Explicación de TP Nº 2

Reacción en cadena de la

Polimerasa (PCR)

Química Biológica Patológica

Dra. Mariana L. Ferramola

2017

Definición de PCR

� Es la amplificación enzimática de un fragmento de interés

(DNA) localizado entre dos oligonucleótidos (cebadores).

� Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de

interés.

Componentes del sistema de PCR

� ADN molde

� Oligonucleótidos (cebadores o primers)

� Polimerasa termoestable

� Solución buffer

� dNTPs (dATP; dCTP; dTTP; dGTP)

Máster

Mix

Componentes del sistema de PCR: ADN molde

El ADN molde puede ser de cadena sencilla o doble, circular

o lineal. En caso de desear amplificar una secuencia de ARN

se debe utilizar primeramente una transcriptasa reversa.

� Deben tenerse en cuenta los posibles contaminantes

presentes en el ADN molde, que pudieran disminuir la

eficiencia de reacción:

� Urea

� SDS

� Acetato de sodio

� Agarosa

� Fenol

La cantidad de ADN molde a utilizar depende de la muestra de partida.

Demasiada cantidad de ADN puede inhibir la reacción de PCR.

Componentes del sistema de PCR: ADN molde

Componentes del sistema de PCR: cebadores

� Longitud de la región complementaria al ADN molde de

entre 18-25pb.

� Deben ser específicos.

� No deben presentar auto-complementariedad.

� No deben ser complementarios entre ellos.

� El contenido de G+C debe estar entre el 40-60%.

� El Tm de los oligos no debe diferir en más de 5ºC.

� La diferencia entre el Tm de los oligos y del amplicón no

debe superar los 10ºC.

� Su concentración debe ser de entre 0.1-1μM

(concentraciones excesivas pueden dar lugar a

inespeficidad de amplificación).

Componentes del sistema de PCR: polimerasa

termoestable

Las ADN polimerasas termoestables presentan las siguientes

características:

� Polimerizan en dirección 5’→ 3’.

� Necesitan de un extremo 3’-OH libre para comenzar la

polimerización.

� Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena

que sirve de molde.

� Necesitan la presencia de Mg para funcionar.

� Son capaces de resistir altas temperaturas por períodos

considerables.

Componentes del sistema de PCR: polimerasa

termoestable

ADN polimerasa Vida media

(95ºC)

A) B) C)

Taq (Thermus aquaticus) 40 + - -

Vent (Thermococcus litoralis) 400 - + -

Pfu (Pyrococcus furiosus) 120 - + -

Tth (Thermus thermophilus) 20 + - +

A) AcDvidad exonucleasa 5’ → 3’.

B) AcDvidad exonucleasa 3’ → 5’.

C) Actividad de transcriptasa inversa.

Existe una variedad de enzimas con características diferentes, según

la finalidad de la PCR a realizar.

Componentes del sistema de PCR: solución

buffer y MgCl

� Se utiliza un buffer Tris-HCl, de pH 8,4 (tº amb).

� La concentración de MgCl influye directamente en la actividad

de la polimerasa, y es uno de los parámetros a ajustar:

� Si la concentración de Mg2+ es deficiente, ↓ la eficiencia de la

enzima.

� Si la concentración de Mg2+ es excesiva, ↑ la polimerización

inespecífica.

La concentración ideal de MgCl

varía entre 0,5-5mM,

dependiendo de:

Conc de ADN molde de partida.

Conc. y longitud de cebadores.

Conc. de dNTPs.

Long. del amplicón.

Componentes del sistema de PCR: dNTPs

� Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los

4 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en concentraciones que

varían entre 200 – 250 μM de c/u.

� Concentraciones mayores a 4mM inhiben la PCR por

quelación de Mg2+.

Protocolo típico de una reacción de PCR.

1º) Desnaturalización (94 – 95ºC; 5 min)

2º) Desnaturalización (94 – 95ºC; 30 seg – 1

min)

3º) Hibridación (tº específica para c/par de

cebadores; 30 seg)

4º) Elongación (72ºC; 30 seg – 3 min,

dependiendo del tamaño del amplicón)

5º) Elongación (72ºC, 5 min)

Los pasos 2, 3 y 4

constituyen un

ciclo de PCR y se

repiten entre 25-

35 veces.

Etapas de un ciclo de PCR.

94ºC

Tm

Primers

72ºC

(min)

Etapas de una PCR: Mezcla inicial

Etapas de un ciclo de PCR: Desnaturalización

Etapas de un ciclo de PCR: Hibridación

Etapas de un ciclo de PCR: Elongación

Reacción de PCR: esquema de amplificación

exponencial

Pérdida de eficiencia de PCR

Factores que llevan a la

pérdida de eficiencia de PCR

luego de varios ciclos:

� Disminución de actividad

de la polimerasa.

� Disminución de la

disponibilidad de dNTPs y

cebadores.

� Disminución de la

disponibilidad de Mg2+,

para el funcionamiento de

la enzima.

[AD

N]

Nº de ciclo

Fase lag

Fase

exponencial

Fase de

meseta

Tipos de PCR.

• PCR-semicuantitativa

• PCR-cuantitativa (PCR-en tiempo

real)

• RT-PCR

• PCR-multiplex.

• PCR-anidada.

• PCR-aleloespecífica.

• PCR-mutagénesis dirigida.

PCR cuantitativa: PCR en Tiempo Real

� Permite cuantificar el producto obtenido a partir de cada

muestra mientras se lleva a cabo la amplificación.

� El equipo se compone de un termociclador y un lector de

fluorescencia, adosados a un equipo de recolección de datos

(ordenador).

Para la cuantificación se

establece un valor de corte

(valor umbral) de

fluorescencia emitida por las

muestras. Una muestra con

mayor concentración inicial

de ADN blanco necesitará

menos ciclos para alcanzar

dicho valor umbral.

RT-PCR

� Se parte de una muestra de ARN.

� Se realiza primero una transcripción reversa, para obtener

DNA copia y luego se realiza la reacción de PCR.

PCR multiplex

� Permite amplificar distintos blancos a la vez en una muestra.

� Se utilizan 2, 3 o más pares de cebadores.

PCR anidada� Consiste en amplificar un blanco con un par de cebadores, y en

una reacción posterior amplificar una fracción interna del

fragmento previamente amplificado.

� Aumenta la especificidad de amplificación.

PCR alelo específica

� Se diseñan cebadores que hibridan específicamente con el alelo

wild type o con el mutado.

� Permite la identificación de individuos que presenten dos

alelos normales, de portadores de mutación, y de individuos

con dos alelos mutados.

Mutagénesis dirigida por PCR

� Consiste en introducir una modificación en la secuencia del

amplicón obtenido mediante el diseño de un cebador que

contenga dicha mutación.