Spårning av fekal förorening med hjälp av Bifidobakterier

Jakob Ottoson

Rap

po

rt Nr 2007-01

Svenskt Vatten Utveckling

Svenskt Vatten Utveckling

Svenskt Vatten Utveckling (SV-Utveckling) är kommunernas eget FoU-program om kommunal VA-teknik. Programmet finansieras i sin helhet av kommunerna, vilket är unikt på så sätt att statliga medel tidigare alltid använts för denna typ av verksamhet.

SV-Utveckling (fd VA-Forsk) initierades gemensamt av Svenska Kommunförbundet och Svenskt Vatten. Verksamheten påbörjades år 1990. Programmet lägger tonvikten på tillämpad forskning och utveckling inom det kommunala VA-området. Projekt bedrivs inom hela det VA-tekniska fältet under huvud-rubrikerna:

DricksvattenLedningsnätAvloppsvattenEkonomi och organisationUtbildning och information

SV-Utveckling styrs av en kommitté, som utses av styrelsen för Svenskt Vatten AB. För närvarande har kommittén följande sammansättning:

Anders Lago, ordförande SödertäljeOlof Bergstedt Göteborgs VA-verkRoger Bergström Svenskt Vatten ABDaniel Hellström Stockholm Vatten ABStefan Marklund LuleåMikael Medelberg Roslagsvatten ABAnders Moritz LinköpingPeter Stahre VA-verket MalmöJan Söderström Sv KommunförbundetGöran Tägtström BorlängeAgneta Åkerberg Falkenberg

Steinar Nybruket, adjungerad NORVAR, NorgeThomas Hellström, sekreterare Svenskt Vatten AB

Svenskt Vatten Utveckling Svenskt Vatten ABBox 47607117 94 StockholmTfn 08-506 002 00Fax 08-506 002 10svensktvatten@svensktvatten.sewww.svensktvatten.se

Svenskt Vatten AB är servicebolag till föreningen Svenskt Vatten.

Författaren är ensam ansvarig för rapportens innehåll, varför detta ej kan åberopas såsom representerande Svenskt Vattens ståndpunkt.

Grafisk formgivning: Victoria Björk, Svenskt Vatten

Rapportens titel: Spårning av fekal förorening med hjälp av Bifidobakterier

Title of the report: Tracking faecal pollution with Bifidobacteria

Rapportens beteckningNr i serien: 2007-01

Författare: Jakob Ottoson, Smittskyddsinstitutet, Avdelningen för Parasitologi, Mykologi, Vatten och Miljö samt Statens Veterinärmedicinska Anstalt, Avdelningen för Vilt, Fisk, Miljö.

Projektnr: 25-110

Projektets namn: Spårning av fekal förorening med hjälp av bifidobakterier

Projektets finansiering: VA-Forsk

Rapportens omfattningSidantal: 22Format: A4

Sökord: Spåra, fekal, förorening, hygien, risk, avlopp, gödsel, övergödning, bifido-bakterier, sorbitol

Keywords: Track, faecal, pollution, hygiene, risk, wastewater, manure, eutrophication, bifidobacteria, sorbitol

Sammandrag: I rapporten utvärderas kvoten totala:sorbitolfermenterande bifidobakterier som spårmetod för att skilja human från animal fekal förorening.

Abstract: In this report the ratio total:sorbitol fermenting bifidobacteria is investigated as a source-tracking method to distinguish human from animal faecal pollution.

Målgrupper: Kommuner, vattenvårdsförbund, vattenverk, mikrobiologiska laboratorier

Omslagsbild: Kolonier av presumptiva bifidobakterier. De gula är sorbitolfermenterande och indikerar human fekal förorening. Fotograf: Jakob Ottoson

Rapporten beställs från: Finns att hämta hem som pdf-fil från Svenskt Vattens hemsida www.svensktvatten.se

Utgivningsår: 2007

Utgivare: Svenskt Vatten AB © Svenskt Vatten AB

Svenskt VattenUtveckling Bibliografiska uppgifter för nr 2007-01

�

Förord

Sverige har en fantastisk resurs i sina ytvatten. Hälften av våra vattenverk använder ytvatten som råvara för sin dricksvattenproduktion. Dessutom kommer våra sjöar och vattendrag allmänheten tillgodo genom bad och rekreation, fiske m.m. Urbanisering, omvandling av sommarstugeområden till permanentboende samt intensivare jord- och skogsbruk riskerar dock att i högre grad förorena såväl yt- som grundvattentäkter.

Fekal förorening från humana och animala restprodukter innebär inte bara en hälsorisk utan också ett miljöproblem då näringsämnen riskerar att övergöda sjöar. För att kunna bedöma hälsoriskerna och för en kostnadseffektiv vatten-hantering är det av stor vikt att kunna bestämma, fördela och förhoppningsvis korrigera föroreningen vid källan.

I den här rapporten utvärderas påvisandet av presumtiva sorbitolfermenterande bifidobakterier som metod för att spåra fekal förorening i ytvatten. Studien är finansierad av VA-Forsk. Tack till alla som har hjälpt till med provtagning och distribution av prover.

�

�

Innehåll

Förord . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Sammanfattning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1 Introduktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.1 Metoderförspårning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.1.1 Totala:Sorbitolfermenterande Bifidobakterier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .101.2 Specifiktsyftemedrapporten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11

2 Material och metoder . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.1 Bakterier,substratochprovtagning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .112.2 Överlevnad. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .122.3 Databehandling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12

3 Resultat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123.1 Avlopprespektivedjurprover . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .123.2 Överlevnadochkvotvid22°C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123.3 Överlevnadochkvotvid4°C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .133.4 Fekalakoliformer:bifidobakterier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14

4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

5 Slutsatser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

Referenser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Bilaga A: Metodbeskrivning för antalet totala och sorbitolfermenterande presumtiva bifidobakterier . . . . 19

�

�

Sammanfattning

Fekal förorening av ytvatten innebär en hälsorisk för människor och djur som exponeras för den, t.ex. genom bad eller dricksvattenproduktion. Föroreningen beror i många fall på utsläpp från kommunala eller privata avlopp men även på avrinning från jordbruksmark. Med den fekala föroreningen följer näringsämnen som riskerar att övergöda sjöar och vattendrag. För att korrekt kunna bedöma riskerna med och för att effektivare kunna stoppa eller begränsa utsläppen är det av stor vikt att spåra källorna till dem.

