Ramanova spektroskopie

Připomentuní elmag. záření

Princip

● Neelastický rozptyl monochromatického záření● Ramanův rozptyl je jev vznikající při interakci

mezi fotony dopadajícího světla s atomy, kdy se předává energie vibračním a rotačním stavům atomů nebo molekul.

● Ramanův jev je možno popsat pomocí kvantové teorie, jeho základy je však možno vystihnout i v klasickém přiblížení. V klasickém přiblížení platí pro molekulu interagující se zářením, že v molekule je indukován dipólový moment.

Princip - idea

● Bohužel procesů probíhá více současně

Princip

● zářivý dvoufotonový přechod mezi dvěma stacionárními vibračními stavy molekuly, jejichž energie jsou E

1 a E

2, vyvolaný

interakcí s fotonem dopadajícího záření o frekvenci ν0

provázený vyzářením fotonu rozptýleného záření o frekvenci νR

● Tento rozptylový efekt si lze zjednodušeně představit jako současnou absorpci fotonu budícího záření molekulou, kdy molekula přechází na virtuální energetickou hladinu, a emisi sekundárního fotonu, za splnění podmínky zachování energie

● Existuje několik možností takto uskutečněného přechodu podle polohy virtuální energetické hladiny vůči vlastním stavům molekuly (např. normální a resonanční Ramanův jev).

h νR=hν0±(E2−E1)

Princip - hladiny

Prakticky jsou měřena spektra pouze v oblasti Stokesova rozptylu, a to s ohledem na nutnost odfiltrovat Rayleighův rozptyl, jehož intenzita je zhruba 105-1012-krát vyšší než intenzita běžných Ramanových linií.

Může značně ovlivnit vzorek.Fotochemické reakce

Ovlivnění vzorku malé.

Různé vl. délky světla.

Princip - spektrum

Ramanovo spektrum

Ramanovo spektrum má velmi nízkou intenzitu.

Historie

● Ramanova spektroskopie se rozvinula v prvé čtvrtině 20. století, kdy byl rozptyl monochromatického záření se změnami frekvence předpovězen teoreticky rakouským kvantovým fyzikem Adolfem Smekalem. Rozptyl byl pak dlouho studován např. Rayleighem (1871), Einsteinem (1910) a dalšími, nikdo ale nezaznamenal změny frekvencí záření s jedinou výjimkou u X-paprsků pozorovaných Comptonem.

● Prvé pozorování nelastického rozptylu bylo popsáno v Kalkatě Ramanem a jeho spolupracovníkem Krishnanem a téměř ve stejnou dobu Landsbergem a Mandelstamem v Moskvě v r. 1928. Dva roky poté Raman obdržel za svoji práci Nobelovu cenu a obor spektrometrie byl pojmenován po něm.

Sir Chandrasekhara Venkata Raman

*7.11.1888, +21.11.1970

Vlastnosti

● Ramanova spektra stejně jako infračervená spektra poskytují informace o vibračních (a rotačních) pohybech polyatomických částic (molekul, krystalů atd.).

● Frekvence normálních vibračních modů závisí na hmotnostech zúčastněných atomů a na síle vazeb mezi nimi.

● vibrační frekvence molekul jsou nezávislé na tom, zda je studujeme infračervenou nebo Ramanovou spektroskopií, intenzity budou zcela jiné.

V klinické praxi● ex vivo a in vivo k řešení řady biomedicínckých

otázek: – časná detekce rakoviny

– monitoring efektů různých látek na kůži

– analýza složení atherosklerotickeho plaku (usazeniny lipofilních látek na stěnách arterii)

– rychlá identifikace patogenních mikroorganizmů

● jako nedestruktivní technika, přispívá ke studiu molekulární struktury, míry oxidace a krystalinity např. u PE ultra-high molecular weight polyethylene (UHMWPE) v ortopedických �implantátech (kyčelní a kolenní náhrady)

Srovnání i IČ

stejné vlnočty, alejiné intenzity aRaman nemá overtone píky

Co lze detetovat

● Proto, aby se vibrace zobrazila v Ramanově spektru musí docházet ke změně polarizace, tj. ke změně energetické náročnosti vyvolání indukované změny dipolového momentu elektrickým polem zvenčí.

● nepolární vazba v symetrické molekule

Aktivní a neaktivní vazby

● polární vazba je obvykle IČ-aktivní● nepolární vazba v symetrické molekule bude v

IČ absorbovat málo ale hodně v Ramanově spektru

● podstatná je „změna dipolového momentu“ při excitaci

Princip

● Pokud je daný vibrační mód aktivní v Ramanově spektru, bude pro něj principiálně možné pozorovat dvě linie, a to symetricky rozložené kolem linie Rayleighova rozptylu

● V Ramanově spektru je intenzita pásů úměrná druhé mocnině změny polarizovatelnosti během vibračního pohybu (δα/δq)2, zatímco v infračerveném spektru je úměrná druhé mocnině změny dipólového momentu.

