2018RAPPORT

STRATEGIMØTE 2017

Kvalitetskontroll av genteknologiske metoderProgram • Oppsummering • Abstrakter

Redaktører:Andreas Christensen, St. Olavs hospitalØyvind Kommedal, Haukeland UniversitetssjukehusGarth Tylden, Universitetssykehuset Nord-Norge, TromsøRikard Rykkvin, Folkehelseinstituttet

Referansegruppe for ekstern kvalitetssikring i virologi og serologi

Strategimøte oktober 2017

Kvalitetskontroll av genteknologiske metoder

Program ● Oppsummering ● Abstrakter

Redaktører:

Andreas Christensen, St. Olavs hospital

Øyvind Kommedal, Haukeland Universitetssjukehus

Garth Tylden, Universitetssykehuset Nord-Norge, Tromsø

Rikard Rykkvin, Folkehelseinstituttet

Referansegruppen for ekstern kvalitetssikring i virologi og serologi

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

2

Utgitt av Folkehelseinstituttet September 2018

Tittel: Strategimøte oktober 2017 Kvalitetskontroll av genteknologiske metoder

Forfatter(e): Andreas Christensen, Øyvind Kommedal, Garth Tylden, Rikard Rykkvin.

Oppdragsgiver: Referansegruppen for ekstern kvalitetssikring i virologi og serologi

Publikasjonstype: Strategirapport virologi og serologi

Bestilling: Rapporten kan lastes ned som pdf på Folkehelseinstituttets nettsider: www.fhi.no

Grafisk designmal: Per Kristian Svendsen og Grete Søimer

Grafisk design omslag: Fete Typer

ISBN elektronisk utgave: ISBN: 978-82-8082-950-4

Sitering: Christensen A, Kommedal Ø, Tylden G, Rykkvin R. Strategimøte 2017: Kvalitetskontroll av genteknologiske metoder, Folkehelseinstituttet med flere. Rapport september 2018. Tilgjengelig på www.fhi.no

ProgrammetvarsattsammenavenprogramkomitebeståendeavØyvindKommedal,GarthTylden,RikardRykkvinogAndreasChristensen(leder).

MøtelederevarØyvindKommedal(delI)ogFredrikMüller(delII).

Programkomiteensmedlemmererogsåredaktøreravrapporten.

Rapporteninneholderoppsummeringoganbefalingerslikdetkomframpåmøtetsamtsammendragavforedragene(manuskriptene)somergjengittisinhelhet.

Oslo,august2018

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

3

Innhold

Innledning ________________________________________________________________________ 4

Program __________________________________________________________________________ 5

Oppsummering og anbefalinger _______________________________________________________ 6Design av tester 6Validering og verifisering – kvalitative analyser 7Internkontroller 7Black box-systemer 8Løpende vurdering av ytelse basert på driftskontroll 9Kvantitative analyser 10Kvalitet i den daglige rutine 10

PCR-design _______________________________________________________________________ 13

Validering og verifisering av genteknologiske metoder ____________________________________ 15Valideringsparametere 16Verifiseringsparametere 16«Hvor mange prøver bør inngå i validering/verifisering?» 16Andre aspekter 16Spørsmål til diskusjon 16Referanser 17

Use of Internal Controls in Clinical Molecular Virology Testing ______________________________ 18

Black box-systemer ________________________________________________________________ 21

Løpende vurdering av ytelse, avvikskriterier ____________________________________________ 24

Kvantitative genteknologiske analyser _________________________________________________ 26Validering og verifisering 26Estimering av måleusikkerhet 27Løpende vurdering av ytelse 28Referanser 28

Kvalitet i det daglige og feilsøking ____________________________________________________ 29

Deltakerliste______________________________________________________________________ 31

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

4

Innledning

Andreas Christensen, Avd. for medisinsk mikrobiologi, St. Olavs hospital E-post: andreas.christensen@stolav.no Kvalitetskontrollavinfeksjonsserologiskemetodervartemaforstrategimøteti2016ogdeterdermednaturligåfølgeoppmedkvalitetssikringavmolekylærgenetiskemetoderiår.Påmøtetifjorbledetgittdetaljerteanbefalingeromvalidering/verifisering,intern-kontroller,usikkerhetsbedømmelse,gråsonerogtolkning.Genteknologiskemetoderskillersegbetydeligfraserologi,ogkvalitetssikringsrutinenemånødvendigvisværenoeulike.Idetmedisinskmikrobiologiskemiljøharvikommetlangtmht.genetiskkunnskap,etableringavegnetester,analytiskevalueringoglaboratorierutiner(foråunngåforurensning).Denteknologiskeutviklingharogsåkommetlangtogviharmegetgodemetoderfornukleinsyre-ekstraksjon,amplifikasjonogdeteksjon.Likevel,deternoenlikhetspunktermellomserologioggenteknologiogspørsmåleteromviikkeharlittålæreavserologene.Dettegjelderspesieltforløpendekvalitetskontrollidendagligerutinebasertpådriftskontrollogbrukavinternasjonalestandarder.Validering,verifiseringogløpendekvalitetskontrollvilværehovedfokusfordettemøtet.

EtannetproblemsomvivilmøteiøkendeomfangitidenframovererknyttettilPCR-teknologienssværthøyesensitivitet.DNAellerRNAfraenrekkemikroorganismerkanværepåvisbartikliniskematerialerutenatfunnetharkliniskrelevans.Dettekanskyldesasymptomatiskprimærinfeksjon,persistensellerreaktivering.Problemeterspesieltrelevantforbredemultiplex-panelersomidagtasmerogmeribruk,ogdetantasåøkeendameriomfangmednestegenerasjonsekvensering(NGS).Etbetydeligarbeidmht.vurderingavkliniskrelevansavulikefunnstårforanoss.TidenermedandreordikkemodenforåtabredeåpnepanelerellerNGSrettinnirutinediagnostikken.Forskningoggrundigevalideringerpåforhåndernødvendig.Manbøravsammegrunnerværetilbakeholdenmedåtaibrukkommersielle,såkalte«black-box»-systemersomikkegirtilgangpåfluorescenskurver,primer-ellerprobesekvenser.Slikinformasjonvilværenødvendigforågjørelokalevalideringer.Denneproblematikkenvilblibelystfraulikesideriløpetavmøtet.

Andreaktuelletemaersomkanværeaktuellefordiskusjonpåmøtet,ogitidenframover,er:

• Valgavin-housevs.kommersielletester• Børmanrutinemessigvurdereallekurver?• Pasientnærdiagnostikk.Hvembørgjøredette?Børvihadøgnberedskapfor

enkeltePCRer?

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

5

”Referansegruppeforeksternkvalitetssikringivirologiogserologi”invitererlandetsmikrobiologiskelaboratoriertilstrategimøteom

Kvalitetskontroll av genteknologiske metoder

Møtedato:26.10.2017

Møtested:Gjestehuset,Lovisenbergsykehus,Oslo

Program:

Møteledere:ØyvindKommedalogFredrikMüller

Tidspunkt Tid Tittel Foredragsholder

09.45 -10.00 15 min Frukt og kaffe

10.00-10.05 5 min Velkommen Innledning ved leder for referansegruppen Helvi Holm Samdal

Del I: Møteleder Øyvind Kommedal

10.05 -10.20 15 min Kvalitetssikring av genteknologiske metoder – innledning

Andreas Christensen

10.20 -10.55 35 min Design av tester, optimalisering Kåre Bergh

10.55 -11.10 15 min Kaffepause

11.10 -11.40 30 min Validering og verifisering Fredrik Müller

11.40 -12.05 25 min Bruk av kontroller Amir Moghaddam

Del II: Møteleder Fredrik Müller

12.05 –12.30 25 min Kvantitative analyser Rikard Rykkvin

12.30 -13.30 60 min Lunsj

13.30 –13.55 25 min Løpende vurdering av ytelse, avvikskriterier Karoline Bragstad

13.55 -14.15 20 min Black box-systemer Garth Tylden

14.15 -14.45 30 min Kvalitet i den daglige rutine og feilsøk Øyvind Kommedal

14.45 -15.30 45 min Oppsummering. Anbefalinger Møteledere

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

6

Oppsummering og anbefalinger

Design av tester

VurderingavprimereogprobersdesignsamttemperaturprofilogreagenskonsentrasjonererselvsagteelementerikvalitetsvurderingenavegenutvikledePCR-tester,menerogsåheltnødvendigetrinnivurderingenavpubliserteogkommersielletester.Unntakkangjøresforkommersielletesterderreagenserogsekvensererbedriftshemmeligheter,menreferanse-gruppenanserikkedettesomengunstigsituasjon.ÅpenhetrundtPCR-testersdesignfremmerfagligutveksling,økermuligheteneforåfinnefeilogbidrardermedisisteinstanstilgoddiagnostiskkvalitet.

Gradavsekvenslikhetmellomprimere/proberogmålsekvensvurderesvedhjelpavdatabasesøksomf.eks.BLAST-søk.Søkemåteogvalgavdatabasereravgjørende.Væroppmerksompåatfeilforekommerbådeidatabaserogipublisertesekvenser.NCBI’sgenbankerdenmestomfattendeogmestbrukteavdatabasene.Spesifisitet,menogsåtilenvissgradsensitivitet,kanbedømmeselektronisk(insilico)vedslikeanalyser.

Sjekklistefordesignavprimereogprober:

• Primereervanligvisrundt20baserlange,probernoelengre• Smeltetemperaturforprimereliggeroftestiområdet50-60grader• Forprobererdetvanligåleggesmeltetemperaturen5-10graderhøyere• Arbeidstemperatur(«annealing»-temperatur)eroftest2-5graderlavereenn

smeltepunktetforprimere• Primer-dimererbørunngås(spesielti3’ende)• Hårnålsformasjonerbørogsåunngås,mentolereresistørregradenndimerer• Repeterendesekvenserbørunngås(maksimumfiredi-ellermononukleotider

etterhverandre)• G/C-andeleni3’endebørværelav(helstfærreenntreblantdesistefem

nukleotidene)• Degenererteprimerebørbrukesmedforsiktighet,oggenereltikkeoverstigetotil

tredegenererteposisjonerperprimer-/probesekvens• DeterstortslingringsmonnnårdetgjelderPCR-produktetsstørrelse,mendeter

vanligåleggesegpå100-300baseparforreal-time-PCR’er.

Etgodtutvalgavprogramvareertilgjengeligforsekvens-ogstrukturanalyseravprimereogprober.Detmåforøvrignevnesattilsynelatendedårligeprimerelikevelkanfungereypperligipraksis.