Bifidobakterier utsöndras i höga halter (ca en miljard per gram feces) av de flesta varmblodiga djur. Kvoten totala:sorbitolfermenterande bifidobakterier (SFB) har föreslagits som metod att bestämma källan till fekal föroreningen i ytvatten efter analys på ett medium som beskrevs av Mara och Oragui (198�), Human Bifid Sorbitol Agar, HBSA. Är kvoten under 10 är föroreningen troligtvis human, mellan 10 och 100 blandad och över 100 till största del animal (Ottoson 200�). En kvot vid källan behöver dock inte vara stabil över tiden i miljön. Därför gjordes inom ramen för detta projekt en överlevnadsstudie på bifidobakterier i ytvatten där kvoten följdes över tiden i � °C och 22 °C. Dessutom analyserades �� prover från avloppsverk och olika djurslag; gris, häst, ko och fjäderfä. Vid sidan om bifidobakterierna analyserades även proverna för fekala koliformer.

SFB kunde isoleras ur alla (n = �9) prov från kommunala avloppsverk. Kvoten totala:SBF var i genomsnitt �,2. Från djurproverna isolerades SFB ur �2 % av proverna (n = 2�). Dessa utgjordes av fem prover från gris, tre prover från fjäder och ett från häst. Snittet på kvoten var ��0, men för fjäderproverna lägre. I de statistiska beräkningarna uttrycktes kvoterna som log-normalfördelningar vilka var 100,�9 ± 0,�1 i avloppsproverna samt 102,2 ± 1,0 i djurproverna. Kvoten totala:SFB var signifikant lägre i avloppsproverna än i gödselproverna. Ett visst överlapp mellan grupperna kunde dock påvisas. Framför allt isolerades presumtiva SFB ur brunnet gödsel från fjäderfä där andelen utgjorde �� % av det totala antalet, vilket är i paritet med avloppsproverna.

Andelen fekala koliformer i relation till SFB ökade med tiden. Den svaga ökningen tillsammans med spridningen vid källan begränsar dock möjligheten till att åldersbestämma föroreningen med hjälp av den kvoten. När det gäller totala:SFB var den kvoten stabil över tiden vid båda temperaturerna. I och med att fenotyperna följer samma avdödningskinetik kan man anta samma förhållande i miljön som vid källan till föroreningen. Detta bygger dock på att inte andra föroreningskällor än fekala påverkar analysresultatet. HBSA är dock inte ett helt specifikt medium och verifiering av isolerade kolonier rekommenderas (Long et al. 200�). Erfarenheter från studier i ytvatten har visat på en hel del a-typisk växt som komplicerar bedömningen av vattnet med avseende på SFB (opublicerade data). Detta begränsar tyvärr möjligheten att utnyttja denna annars så enkla spårmetod.

8

Summary

Faecal contamination caused by animal and human waste can degrade aquatic environments for uses as drinking water supply, recreation, shellfish culture and irrigation. Management of faecal pollution would be more cost-effective if actual sources (human and/or non-human) could be identified, apportioned and perhaps corrected at the source.

Bifidobacteria are excreted in high amounts (approx. one billion per gram faeces) by most warm-blooded animals. The ratio total:sorbitol fermenting bifidobacteria (SFB) has been proposed as a method to identify the source of faecal pollution in surface water after analysis on a media described by Mara & Oragui (198�), Human Bifid Sorbitol Agar, HBSA. If the ratio is below 10 the pollution is most probably human, between 10 and 100 mixed and above 100 animal (Ottoson 200�). However, a ratio at the source does not have to be stable over time in the environment. This project was therefore designed to study the survival of bifido-bacteria in surface water and to follow the ratio over time at � °C and 22 °C. Further �� wastewater and animal waste (pig, horse, cow and poultry) samples were analysed. Besides total and SFB all samples were analysed for faecal coliforms (FC).

SFB were isolated from all (n = �9) wastewater samples. The mean ratio total:SFB was �,2. SFB were isolated from �2 % of the animal samples (n = 2�), five from pig, three poultry and one from horse. The mean ratio was ��0, but lower in the poultry samples. In the statistical analyses the ratios were expressed as log-normal distributions. These were 100,�9 ± 0,�1 and 102,2 ± 1,0 for the wastewater and animal samples respectively. The ratio total:SFB was significantly lower in wastewater than manure samples. There was an overlap between the distributions. Presumptive SFB were isolated in high numbers from stored poultry manure where they constituted �� % of the total number of bifidobacteria, which is in line with the wastewater samples.

The number of faecal coliforms in relation to SFB increased with time. However the span of the ratio FC:SFB at the source limits the possibility to determine the age of the pollution based on this ratio. The ratio total:SFB was, however, stable over time at both temperatures. Since both phenotypes (sorbitol ferementors/non-fermentors) have the same die-off kinetics you can assume the same ratio in the environment as the source. This is however depending on that no other than faecal sources influence the analysis. HBSA is not a very specific medium and verification of isolated colonies is recommended (Long et al. 200�). Analyses of surface water have shown a-typical growth on HBSA, complicating the inter-pretation of the results (unpublished data). This fact limits the usefulness of this otherwise simple tracing method.

9

1 Introduktion

Från avloppsutsläpp och vid kraftiga regn och över-svämningar kan stora mängder sjukdomsframkall-ande mikroorganismer, patogener, tillföras våra sjöar och vattendrag. Dessa är i huvudsak mag-, tarm-organismer som smittar fekalt-oralt. Patogener före-kommer inte naturligt i tarmen och deras förekomst i avlopp beror på andelen sjuka människor i populat-ionen. För en direktbestämning av patogener från miljöprov behövs ofta komplicerade analyser som är relativt dyra. Därför bedöms vattenkvalitet rutin-mässigt vanligen baserat på förekomsten av indikator-bakterier. En bra indikator på fekal förorening är naturligt förekommande i tarmen hos varmblodiga djur, men inte i andra miljöer. Den har samma över-levnadsmönster i miljön och i reningsprocesser som de patogener den skall indikera och analysen av in-dikatorn skall vara relativt enkel att utföra (Stenström 198�). De vanligast använda indikatorerna för fekal förorening är E. coli, totalantalet koliforma bakterier och i marina vatten enterokocker. Andra indikatorer, som bättre avspeglar överlevnaden i vatten och mark eller avskiljningen i behandlingsprocesser av speciella grupper av sjukdomsframkallande organismer, är t.ex. kolifager (virus som infekterar E. coli) och clostridie-sporer. Indikatorerna kan inte i rutinutförande skilja på fekal förorening mellan djur och människa. För att kunna bedöma den relativa inverkan av olika föro-reningskällor behöver man veta var dessa härstammar ifrån. Medan zoonoser som Campylobacter, Crypto­sporidium och EHEC kan spridas både från avlopps-vatten och från djur till människa har tarmvirus som Hepatit A snävare värdspektrum och sprids i regel endast mellan och till människor, t.ex. genom bad i avloppsförorenat vatten. Även bland andra grupper av patogener finns humanspecifika typer, t.ex. olika serogrupper av Salmonella. Sammantaget leder detta till att fekal förorening från urbana avlopp i regel innebär en större hälsorisk än om den hade sitt ur-sprung från djurspillning (Scott et al. 2002).