Užitečné● intenzity pásů v Ramanových spektrech souvisejí se změnou

polarizovatelnosti (intenzivnější pásy jsou pro symetrické vibrace a vibrace ve fázi než pro vibrace antisymetrické a v protifázi, obzvláště intenzivní jsou pásy vícenásobných symetrických vazeb – např. -C≡C-, -C=C-, -N=N-).

● Vzhled infračervených a Ramanových spekter je tak silně ovlivněn symetrií molekul (buněk krystalu) a symetrií jednotlivých vibračních pohybů. Pro molekuly s nízkou symetrií (charakterizované pouze prvkem symetrie „identita“) jsou pásy všech vibrací pozorovatelné v obou typech spekter, ovšemže s odlišnou intenzitou.

● Pro molekuly s vysokou symetrií se stávají spektrum infračervené a Ramanovo navzájem doplňkovými (komplementárními). Např. pro molekuly se středem symetrie platí princip alternativního zákazu, tj. pásy vibrací patrné v Ramanově spektru jsou zakázány v infračerveném spektru a naopak;

● plně (totálně) symetrické vibrace jsou aktivní v Ramanově spektru a v infračerveném spektru jsou inaktivní.

Interpretace

● Na rozdíl od infračervených spekter lze velmi snadno identifikovat i řadu symetricky substituovaných skupin resp. skeletů molekul. Například symetricky substituovaná trojná vazba se obvykle projevuje velmi silným pásem valenční C≡C vibrace v oblasti cca 2260 až 2160 cm-1. Je tak možné ji jednoznačně odlišit od nesymetricky substituované C≡C vazby (cca 2180 až 2100 cm-1), případně lze identifikovat více trojných vazeb v jedné molekule.

● Dále se v Ramanových spektrech výrazně projevuje dvojná C=C vazba svojí valenční vibrací v oblasti cca 1690 – 1630 cm-1 pro nekonjugované alkeny, resp. v oblasti 1660 – 1580 cm-1 pro konjugované alkeny. Naopak pouze slabými pásy se projevují C=O vazby, ať již v ketonech, esterech, amidech atd.

● Kombinací Ramanovy a infračervené spektroskopie lze pak jednoznačně přiřadit konkrétní pásy v oblasti 1750 – 1580 cm-1 (ať již vibracím C=O nebo C=C) nebo identifikovat odlišný původ pásu.

Vlnočty - identifikace

Důležité

● Na rozdíl od infračervené spektroskopie lze pomocí Ramanovy spektroskopie úspěšně charakterizovat technicky významné prvkové materiály, např. uhlíkové materiály (grafitické vrstvy, saze, přírodní i umělé diamanty atp.) a křemíkové materiály (elektronika).

● Dále pak lze studovat anorganické materiály obsahující těžké prvky, např. korozní oxidické, /di/sulfidické vrstvy pro slitiny těžkých kovů (koroze materiálů v přírodním nebo výrobním prostředí). Při studiu polypeptidů a proteinů je významná možnost sledovat symetrické valenční S-S vibrace disulfidických můstků

Komplikace

● Signál je velmi slabý

Síra

Spektra jsou po odečtu pozadí.

Spektra jsou po odečtu pozadí.

Objemový vzorek Tenká vrstva

Tenká vrstva po60 s expozice laseru

Příklad - As40

S60

Identifikace

● Porovnáním s databází spekter – Raman je dobrý otisk prstu

● Ramanovo spektrum je jednoduší než IR spektrum

●

Kvantitativní analýza

● v této metodě také není obvykle splněn jednoduchý princip lineární závislosti intenzity pásu na koncentraci analytu.

● Pro kalibraci je v Ramanově spektrometrii často třeba vyvíjet složitější kalibrační modely s využitím pokročilých chemometrických algoritmů, které obvykle vyžadují rozsáhlou sadu standardů (mnohdy i více jak 30 kalibračních vzorků). Taková sada musí dostatečně reprezentativní.

Kvantitativní analýza

● Cílem je nalézt vztah mezi vícedimenzionální spektrální informací (reprezentovanou maticí hodnot intenzity rozptylu ve vybraných spektrálních úsecích pro sadu kalibračních vzorků) a složením vzorků (reprezentovaným maticí hodnot koncentrací skupiny sledovaných analytů v sadě kalibračních vzorků).

● Podmínky měření všech spekter i způsoby jejich úprav a zpracování musí být zachovány od kalibračních, přes validační až po neznámé zkoumané vzorky.

● Pouze v jednoduchých případech čirých roztoků měřených za stabilních experimentálních podmínek je možné provádět poměrně jednoduchou kalibraci na základě vyhodnocování hodnot korigovaných ploch (po odečtu spektrálního pozadí) vybraných pásů. Velmi často se plochy pásů analytu vztahují k hodnotě plochy píku vnitřního standardu, případně rozpouštědla.

