinici perl’adesione ai previsti standard internazionali.RINGRAZIAMENTI

Si ringraziano la Prof.ssa Maria DomenicaCappellini, Presidente SITE, per il costanteincoraggiamento alla stesura di questo documento, laDott.ssa Nicoletta Sacchi (Ospedali Galliera, Genova)per la revisione della parte di competenza, la Dr.ssaMariella Mercadanti (Azienda Ospedaliera Universitariadi Parma) per i confronti sugli intervalli di riferimento. Peri suggerimenti nell’ultima fase di valutazione “online” unringraziamento va inoltre alla Dr.ssa MariastellaGraziani, alla Dr.ssa Giovanna Patrucco e al Prof.Giuseppe Castaldo.CONFLITTO DI INTERESSI

Nessuno.



APPENDICECONSENSO ALL’ESECUZIONE DI ESAMI GENETICI PER LE EMOGLOBINOPATIE

Io sottoscritto/a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . nato/a a . . . . . . . . . . . . . . .il . . . . . . . . . . . . . . .abitante a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . CAP. . . . . . .via. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .telefono . . . . . . . . . . . . . . . . . . padre /madre del neonato/minore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . nato/a a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . il . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .confermo di avere ricevuto alcune informazioni sul significato e le implicazioni dei test genetici finalizzati alla ricercadi difetti dei geni globinici e di averne compreso l’utilità.Dichiaro in particolare di essere stato/a informato/a che:- il test può risultare normale o evidenziare alterazioni; - il referto di 1° livello potrà essere conclusivo già alla nascita; - nel caso di una conclusione presuntiva il laboratorio potrà consigliare di rimandare a dopo 6-8 mesi la conclusione

definitiva, o comunque allo “switch” completo dell’emoglobina fetale. Solo nel caso in cui il risultato definitivo siaritenuto urgente dal neonatologo o dalla banca che conserva il sangue cordonale, il laboratorio potrà procederesubito a esami di 2° livello per la caratterizzazione dei difetti presunti;

- potrebbe essere necessario estendere gli esami ai genitori e/o ai familiari;- il referto dovrà essere portato a conoscenza del pediatra di libera scelta; - il risultato dell’esame dovrà essere conservato per comunicarlo al/alla figlio/a quando lo riterrò più opportuno.Inoltre:- il DNA estratto dal campione ematico del neonato potrà essere conservato per eventuali ulteriori approfondimenti

i cui esiti, se diversi da quelli già comunicati, saranno comunicati al soggetto che acconsente. Pertanto acconsento �, non acconsento � alla conservazione del DNA;

- acconsento �, non acconsento � al trattamento dei dati sensibili e in particolare dei dati genetici per attività diricerca medico-scientifica/statistica collegata all’indagine genetica in atto.

Acconsento quindi a far eseguire l’esame genetico di 1° livello ed eventualmente di 2° livello per le emoglobinopatiemediante prelievo di sangue a mio/a figlio/a o sul sangue del cordone ombelicale già conservato alla nascitaData ………………………………………………… Firma………………………………

Il sanitario che ha raccolto il consenso:Cognome e nome ……………………………………………….Tel…………………………………………Struttura/Istituto …………………………………………………………………………………………….............................

Firma………………………………

Il trattamento dei dati personali è conforme alle disposizioni contenute nel Decreto legislativo 30 giugno 2003 n. 196- Codice in materia di protezione dei dati personali e nel Provvedimento del Garante della Privacy – Aut. n°8/2013 -Autorizzazione al trattamento del dato genetico.



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Raccomandazioni per la diagnosi neonatale delle emoglobinopatie