Förutom den direkta hälsorisken med fekal föro-rening leder näringsämnen i avlopp och djurspillning till eutrofiering och försämrad vattenkvalitet i sjöar och vattendrag. För en effektiv vattenhantering är det

alltså också av stor vikt att kunna bestämma föro-reningarnas ursprung. Insatser för att åtgärda många små avlopp kan bli dyrt i längden och motverka sitt syfte om det visar sig att avrinning från jord-bruksmark och strandbete dominerar påverkan, eller omvänt, ska strandbete kunna tillåtas om andra föroreningskällor dominerar.

Internationellt pågår forskning som syftar till att ta fram metoder för att kunna skilja mellan human och animal fekal förorening i ytvatten. Problemen med de metoder som finns idag är att de antingen: 1) befinner sig på ett forskningsstadium, 2) är dyra, �) inte tillräckligt särskiljer mellan human och animal förorening, eller �) inte tillräckligt känsliga (Simpson et  al. 2002). Känslighet, särskiljande förmåga och analyskostnader kan sällan uppfyllas samtidigt.

1.1 Metoderförspårning

Att man med hjälp av mikroorganismer ska kunna spåra källan till en förorening kallas ”mikrobiell käll-spårning” (engelska Microbial Source-Tracking). Metoderna som används kan grovt delas in i fyra kategorier: 1) värdspecifika arter, 2) kvoter mellan arter/organismer, �) fenotypisk analys (uttryckta egen-skaper) av mikrobiella populationer samt �) geno-typisk identifiering av mikrobiella grupper/organismer (Taylor 200�). En del metoder kan grupperas inom fler av kategorierna. Vidare finns det �) icke-mikro-biella, kemiska metoder, för spårstudier.

Värdspecifika arter: Identifiering av värdspecifika stammar eller organismer diskriminerar mellan animal och human fekal förorening. Problemet är att värdspecifika arter förekommer i låga halter i miljön och därför blir metoden okänslig.Kvoter mellan arter/organismer: Indikatororgan-ismer förekommer normalt i detekterbara halter i ytvatten. Metoderna för detektion är billiga. Däremot är kvoterna mellan olika grupper av organismer inte särskilt diskriminerande. Dess-utom behöver en kvot vid källan inte nödvänd-igtvis vara stabil i miljön beroende på olika avdödningshastighet hos de olika grupperna/organismerna.Fenotypning: Om värdspecifika organismer är svåra att hitta i miljön är det lättare att detektera

1.

2.

3.

10

vissa grupper eller typer av organismer som i huvudsak finns i animal respektive human tarm-flora (Taylor 200�). Genom att studera bakterie-populationers fenotyper (egenskaper) och sedan jämföra dem med de vanligast förekommande hos djur respektive människa kan man bestämma ursprunget av populationerna. Full särskiljning är dock svårt att uppnå och typning av organ-ismer är tidskrävande. Metoder där hastigheten med vilken indikatorbakterier bryter ner olika sockerarter m.m. (biokemiska test) har utvecklats i syfte att vidareidentifiera och särskilja olika stammar av vanliga indikororganismer som isol-erats från miljön (Kühn et al. 1991; Kühn et al. 199�).Genotypning: Metoder som bygger på geno-typning är bland annat pulsfälts gelelektrofores (PFGE), typning baserad på ribosomernas gen-uppbyggnad samt direktdetektion av artspecifika gener (Scott et al. 2002). Genotypning av stora populationer kan vara än mer tidskrävande än fenotypning. Direktdetektion of art- eller stam-specifika gener är dock möjligt, och skiljer mellan olika stammar, men leder till att man förlorar i känslighet (Ottoson 200�). Framstegen inom det här området går dock fort och utvecklingen av genchips-, microarray- och biosensortekniker kommer att öka såväl känsligheten som möjlig-heterna att detektera både populationer som enskilda markörer (Scott et al. 2002).Ickemikrobiella metoder: Det finns också met-oder för källspårning som bygger på kemiska substanser. Koffein finns i många drycker som kaffe, te och läsk, samt i flera läkemedel. Det utsöndras med urinen och påvisande av koffein i miljön är följaktligen ett tecken på human föro-rening (Burkhardt et al. 1999). Fekala steroler är ett samlingsnamn på de steroler och stanoler som utsöndras med avföringen. Beroende på diet och tarmflora utsöndrar olika arter fekala steroler i olika proportioner. Människan har ett förhåll-andevis högt kolesterolintag. I tarmen omvandlas delar av kolesterolet till koprostanol, som är en kemisk markör för human fekal förorening (Leeming et al. 1998). Problemen med de kemiska markörerna är låga koncentrationer, komplicerade och/eller dyra analyser samt att man har dålig kunskap om deras omvandling i miljön (Scott et al. 2002).

4.

5.

1.1.1 Totala:Sorbitolfermenterande Bifidobakterier

Bifidobakterier är obligata anaeroba bakterier som utsöndras av varmblodiga djur i halter runt en miljard per gram feces och utgör en viktig del av den normala tarmfloran. Att bifidobakterier inte används som indikatorer på fekal förorening beror på de dör snabbare i miljön än koliforma bakterier (Resnick & Levin 1981), framför allt vid temperaturer över 1� °C (Rhodes & Kator 1999). Däremot har användandet av bifidobakterier som spårorganism för att be-stämma ursprung av fekal förorening föreslagits av flera författare (Resnick & Levin 1981; Mara & Oragui 198�; Carrillo et al. 198�; Rhodes & Kator 1999; Nebra et al. 200�; Long et al. 200�). Hos människan finns det en typ som kan utnyttja sorbitol som kolkälla. Att denna fenotyp i regel återfinns hos människa men mer sällan hos djur beror på att sorbitol är ett sötningsmedel som ingår i många livsmedelsprodukter, men inte används i djurfoder (Long et al. 200�). Sorbitolfermenterande bifido-bakterier (SFB) kan skiljas från andra bifidobakterier vid tillväxt på ett näringssubstrat, Human Bifid Sorbitol Agar (HBSA), beskrivet av Mara & Oragui (198�). Metoden är enkel, billig och studier i Sverige har visat på god diskriminerande förmåga. Problemet är att HBSA inte är ett särskilt selektivt medium utan tillåter tillväxt av andra organismer, t.ex. entero-kocker. Kolonierna från den a-typiska tillväxten är dock oftast signifikant mindre (< 0,� mm) än de som bifidobakterierna ger upphov till (Nebra & Blanch 1999). Long m.fl. (200�) rekommenderar ändå att en verifiering av kolonier isolerade på HBSA sker. Studier som utfördes på Smittskyddsinstitutet, SMI, inom ramen för EU-projektet Tracking the Origin of Faecal Pollution in Surface Water (TOFPSW 200�), tydde på att kvoten mellan totala halten/SFB på HBSA skiljer mellan human och animal fekal föro-rening (TOFPSW 200�). I prover på svenskt avlopps-vatten var kvoten 100.�8±0.29, medan den i prov från djurspillning var > 102. Detta innebär att en kvot i ett vattenprov < 10 tyder på avloppsförorening, 10 < x < 100 blandad förorening och > 100 på animal förorening (Ottoson 200�).