Idagforetrekkesreal-time-formatetideallerflestesammenhenger,ogdeteksjons-systemeneTaqManogFRETdominerer.Sistnevntemuliggjørsmeltepunktsanalyser.FluorescerendefargestoffersombindersegtildobbelttrådetDNA(f.eks.SYBRGreen)kanogsåbenyttessomdeteksjonssystem,mendennemetodenbenyttesstadigmindre.Denkanværenyttigtilfeilsøkvedspørsmålomprobesviktellertilanalyserderprobeikkeeraktuellsomf.eks.16S-DNA-PCR.Slikefargestofferervelegnettilsmeltepunktsanalyser.

Alternativeprinsippersomkanbidratiloptimaliseringavprimer-ogprobedesignerdualprimingoligonucleotide(DPO),lockednucleicacid(LNA)ellerpeptidenucleicacid(PNA).

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

7

MålingavenPCR’seffektiviteterenessensielldelavkvalitetsvurderingenavenPCR.Eneffektivitetpå90-110%tilstrebes.Vedlaveffektivitetforsøkesførstoptimaliseringavreaksjonsbetingelsene.Spesieltendringeriannealing-temperaturellerMgCl-konsentrasjonkanhastorbetydning.Vedfortsattlaveffektivitetmåredesignavprimereogprobervurderes.

Validering og verifisering – kvalitative analyser

Vedenvalideringdokumenterermanatenmetodeellertesteregnetforsittformål.Verifiseringermindreomfattendeoginnebæreratmandokumentererattestenfungereridetenkeltelaboratorium.Dettevilforutsetteatenvalideringerutførtetannetsted.

Genteknologiskemetoderforpåvisningavmikrobiologiskeagenseridagistorgradegenutviklede.Forsliketestermålaboratorietselvgjørevalideringen.Forkommersielletesterellertesterutvikletvedandrelaboratoriervilenverifiseringværetilstrekkelig.Publikasjonerivitenskapeligetidsskrifterkanbrukessomgrunnlagienvalideringogvilisåfallkunneredusereomfangetavvalideringen.

Envalideringbøromfatteminimum40-50prøver(25%positive,25%svaktpositiveog50%negative).Vedenverifiseringkandetværetilstrekkeligmedhalvparten.Vedvalideringellerverifiseringavtesterforsjeldneellerlitekjenteagenskandethendemanmåklaresegmedetlavereantall.Bådepositiveognegativeprøvermåværeavdentypenprøvematerialersomtestennormaltvilanvendespå.

Endetaljertplanmålagespåforhåndforbådevalideringerogverifiseringerogmåomfattemetodebeskrivelse,aktuelleprøvematerialer,kontroller,opplæring,kontinuerligoppfølging,besvarelseidatasystemet,ogkravtilparameteresomskalværetilfredsstiltforengodkjenning.Vedenvalideringbørparameterneomfatteanalytiskspesifisitet,diagnostisksensitivitet,nøyaktighet,presisjon(repeterbarhetogreproduserbarhet),deteksjonsgrenseoglinearitet(sistnevntekunforkvantitativemetoder).PresisjonkantallfestesmedCohen’skappa-koeffisientsombørvære>0,75.Vedenverifiseringvildetvanligvisværetilstrekkeligmednøyaktighetogpresisjon.

Envaliderings-ellerverifiseringsrapportmåskrivesietterkant.Idenneskaltestensytelsevurderesoppmotkravenesomblestiltpåforhånd,ograpportenskalendemedkonklusjonengodkjent/ikkegodkjent.Referansegruppenoppfordrertilutvekslingavvalideringsrapportermellomlaboratoriersomvurdereridentisketester.Dettevilværebetydeligarbeidsbesparendeformottakerlaboratoriene.

DeteridagkravomCE-merkingavegenprodusertePCR-tester.Viviseridenforbindelsetil«GuideforvalideringogCE-merkingavegenutvikledemolekylærbiologiskediagnostisketester».DenneerlagetavenarbeidsgruppefordemikrobiologiskelaboratorieneiNorge,ogfinnespåMikInfo.

Internkontroller

Eninternkontrollbørværeenkontrollsomdekkeralletrinniendiagnostisktest,inklusiveekstraksjonen.Dettekanoppnåsvedåtilsettekontrollenførekstraksjonstrinnet(eksogenkontroll)ellervedåundersøkeforhumantgenmaterialesomalleredefinnesimaterialet(endogenkontroll).

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

8

DNA-kontrollerbenyttesforbakterierogDNA-virus.RNA-kontrollerbenyttesforRNA-virus.RNA-kontrollervilvanligvisværeeksogenetranskripter,menendogeneRNA-kontrollerkanogsådesignes.Dissebørinkludereetsplicing-sete.DettevilhindrekonkurransemedhumantgenomiskDNA,somvilinkludereetintronogikkelasegamplifiserepågrunnavdenstoreavstandenmellomprimerne.

Brukavendogenekontrollererpraktiskogenkeltettersommanslipperåpreparereogtilsetteekstramateriale.Itilleggfårmanenkontrollpåprøvetakingen.Detteermestaktueltforpenselprøverogskyllematerialerderkvalitetenpåprøvetakingenkanvarierebetydelig.Endogenekontrollererikkeegnettilcellefattigematerialerdermengdenhumantgenmaterialeerliten,sliksomf.eks.spinalvæsker.Isliketilfellermåmantilsetteeksogenekontroller.

Eksogenekontrollerharellersdenfordelatkonsentrasjonenkanreguleres.Dermedkanmanangietområde(Ct-verdi-intervall)somsignaletforventesåhavneinnenfor.Detteøkermulighetentilåavdekkepartiellinhibisjon,noesomermestaktueltforprøve-materialermedstabilkvalitet.Eneksogenkontrollvilderforværehensiktsmessigformaterialersomblod,spinalvæsker,serumogleddvæsker.Detsammegjelderforprøvematerialerderhemmingeretvelkjentproblemsomforeksempelfeces.Forkvantitativetesterereksogenekontrollerheltnødvendigettersomdissetestenemåkalibreresmotkontrollermedetdefinertogstabiltkopitall.

Eksogenekontrollerbørtilsetteslyseringsbufferenderdetteermulig.ForDNA-kontrollerkanmanalternativtgjøretilsettingeniekstraksjonsmiksen.

VæroppmerksompåateninternkontrollsomkjøresimultiplexmeddiagnostiskPCRkankonkurrereomnukleotiderogenzymerogdermedhemmedendiagnostiskePCR-reaksjonen.Detteproblemetkanløsesvedåbrukelavekonsentrasjoneravkontroll-primereog/ellerselvekontrollen.EtannetalternativeråbenytteGC-rikekontrollermedhøyeresmeltepunktenndiagnostiskmålsekvens.MeddettefavoriserermandiagnostiskPCR.Kontrollreaksjonenefårdasuboptimaleforholdogforbrukermindrereagenser.Pådenannensidemåmanpassepååjustereforholdeneslikatmanlikeveloppnårrobustamplifikasjon.Kontroll-PCR’enekanalternativtkjøresseparatforslikåunngåkonkurranse.

Designedekontrollermedbindingsstederfortestensprimereihverende,menmeduliksekvensforprobe(homologekontroller),ersværtvelegnedesominhibisjonskontrollersamtsomkontrollerikvantitativetester.Hermåmandogværespesieltoppmerksompåkonkurranse.Reaksjonenevilkonkurrereogsåomprimere(ikkebarenukleotiderogenzymer).

InternkontrollererikkenødvendigeforPCR’erbenyttettilgenotyping.DetteersupplerendePCR’ersomgjørespåmaterialesomalleredeerkonfirmertpositiveforaktuelleagens.Endaenkontrollanseesunødvendig.

Detbørværeetmålatallenyeanalysersominnføresharenadekvatinternkontrollogatmanpåsiktogsåinnførerdettepåeldreanalysersommanglerinternkontroll.Tilgjengelighetenpåkommersiellekontrollermedangittkopitallbliridagstadigbedre.

Black box-systemer Medbegrepet«black-box-systemer»menesherkommersielletestsystemermedbedrifts-internekomponenter.Detteinnebæreratbrukereikkeharinnsynisentraleprosesser.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

9

Ofteerprimer-ogprobesekvenserhemmeligeogfluorescenskurverutilgjengelige.Detteharblittvanligereidesenereåreneogskaperproblemerformedisinskmikrobiologiskelaboratorier.Vedvurderingavenkeltresultaterskliniskebetydningermanofteavhengigavslikedata.Detteerspesieltaktueltveduventedeelleravvikenderesultater.Medslikesystemeroverførermanipraksisdeleravdetmedisinskeansvarettilprodusenten.Dettemenervieruheldig,ogvianbefalerderforattestprodusentertilgjengeliggjørprimer-ogprobesekvenser,fluorescenskurveroginformasjonomekstraksjonsmetodikk.Vedanskaffelseravnyekommersielletesteranbefalerviitilleggatmedisinskmikrobiologiskelaboratoriervelgeråpnesystemermedtilgangpåamplifikasjonskurverogsekvensdataderdetteermulig.Egenutvikledetesterbøravsammegrunnerforetrekkesderdetteerhensiktsmessig.

Resultaterfrablackbox-systemerbørregelmessigkontrolleresmedegenutvikledemetoder.Løpendebioinformatiskovervåkingavtreffsikkerhetentilalleprimereogprober(bådetilgjengeligekommersielleogegenutviklede)børogsåinnføres.

Løpende vurdering av ytelse basert på driftskontroll Kontinuerligovervåkingavenkvalitativtestsnøyaktighetogpresisjonbaserespåenpositivdriftskontrollmedkjentsignalstyrke.Detertilstrekkeligmedénkontrollperoppsett.Forkommersielletesterkanleverandøruavhengigkontrollbenyttesihvertoppsett,ellersometminimum,vedtestingavhvernyebatchfraleverandør.

DetervanligåfortynnekontrollenslikatdenleggersegmidtilineærtområdefortestenmedCt-verdierrundt28-30.Denpositivekontrollenkanværeetplasmidellerkunenkjentpositivprøve.Plasmiderforetrekkesdadisseerlettereåstandardiseresamtgirmengdernoktilåvareiårevis.