Další komplikace - fluorescence

Časté pro virtuální stavy v oblasti excitačních stavů, proto je důležité mít i světlo z blízkého IČ.

Řešení luminiscence

Ramanovo spektrum thio-indiga měřené s excitací při 488 nm (a) a 1064 nm (b)

Ramanovy spektroskopie se zvýšenou citlivostí

● Rezonanční Ramanova Spectroskopie● Povrchově zesílená Ramanova spektroskpie

Rezonanční Ramanova Spectroskopie

● Excitace zářením, které odpovídá absorpčnímu maximu studovaných částic - 102–104 roste intenzita Ramanovského rozptylu daného chromoforu

Povrchově zesílená Ramanova spektroskopie

● Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS)

● Vybuzením povrchových plazmonů vzroste signál 103 až 106 krát

● Lze na povrchu kovů Au, Ag a Cu v oblasti VIS a NIR, kov obvykle ve formě mikročásti

● Světlo 382 nm pro částice 5 μm Ag, ale již 600 nm pro větší eliptické Ag částice

Příklad - identifikace

L. Ziegler, Boston University, C+EN Sept. 21, 2009

Polarizační měření

● Na přelomu 60. a 70. let minulého století bylo na základě obecné teorie polarizačních vlastností Rayleighova (pružného) a Ramanova (nepružného) rozptylu světla chirálními molekulami ukázáno, že rozptýlené světlo obsahuje velmi slabou složku s kruhovou polarizací, a naopak že intenzita rozptylu dopadajícího pravo- a levotočivě kruhově polarizovaného záření je poněkud rozdílná.

● Výsledkem měření ROA jsou vždy dvě spektra – vlastní ROA (tedy diferenční) spektrum a zdrojové Ramanovo (sumární) spektrum.

Teorie

● Ramanův rozptyl a ROA – dvoufotonové jevy popis tenzorovými veličinami⇒

● ROA –při popisu musíme jít za rámec dipólové aproximace a zahrnout kromě elektrického dipólu i magnetický dipólový a elektrický kvadrupólový člen

● Obecná teorie ROA je velmi komplikovaná● Použití, např. určení a konformace biologických

molekul v roztoku (proteinů, nukleových kyselin, cukrů, virů …)

Polarizační měření

● ROA spektra L-alanyl-L-alaninu - pozorujeme ROA pásy téměř pro všechny pásy vibračního Ramanova spektra, přičemž znaménko a intenzita každého z nich odráží stereochemii včetně absolutní chirality té části molekuly, která se příslušné normální vibrace účastní.

L-alanyl-L-alanin D-alanyl-D-alanin

Přístroje

● Jako u IČ– Dispersní zejména pro UV, VIS + plošný CCD det.

– S Fourierovou transformací pro NIR

Zdroj monochromatického světla

● Laser – to je drahý zdroj světla– He-Ne 632.8 nm

– Argonový 488 nm, 496.5 nm, 514.4 nm

– Kryptonový 530.9 nm, 674.1 nm

– Nd:YAG 1064 nm

– Různé laserové diody

– Laditelné lasery● Výhodou excitace v UV-VIS oblasti je vyšší intenzita rozptylu

(intenzita rozptylu klesá se čtvrtou mocninou vlnové délky excitujícího záření), naopak zásadní nevýhodou jsou rizika velmi intenzivní fluorescence nebo nežádoucích fotochemických reakcí.

Proč různé vlnové délky?

● Luminiscence závisí na vlnové délce exitačního laseru. theophylline-7-COOH

514 nm laser

1064 nm laser

Pro NIR

● Citlivý detektor – často chlazený● Vysokou světelnost optiky● Tok záření Ramanova rozptylu obecně též roste

se zvyšujícím se tokem excitujícího laserového záření, to znamená se zvyšujícím se výkonem laseru – pozor na ohřev vzorku

Kalibrace vlnočtové škály

● Klíčová operace

Aplikace – identifikace drog

Originalita artefaktů

Identifikace vazeb uhlíku

● hlavní jsou tzv. G pík kolem 1560 cm-1 a D pík kolem 1360 cm-1.

● amorfní uhlík – 1060 cm-1

● diamant – 1332 cm-1 sp3

Literatura

● prof. Ing. Miroslav Vlček, CSc. - Ramanova spektroskopie.pdf (neznámý zdroj), UPCE

● Doc. RNDr. Vladimír Baumruk, DrSc., Ramanova optická aktivita – proč a nač, UK

● Marcela Dendisová, Pavel Žvátora, Pavel Matějka, Úvod – princip Ramanovy spektrometrie

● Drašar, Ramanova spektroskopie speciální analýza přírodních látek,

● L. Ziegler, Boston University, C+EN Sept. 21, 2009