11

1.2 Specifiktsyftemedrapporten

Kvoten totala:FB skulle potentiellt kunna uppfylla kraven på en bra spårmetod. Antalet prov från svenska djur och avlopp inom EU-projektet beskrivet ovan var däremot begränsat och därför behöver en mer omfattande genomgång göras. Dessutom be-höver avdödningshastigheten i vatten för de olika fenotyperna studeras då en kvot vid källan inte nöd-vändigtvis är stabil över tiden i miljön. Inom ramen för detta projekt togs därför ytterligare gödselprover från olika djurslag samt vatten från kommunala avloppsreningsverk. Vidare gjordes en överlevnads-studie där avklingningen av bifidobakterier, samt ut-vecklingen av kvoten totala:sorbitolfermenternade bifidobakterier, vid � °C och 22 °C i ytvatten följdes.

2 Material och metoder

2.1 Bakterier,substratochprovtagning

Prover togs på inkommande och utgående avlopps-vatten från avloppsreningsverk (ARV) av olika storlek samt djurprover från olika gårdar enligt Tabell 2-1. Sammanlagt har �� prover analyserats. Dessa för-delade sig på Avlopp (�9) samt Djur (2�). Vidare gjordes en uppdelning i typer, in utgående avlopp samt djurslag (Tabell 2-1).

Analyserna utfördes genom direktutstryk av lämplig spädning på HBSA. Plattorna inkuberades anaerobt vid �� ± 1 °C i �� ± � timmar (se Bilaga A för fullständig metodbeskrivning). Fekala koliformer analyserades enligt svensk standardmetodik (SS 199�) med utstryk på mFC agar (Difco; Becton, Dickinson and Company; Franklin Lakes, NJ). Laktosfermenterande, blåa, kolonier avräknades efter inkubering vid �� ± 1 °C i 21 ± � timmar.

Tabell 2-1. Prover tagna inom ramen för projektet uppdelat på kommunala avlopp och djur och vidare i undertyper (inkommande/utgående avlopp samt djurslag). Inom parentes anges antal prov av varje typ.

Prov Typ Undertyp Plats

Avlopp (39) In (20) Stockholm (9)Göteborg (4)Malmö (2)Växjö (2)Uppsala (2)Umeå (1)

Ut (19) Lilla Edet (7)Göteborg (5)Trollhättan (3)Stockholm (2)Malmö (1)Umeå (1)

Djur (24) Fjäder (8) Hönseriavlopp (1)Färskt gödsel (3)Brunnet gödsel (4)

BollnäsUppsalaUppsala

Gris (6) Flytgödsel Uppsala

Nöt (6) Flytgödsel Uppsala (4)Stockholm (2)

Häst (4) Fekalier (2)Gödsel (2)

UppsalaStockholm

12

2.2 Överlevnad

För överlevnadsstudien och utvecklingen av kvoten över tiden späddes en del avloppsvatten med nio delar ytvatten och fördelades i rör om cirka tre mL i varje rör. Dessutom gjordes en kontroll där avloppsvattnet späddes på samma sätt som ovan i fosfatbuffrad salt-lösning, PBS. Detta gjordes för att utesluta eventuell effekt av ytvattnet på överlevnaden och kvotens utveckling. Överlevnaden studerades vid � °C och 22 °C. För varje uttag analyserades bifidobakterier från tre oberoende prov (d.v.s. rör) medan fekala koli-former analyserades som singelprover. Prover analys-erades dag 0, �, �, 1� och 20.

2.3 Databehandling

Mikroorganismers halter i miljöprover beskrivs ofta väl med en log-normalfördelning (Hirano et al. 1982; Loper et al. 198�). Därför anges halterna i proverna som log10 koloniformande enheter per mL eller 100 mL (CFU/mL). Kvoten beräknades dock på de icke-transformerade värdena. Däremot beskrevs kvotens fördelning bättre genom log-normalfunktion varför denna nyttjades i de statistiska testerna istället för normalfördelning. Detekterades inte någon para-meter vid provtagningen användes detektionsgränsen för den parametern vid den statistiska bearbetningen av resultaten.

Resultaten delades in i grupper enligt tabell 2-1 i första nivån prov, sedan även i typ. För undertyperna var underlaget för lågt för att kunna utföra statistisk analys. Students t-test eller Mann-Whitney Rank Sum test användes för att studera skillnader mellan grupper. För överlevnadsstudien gjordes en regress-ionsanalys, dels för att bestämma avdödningshastig-heterna, men även för kvoten totala:sorbitolferment-erande bifidobakteriers utveckling över tiden. För att studera skillnader i kvot mellan olika uttag användes variansanalys. Statistiska tester utfördes i SigmaStat �.0 (SPSS; Chicago, IL). Diagrammen gjordes i ExcelDiagrammen gjordes i Excel (Microsoft Corporation; Redmond, CA).

3 Resultat

3.1 Avlopprespektivedjurprover

Sammanlagt analyserades �� prover. I tabell �-1 sammanfattas resultaten från dessa prover för avlopp respektive djurprover samt uppdelat på in-, utgående avlopp samt djurslag. Halterna är av litet intresse då de speglar utspädning och reningsgrad och inte i sig innebär en diskriminerande parameter. Däremot gör kvoten totala:SBF det. Den var signifikant lägre i de utgående avloppsproven än i djurproven (p<0,001). Även inom avloppsproverna påvisades en signifikant skillnad med en lägre kvot i de utgående proverna. Få av avloppsproverna var dock parade (d.v.s. in, ut från samma verk vid samma tidpunkt). Där det fanns parade prover (n = �) var skillnaden i kvot mellan inkommande och utgående vatten inte signifikant.