AvvikskriterieneersomforserologisketesterogbaserespåWestgardsregler(serapportenKvalitetskontrollavinfeksjonsserologiskemetoderfra2016).Erfaringviserdogatenaksjonsgrensepå2standardavvikofteerforstreng.VariasjonenfrakjøringtilkjøringerforstorforkvalitativePCR-analyser,ogdetharblittalminneligåbaseresegpå±2sykluser(Ct-trinn)istedet.EnlikepragmatisktilnærmingvilværeåsetteminimumCV%til2,5%.Dvs.dersomCV%målestilmindreenn2,5%ienvalidering/verifiseringsåerstattesdenneav2,5%,somsåbenyttestilåsetteoppaksjonsgrensene.Dettevilgiomtrentsammeslingringsmonnsom±2Ct-trinnioptimalsone(Ct-verdiermellom25og30),ogstørreslingringsmonnvedsvakesignaler–noesomkanværegunstig.Herkanmanvelgedenmetodensompasserbestinnilokalerutinerogtillaboratorietsprogramvare.BruddpåWestgardsreglerbørføretilomkjøring,menmanmåbrukeskjønn.Vedf.eks.forsterkpositivkontrollkannegativeresultatergodkjennes.VedhyppigealarmerkandetværeaktueltågjøreennyberegningavstandardavvikogCV%basertpåetstørrematerialeforslikåfangeoppmeravdennaturligevariasjonen.

Itillegghørerdetmedennegativkontrollsommanglertemplatsekvensenihvertoppsett.Ethvertutslagidennekontrollenanseessomavvik.

Løpendebioinformatiskkontrollavprimereogproberbørinnføres.Jf.avsnittetoveromblackbox-systemer.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

10

Kvantitative analyser

Valideringogløpendevurderingavkvantitativegenteknologiskeanalyserfølgerdesammeprinsippenesomforkvalitativeanalyser,mendetstillesspesiellekravtilberegningene.Deforholdsomgjelderspesifiktforkvantitativeanalyservilbliomtalther.

Kvantitativegenteknologiskeanalyserermestaktuellepåmaterialersomfullblodogplasma.Detteermaterialersomdeterlettåtastandardiserteprøverav.Analyseneanvendestilmonitoreringavsykdomsforløpellerbehandlingseffektvedinfeksjonermedf.eks.HBV,HCV,HIV,CMVellerEBV.Forandrematerialersomf.eks.luftveismaterialeellerbiopsierkansåkaltnormaliseringbenyttes.Dettevilikkeblinærmereomtaltidennerapporten.

DeterviktigåmerkesegatPCR-resultatermedbenevningeneIU/mlellerkopier/mlikkeernormalfordeltenårdeuttrykkespåvanligaritmetiskskala.Fordelingeneblirtilnærmetnormalisertetterlogaritmisktransformasjonogdetanbefalesderforatmangjørenlog10-transformasjonførmangjørstatistiskeberegninger.Ct-verdierrepresenterertilnærmetlog2-transformerteverdieravnukleinsyrekonsentrasjonerogegnersegderforfaktiskogsåbedretilstatistiskeberegningerennaritmetiskekonsentrasjonsverdier,menmanmisterdakorreksjonenfrastandardkurven.Logtransformertekonsentrasjonsverdiererderforåforetrekke.

Validering Presisjon(reproduserbarhetogrepeterbarhet)børoppgissomlog10SD.Denbørdessutenoppgisfortrenivåer(sterktpositiv,svaktpositivognærdeteksjonsgrensen).SD<0,19log10kanaksepteres.

Linearitetberegnespåenfortynningsserie(ofteoveretområdepå6-7log10)ogangismedkorrelasjonskoeffisientenR2(børværenær1,minimumsgrense0,7).Deteksjonsgrensensamtøvrekvantiteringsgrenseilineærtområdeberegnesogsåienslikanalyse.

Måleusikkerhetavhengeravpresisjonberegnetundervalideringogbøroftestinkluderesivalideringsrapportentilkvantitativeanalyser.Beregningenbaserespåstørstpåvistestandardavvikitestensmåleområdeogangissom95%konfidensintervall.Merkatdetendeligekonfidensintervallethvismanrapportererverdierpåenaritmetiskskalavilværeasymmetrisketterlog10/exp10-transformasjon.

Løpende vurdering av ytelse AlarmgrensenefordriftskontrolleniLewey-Jennings-ellerWestgard-plotbørberegnesetterlog10-transformasjonførdeevt.transformerestilbakesombeskrevetoverhvismanønskeråopereremedverdierpåaritmetiskskala.OmregningavalarmgrensenetilCt-verdierellerkopitallkangjøresavhengigavlaboratorietsrutinerogdatasystem.EttersomkvantitativeanalyserrelaterestilenstandardkanWestgardsreglerbenyttes.Somnevntovererdissekriterieneofteforstrengeforkvalitativeanalyser.

Kvalitet i den daglige rutine

Dendagligevurderingavtestresultatersammenholdtmedkliniskeopplysningerogsupplerendeundersøkelsereretviktigsistetrinnikvalitetskontrollenavgenteknologiskemetoder.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

11

EthyppigproblemersværtsvakesignalermedCt-verdierrundt40.Dissekanrepresentereuspesifikkereaksjonerellersværtlavmengdeavmålsekvensiprøven.Svakeuspesifikkereaksjonerkanellersskyldesprobesvikt(såkalt«dropoff»ellerdegradering)somførertiluspesifikkaktiveringavfluoroforen.Uspesifikkamplifikasjonavhumantgenmaterialeerenannenmulighet.DetharværtdiskutertommanbørinnføregråsonerforPCR-analyserpåtilsvarendemåtesomforserologisketester.Formenpåamplifikasjonskurven,kliniskbilde,typeprøvematerialeogtidligereprøveresultaterharstorbetydningvedvurderingenavslikeresultater,ogdeterderforvanskeligåholdepåetlikestrengtgråsonesystemsomforserologisketester.VianbefalerhelleratresultatermedCt-verdieriområdet38ogoppovervurderesmedspesiellårvåkenhet,ogatmanharlavterskelforåkjøreslikeprøveromigjen.GenereltbørmanværeforsiktigmedågodtapositiveresultatermedCt-verdierover40,iallefallikkeforTaqman-probersomermestutsattforprobesvikt.

Ennegativinternkontrollogsamtidignegativtresultatbørføretilataktuelleprøveundersøkespånytt.Etnegativtresultatforpositivkontrollbørføretilatallenegativeprøverietoppsettkjørespånytt.Positiveresultaterkangisut.Vedandreavvikvildetvarierehvorvidtheleellerbaredeleravoppsettetbørkjøresomigjen.

Hvisreanalyseikkeløserproblemetmåmanleggeenplanforutvidetfeilsøk.Væroppmerksompåatnegativeinternkontrollerkanskyldesandreforholdenninhibitoreriprøvematerialet.ValgavforsendelsesmediumogfortynningsbufferkanforeksempelpåvirkeekstraksjonenseffektivitetdaenkelteekstraksjonsmetoderersensitiveforendringeripHellersaltkonsentrasjoner.Tilstedeværelseavinhibitoreriprøvematerialetkanavdekkesvedåfortynneprøven1/10ogundersøkedenneparalleltmedufortynnetprøve.Dersomdenfortynnedeprøvengirsterkestsignaltyderdettepåinhibisjon.Denbestekvalitetskontrollenidagligrutineereneksogeninternkontrollsomtilsettesførekstraksjonogdermanharvurdertogdefinertetintervallsomdennemåfalleinnenfor.DersommanakseptererenhvilkensomhelstCt-verdiforinternkontrollenvilmanmistemulighetentilåoppdagepartiellinhibisjon.

Amplikon-forurensningeridagetlangtmindreproblemennforfåårsiden.Detteskyldesinnføringavrealtime-teknologiogbrukavuracilN-glykosylase(UNG).Problemeterlikevelikkeeliminert,ogdeterviktigåopprettholdegodelaboratorierutinerforåunngåforurensning.Lavgradigeforurensningerkanværevanskeligeåoppdageogkreverårvåkenhetavbioingeniørerogleger.Tegnpåforurensningkanværepositiveutslaginegativekontroller,påfallendemangesvaktpositiveprøverperoppsettellerflerepositiveprøverfrapasientermedliterelevantklinikk.Vedmistankeomforurensningbørførstetiltakværeåtesteetoppsettmedkjentenegativeprøver.Laboratorietmåhaetablerterutinerfortiltakvedbekreftetforurensning.

KrysskontamineringunderprøvebehandlingellerPCR-oppsettkanforekommebådeiautomatiserteogmanuellearbeidsflyter.Tegnpåkrysskontamineringvilværedesammesomforamplikon-forurensing.Vedmistankeomkrysskontamineringiautomatiserteoppsettbørmankjøreettestoppsettmedvekselsvispositiveognegativprøver(sjakk-mønster).VedspørsmålomkrysskontamineringavenkeltprøverbørprøvenekstraherespånyttføromkjøringavPCR,forslikåkontrollereforkrysskontamineringogsåitrinneneførogunderekstraksjon.

Falsktpositiveresultaterietrealtime-PCR-oppsettkansomnevnthamangeårsaker.Avvikendeamplifikasjonskurvererhyppigveduspesifikkereaksjoner(manglendeeksponentiellfaseertypisk).Alleamplifikasjonskurverbørderforinspiseres.Detvarierermellomlaboratorierhvorvidtdeterleger,bioingeniørerellermolekylærbiologersomgjør

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

12

dette.Detvariererogsåhvorvidtkurvervurderesavénellertopersoner.Detavgjørendeeratinformasjonomavvikendeamplifikasjonskurvernårframtillegensomgjørdenhelhetligemedisinskevurderingen.

Detvariererogsåfralaboratoriumtillaboratoriumommankjørerenkeltprøverellerdubletterforutvalgtematerialer.Vianbefaleratspinalvæskerfrapasientermedreelmistankeommeningittellerencefalittkjøressomdubletter.Veddiskrepansmellomdublettenemåbeggekjørespånyttfortynnetogufortynnet.Negativtresultatialleparallellervedomkjøringtolkessomuspesifiktresultatiførstekjøring.Dublettkjøringøkerdendiagnostiskepresisjonnoe,mendennegevinstenmåveiesoppmotdenøkteressursbruken.Strategienerderformestaktuellitilfellermedalvorligsykdomderresultatetgirbehandlingsmessigkonsekvens.Ideflesteandretilfellerkanmannøyesegmedomkjøringvedusikreresultater,alternativtkanmanbeomnyprøve.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

13

PCR-design

Kåre Bergh, Avd. for medisinsk mikrobiologi, St. Olavs hospital E-post: kare.bergh@stolav.no IinnleggetvilomtalesendelgrunnleggendemomenterfordesignavPCRmedbakgrunnivalgavmålseter,oligonukleotidegenskaper,mulighetforåvelgemetoderavhengigavformåletmedanalysen.NoenviktigemomenterformodifiseringavingredienserogoptimaliseringavPCRvilbliomtalt.

Bioinformatiskarbeidernødvendigforåfinneegnedemålseter,entenviaåsøkekjentesekvenserfragenerigendatabaser,ellerf.eksetteråhafunnetegnede,evtunikegenerfrahelgenomsekvenser.Obs!resulataterkanværesterktavhengigavsøkemåte.Ettervalgavprimernemåspesifisitetinsilicokontrolleres.

