REACTIVOSReactivos preparados:Es aconsejable la utilizacin de reactivos ya preparados, especialmente el HCl (o H2SO4) de valoracin. Cualquier error en su preparacin puede afectar directamente al resultado de la determinacin.Utilizar los siguientes, o sus equivalentes en otras marcas: cido Brico (en polvo) 99.5%PANREAC 141015 Indicador mixto 4.8 ( 5) RVPANREAC 283303(Rojo metilo + Verde de Bromocresol) Indicador mixto 4.4 RVPANREAC 282430(Rojo metilo + Azul de Metileno) HCl 0.1N SVPANREAC 171023 HCl 0.25N SVPANREAC 182318 H2SO40.1N SVPANREAC 181061 H2SO40.2N SVPANREAC 182011 Sodio Hidrxido 40% REPANREAC 171220(Para determinacin de N) Acetanilida 99% (Patrn para validacin)PANREAC 151005 Amonio sulfato (Patrn para validacin)PANREAC 131140 Catalizador Kjeldahl 6.25% Cu tabl. 8gPANREAC 174428Preparacin de la solucin fijadora de amonaco1.- Con indicador Mixto 4.8 ( 5)Preparar la solucin de la siguiente frmula para 1 litro de solucin fijadora: Pesar 10g de Acido Brico (en polvo)PANREAC 141015 Disolverlo en 1 litro de agua destilada. Aadir 15ml de Indicador mixto 5.PANREAC 2833032.- Con indicador mixto 4.4Preparar la solucin de la siguiente frmula para 1 litro de solucin fijadora: Pesar 10g de cido Brico (en polvo)PANREAC 141015 Disolverlo en 1 litro de agua destilada. Aadir 10ml de Indicador mixto 4.4.PANREAC 282430PROCEDIMIENTOREPARACIN DE LA MUESTRA1. Triturar, homogeneizar y mezclar la muestra.2. Pesar entre 1 y 2 gramos de muestra.3. En muestras con contenidos de nitrgeno muy pequeo, tomar la muestra suficiente para que contenga como mnimo 5 mg de nitrgeno.DIGESTIN Aadir entre 10 y 15 ml (tubo macro) de H2SO496-98% y 1 tableta (8 gm) de catalizador.(Para el tubo micro, el mximo de H2SO4es 5ml) Montar un sistema para la extraccin de humos o scrubber con Na2CO3. Realizar la digestin en tres pasos:1.En funcin del contenido de agua de la muestra, empezar la digestin evaporando agua a 150C entre 15 y 30 minutos.2.Realizar un segundo paso entre 270 y 300C entre 15 o 30 minutos para reducir la produccin de humos blancos.3.Continuar la digestin a 400C entre 60 y 90 minutos.Algunos ejemplos:Queso o carne:Paso1: 150C / 30 Paso 2 : 270C / 30 Paso 3: 400C / 90Cereales:Paso1: 150C / 15 Paso 2 : 300C / 15 Paso 3: 400C / 60Control Visual:El resultado es un lquido transparente ntido con coloracin azul claro, verde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. No deben quedar restos negros adheridos a la pared de tubo.Nota:Durante la digestin debe controlarse la produccin de espuma en las muestras. Si esta es excesiva, debe alargarse el paso n 1.DILUCIN Sacar los tubos muestra del bloque digestor y dejar enfriar a T ambiente. (Puede forzarse sumergiendo los tubos, cautelosamente, en un poco de agua). Aadir unos 25ml de agua destilada en cada tubo. Aadir el agua despacio y moviendo el tubo sin dejar solidificar la muestra. Si es necesario calentar ligeramente el tubo (por ej. introducindolo en el bloque digestor todava caliente) Dejar enfriar de nuevo hasta T ambiente. Para evitar prdidas de nitrgeno y reacciones violentas no introducir el tubo todava caliente al destilador.DESTILACIN Situar un Erlenmeyer de 250ml a la salida del refrigerante con 50ml de cido Brico y unas gotas de indicador. Programar una dosificacin de 50 a 75 ml de NaOH. Introducir el tubo con la muestra en el destilador. Destilar hasta recoger 250ml en el Erlenmeyer (50ml Brico + 200ml de destilado).Control Visual:Una vez se ha aadido el NaOH, la muestra debe tomar una coloracin azulada, de no ser as, aadir ms NaOH.VALORACIN Y CLCULO Valorar el destilado con HCl H2SO4hasta el cambio de color. (punto final: pH 4.65)Moles de HCl = Moles de NH3= Moles de N en la muestraMoles de H2SO4= 2Moles de NH3= 2Moles de N en la muestra Realizar el clculo:mg N = N x V x 14Donde:N =Normalidad del cido de valoracinV =Volumen de cido consumido14 =Peso atmico del nitrgeno. Para pasar a contenido de protenas corregir por el factor adecuado segn la naturaleza de la muestra. (6.25 por defecto) Peridicamente realizar un ensayo en blanco y restarlo del resultado.% Protenas = P2/P0x 100 x FDonde:P2:Nitrgeno (mg).P0:Peso de la muestra (mg).F:Factor protenico.