Det var ett visst överlapp mellan fördelningarna (djur respektive avlopp) även om det ofta rörde sig om detektionsnivån för djurproverna (Tabell �-1). Prover analyserade från fjäderfä skilde sig signifikant från avloppsproverna även om det från brunnen (�–12 mån) hönsgödsel isolerades presumtiva bifidobakt-erier i samtliga prover av vilka en stor del (�� %) var sorbitolfermenterande. Även alla grisproverna var positiva för presumtiva SFB men med kvoter > �00. Kor bar inte på några SFB, men i vissa prover kunde höga halter a-typiska (ej strikt anaeroba) bakterier isoleras. Ett prov (av fyra) från häst var SFB-positivt med en kvot totala:SFB på 9�� (= 102,9�).

Även om kvoten fekala koliformer:SFB generellt är lägre för avloppsproverna än för djurproverna är spannet i båda fördelningarna stort. En signifikant skillnad påvisades (p < 0,0�) men styrkan i testet var låg.

3.2 Överlevnadochkvotvid22°C

Vattnet påverkade inte överlevnaden eller kvotens utveckling över tiden och resultaten nedan baserar sig helt på studien i ytvatten. I Figur �-1 presente-

1�

Tabell 3-1. Halterna fekala koliformer (FC), presumtiva bifidobakterier (HBSA) och presumtiva sorbitolferment-erande bifidobakterier (HBSA-Y) angivna som log CFU/100 mL eller g (SD) samt kvoterna mellan HBSA:HBSA-Y och HBSA-Y:FC i avloppsvatten och gödsel från olika djurslag.

Provtyp FC HBSA HBSA-Y HBSA:HBSA-Y FC:HBSA-Y

Medel (SD)

Medel (SD)

% pos

Medel (SD)

median min max median min max

Avlopp 100 2,1 1,0 17 2,6 <0,1 464

-in 6,3 (0,7) 6,6 (1,0) 100 6,1 (0,9) 2,9 1,0 17 2,0 <0,1 464

-ut 4,0 (0,4) 4,5 (1,0) 100 4,3 (1,0) 1,6 1,0 8,0 7,5 0,1 9,5

Djur 7,0 (1,3) 6,2 (2,0) 42 4,9 (5,6) 305 1,4 >3100 64 <0,1 >1600

-gris 8,0 (1,1) 7,2 (0,7) 88 5,6 (1,4) 355 305 916 55 1,2 450

-nöt 6,7 (1,1) 6,0 (1,0) 0 3,8 (0,4) >1600 >35 >3100 >505 >1,0 >1600

-häst 5,7 (1,0) 3,9 (1,4) 25 3,8 (0,5) >60 >15 933 >2,5 >0,2 35

-fjäder 7,2 (1,1) 6,6 (2,4) 50 5,7 (1,6) 28 1,4 >550 118 <0,1 >1100

ras halten presumtiva bifidobakterier, uttryckt som log CFU/mL, samt kvoten totala:sorbitolferment-erande bifidobakterier som en funktion av tiden i försöket som utfördes vid 22 °C. Bifidobakterierna avdödades linjärt (p < 0,001; R2 = 0,9�) med en hastighet av 0,�9 log CFU/mL · d (SE = 0,0�). Kvoten ändrades inte signifikant över de tre mättillfällen som togs innan halten var under detektionsnivån (1,0 CFU/mL). Den svagt lutande regressionslinjen är inte signifikant (p = 0,�0; R2 = 0,0�) och ingen signifikant skillnad mellan kvoterna från de tre uttagen kunde heller påvisas (p = 0,�0).

0

1

2

3

4

5

0 5 10

t (dygn)

halt

(log1

0 C

FU/m

l)

3.3 Överlevnadochkvotvid4°C

Vid � °C var avdödningshastigheten signifikant lägre för bifidobakterierna än vid 22 °C, 0,1� log CFU/mL · d (SE = 0,008). Även här stämde en linjär modell väl överens med mätdata (p < 0,001; R2 = 0,9�) (Figur �-2, nedan). Kvoten höll sig stabil vid den lägre temperaturen och inga signifikanta skill-nader kunde påvisas mellan kvoterna för de olika mätpunkterna (p = 0,�0). Regressionslinjen i figur 2 pekar svagt uppåt, men modellen är inte signifikant (p = 0,0�; R2 = 0,22).

Figur 3-1. Halten presumtiva bifidobakterier (vita romber, log CFU/mL) som en funktion av tiden (d) samt kvoten totala:sorbitolfermenterande bifidobakterier (svarta trianglar) i ytvatten vid 22 °C.

1�

3.4 Fekalakoliformer:bifidobakterier

I Figur �-� och �-� visas halten presumtiva SFB tillsammans med halten fekala koliformer som en

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20

t (dygn)

halt

(log1

0 C

FU/m

l)

Figur 3-2. Halten presumtiva bifidobakterier (vita romber, log CFU/mL) som en funktion av tiden (d) samt kvoten totala:sorbitolfermenterande bifidobakterier (svarta trianglar) i ytvatten vid 4 °C.

funktion av tiden i överlevnadsförsöken vid 22 °C respektive � °C. I båda temperaturerna dör bifido-bakterierna av snabbare än de fekala koliforma bakt-erierna. Kvoten fekala koliformer:SBF ökade något snabbare i 22 °C än i � °C, 0,1� (SE = 0,0�; p; R2 = 0,9�) mot 0,11 (SE = 0,02; p; R2 = 0,8�) per dygn.

Figur 3-3. Halten presumtiva sorbitolfermenterande bifidobakterier (gråa kvadrater, log CFU/mL), fekala koliformer (vita romber, log CFU/mL) som en funktion av tiden (d) samt kvoten mellan ovanstående (svarta trianglar) i ytvatten vid 22 °C.

0

1

2

3

4

5

0 5 10

t (dygn)

halt

(log1

0 C

FU/m

l)

1�

Figur 3-4. Halten presumtiva sorbitolfermenterande bifidobakterier (gråa kvadrater, log CFU/mL), fekala koliformer (vita romber, log CFU/mL) som en funktion av tiden (d) samt kvoten mellan ovanstående (svarta trianglar) i ytvatten vid 4 °C.