OptimaleprimereergrunnleggendeforPCRsfunksjon.Myeerkunnskapbasertpåempiri,menvisseprinsippererfornuftigåbenytteforålagegodtfungerendePCR-assay.Detskaldogbemerkesatteoretisk”håpløse”primerekanvisesegåfungere.Motsattvilogsånoeskuffenderesultatkunneobserveresmedteoretiskgodeprimere.

Mangetarutgangspunktiønsketprimerlengde,gjerneca.18-22nukleotider(nt)menkanvariereganskemye.Primernessmeltetemperaturvilofteværeiområdet50-60oCogbørværerelativtlikemeddifferanse<5oC.Nukleotidsammensetningenønskesrelativtbalansert.Arbeidstemperatur(annealingtemperatur)iPCRvilsomregelværenoe(ca2-5oC)lavereennprimernessmeltetemperatur.Modifikasjoneravprimernekangjøresforåoppnåønskedetemperaturer,f.eksvedåøkelengdeellerendrepurin-ogpyrimidin-sammensetningen.Dinukleotid-repetisjonerbørikkeoverskride4,rekkefølgeavsamment(”runs”)vilofteværeakseptabelthvisikkemerenn4nt.3’-endeavprimererkritiskforPCRogbørikkeværeforsterktbundettiltemplatet(dvshelstmaksimum3G/Cblantde5sistenti3-enden).Primerdimererbørsøkesunngått,spesielt3’-endenetilstrebesfrieogutenkomplementaritet,mensinternebindinger(<8nt?)oftevilkunnetolereres.Detfinnesgodedataprogrammersomernyttigefordisseanalyser,inklanalyseavhårnålsstrukturerogøvrigemomenterforetgodtprimerdesign.

Real-timePCRerklartmestbenyttetidag.DeteksjonavPCR-produktireal-timekanoppnåsvedinterkalerendefluoroforersomfluorescerernårbundettildsDNA(eksSYBRGreen,EVAGreen).ForåoppnåbedresikkerhetomatPCR-produkteterkorrektkanPCRetterfølgesavensmeltepunktanalysehvorsmeltekurvenskalsammenfallemedaktuellpositivkontroll.Detkanlagesprobermedhøyeresmeltetemperaturennprimerne.Probebaserteassayvilderforkunnegiytterligeresikkerhet(spesifisitet)forkorrektamplikon.Mestbenytteter5’eksonukleasesensitivprobesomavgirfluorescensnårDNApolymerasenkommertil5’ntiprobensomkuttes(TaqMan-assay)ellervedhybridiseringsprobersomavgirsignalnårbeggenærtlokaliserteprobersamtidigerbundettiltemplatet,FRET-proberharværtmestbenyttet.HvisbehovforålageenkortereprobevilMGB(«Minor-GrooveBindingprobe»)kunnebenyttes.

ForåforbedreetPCRassayvilmodifikasjonerofteværenødvendigellerønskelig.Dettekaninnbefatteendringmhtmålsekvensen,menkanogsåomfattestrategiendringiformavDPO(dualprimingoligonucleotide)ellernukleotidmodifikasjonersomLNA(lockednucleicacid)ellerPNA(peptidenucleicacid).

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

14

VedsidenavPCRfordeteksjonavspesifikkegeneridefinerteorganismer,kanPCRbenyttestilflereformål:bl.a.kvantitativeanalyserellergenotypiskeanalyserf.eks.mutasjonsdeteksjon.Endelprinsipperformutasjonsdeteksjonmedogutenbrukavprobervilbliomtalt.Probeuavhengigmetodeerillustrertnedenfor.FRET-proberogSimpleProbeereksemplerpåprobersomkanbrukestilmutasjonsanalyse.

Eksempel på probeuavhengig mutasjonsdeteksjon basert på interkalerende fluorofor (SYBR Green)

NårinnledendeanalyserviseratPCRfungerererdetnødvendigåoptimaliserestringens-ogøvrigereaksjonsbetingelserformaksimalsensitivitetogspesifisitet.Verifiseringavreaksjonenseffektivitethørermed.Vedreal-timePCRkandetteenkeltgjøresvedåberegnestigningskoeffisientenienfortynningsrekkeavproduktetplottetmotCT-verdier.

Referanser

EtpargodeoversikterovermomenterknyttettiloptimaliseringavPCRvilkunnevære:

• Kapittel4«OptimizationofPCR»iPCRSecondEditionavM.McPhersonogS.Møller,Taylor&FrancisGroup.(BokenerforøvrigutmerketogsåsombasiskunnskapforPCR).

• Lorentz,T.C.PolymeraseChainReaction:BasicProtocolPlusTroubleshootingandOptimizationStrategies.J.Vis.Exp.(63),e3998,doi:10.3791/3998(2012).

Detforeliggermangegodeoversikterpåprodusentersnettsider.Etpareksemplerpådetteer:

• http://www.bio-rad.com/en-no/applications-technologies/pcr-assay-design-optimization

• SelectionofHybridizationProbeSequencesforUsewiththeLightCycler.RocheMolecularBiochemicalsTechnicalNoteNo.LC6/99.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

15

Validering og verifisering av genteknologiske metoder

Fredrik Müller, Avdeling for mikrobiologi, Oslo universitetssykehus E-post: fmuller@ous-hf.no Kravtilvalideringellerverifiseringavmetodererbasertpåkraviakkrediterings-standardenNS-ENISO15189(1),dissekraveneernærmereomtaltiNA-dokument48b(2).Mangeavdesammekravenekangjenfinnesi«IVD-direktivet»(3).DettevilblierstattetavIVD-regulativet(4)medvirkningfra2022.

Analysemetodeneinnenvirologiomfatterdelskommersielletester,delsegenutviklede(«inhouse»)tester.Særliginnennukleinsyrepåvisningerdetetbetydeliginnslagavegenutvikledetestersomeribrukvedmangenorskelaboratorier.Inneninfeksjons-serologianvendesiallhovedsakkommersielletester.KommersielletestererihovedsakIVD-godkjent,detvilsiatdeervalidertavprodusentihenholdtilkraveneiIVD-direktivet.

Vedvalideringavenanalysemetodekontrolleresogdokumenteresdetatmetodeneregnetforsittformål.Valideringerenomfattendeprosess.«Validationdeterminesthatwearedoingthecorrecttest”(5).IfølgeISO15189skalvalideringenværesåomfattendesomnødvendig,ogskalvedframleggingavobjektivtbevis(iformavanalysekarakteristika)bekrefteatdespesiellekravenefordentiltenktebrukenavanalysenharblittoppfylt.Alleegenutvikledemetodermåvalideresavlaboratoriet.

Verifiseringavenanalysemetodeerenmindreomfattendeprosessdermetodensprestasjonerbekreftesavlaboratoriet.«Verificationconfirmsthatwearedoingthetestcorrectly»(5).Kommersielle,IVD-godkjentemetodermåverifiseresavlaboratoriet.

Forutforenvalideringellerverifiseringmådetgjennomføresenplanleggingsprosessderbehovfornyanalysevurderesoghvorvidtplanlagtanalysemetodeeregnetforformålet.Foregenutvikledemetodervildetogsåofteværenødvendigmedenutviklingsprosessderulikemetodevarianterprøvesut(seegetinnleggomdesignogoptimaliseringavtester).

Bådevedvalideringogverifiseringmådetlagesenplandermandefinererhvasomskalutføres,hvilketyperprøvematerialesomeraktuelle,hvemsomskalgjøreoppgavene,tidsbrukoghvemsomeransvarlige.Deterviktigådefineregodkjenningskriterierformetodeniplanen.Enperson(medgodkjentkompetanse)måangissomvalideringsansvarligformetoden.Dervalideringsansvarligikkeerlege,vildetværenødvendigogsååhamedenmedisinsk-fagligansvarlig.Bådeegnedataogdatafralitteratur,leverandør,andrelaboratorieretckaninngåivalideringen/verifiseringen.

Nårarbeideterutførtetterplan,skrivesdetenrapportderresultatenepresenteresogderdetkonkludereshvorvidtanalysensgodkjenningskriteriererinnfriddogomanalyseneregnetforformålet.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

16

Itilleggerdetenrekkeandreforholdsommåpåplassføranalysenkantasibruk,såsomvalgoginnstillingavkontrollerogvalgavSLP(sammenliknendelaboratorieprøving)-program(seegetinnleggombrukavkontroller),metodebeskrivelse(prosedyre),eventuelleendringeriandredokumenterikvalitetssystemet,opplæringavpersonell,endringerilaboratoriedatasystemet,valgavøkonomisketakster,eventuellfleksibelakkreditering(omrelevant),mv.Dettekanfeksdokumenteresienendringskontrollmedutgangspunktienmalderdissemomenteneertattmedogdertidspunktforiverksettingavmetodendokumenteres.

Valideringsparametere

Valideringsparameteremåvelgesogbegrunnes.Enrekkeparameterekanværerelevante:Spesifisitet,riktighet,presisjon(repeterbarhet,reproduserbarhet),deteksjonsgrense,interferens,sporbarhet,robusthetogPCR-effektivitet(nårrelevant).Forkvantitativemetodervilparameteresomlinearitet,måleområdeogkvantiteringsgrenseogsåværerelevante(seegetinnleggomkvantitativemetoder).

Verifiseringsparametere

Hererkravenemindreomfattende.Aktuelleparameterekanværeriktighet,presisjon(repeterbarhet,reproduserbarhet),spesifisitet,mv.

«Hvor mange prøver bør inngå i validering/verifisering?»

Antallprøversomskalinkluderesienvalideringellerverifiseringmåbaserespåstatistiskevurderinger.Flerepublikasjonergirforslagtilprøveantall,bl.a.referanse5og6.

Andre aspekter Preanalytiskeforhold,instrumenterogannetutstyr(medkravtilvedlikehold,servicemv),tilkoblingtillaboratoriedatasystemet(kreververifisering),lokaler,opplæringoggodkjenningavpersonell,postanalytiskeforhold,mvmåogsåvurderes.Itilleggmådetsettesoppenplanforoppfølgingavmetoden(seegetinnleggomløpendevurderingavytelseogavvikskriterier).

Spørsmål til diskusjon

• Børlaboratorieneistørregradsamarbeideomvalideringerogverifiseringer?• Hvordansørgervifortilstrekkeligopplæringivalideringogverifiseringinnen

medisinskmikrobiologi?• NyttIVD-regulativ:Ihvilkengradkanvifortsettemedegenprodusertetesteride

kommendeår?

