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Recuperação de produtos de Bioprocessos
Recuperação de produtos
Operações down-stream
Finalidade de uso: alimentos? medicamentos? diagnóstico?
catálises industriais? detergentes?
Localização: (intra x extracelular)??diversidade química e abundância de
moléculas
Custos
Recuperação de produtos
Operações unitáriasOperações unitárias
-clarificação-rompimento de células-concentração e/ou purificação de baixa resolução-purificação de alta resolução-tratamentos finais
-acondicionamento
Recuperação de produtos
Recuperação de produtos
CLARIFICAÇÃO Separação das células do meio de
cultura Interesse no extrato ou no pellet de
células?
ClarificaçãoClarificação
ClarificaçãoClarificação
1. Filtração• Usado para grandes volumes de extratos diluídos• Obtenção do filtrado e do retido (“torta de células”)• Ausência de esterilidade*• -microfiltração: 0,22 ou 0,45 μm• Filtros convencionais: 100 μm• Problemas com “fouling”• Uso de pressão (vácuo).
Materiais dos filtros: materiais celulósicos, terra diatomácea, materiais sintéticos
“Torta de Células”
ClarificaçãoClarificação
2. Centrifugação• Aceleração do processo de sedimentação
por ação de um campo centrífugo Esterilidade
• Pellet mais úmido que na filtração• Possibilidade de refrigeração
Descontínuo ou contínuo
Tendo definido o processo, torna-se possível selecionar o tipo especifico de centrifuga.
De um modo geral, as centrifugas podem ser divididas em
centrifugas de filtração de sedimentação
Centrifuga de Discos
Centrifuga Decantadora de Vaso Horizontal
Centrifuga TubularCentrifuga Tubular
Centrifuga de CestaCentrifuga de Cesta
Filtração TangencialFiltração Tangencial
Filtração TangencialFiltração Tangencial
Diminui tensão de cisalhamento da célula
Diminuição da formação do fouling Processo usado em
concentrações/purificações do produto
Diferentes “cut off”. Materiais poliméricos
Filtração TangencialFiltração Tangencial
ROMPIMENTO CÉLULAR
Para produtos intracelulares Romper ou permeabilizar? Cuidados com calor e proteases Diferentes composições de parede
celular
ROMPIMENTO CÉLULAR
ROMPIMENTO CÉLULARMétodos:
Enzimáticos
Usados para biomoléculas sensíveis a tensão de cisalhamento
Necessidade de danos parciais Utilização de combinações de enzimas:Leveduras: glicanases, proteases e mananasesBactérias: glicosidadese proteases.
Vantagens: fácil controle de pH e temperatura, alta especificidade.
Desvantagens: custos, variação em função do estado fisiológico do micro-organismo.
ROMPIMENTO CÉLULAR
2. Mecânicos: Mais usados industrialmente. Equipamentos: homogeneizadores de
alta pressão (Prensa Francesa) e moinho de coloidal, vortex*
Mais baratos. Aumento de temperatura.
ROMPIMENTO CÉLULAR
Moinho Coloidal Moinho de bola
ROMPIMENTO CÉLULAR
3. Não mecânicos:
Choque osmótico, Congelamento/descongelamento, Ultra som
ROMPIMENTO CÉLULAR
4. Químicos:
Detergentes, ácidos, bases
Qual método usar dos 4?
Rendimento, especificidade, controle de temperatura, custos.
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Natureza protéica dos produtos: enzimas, antibacterianos, anticorpos, etc.
1. Precipitação com sais:
Método tradicional e simples Boa capacidade de separação de proteínas Fatores que determinam a estrutura e a
solubilidade de uma proteína Princípio de ppt: perda da estrutura tridimensional Uso de altas concentrações de sal: salting out. -salting in!
Adição de sais reduz a disponibilidade de água, devido à hidratação dos íons do sal, reduzindo a disponibilidade de água (o que torna o meio mais hidrofóbico). Proteínas exibem diferentes graus de hidrofobicidade!!
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Faixas de saturação utilizadas Controle da temperatura durante adição do sal Controle do pH Centrifugação Suspensão em tampão Volume?? Recuperação de atividade Operação pós-suspensão Necessidade de eliminar o sal por diálise ou gel
filtração?
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Sais para ppt:• alta solubilidade• pouco viscosidade em altas concentrações• o ânion é mais importante na escolha• -série de Hoffmeister (em ordem crescente de
eficiência):• nitratos < brometos< cloretos< acetato<
sulfato< fosfato prefere-se cátions monovalentes: Na < K
< NH4
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Sulfato de Amônio (NH4)2SO4 100% de saturação: 4 M (> 700 g/L) solubilidade elevada em amplas faixas de
temperatura produz baixa viscosidade efeito anti-proteolítico e antibacteriano baixo custo concentração de proteínas Precipitação -60 g de sal em 100 mL de extrato (85% de
saturação)
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS Precipitação isoelétrica Alterar o pH até o ponto isoelétrico (PI)
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Precipitação por solventes orgânicos: -etanol ou acetona: reduzem a Aw,
diminuem a constante dielétrica do meio, aumentando a interação entre cargas opostas de AA expostos
Vantagens: redução da densidade do meio, favorecendo a sedimentação natural.