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20

t (dygn)

halt

(log1

0 C

FU/m

l)

4 Diskussion

Presumtiva SFB fanns i alla avloppsprover men endast i �2 % av djurproverna. Kvoten totala:SFB var signifikant lägre i avloppsproverna än i djurproverna. Medianvärdet var 2,1 i avloppsproverna jämfört med �0� i djurproverna (Tabell �-1). Ett överlapp mellan fördelningarna fanns dock. Framför allt visade sig brunnen hönsgödsel innehålla höga halter SFB och kvoter mellan 1,� och 11,� vilket är i paritet med kvoterna i avloppsvatten. Med tanke på att det var gödsel som lagrats i sex till 12 månader fanns an-tagligen anaeroba zoner med tillväxtmöjligheter för presumtiva SFB i materialet. I en spansk studie var ett av tre prover från hönseriavloppsvatten positivt för SFB med polymerase chain reaction (PCR) – metodik för Bif. adolescentis (som är sorbitolferment-erande). Även avlopp från nöt var positivt vid två av fyra tillfällen (Bonjoch et al. 200�). Inga nötprover var dock positiva i den här studien (Tabell �-1). SFB kunde också isoleras från grisgödsel i fem av sex prover. Kvoten totala:SFB i de positiva proverna låg dock mellan �0� och 91�, d.v.s. mycket högre än i avloppsvatten. Att grisar utsöndrar låga halter SFB har även rapporterats av Long m.fl. (200�). Ett av fyra hästprover i den här studien var positivt med en kvot på 9��, d.v.s. långt över 100 som sattes som

gräns för animal påverkan av Ottoson (200�).Bifidobakterierna dog av log-linjärt i såväl 22 °C

som � °C. I den varmare temperaturen var av-dödningstakten 0,�9 log CFU per mL dygn, vilket är något snabbare än vad Resnick & Levin (1981) rapporterade för Bif. adolescentis i PBS vid 22 ºC. I � °C gick avdödningen långsammare, 0,1� log CFU per mL dygn. För fekala koliformer var motsvarande siffror 0,29 respektive 0,09 log CFU per mL dygn. Trots att bifidobakterier förekommer i högre halt än fekala koliformer och E. coli i avloppsvatten talar den relativt snabbare avdödningstakten mot användandet av dem som indikatorer för fekal förorening då en bra indikator bör ha likvärdig eller bättre överlevnad i miljön än den patogen den ska indikera (Stenström 198�).

Från att ha varit cirka en log lägre från början var halten fekala koliformer högre än bifidobakterierna efter sex dygn i 22 °C och 1� dygn i � °C. Det faktum att kvoten förändras linjärt över tiden, gör att kvoten fekala koliformer:bifidobakterier potentiellt kan användas som en uppskattning på föroreningens ålder. Skillnaden vid källan (utgående avlopp) vari-erade dock mellan 0,�� och �� även om den i de flesta fall låg mellan 1 och 2. Att skillnaden är så pass stor, vilket begränsar möjligheten att utnyttja kvoten för åldersbestämning, kan bero på skillnad i avloppsrening (d.v.s. mer eller mindre luftning) vid olika verk. Just luftningen påverkar grupperna av

1�

bakterierna olika mycket eftersom bifidobakterierna är syrekänsliga.

Med tanke på vad som skrivits om snabbare avdödningstakt för bifidobakterier än fekala koli-former, framför allt i varmare vatten (Rhodes & Kator 1999), är det ändå förvånansvärt liten skillnad mellan avdödningshastigheterna. Att kvoten för-ändrar sig i nästan samma takt i � °C som i 22 °C kan bero på att det vid den lägre temperaturen är en högre halt syre löst i kallare vatten, vilket har en negativ effekt på bifidobakterierna. I en forsande flod, med god syresättning av vattnet, har takten med vilken bifidobakterier reduceras kunnat vara 2� gånger snabbare än avdödningstakten för E. coli (Resnick & Levin 1981).

Det var ingen skillnad med mellan avdödningen för totala presumtiva bifidobakterier jämfört med SFB i någon av temperaturerna, vilket indikerades av kvoternas stabilitet över tiden (Figur �-1 och �-2). Det gör att kvoten totala:SFB är ett potentiellt verktyg att skilja animal från human fekal förorening i ytvatten. Problem som fortfarande återstår att överkomma är dels gödsel från fågel där presumtiva SFB verkar har möjlighet att tillväxa under lagringen. Dessutom har erfarenheter från ytvattenprover (ej publicerade data) visat på a-typisk växt av ej strikta anaerober, såväl sorbitol- som ickesorbitolferment-erande, vilket försvårar tolkningen av resultaten. Flera författare rekommenderar verifiering av bakt-erier isolerade på HBSA (Nebra et al. 200�; Long et al. 200�), t.ex. genom fermentering av fler socker-arter, katalas- och nitratreduktion, gramfärgning och rörlighet eller m.h.a. Bifidobacterium spp.-specifika prober.

HBSA användes p.g.a. att det i fler studier har visat sig vara mer selektivt än andra alternativ så-som Beerens medium, Reinforced Clostridium Agar, BIM-2�-medium och YN-� (Resnick & Levin 1981;(Resnick & Levin 1981; Mara & Oragui 198�; Carrillo et al. 198�; Long et al. 200�). Ett annat alternativ är att använda sig avEtt annat alternativ är att använda sig av PCR-metodik som t.ex. Bonjoch m.fl. (200�). I den studien användes en multiplex PCR för detekt-ion av Bifidobacterium spp., Bif. dentium and Bif. adolescentis. Multiplex PCR är dock inte lika känslig som en vanlig PCR (med en istället för fler primers) eller reltids PCR (qPCR) och metoden därför mest användbar vid kraftigt förorenade vatten (Bonjoch et al. 200�). Utveckling inom qPCR kan däremot vara en väg att snabbare och säkrare bestämma halten av olika arter av bifidobakterier. I och med

att metoden är kvantitativ finns också möjligheten att bestämma kvoten mellan de olika genotyperna för att uppskatta andelen human och animal fekal förorening i ett prov.

5 Slutsatser

Sorbitolfermenterande bifidobakterier (SFB) isol-erades oftare och i högre halter från kommunala avlopp än från djurprover. Kvoten totala:SFB var signifikant högre i djurprover än i avlopp. Däremot utgjorde SFB en stor del av den totala bifidopopulat-ionen i gödsel från fjäderfä.

Kvoten totala:SFB var stabil över tiden i ytvatten vid såväl � °C som vid 22 °C. Kvoten fekala koli-former:SFB ökade däremot med tiden i samma vatten. Ökningstakten var något snabbare vid 22 °C än vid � °C.

Även om SFB är vanligare i avloppsprover än gödsel och andra djurprover bör resultaten från en analys av ytvatten tolkas med stor försiktighet. Dels påvisades presumtiva SFB i gödselprover från fjäder. Dessutom kan mycket a-typisk växt i ytvattenprover förekomma, vilket stör analysen och/eller försvårar tolkningen av resultatet. För en korrekt tolkning av resultaten bör presumtiva bifidobakterier verifieras. Detta innebär dock att metoden förlorar sina egen-skaper av att vara snabb och enkel.