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

17

Referanser

1. NS-ENISO15189:2012:Medisinskelaboratorier.Kravtilkvalitetogkompetanse.2. NA-Doknr.48b.Medisinskmikrobiologi.Norskakkreditering,2016.3. Directive98/79/ECoftheEuropeanParliamentandoftheCouncilof27October

1998oninvitrodiagnosticmedicaldevices.http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A31998L0079

4. Regulation(EU)2017/746oftheEuropeanParliamentandoftheCouncilof5April2017oninvitrodiagnosticmedicaldevicesandrepealingDirective98/79/ECandCommissionDecision2010/227/EU.http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=CELEX%3A32017R0746

5. JenningsL,VanDeerlinVM,GulleyMI.RecommendedPrinciplesandPracticesforValidatingClinicalMolecularPathologyTests.ArchPatholLabMed2009;133;743-55.

6. BurdEM.ValidationofLaboratory-DevelopedMolecularAssaysforInfectiousDiseases.ClinMicrobiolRev2010;23:550-76.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

18

Use of Internal Controls in Clinical Molecular Virology Testing

Amir Moghaddam, Fürst Medisinsk Laboratorium, Søren Bulls vei 25, 1051 Oslo E-post: amoghaddam@furst.no Nucleicacidamplificationtests(NAATs)forviraltargetsmakeuseofinternalcontrolstomonitorsampleextractionandinhibitionofreversetranscription,amplificationanddetection.Internalcontroliscrucialinclinicalmolecularvirologytests,inordertoreportnegativepatientresultswithconfidence.ForRNAviruses,useofRNAinternalcontroliscrucialtomonitorreversetranscriptioninhibition,whilstforDNAviruses,DNAinternalcontrolispreferred.EndogenouscontrolsmakeuseofDNAorRNApresentinpatient’ssamplesandareidealtomonitortheentireprocessofpatientsampling,nucleicacidextraction,reversetranscriptionifnecessary,andamplification.However,itisdifficulttohaveauniformcopynumberforendogenousinternalcontrols.Spikingwithexogenousinternalcontrolisthemostpracticalandpreferredmethodinmostroutineclinicallaboratories.Exogenouscontrolscanmakeuseofsameprimersastheviraltargetsequencebutwithanalteredprobebindingsiteandthesearereferredtoascompetitiveinternalcontrols.Non-competitiveinternalcontrolsmakeuseofcompletelyunrelatedprimersandprobes.Exogenousinternalcontrolscanbespikedintothesampleatthesametimeaslysisbuffers,orinthereversetranscription/amplificationmastermix.

Thechoiceofinternalcontrolwilldependonseveralfactorsandbelowareguidelinesinchoosingtheappropriateinternalcontrolwithexamplesandreferences.Thelistisnotexhaustivebutaguideline.Weareassumingthatclinicalsamplestobetestedareprimarysamplesfrompatientsandnotcultured.

1. AnEndogenousinternalcontrol,iehumanDNAormRNA,shouldbechosenwhenevertestingforcellularityofthesamplegivesconfidencetoqualityofsampling,transport,nucleicacidextractionandNAATtest.

• ExamplesoftargetincludeRnasePgene,b-globingene,GAPDH,endogenousretrovirus1

• IftargetingRNA,amplificationshouldgoacrossalargeintronsothatamplificationisfromcDNAandnotgDNA.

• AnexampleistestingforHPVwhereitisimportanttoknowthatsufficientnumberofcellshavebeensampledfromthecervix.

• Anotherexampleiswhentestingforvirusesinparaffinsections,lesions,Broncheoalveolarlavageandcerebralspinalfluid.AtestforhumanDNAormRNAwillshowthatextractionofnucleicacidfromthesectionhasbeensuccessful2.

• Somesamplesarehighlycellular(e.g.nasopharyngealswabscrapings)andtestforhumanDNA/RNAmayoutcompetethevirusofinterestifperformedinmultiplex.

• Samplessuchasserum,plasmaurine,stool,althoughitispossibletodetecthumanDNAandtousethatasendogenousinternalcontrol,theresultwillvaryfromonesampletoanothergreatlyanddifficulttostandardizeforroutineanalysisandtomeetCE-IVDrequirements.

2. Exogenousinternalcontrols,e.g.invitrotranscribedRNA,plasmidDNA,DNAamplicons,Armoured-RNA3shouldbeintroducedintothelysisbuffer,priortoextractionfromclinicalsample,wheneverpossible.Thecontrolsneedtobe

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

19

titratedsoasnottocompetewiththetargetduringreversetranscription,amplificationanddetection.Newautomatedextractionplatformsmaynotallowalteringvolumeoflysisbuffersintroughsandmaynotalloweasymixinginofexogenousinternalcontrols.

3. ExogenousRNAinternalcontrolsshouldbeaddedtolysisbufferstoallowcontrolofdownstreamdetectionofRNAseactivityandinhibition.AnexampleisNAATsforHCVandHIV.

4. ExogenousDNAinternalcontrolscanbeaddedtoamplificationmix,ifaddingtolysisbufferpriortoextractionisnotdesiredorpractical.

5. Primersfortheinternalcontrolandtheamountofinternalcontrolshouldbesuchthatamplificationofinternalcontroldoesnotcompetewithamplificationoftarget4.SomelaboratoriesuseinternalcontrolswithhighGCrichcontenttomakethemuncompetitive5.

6. Internalcontrolswithsameprimerbindingsequencesastargetviruscancompetewiththetarget,however,theyareusefulforcontrollingforPCRinhibition6andquantification.

7. Generally,whenperformingvirustypingassaysordrugresistancetesting,internalcontrolisnotrequiredaslongasallvirustypesarecoveredintheassay.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

20

References

1. WhileyDM,MackayIM,SyrmisMW,WittMJ,SlootsTP.Detectionanddifferentiationofherpessimplexvirustypes1and2byaduplexLightCyclerPCRthatincorporatesaninternalcontrolPCRreaction.JClinVirol2004;30(1):32–8.

2. TachikawaR,TomiiK,SeoR,NagataK,OtsukaK,NakagawaA,etal.DetectionofHerpesVirusesbyMultiplexandReal-TimePolymeraseChainReactioninBronchoalveolarLavageFluidofPatientswithAcuteLungInjuryorAcuteRespiratoryDistressSyndrome.Respiration2014;87(4):279–86.

3. ZhaoL,LiR,LiuA,ZhaoS.AnovelduplexrealtimequantitativereversetranscriptionpolymerasechainreactionforrubellaviruswitharmoredRNAasanoncompetitiveinternalpositivecontrol.JVirolMethods2015;219:84–9.

4. HoffmannB,BeerM,SchelpC,SchirrmeierH,DepnerK.Validationofareal-timeRT-PCRassayforsensitiveandspecificdetectionofclassicalswinefever.JVirolMethods.2005;130(1–2):36–44.

5. DingleKE,CrookD,JefferyK.StableandnoncompetitiveRNAinternalcontrolforroutineclinicaldiagnosticreversetranscription-PCR.JClinMicrobiol2004;42(3):1003–11.

6. HartleifS,GöhringK,GoelzR,JahnG,HamprechtK.QuantitativemonitoringofHCMVDNAlactiainhumanmilkbyrealtimePCRassay:Implementationofinternalcontrolcontributestostandardizationandqualitycontrol.JVirolMethods2016;237:101–6.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

21

Black box-systemer

Garth Tylden, Avdeling for mikrobiologi og smittevern, Universitetssykehuset Nord-Norge, Tromsø E-post: garth.tylden@unn.no Blackboxerenbetegnelseforprosesserellerinstrumentermedkomponentersomerukjenteforbrukeren.Ikliniskmikrobiologigjelderdettekommersielleanalysermedulikebedriftsinternekomponenter.

Verifiseringavblackboxmetodereruproblematiskogbaserersegpåsammenligningmedtidligereverifisertemetodermedutvalgtepasientprøverogsammenlignendeprøver(SLP).LøpendekvalitetssikringkreverdeltagelseiSLP-programmerogovervåkningavkitavhengigeoguavhengigekontroller(seinnleggomvalideringogverifiseringidennerapportenogvirologiskstrategirapport2016:Kvalitetskontrollavinfeksjonsserologiskemetoder).

Flereavvåreviktigsteanalyserutføresmedkommersielleblackboxsystemer.DelsskyldesdetteatdetlengeharværtlovpålagtåbrukeCE-merkedemetoderforblodsmitte-virusogvisseandrekommersieltviktigeagens,plassertikategoriAogBiEUdirektiv98/79/ECoglovommedisinskutstyr.Forendelandreagenshardetsenerekommetkommersielleanalysermedet-trinnshåndtering.Disseerattraktiveforbrukiakuttesituasjoner,utenforlaboratorietsåpningstidogforåutvidedetdiagnostiskerepertoaretpåenkeltvis.

Hemmeligholdavnukleotidsekvensenetilproberogprimereeretproblematiskaspektvedmangeblackboxanalyser.Kontrollavanalysenssensitivitetogspesifisitetmotpublisertesekvensererdaikkemuligforbrukeren.Viktigeaspekteravdetmedisinskeansvaretoverlatesdermedtilprodusenten.

Kommersielleanalysererikkealltiddebesteanalysene.Genetiskeendringersomstadigoppstårhosmikroorganismerogsvakheterimetodedesignkanføretildiagnostisksvikt.Sviktikommersielleanalyserharførttilbådeunder-[1]ogoverdiagnostisering[2].Betydningenavdiagnostisksviktforfolkehelsenunderstrekesvedfrem-seleksjonavdiagnostisk-escape-varianteribefolkningen[3].Egenutvikledemetoderkanforandresrasktforåtahøydefornyesekvensvarianter.Daøkonomiskehensynveiertyngstforprodusentene,fallerikkederesinteresseralltidsammenmedhelseforetakenesogpasientenesinteresserogutbedringavkommersiellemetoderkantalangtid.

Forandringerireguleringogfremskrittinnenforautomatisering[4]oginsilico-valideringavdiagnostiskePCR-analyservarslerendredeforholdforegenutvikledevs.kommersielleanalyseriløpetavnestetiår.

DennyeEU-reguleringen(EU/2017/746),gjeldendefra2022,erstatteragenslisteneAogBmedeninndelingfraA-Dbasertpåmateriale,sykdommensalvorlighetsgrad,smitte-mekanismeogsmittefare.DennyekategoriseringenskaperromfortolkningmendeterlikevelklartatflereagensvilkreveCE-godkjenteanalyser.KravenetilCE-godkjenningblirogsåskjerpet.SamtidigfritasakkreditertelaboratorierfrakravomCE-godkjenningunderenrekkeforutsetninger,deriblantatdriftenbegrensestil«ikke-industriellskala»ogatdetikkefinnesmarkedsførte,CE-godkjenteanalysersomtilfredsstiller«pasientgruppensspesifikkebehovpåetpassendeytelsesnivå».