(6.25 por defecto)Factor protico de algunos alimentos:Almendras 5,18Nueces 5,30Nueces - cacahuetes 5,41Gelatina 5,55Soja 5,71Cebada, avena, centeno 5.83Trigo, harina entera 5,83Harinas (no entera) 5,70Arroz 5,95Maz 6,25Todos los otros alimentos 6,25Salvado 6,31Leche y lcteos 6,38VERIFICACIN DE LA RECUPERACIN CON AMONIO SULFATOEsta verificacin es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del destilador.Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrgeno es conocido. Esta se destila, se valora con HCl 0.25N y se calcula el Nitrgeno detectado.El porcentaje de nitrgeno detectado sobre el de la muestra se denominarecuperacinde Nitrgeno.Preparar la muestra:Contenido de nitrgeno de una muestra de Amonio sulfato :Formula:(NH4)2 SO4Peso molecular:132.14Factor:14 * 2 / 132.14 = 0.212mg de Nitrgeno =0.212 * mg de Amonio sulfato Pesar unos 100mg de amonio sulfato. El peso exacto ser P0 La cantidad exacta de Nitrgeno es:P1 (mg) = P0 x 0,212 Destilar aadiendo 25ml de NaOH Una vez destilado y valorado obtenemos el nitrgeno (mg) detectado: P2P2 = N x V x 14Donde:N =Normalidad del cido de valoracin (HCl 0.25)V =Volumen de cido consumido14 =Peso atmico del nitrgeno. Calculamos la recuperacin:R(%) = P2/ P1*100 La recuperacin aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.Si se utiliza HCl de normalidad diferente preparar muestras:NormalidadMuestra de Amonio sulfato.0,05 20 ... 40 mg0,140 ... 90 mg0,25 100 200 mg0,5 200 400 mgVERIFICACIN DE LA RECUPERACION CON ACETANILIDAEsta verificacin es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del proceso completo del anlisis del nitrgenoKjeldahlque incluye las etapas de digestin, destilacin y valoracin.Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrgeno es conocido. Esta se digiere, se destila, se valora y se calcula el Nitrgeno detectado.El porcentaje de nitrgeno detectado sobre el de la muestra se denomina recuperacin de Nitrgeno.Para realizar sta verificacin se utiliza la Acetanilida.Preparar la muestra:Contenido de nitrgeno de una muestra de Acetanilida :Frmula:C8H9NOPeso molecular:135.17Factor:14 / 135.17 = 0.1035mg de Nitrgeno =0.1035 * mg de Acetanilida Pesar alrededor de 250mg de acetanilida. El peso exacto ser P0 La cantidad exacta de Nitrgeno es:P1 (mg) = P0 x 0,1035Digestin de la muestra: Colocar la acetanilida en un tubo, aadir 10ml de cido sulfrico 98% y una tableta de catalizador Kjeldahl. Digerir a 400C durante 1h. (El resultado debe ser un lquido transparente con coloracin azul.) Dejar enfriar y aadir 25ml de agua destilada en cada tubo. Tomar precauciones para evitar salpicaduras. La reaccin del agua sobre el cido sulfrico es violenta.Destilar: Destilar aadiendo 75ml de NaOH. Utilizar HCI 0.25N para la valoracin. Una vez destilado y valorado, obtenemos el nitrgeno (mg) detectado: P2Donde:N =Normalidad del cido de valoracin (HCl 0.25).V =Volumen de cido consumido.14 =Peso atmico del nitrgeno.P2 =N x V x 14 Calculamos la recuperacin:R(%) = P2/ P1*100 La recuperacin aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.FUENTES DE ERRORLas principales fuentes de error son:En el proceso de digestin:1.-La inclusin de nitrgeno no protico (aunque la cantidad de este nitrgeno suele ser despreciable comparada con la del nitrgeno protico);2.-La prdida de nitrgeno durante la digestin. El exceso de sulfato de sodio o potasio que se aade al cido para elevar el punto de ebullicin, puede producir una descomposicin por calor y por lo tanto prdida de nitrgeno. Por otro lado, el exceso de catalizador (de cobre generalmente) tambin puede producir prdidas de nitrgeno3.-La digestin incompleta de la muestra. Generalmente debida a falta de tiempo de reaccin o falta de cido sulfrico.Durante la destilacin:1.-Neutralizacin incompleta de la mezcla digerida. Es necesario aadir suficiente NaOH para neutralizar el exceso de cido sulfrico resultante de la digestin as como transformar todo el amonio formado en la digestin en amonaco.2.-Perdida de amonaco por fugas en el circuito de destilacin.3.-Perdida de amoniaco por refrigeracin insuficiente en el condensador.