1�

Referenser

Bonjoch X., Balleste E. & Blanch A. R. (200�). Multiplex PCR with 1�S rRNA gene-targeted primers of bifidobacterium spp. to identify sources of fecal pollution. Appl Environ Microbiol, 70(�): �1�1–�.

Burkhardt M. R., Soliven P. P., Werner S. L. & Vaught D. G. (1999). Determinat-ion of submicrogram-per-liter concentrations of caffeine in surface water and groundwater samples by solid-phase extraction and liquid chromatography. J AOAC Int, 82(1): 1�1–�.

Carrillo M., Estrada E. & Hazen T. C. (198�). Survival and enumeration of the fecal indicators Bifidobacterium adolescentis and Escherichia coli in a tropical rain forest watershed. Appl Environ Microbiol, 50(2): ��8–��.

Hirano S., Nordheim E., Arny D. & Upper C. (1982). Lognormal Distribution of Epiphytic Bacterial Populations on Leaf Surfaces. Appl  Environ  Microbiol, 44(�): �9�–�00.

Kühn I., Allestam G., Stenström T. A. & Möllby R. (1991). Biochemical finger-printing of water coliform bacteria, a new method for measuring phenotypic di-versity and for comparing different bacterial populations. Appl Environ Microbiol, 57(11): �1�1–�.

Kühn I., Burman L. G., Haeggman S., Tullus K. & Murray B. E. (199�). Bio-Bio-chemical fingerprinting compared with ribotyping and pulse-field gel electro-phoreses of DNA for epidemiological typing of enterococci. J Clin Microbiol, 33(11): 2812–1�.

Leeming R., Nichols P. D. & Ashbolt N. J. (1998). Distinguishing sources of faecal pollution in Australian inland and coastal waters using sterol biomarkers and microbial faecal indicators. Urban Water Research Association of Australia. Report 20�.

Long S. C., Arango P. C. & Plummer J. D. (200�). An optimized enumeration method for sorbitol-fermenting Bifidobacteria in water samples. Can J Microbiol, 51(�): �1�–22.

Loper J., Suslow T. & Schroth M. (198�). Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere. Phytopathol, 74(12): 1���–�0.

Mara D. D. & Oragui J. I. (198�). Sorbitol-fermenting bifidobacteria as specific indicators of human faecal pollution. J Appl Bacteriol, 55(2): ��9–��.

18

Nebra Y. & Blanch A. R. (1999). A new selective medium for Bifidobacterium spp. Appl Environ Microbiol, 65(11): �1��–�.

Nebra Y., Bonjoch X. & Blanch A. R. (200�). Use ofUse of Bifidobacterium dentium as an indicator of the origin of fecal water pollution. Appl Environ Microbiol, 69(�): 2��1–�.

Ottoson J. (200�). Comparative analysis of pathogen occurrence in wastewater – management strategies for barrier function and microbial control. PhD thesis in Land and Water Resource Sciences, Royal Institute of Technology, KTH. Stockholm.

Resnick I. G. & Levin M. A. (1981). Assessment of bifidobacteria as indicators of human fecal pollution. Appl Environ Microbiol, 42(�): ���–8.

Rhodes M. W. & Kator H. (1999). Sorbitol-fermenting bifidobacteria as indicatorsSorbitol-fermenting bifidobacteria as indicators of diffuse human faecal pollution in estuarine watersheds. J Appl Microbiol, 87(�): �28–��.

Scott T. M., Rose J. B., Jenkins T. M., Farrah S. R. & Lukasik J. (2002). Microbial source tracking: current methodology and future directions. Appl  Environ Microbiol, 68(12): ��9�–80�.

Simpson J. M., Santo Domingo J. W. & Reasoner D. J. (2002). Microbial source tracking: state of the science. Environ Sci Technol, 36(2�): �2�9–88.

Stenström T. A. (198�). Infiltration i mark, mikroorganismers transport och över-levnad. Svenska Naturvårdsverket. SNV pm �0�1. Stockholm.

Taylor H. D. (200�). Surface waters. In Water and wastewater microbiology, eds. D. D. Mara & N. J. Horan, Academic press. London.

TOFPSW (200�). Tracking the origin of facal pollution in surface water. Anicet Blanch. http://www.ub.es/microbiologia/TOFPSW_archives/TOFPSW_FR.pdf. Latest accessed 20/09/200�.

19

Bilaga A: Metodbeskrivning för antalet totala och sorbitolfermenterande presumtiva bifidobakterier

Indikation

Bifidobacterium spp. förekommer i tarmen på människor och djur och kan användas som fekal indikator vid analys av, råvatten samt strandbad. Överlevnaden är dock sämre, framför allt i lite varmare och mer luftat vatten (1� ºC), än för termotoleranta koliformer (Rhodes & Kator 19991999). Sorbitolfermenterande presumtiva bifidobakterier är de som vid jäsning av sorbitol ger gula kolonier på ett definierat medium, Human Bifid Sorbitol Agar (HBSA) (Mara & Oragui 198�198�).

Kvantitativ analys av antalet totala och sorbitolfermenterande presumtiva bifidobakterier sker med standardiserad metodik enligt SS 0281��:2 (SS 199�).

För att säkerställa fekal påverkan kan även analys av alternativa fekala indikatorer såsom E. coli, fekala streptokocker, kolifager och sulfitreducerande clostridier utföras.

Analysprincip/teststrategi

Med presumtiva bifidobakterier menas de bakterier som kan bilda kolonier med en diameter större än 0,� mm vid anaerob odling på HBSA vid �� ± 1 °C under �� ± � timmar. Med presumtiva sorbitolferment-erande bifidobakterier menas de bakterier som blir gulfärgade enligt ovan och som dessutom inte kan till-växa aerobt.

Kvantitativ analys sker med membranfiltrering.

Apparatur

Membranfiltreringsutrustning Inkubator �� ± 1 °C

Material

AnaerobklockaAnaerobkatalysatorMembranfilter 0,�� µm. Svarta (t.ex. Sartorius 1�90�-0��ACR)Pincett med plana spetsarPipetter, sterila, 10 mL(Öglor, 10 µL)

20

Reagens

HBSA, (Receptbeskrivning se nedan)

Ingrediens Ex. På leverantör

Sorbitol 10 g Sigma (S-1876)

Polypepton 10 g BBL 211910

Jästextrakt 20 g Scharlau (131659)

Natriumklorid 3,2 g

Bromokreosollila 0,1 g Merck (2557427)

Casaminosyra 8 g Difco (0231-17-2)

Destillerat vatten 1 L

Beredning

Koka ingredienserna i tio minuter till dess att de är lösta.Tillsätt �0 mg Nalidixinsyra (Sigma N-88�8) och 0,�0 g Cystein hydroklorid (Sigma C-12��).Korrigera pH till �,9.Tillsätt 1� g agar och autoklaveraEfter autoklavering, tillsätt 10 IU Polymixin B (Sigma P-9�02) och �0 µg kanamycinsulfat (Sigma K-�000).Gjut plattorHållbarhet i � °C, � veckor.