FremskrittmedautomatiseringavegenutvikledePCRanalyserkangjørelaboratorieneistandtilåsettesammenetrepertoaravanalysersompassertilpasienteneilaboratoriets

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

22

nedslagsfeltmedstorgradavfleksibilitetogeffektivitet.DetviktigstefremskritteterutviklingavuniversellePCRbetingelserslikatheltulikeagensfraulikematerialerkandetekteressamtidigisammePCRoppsett[4].Dettebetyratsmåskalaanalyserkanpotensieltutføresmedtilnærmetlikeffektivitetsomstorskalaanalyser.

Insilico-ellerelektroniskvalideringavdiagnostiskePCR-analysergårutpååestimerespesifisitetogsensitivitetelektronisk.Sekvensenetilprimereogprobersjekkesmotmikrobielleoghumanesekvenserfradatabaserforpredikertspesifikkoguspesifikkbinding,amplifikasjonogdeteksjon.Mangevariablerpåvirkerresultatene,inkludertvalgavdatabase,søkebegrep(nukleotidsekvensenesomdannersøkegrunnlaget),mismatch-toleranse,ogmetoderforåfinnesekvensersomPCR-analysenikkevilkunnedetekteremensombørdetekteres(sterktforandretellermanglendeprimer/probe-bindingsseterhosensannpatogen).SvenskeFolkhälsomyndighetenharutvikletetprogramforelektroniskvalideringavdiagnostiskPCRkaltSmiPrimer[5].FolkhälsomyndighetentilbyrSmiPrimersomentjenestehvorPCR-analyserinnlosjeresforkontinuerligovervåkningavvaliditetihenholdtiltilgjengeligsekvensdata.

SystematiskelektroniskovervåkningavPCR-validiteterhittilikkeetablertiNorge.DeenkeltelaboratorienebrukerulikevarianteravBLASTanalyser(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)kombinertmedmanuellemismatch-analyser.Slikesøkealgoritmertesterhovedsakeligspesifisitet.Etkomplettestimatavsensitivitetkanikkefåssidensekvenserhentesfrembasertpålikhetmedsøkebegrepet.Manfåraltsåikkeoversiktoversekvensermedomfattendemutasjonerellerhvorbindingssetermanglertotalt.Meddenstadigøkendemengdensekvensdata,vilmanuellbearbeidingrasktbliforomfattendeforrutine-diagnostiskelaboratorier.DetvoksendedatagrunnlagetøkersamtidigrelevansenavelektroniskvalideringforløpendekvalitetssikringavdiagnostiskPCR.

DeterbehovforåbyggeoppkompetanseogutvikleverktøyforovervåkningavPCR-validitetiNorge.Etableringavetsentraliserttilbudvilgiflerefordeler,deriblantforenkletetablering,ogløpendekvalitetssikringavegenutvikledePCRforlaboratoriene.Manvilkunnefåenoversiktoversamletanalytiskberedskapilandetpåsekvensnivå.Informasjonenomforventetytelseavdeenkelteanalysenevilhjelpelaboratorienemedådefinereet«passendeytelsesnivå»forkommersielleanalyser.

Brukavblackboxmetoderkanseespåsom«outsourcing»avdetbioteknologiskearbeidet.Dettesvekkerfagutviklingenimedisinskmikrobiologi.Foråtryggediagnostikkenogsikrefagutviklingenbørbrukenavblackboxmetoderbegrenses.Negative,positiveogkvantitativeresultaterfrablackboxmetoderbørkontrolleresmedegenproduserteanalyser,medenhyppighetsomavhengeravmetodensomskalkontrolleres.Etreferansesenterforinsilico-overvåkningavlaboratorienesegenprodusertePCRanalyserbøretableres.

Anbefalinger

• Begrensebrukenavanalysermedskjulteprimer/probe-sekvensero Pasientnæreanalyserbegrensestilø-hjelpogutenforvanligarbeidstid

§ Resultaterbørkontrolleresmedalternativemetoder• OppretteensentraliserttjenesteforinsilicoovervåkningavPCR-validitet

o Kontrollererprimereogprobermotpublisertesekvensero Rapportereromsviktipredikertspesifisitetogsensitivitet

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

23

o LandsdekkendeløpendeoversiktavinsilicoPCR-validiteto Setterstandardforakseptabelinsilcokvalitetskontrollforkommersielle

aktører

Referanser

1. Ripa,T.andP.A.Nilsson,AChlamydiatrachomatisstrainwitha377-bpdeletioninthecrypticplasmidcausingfalse-negativenucleicacidamplificationtests.SexTransmDis,2007.34(5):p.255-6.

2. Blanc,D.S.,etal.,HighProportionofWronglyIdentifiedMethicillin-ResistantStaphylococcusaureusCarriersbyUseofaRapidCommercialPCRAssayDuetoPresenceofStaphylococcalCassetteChromosomeElementLackingthemecAGene.JournalofClinicalMicrobiology,2011.49(2):p.722-724.

3. Klint,M.,etal.,PrevalencetrendsinSwedenforthenewvariantofChlamydiatrachomatis.ClinicalMicrobiologyandInfection,2011.17(5):p.683-689.

4. Greub,G.,etal.,TenyearsofR&Dandfullautomationinmoleculardiagnosis.FutureMicrobiology,2016.11(3):p.403-425.

5. Alm,E.,Utvecklingavettautomatisktvarningssystemförprimersochprobes.2016,Folkhälsomyndigheten.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

24

Løpende vurdering av ytelse, avvikskriterier

Karoline Bragstad, Avdeling for Influensa, Folkehelseinstituttet E-post: karoline.bragstad@fhi.no Polymerasekjederaksjon(PCR)utgjøridagenstordelavdiagnostikkeninnenforbådebakteriologiogvirologiogergrunnsteinenforvidereavanserteanalyser,fraisoleringavspesifikkegenertildybdesekvenseringavhelegenom,oghardermedblittenavdemestbruktelaboratorieteknikkene.Vedbrukavhydrolyseprobererdiagnostikkogovervåkingmuligisanntid.Økningenavreporterfluorescenserproporsjonalmedmengdenavamplikonmåltmedhøyfølsomhet.Nettopppågrunnavdenhøyefølsomheten,erdetviktigmedkvalitetssikring/kvalitetskontroll(QA/QC)foråforhindrekontamineringogfalsktpositiveellernegativeresultater.

Hovedmåletmedvelfungerendereal-timePCR-analysereråproduseredatasomervitenskapeliggyldig,juridiskforsvarligogavkjentogdokumentertkvalitetisamsvarmednasjonaleoggjerneinternasjonaleanerkjentestandarder.Vurderingavytelsegjørespåbakgrunnavkontrollmaterialenesominkluderesianalysen,bådeinnenforenanalyse-kjørsel,menogsåpåanalyserutførtovertid.Hvormyeavvikkantillates,ellerhvoroftetillatesdetatavvikforegår,foratenanalyseoppfyllerkvalitetskravetoghvordanmålesdettebest?Ytelsesmonitoreringbrukesforåbestemmestatuspåenprøvesomgodkjent/ikkegodkjentidiagnostiskassayogsamtidigløpendevurderingogforbedringavytelsen.Verdierfragjentatttestingavkvalitetskontrollerbørregistreresvedhvertbruk,blievaluertstatistiskovertidogytelsesintervallvurderesmedjevnemellomrom.

Forutenkontrollpådefysiskerammenerundtenanalysesomlokaler,utstyr,personale,reagenseroggoderutienergenereltsåmådetgjøresløpendekontrollogvurderingavenanalyseogforkvalitativeanalyserstårLevey-JenningsplotogWestgardreglenesentralt.Fornoenanalyserkandetværeaktueltåsetteenenkelkontrollterskelsomgjerneeretgjennomsnittavverdierforetkontrollmaterialeplussellerminus2ellertrestandard-avvik.Dersomikkeregelensettesforstrengtsåvilenenkeltregel-kvalitetskontroll-prosedyrekunnegienakseptabeltlavavvisningsrate,spesielthvisviktigefeilogsåkanpåvisesi90%avgangene.Enslikprosedyreeroftetilstrekkeligvedhøyautomatiskeogveldigpresiseanalyser.Forbedreåkunnepåviseanalytiskefeilmedmetodenogfåetlaverenivåavfalskeavvisningeravanalysersåbrukesgjernemultiregel-kvalitetskontrollisteden.Regelenbrukesgjernedersomfeilianalysenvanskeligerekanpåvises.Detbrukesenkombinasjonavkontrollreglerforåbestemmeomenanalysekjørselerinnenforelleruteavkontroll.MedWestgard-prosedyrenbrukes5forskjelligekontrollreglerforåbestemmeakseptansenavenanalytiskkjørsel.Trenderbrukesogsåoftesomenegenkontrollregel,mendakandetgåtidførfeiloppdages.

Idagfinnesdettemplatfilerfornedlastingogegneprogrammerforføringavkontroll-verdiernoesomgjørløpendevurderingavanalysermerstandardisertogforenklet.Datagrunnlagetbørminstinkludere10datapunkterfrauavhengigeanalyseroghvor«outlayers»erekskludert.Nyegjennomsnittbørgenereshvert10-20analysekjørseloggjennomsnittenebørholdesoppmothverandreovertidogakseptantsintervallforverdieneløpendevurderes.Kontrollenebørlignemestmuligprøvenemanskalanalysereogideflestetilfellerhaenkonsentrasjonsomligger10-100gangerhøyereenndeteksjonsgrensentilanalysen.Enfor«god»kontrollvilikkekunnesignaliserefeilvedanalysenlikegodt.Hvilketiltaksomskaliverksettesbasertpådenløpendeovervåkingen

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

25

avanalysenavhengerveldigavanalysenogdekriteriersomersattforåakseptereenpositivprøve.

Nyutvikledeanalyserpånyeagens,ellernyeprøvematerialerkankrevestørregradavkontrollbehovennanalyserhvormanergodtkjentmedprøvematerialetelleragens.Dersomdetagenssominngårianalysenforandrersegovertid,villøpendevurderingavprimersekvenserværeessensieltforhvordananalysenfungerer.Detfinnesprogrammeridaghvoretbibliotekavprimereautomatiskkanvurderesoppmotetreferansesettavagensforløpendevurderingavprimermismatch.Manuellbioinformatiskanalyseavprimerevedhurtigvarierendeagensertidkrevendeogblirofteenflaskehalsivurderingsarbeidetmedenanalyse.