Desvantagem: inativação da enzima, efeito de diluição, aquecimento
Precipitação por solventes orgânicos
Ultrafiltração
Transporte de soluções através de membranas com poros de diâmetros entre 0,001 e 0,1 μm sob pressão.
• Usado para macromoléculas como proteínas e polissacarídeos.
• água e pequenas moléculas passam pela membrana, enquanto que as maiores, com diâmetro nominal (cut-off) maior, ficam retidas.
• cut-offs devem ser 20% menores que a molécula alvo.
• Vantagens: retira sais, concentração do produto, aplicável em grandes escalas.
PROBLEMAS: “fouling”, custos, furos na membrana, formação de agregados, baixa resolução, EFICIÊNCIA!
Cromatografia
Princípio: solutos de um meio líquido (enzimas, anticorpos, etc) são adsorvidos/retidos em um leito poroso. A posterior remoção gradual do soluto por ação deu uma fase móvel (eluente) resulta na separação das diferentes moléculas.
Cromatografia
Configuração geral: -coluna-fase estacionária (matriz), que pode interagir química/eletricamente ou não apresentar interação com o produto,-fase móvel: tampão
Cromatografia
3.1. Troca Iônica• uma das mais utilizadas• processo baseado na afinidade que os
componentes de uma amostra têm pelos sítios iônicos de uma matriz.
a fase estacionária, eletricamente carregada, tem a capacidade de reter solutos que estão na fase móvel e apresentam cargas opostas
Troca Iônica
Para ocorrer adsorção, controlam-se fatores como pH e força iônica.
Trocadores: catiônicos (carregados -) ou aniônicos (carregados +)
Troca Iônica Eluição reversibilidade da ligação- as proteínas exibem
diferentes números de sítios carregados na molécula, por isso seus graus de ligação à resina são variáveis.
Formas de eluir: 1. Alteração de pH - diminuir pH em trocas aniônicas - aumentar o
pH em trocas catiônicas. Problema: resinas tem boa capacidade
tamponante.
Troca Iônica
2. Alteração da força iônica mais usado o “desligamento” da proteína da resina
ocorre pelo deslocamento com outros íons (Na+ou Cl-, por exemplo), com a mesma carga adsorvida, porém com mais força de interação com a fase estacionária.
Eluente mais usado: NaCl utiliza-se um gradiente crescente de NaCl
Troca Iônica
Troca Iônica
Vantagens da troca iônica -reprodutibilidade -alta resolução -concentração da amostra -rapidez Escalonamento -aumenta-se o volume da coluna -relação altura/diâmetro
Gel filtração
gel permeação, cromatografia de exclusão molecular
muito usada para purificação de enzimas, a separação ocorre baseada no tamanho
(peso molecular) da enzima são usadas resinas inertes fabricadas em
polímeros naturas (dextranas) ou sintéticos.
Gel filtração
Gel filtração
Medidas das colunas -colunas largas e curtas: separação
rápida, pouca turbulência e pouco resolução
-colunas estreitas e compridas: separação lenta, maior resolução
COLUNA IDEAL: a altura deve ter de 20–40 x o diâmetro.
Cromatografia de Afinidade
Ligação específica do ligante (na resina) com a molécula alvo
Extremamente seletiva
Cromatografia de Afinidade Tipos de interação específica:
-antígeno/anticorpo -enzima/substrato -enzima/cofator -“cauda de histidina” proteínas recombinantes IMAC (Cromatografia de Afinidade por Metal Ionizado)
Eluição:
-detergentes, -mudanças na concentração de sal -aplicação de uma molécula com mais afinidade (eletrólitos)
Cromatografia de Afinidade
Eletroforese Usada para acompanhar as etapas de
purificação• Separação de proteínas pela ação de um
campo elétrico que força o movimento de proteínas eletricamente carregadas através de um gel.
• As proteínas movimentam-se em função da quantidade total de cargas elétricas negativas (que é proporcional ao peso molecular),
Após a “corrida”as proteínas são coradas com Comassie Blue ou com prata,
Eletroforese
Aspectos práticos-Carregar a proteína negativamente (SDS)
-eliminar pontes de dissulfeto (mercaptoetanol)
Tratamentos finais
Qual o grau de pureza? • acondicionamento• liofilização, secagem• inibidores de atividades indesejáveis
Veículos de estocagem:
glicerol, sorbitol, sacarose