ReferensstammarPositiv kontroll: Bifidobacterium adolescentis    ATCC 1��0�A-typisk kontroll: Enterococcus faecalis          ATCC 29212Negativ kontroll: E. coli                     ATCC 2�922

Analysprocedur

ProvsättningMärk agarplattorna enligt provsättningstabell.Filtrera provet enligt SS 0281��:2 (SS 199�).

InkuberingStapla plattorna i en anaerobklocka tillsammans med katalysatorn.Inkubera anaerobt med agarytan ner i �� ± 1 °C under �� ± � tim.

AvläsningBörja med största filtrerade volym. Om koloniantalet totalt överstiger ca 200 CFU fortsätt till nästa lägre filtrerade volym samt ange för första filtrerade volymen på avläsningsprotokollet:TNTC = too numerous to count eller kvantifiering ej möjlig p.g.a. överväxt av atypisk bakterieflora.Avräkna totala antalet kolonier större än 0,� mm i diameter.Avräkna antalet gula kolonier större än 0,� mm i diameter.

Anm: Atypiska kolonierAtypisk flora kan vara vanlig. Den utgörs ofta av fakultativa anaerober, såsom Ent. faecalis, som växer ut långsammare än bifidobakterierna och är signifikant mindre till storlek (< 0,� mm) (Nebra & Blanch 19991999).

1.2.

1.2.

21

VerifieringIngen ytterligare verifiering än kontroll för obligat anaerobiosis ingår i metoden, men bör utföras om man vill vara säker på att de avräknade kolonierna utgörs av bifidobakterier (Long et al. 200�). Plocka kolonier och stryk på HBSA eller Reinforced Clostridium Agar (RCA) med sorbitol (Long et al. 200�). Inkubera aerobt i �� ± 1 °C under 2� ± � tim för kontroll av obligat anaerobiosis.

Verifiering kan vidare göras med gramfärgning, glukos- och laktosfermentering, nitrat- och katalas-reduktion samt rörlighet enligt Long m.fl. (200�) eller med specifika prober enligt Nebra m.fl. (200�).

Uträkning

I svaret ska antalet bifidobakterier/100 mL och antalet sorbitolfermenterande bifidobakterier/100 mL anges.Beräkna antalet presumtiva bifidobakterier /100 mL enligt följande formel

∑ n1+n2... n = avräknade kolonier på ett filter 1, 2__________ x100∑ V1+V2... V = provvolym filtrerad genom filter 1, 2

Beräkna halten sorbitolfermenterande (gula) presumtiva bifidobakterier/100 mL på samma sätt.

Ex Avläsning Analysvol100 mL

Analysvol10 mL

Uträkn. SvarCFU/100mL

1 Totala > 0,5 mm

Gula > 0,5 mm

82

73

4

6

(82+4)·100100+10

(73+6)·100100+10

Bifidobakterier 78

Sorbitolf. Bif.72

2 Totala > 0,5 mmA-typ

1Ca 200

3Ca 200

Bifidobakterier påvisade.Kvantifiering ej möjlig p.g.a överväxt av atypisk bakterieflora.

Kvalitetssäkring

Gör löpande kontroll på sterilitet av sköljvätska och spädningsvätska med ingjutning av 1 mL i jäst-peptonagar varje analysdag. Temperatur i inkubatorer avläses, antecknas och signeras varje arbetsdag.Loggbok förs vid all tillverkning av substrat (uppvägd mängd, totalmängd och pH).Kontroll av koloniutseende och växt på varje ny sats av i metoden ingående substrat.

Prestanda

Kvantifiering är ej möjlig om totala antalet utväxta kolonier överstiger 200 per filterMembranfiltrering jämfört med ytspridning på ett oselektivt medium bör visa > 80 % i utbyte.Följande tabell visar noggrannhet med 9� % konfidensintervall

Antal kolonier Nedre gräns Övre gräns

1 0,025 5,6

5 1,6 11,7

10 4,8 18,7

≥20 –100 kolonier C-2(1+√C) C+2(2+√C)

C = antal kolonier.

•

•••

•••

22

Mätintervall

Halter mellan 1–20000/100 mL kan kvantifieras.Om högre antal förväntas görs direktutstryk med 0,1 mL på HBSA.

Signeringavanalysresultat

Provsvar signeras av ansvarig vattenundersökare.Laboratorieprotokoll signeras av den person som utfört respektive avläst analysen.

Säkerhetsaspekter

Nalidixinsyra kan vara retande.

Referenser

Rhodes M.W. & Kator H. (1999). Sorbitol-fermenting bifidobacteria as indicators of diffuse human faecal1999). Sorbitol-fermenting bifidobacteria as indicators of diffuse human faecal pollution in estuarine watersheds. J Appl Microbiol 87:�28–���.

Mara D.D. & Oragui J.I. (198�). Sorbitol-fermenting bifidobacteria as specific indicators of human faecal198�). Sorbitol-fermenting bifidobacteria as specific indicators of human faecal pollution. J Appl Bacteriol 55:��9–���.

SS (199�). Svensk Standard 0281��:2. Vattenundersökningar – Koliforma bakterier, termotoleranta koliforma bakterier och Escherichia coli i vatten – Bestämning med membranfiltermetod (MF).

Nebra Y. & Blanch A.R. (1999). A new selective medium for1999). A new selective medium for Bifidobacterium spp. Appl Environ Microbiol 65:�1��–�1��.

Long S.C., Arango P.C. & Plummer J.D. (200�). An optimized enumeration method for sorbitol-ferment-ing Bifidobacteria in water samples. Can J Microbiol 51:�1�–�22

Nebra Y., Bonjoch X. & Blanch A.R. (200�). Use of200�). Use of Bifidobacterium dentium as an indicator of the origin of fecal water pollution. Appl Environ Microbiol 69:2��1–2���.

Spårning

av fekal föro

rening m

ed hjälp

av Bifi

do

bakteriern

Box 47607 117 94 Stockholm

Tfn 08 506 002 00

Fax 08 506 002 10

E-post svensktvatten@svensktvatten.se

www.svensktvatten.se