Determangefaktoreråtahensyntilogmedvissegrunnprinsipperibunnsåmådetgjøresenindividuellvurderingforhveranalyseomhvilkefaktorersomskalinngåidenløpendevurderingenoghvilkekriteriersomskalværegjeldendeforåsikreananalysesomerstabiltogsommankanstolepå.

Referanser

• Westgard,BasicQualitycontrolPractices,ISBN1-886958-30-0• WestgardJO,BarryPL,HuntMR,GrothT.Amulti-ruleShewhartchartforquality

controlinclinicalchemistry.ClinChem1981;27:493-501.• www.westgard.com

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

26

Kvantitative genteknologiske analyser

Rikard Rykkvin, Avdeling for tuberkulose, blod- og seksuell smitte, Folkehelseinstituttet E-post: rikard.rykkvin@fhi.no

Validering og verifisering

Mangeavelementenesominngårivalideringogverifiseringerdesammeforkvalitativesomforkvantitativeanalysemetoder.Idetfølgendeomtalesdeparameteresomentenkunerrelevanteforkvantitativemetoderellersommåberegnesannerledesnårmetodenerkvantitativ.

Genereltvedstatistiskbehandlingavmåleresultaterfrakvantitativegenteknologiskemetoderhvorverdieneoppgispåaritmetiskskala(foreksempelIU/mliabsoluttetall)anbefalesåførstlogtransformereverdienesomskalanalyseres[1,2],fordi:

1. DenfundamentalemåleenhetensomkvantitativPCRutledesfra(CT-verdier)erlogaritmiskisinnatur(log2vedperfektPCR-effektivitet),mensaritmetiskeabsolutteverdiersomoppgissomsluttresultateranti-logtransformertfraCT-verdiene(ogstandardisert).Dettetilsieratserieravlogtransformertemåleresultatervilværenærmerenormalfordeltennlineæremåleserier,ogdermedegnesegbedreforstatistiskbehandling.

2. Metodeneharetbredtmåleområde.

Riktighet Tilforskjellfrakvalitativetesterhvorriktighetundersøkesvedåberegnediagnostisksensitivitet,spesifisitetogeventueltCohen’skappa,anbefalesdetforkvantitativetesteråplotteparvisemålingerutførtmednyvs.etablertmetode(forventetverdi).Manbørinkludereminst40(validering)eller20(verifisering)prøverfordeltforeksempelsom1/3negative,1/3lavepositiveog1/3høyepositiveprøver[3].

1. Spredningsplott/XY-plott.Deparvisemålingeneplottessom(X,Y).Regresjonslinjeniplottetbørhastigningstallnær1(ingenproporsjonalbias)ogskjæringspunktetiy-aksennær0(ingenkonstantbias).

2. Bland-Altmanplott,hvorgjennomsnittetavhverparvisemålingplottespåx-aksenogdifferanseninnenhverparvisemålingpåy-aksen.Manberegnerogplotterogsålinjerforgjennomsnittetavdifferansene(sombørværenær0nårdetikkeforeliggerbias)og95%konfidensintervallforgjennomsnittene,ogkandagjøreenvisuellvurderingavmetodenessamsvargjennommåleområdet.Hvis95%konfidensintervallinneholder0,erdetingenstatistiskeholdepunkterforbias.Kliniskbetydningavbiasbørogsåtasmedivurderingen,ognoenkilderoppgir<0,3logigjennomsnittligdifferansesomakseptabeltinnenmolekylærvirologi[3].

Presisjon Presisjonvurderesbådemtp.intraseriellpresisjon(«repeterbarhet»)oginterseriellpresisjon(«reproduserbarhet»,hvisfaktorersomlaboratorie,lotnr.,operatør,dagosv.varierer).Sidenmanbørregnepålogtransformerteverdier(seovenfor),følgerdetatmanberegnergjennomsnittogSDuttryktilog10.Variasjonskoeffisienten(CV%)sommanbrukerforåuttrykkevariasjonformålingerpåenaritmetiskskalaermisvisendefor

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

27

målingerpåenlogaritmiskskala(eksempel:etsettmålingermedgjennomsnitt2log10IU/mlogSD0,2log10ogetannetsettmålingermedgjennomsnitt5log10IU/mlmedsammeSD0,2log10hardetsammestandardavviketpåbeggenivåer,menhvismanberegnerCV%vildenbli10%vs4%).

Presisjonforkvantitativegenteknologisketesterviloftevarieregjennommåleområdet,medstørrespredningidethøyeoglavemåleområdetennimiddelområdet,ogdeterderforanbefaltsomminimumåinkludereensterkpositivprøve,ensvakpositivprøveogenprøvemedkonsentrasjonsånærdeteksjonsgrensensommulig[1].Deteringenallmennenighetomakseptabeltpresisjonsnivåforverifiseringavkvantitativegentekno-logisketester,menSD<0.19log10erforeslått[3].Manbørtilstrebeåminstoppnåprodusentensoppgitteintra-/interseriellepresisjon[3],somoftestoppgisiSDlog10differensiertforulikekonsentrasjonsnivåer,ogdeterderforhensiktsmessigåvelgesinekontrollmaterialerutifradette.Detforeliggermangeforslagtilantallprøver,replikater,oppsettogdagerforåestimereintraserielloginterseriellpresisjon[1-3],oggenereltvildeværemindreomfattendeforverifiseringennvalidering.Forvalideringanbefalesåutføreoppsetthverdagi20dager[2],mendetkandagjøressinglikat-ellerevt.duplikattesting.Sidenbådevalideringogverifiseringavmetodeneertidkrevendeogeventueltkostbart,børmannøyesetteoppeksperimentseriersomikombinasjondekkeralleønskedeparametresamtidig.

Linearitet Linearitetertestensevnetilåproduseremåleverdiersomerdirekteproporsjonalemedkonsentrasjonenavanalyttiprøven.Linearitettestesvedhjelpavenseriefortynnings-prøversomgårfranoelaveretilnoehøyereenntestenskjenteellerantattemåleområde,ogsomkanpresenteresietspredningsplottoganalyseresmedforeksempellineærregresjon.KorrelasjonskoeffisientenR2børværenær1.Vedbrukavpolynomiskregresjonsanalysekanmanevt.eliminereprøvenemedlavesteellerhøyestekonsentra-sjonhelttilmanfinnerenlineærsammenheng.Lavestegjenværendekonsentrasjonvildarepresenterenedrekvantiteringsgrense(LLOQ,lowerlimitofquantification),menshøyestekonsentrasjonrepresentererøvrekvantiteringsgrense(ULOQ,upperlimitofquantification).Vedverifiseringkanbekreftelseavlinearitetgjøresnoemindreomfattende,ogdetertilstrekkeligåanalysere2replikateri5-7fortynningersomdekkertestensoppgittemåleområde[1].

Estimering av måleusikkerhet

Måleusikkerhetenavhengeravtestenspresisjon,ogskalestimeresforallekvantitativeanalyser[4].Denbørfremgåavanalyserapportene,medmindredenergjorttilgjenstandforforenkletrapportering.Somnevntviloftepresisjonen,uttryktvedSDlog10varieregjennomdetkvantitativemåleområdetforgenteknologiskemetoder.Hvisikkevariasjonenerforstor,erdetenmulighetåfinnedetstørstepåvistestandardavviketfraverifisering/validering,foreksempel0,15log10,ogangiforalleprøvesvaridetkvantitativemåleområdetat95%konfidensintervallutgjøropptil+/-0,3log10(1.96SD).Hvisprøvesvaroppgispåaritmetiskskalapåanalyserapportene(foreksempel100000IU/ml),kanmanlogtransformereresultatet,regneutetkorrektsymmetrisk95%konfidensintervallpådenlogaritmiskeskalaen,ogderetterbrukeanti-logtilåfåetkorrektassymmetrisk95%konfidensintervallpåaritmetiskskala.VedFHIharviprogrammertalgoritmermedformlerilaboratoriedatasystemetsomutførerdisseberegningeneautomatisknåretgittresultatpåaritmetiskskalaleggesinn.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

28

Løpende vurdering av ytelse

Temaettasoppbredtiforegåendeinnlegg.EtviktigpoengsomerspesieltforkvantitativPCReratmåleverdienesomregistreresiLewey-Jennings-diagrametcogsomdannergrunnlagetforalarm-ogaksjonsgrenserbørværelogaritmiske(sebegrunnelseovenfor).HvisinstrumentetprodusererverdierpåaritmetiskskalakandeenkeltlogtransformeresiExcelførplotting.ReneCT-verdiererogsålogaritmiskeinatur,menermindrenøyaktigesammenlignetmedtransformertemåleverdier,fordiCT-verdieneikkeerstandardisertmedstandardkurve.

Referanser

1. Burd,E.M.,ValidationofLaboratory-DevelopedMolecularAssaysforInfectiousDiseases.2010.

2. Jennings,L.,V.M.VanDeerlin,andM.L.Gulley,Recommendedprinciplesandpracticesforvalidatingclinicalmolecularpathologytests.ArchPatholLabMed,2009.133(5):p.743-55.

3. Newman,H.,etal.,Basicoverviewofmethodvalidationintheclinicalvirologylaboratory.ReviewsinMedicalVirology,2017.27(5).

4. Akkreditering,N.,NADok.nr.48b.Medisinskmikrobiologi.2016.

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

29

Kvalitet i det daglige og feilsøking

Øyvind Kommedal, Mikrobiologisk avdeling, Haukeland Universitetssjukehus E-post: oivind.kommedal@helse-bergen.no Kvalitetidetdagligehandleromhåndteringavavviksomoppståretteratenanalyseerferdigvalidertogimplementert.Viderehandlerdetomhvordanenkeltsvarkvalitetssikresogtolkes.Sist,menikkeminst,handlerdetomhvorrasktrekvirentenfårsvar.

DevanligsteproblemeneiPCR-oppsetterpositivekontrollersomfallerutenforreferanse-grensene,atypiskekurverogsåkalte«skitupper»,detvilsikurversombegynneråstigeheltpåsluttenavkjøringen.Førsteleddienfeilsøkingersomoftestenomkjøring.Enkontrollsomikkegårinnellermangeprøvermedskitupperelleratypiskeamplifikasjons-kurverkreversomoftestatheleoppsettetkjørespånytt.Forproblematiskeenkeltkurverholderdetsomofteståreanalyseredenprøvendetgjelder.Dersomheleoppsettetmåkjørespånyttmåmansjekkeomdetertattibrukennylotavetellerflerereagenser/-kontrollerogomdetisåfalleraktueltmedparallelloppsettmedgammel/nylot.

Risikoenforamplikon-forurensing,detvilsiatutstyrogreagenserkontamineresmedamplikonfratidligerePCR-kjøringer,erbetydeligredusertmedinnføringavreal-timePCRogreduksjonavbehovetforåutføreviderearbeidmedoppkopiertDNA.Risikoenerlikevelikkeeliminert,ogbrukavfysiskadskilteromfortillagingavmastermiks,tilsettingavtemplatogamplifikasjonavPCRersunneprinsippersommåivaretas.Idetilfellenederviderearbeidsomgelkjøringellersekvenseringernødvendig,mådetteutførespåetegetpost-PCRromavgodtopplærtpersonaleogmeddedikertutstyrsomikkebrukesandresteder.

Robotiseringogparallellprosesseringavmangeprøversamtidigrepresentererofteenkvalitetsheving.Likevelerdet,somfølgeavteknisksvikt,brukerfeilellerdårligdesignenrisikoforkrysskontamineringbådeunderekstraksjonogPCR.Genereltgjelderforbådeautomatiserteogmanuellemetoderatmassivforurensingerlettåoppdagevedatdennegativekontrollen/heleoppsettetblirpositivt.Sporadiskellerlavgradigforurensingkanværemegetvanskeligåoppdage,ogkreverårvåkenhetavbådebioingeniørerogleger.Tegnpåforurensingkanværemangesvaktpositiveprøver,enplutseligøkningavforekomst,ellerdårligkorrelasjonmellompositivtresultatogklinikk.Vedmistankeomforurensingerofteførstetiltakåsettepåetheltoppsettmedsikkertnegativeprøverogderettereventueltkjøremedøktantallnegativekontrollerenperiode.Nårfeiloppstårerdetviktigåtastillingtilomfeileneravenslikkarakteratingensvarbørgisut,elleromnoenprøverlikevelkanbesvaresmedrimeligsikkerhet.Dissevurderingeneavhengeravnårprøvenekanreanalyseresoghvilkentypeprøvemateriale/problemstillingdetersnakkom.Forpasientermedakutteinfeksjonstilstanderrepresentererforlengetsvartidenvesentligreduksjonidiagnostiskkvalitet.Dersomlot-kontrollogomkjøringikkeløserproblemetmådetumiddelbartleggesenplanforviderefeilsøkingogforhvordandeaktuelleprøveneskalhåndteresimellomtiden.

MangelaboratorierharPCR-analyserutenamplifikasjonskontroll.Amplifikasjonskontrollenerheltnødvendigforåoppdageinhibisjon,menogsåforåkontrollereatallenødvendigereagenserertilsattidenaktuellereaksjonsbrønnen.Dettegjelderikkeminstprøversompipetteresmedrobot.Amplifikasjonskontrollenbørtilsetteslyseringsbuffer/ekstraksjonsmiksoggågjennomekstraksjonstrinnet.HvisikkeermansårbarforfalsktnegativeprøvesvarsomfølgeavegenskapervedprøvematerialeellertransportmediumsomkanredusereutbyttetavDNA-ekstraksjonen.Dettekanblant

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

30

annetværevariasjoneripHellersaltkonsentrasjonerogvilsærliggjeldeanalysersomkjøresienrekkeulikeprøvematerialerellerdersomenmottarprøverfraandrelaboratoriersombenytterandretransportmedier.Vedekstraksjonfracellefattigmaterialesomforeksempelspinalvæskerellerskyllevæskerfraluftveienekandetværenødvendigåtilsetteensåkalt«carrier»foråredusereuspesifikkbindingavmål-DNA/RNAtilplastogsikreatdetmestekommergjennomekstraksjonen.Carrierkanbeståavf.eks.kommersieltpoly-A,plasmaellertransportmedium.Detbørværeetmålatallenyeanalysersominnføresharenadekvatamplifikasjonskontroll,ogatmanpåsiktogsåinnførerdettepåeldreanalyserderdettemangler.

TolkingavPCR-kurvereriutgangspunktetuproblematisk.Ipraksisserviimidlertidoftekurve-fenomenersomkanværevanskeligeåtolkeogatdenautomatisketolkningensomutføresavPCR-instrumentetkanværetvilsom.Detkanværeulikoppfatningblantbådebioingeniøreroglegeromhvasomerensikkeroghvasomerentvilsomkurve-fortolkningoglaboratorieneharulikpraksisiforholdtilomkurverskalvurderesavenellerflerepersoner.Deterviktigåhaenlavterskelfornårenkurveskaldiskuteresmedfagansvarligbioingeniørog/ellerlege.

EnannenpotensiellfeilkildeeroverføringavsvarfraPCR-instrumenttillaboratorietsdatasystem.Dersomdettegjøresmanuelterdetenikkeneglisjerbarmulighetfortastefeil,spesieltpåstørreoppsettmedmangepositiveprøver.Laboratorieneharulikpraksisforihvilkengradinnleggingavsvarkvalitetssikres.

Laboratorieneharulikpraksisforbrukavcut-offforPCR.NoenopererermedengråsoneetterengittCt-verdi,derpositivePCR-kurveretterdenneoppfattessomusikre.Andrebegrenserantalletsykluserdekjørerogakseptererallepositivekurver.Mangeharikketattaktivstillingtildenneproblemstillingenidetheletatt,iallefallikkeforallesinePCR-analyser.

Foralleanalysermedbehandlingsmessigekonsekvenserbørlaboratorietsettesegetmålomønsketanalysetid.Denfaktiskeanalysetidenbørkontrolleresjevnlig,ogforbedringstiltakinnføresdersomdenerlengreenndetsomerønskelig(eventueltmulig).

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

31

Deltakerliste

Strategimøte i virologi 26. oktober 2017 - Kvalitetskontroll av genteknologiske metoder

Foredragsholdere og møteledere

Øyvind Kommedal Helse Bergen oyvind.kommedal@helse-bergen.no innleder/ møteleder

Fredrik Müller Oslo universitetssykehus fmuller@ous-hf.no innleder/ møteleder

Gro Njølstad Helse Bergen gro.njolsatd@helse-bergen.no innleder

Andreas Christensen St. Olavs Hospital Andreas.Christensen@stolav.no innleder

Kåre Bergh St. Olavs Hospital kare.bergh@stolav.no innleder

Amir Moghaddam Fürst Medisinsk Laboratorium amoghaddam@furst.no innleder

Garth Tylden Universitetssykehuset Nord-Norge

garth.tylden@unn.no innleder

Rikard Rykkvin Folkehelseinstituttet rikard.rykkvin@fhi.no innleder

Karoline Bragstad Folkehelseinstituttet karoline.bragstgad@fhi.no innleder

Øvrige deltakere Øvrige deltakere

Anders Bredberg Sykehuset Innlandet - Lillehammer

anders.bredberg@sykehuset-innlandet.no

representant

Andreas Emmert Sykehuset Østfold Andreas.Emmert@so-hf.no representant

Angela Kümmel Sykehuset Levanger Angela.Kummel@helse-nordtrondelag.no

representant

Anita Kanestrøm Folkehelseinstituttet anita.kanestrom@fhi.no observatør

Annette Onken Bærum sykehus, Vestre Viken annette.onken@vestreviken.no representant

Astri Lervik Larsen Akershus universitetssykehus Astri.Lervik.Larsen@ahus.no observatør

Carina Thilesen Unilabs Laboratoriemedisin carina.thilesen@unilabs.com representant

Dagny Haug Dorenberg Folkehelseinstituttet DagnyHaug.Dorenberg@fhi.no arbeidsgruppen for møtet

Einar Nilsen Helse Møre og Romsdal. Molde/Ålesund

einar.nilsen@helse-mr.no representant

Elisebet Haarr Stavanger universitetssjukehus hael@sus.no observatør

Ellen Kristine Holter OUS Rikshospitalet eholter@ous-hf.no representant

Guro Helen Furset

Jensen Sørlandet sykehus - Kristiansand gurjen@ous-hf.no observatør

Hans-Johnny Schjelderup

Nilsen St. Olavs Hospital Hans-Johnny.Schjelderup.Nilsen@stolav.no

Heidi Cecilie Villmones Sykehuset i Vestfold heivil@siv.no representant

Inger Sofie Samdal-Vik Folkehelseinstituttet Inger.Sofie.Samdsal.Vik@fhi.no

Irene Beate Olsøy Universitetssykehuset Nord-Norge

irene.beate.olsoy@unn.no representant

Janne Møller-Stray Drammen sykehus JMOELL@vestreviken.no observatør

Strategimøte 2017: Kvalitetssikring av genteknologiske metoder • Folkehelseinstituttet mfl.

32

Kathrine Stene-Johansen

Folkehelseinstituttet Kathrine.Stene-Johansen@fhi.no

Kirsten Irene Ege

Bygdås Folkehelseinstituttet kirsten.bygdas@fhi.no medlem av referansegruppen

Kristin Modalsli Folkehelseinstituttet kristin.rasmussen.modalsli@fhi.no andre

Liv Jorunn Sønsteby Haugesund sjukehus liv-jorunn.sonsteby@helse-fonna.no representant

Monica R. Romstad Stavanger universitetssjukehus monica.regine.romstad@sus.no representant

Nadine Pullar Bærum Sykehus, Vestre Viken NADPUL@vestreviken.no observatør

Nina Egeberg Unilabs laboratoriemedisin AS nina.egeberg@unilabs.com observatør

Olav Hungnes Folkehelseinstituttet olav.hungnes@fhi.no representant

Peter Gaustad Fürst medisinsk laboratorium pgaustad@furst.no representant

Regine Barlinn Folkehelseinstituttet regine.barlinn@fhi.no medlem av referansegruppen

Roar Magne Bævre-Jensen

Drammen sykehus Roar.Baevre-Jensen@vestreviken.no representant

Sandra Åsheim Nordlandssykehuset i Bodø sandra.asheim@nlsh.no representant

Siri Feruglio Folkehelseinstituttet siri.laura.feruglio@fhi.no observatør

Susanne Gjeruldsen

Dudman Folkehelseinstituttet susanne.gjeruldsen.dudman@fhi.no arbeidsgruppen for møtet

Sølvi Nordaas Sørlandet sykehus - Kristiansand solvi.noraas@sshf.no representant

Truls Michael

Leegaard Akershus universitetssykehus Truls.Michael.Leegaard@ahus.no representant

Unn Houge Sørlandet sykehus - Kristiansand unn.houge@sshf.no medlem av referansegruppen

Veselka Petrova Dimova

Svetoslavova Oslo universitetssykehus - Ullevål

vesdim@ous-hf.no representant

Åshild Marvik-Rødland

Sykehuset i Vestfold ashildma@gmail.com observatør

Utgitt av Folkehelseinstituttet September 2018Postboks 4404 NydalenNO-0403 OsloTelefon: 21 07 70 00Rapporten kan lastes ned gratis fra Folkehelseinstituttets nettsider www.fhi.no