Introducere Scopul fundamental al studiului biologic este de a nelege procesele fiziologice i patologice la nivel molecular i chimic. De-a lungul ultimilor 20 de ani, descifrarea corelaiei la nivel molecular dintre sntate i boal a determinat un ciclu repetativ de izolare i caracterizare de noi proteine i gene asociate cu un anumit eveniment pato-fiziologic. Chimia de sintez a jucat de cele mai multe ori un rol major n acest proces, cel mai adesea prin facilitarea identificrii intelor proteice ale produilor naturali bioactivi. Astfel de eforturi chimice au condus ctre caracterizarea unor noi proteine i familii de proteine, subliniind n mod constant amploarea i profunzimea diversitii moleculare ce definete fiecare organism viu. Studiul profilului de activitate al proteinelor este o strategie chimic ce folosete sonde covalente direcionate pe situsul activ pentru a aprecia profilul activitii enzimelor din proteom. Studiul proteomului prin intermediul sondelor chimice poate conduce la identificarea i validarea unor noi inte pentru medicamente i la construirea de medicamente specifice datelor genetice individuale.

Pn n prezent, sondele chimice au fost intens utilizate pentru studierea diferitor clase de enzime, ns n ultimii ani a aprut o nou aplicaie, utilizarea lor fiind extins ctre studierea proteinelor receptor.

Receptorii sunt proteine care se gsesc la nivelul membranelor sau n citoplasm i de care se pot ataa molecule de semnalizare ce poart denumirea de liganzi (neurotransmitori, hormoni, medicamente, toxine). n ultimii ani, numeroasele boli ce afecteaz populaia, precum diferitele tipuri de cancer, osteoporoza, bolile cardiovasculare sau neurodegenerative, au devenit o problem important, fiind punctul de plecare n numeroasele studii efectuate n vederea sintezei de noi compui capabili s reduc riscul apariiei acestor boli i chiar tratarea lor. Astfel de compui studiai i utilizai fac parte din clasa modulatorilor selectivi ai receptorilor estrogenici. Acetia reprezint o clas de liganzi sintetici, ce prezint abilitatea de a aciona ca agoniti n unele esuturi i ca antagoniti n altele, prin legarea la nivelul receptorilor estrogenici.

Un medicament derivat de benzo[b]tiofen utilizat pentru tratarea osteoporozei la femei, dup instalarea menopauzei, este modulatorul selectiv denumit raloxifen. Acesta prezint o bun afinitate de legare la receptorii estrogenici, iar utilizarea sa duce la producerea de efecte secundare reduse fa de utilizarea altor modulatori selectivi. Acestea sunt motivele pentru care este utilizat la ora actual n tratamentul osteoporozei i prevenirea i tratarea cancerului de sn.

Astfel, putem afirma c obinerea raloxifenului a reprezentat un succes remarcabil i c poate fi un punct de plecare n sinteza altor modulatori selectivi.

Modulatorii selectivi ai receptorilor estrogenici realizeaz interacii necovalente cu receptorii estrogenici, aceste fiind legturi labile, prin urmare se consider c ele sunt motivul pentru care activitatea lor este una sczut. innd cont de toate acestea, ne propunem sinteza unei sonde chimice de afinitate pentru receptorul estrogenic, care s pstreze proprietatea de legare necovalent la receptorii estrogenici pe care o prezint raloxifenul, dar care s realizeze i o legare covalent. Lucrarea de fa este mprit n trei capitole, astfel: primul capitol vizeaz generaliti privind structura proteomului, prezentnd date despre studiul proteomului prin intermediul sondelor chimice, proteine receptor i modulatori selectivi ai receptorilor estrogenici;

al doilea capitol urmrete designul i sinteza unei sonde de afinitate pentru receptorul estrogenic, bazat pe structura raloxifenului, care s pstreze afinitatea de legare la receptorul estrogenic, dar s realizeze i o legare covalent;

al treilea capitol este reprezentat de partea experimental i red etapele parcurse pn n prezent pentru realizarea sintezei sondei de afinitate pentru receptorul estrogenic.Capitolul I. Generaliti privind structura proteomuluiProteomul reprezint ntregul set de proteine exprimate de un genom, celule, esuturi sau organism. Proteomica reprezint un domeniu larg ce are ca principal scop nelegerea structurii, activitii, expresiei, localizrii celulare, partenerilor de interacie i a reglrii fiecrei proteine produs de un genom.I.1. Metode chimice de investigare a activitii proteinelorStudiul profilului de activitate al proteinelor (ABPP activity based protein profiling) este o strategie chimic ce folosete sonde covalente direcionate pe situsul activ pentru a aprecia profilul activitii enzimelor din proteom. Domeniul chimiei organice este pregtit n mod unic pentru a aproviziona iniiativele n studiul proteomului cu instrumente i concepte complementare. O metod ideal de investigare a proteomului ar trebui s monitorizeze ntr-un singur experiment activitatea tuturor proteinelor din proteom. Dei, un astfel de el este unul foarte ambiios, au existat sugestii n studii recente c o poriune semnificativ din proteom poate fi monitorizat innd cont de activitate dect de abunden. Un punct comun n cazul acestor tehnici de investigare a proteomului bazate pe activitate l reprezint utilizarea chimiei de sintez pentru crearea sondelor care monitorizeaz n mod direct starea de funcionare a familiilor de enzime. Astfel de sonde de activitate (ABP activity based probe) pot fi definite ca reactivi ce ndeplinesc urmtoarele criterii:

reacioneaz cu o gam variat de enzime dintr-o clas direct n complexul proteomic.

reacioneaz cu aceste enzime ntr-o manier corelat cu activitatea lor catalitic.

prezint reactivitate minim la nivelul altor clase de proteine.

prezint o grupare de vizualizare pentru detecie rapid i izolarea enzimelor reactive. n acest mod, o sond de activitate (ABP) bine proiectat ar putea permite identificarea i msurarea comparat a membrilor activi ai unei clase de enzime prezeni n dou sau mai multe proteomuri.

Pn n prezent chimia de sintez a adus numeroase progrese n studiul proteomului, producnd instrumente pentru: simplificarea proteomului la un numr manevrabil de proteine.

creterea sensibilitii analizei proteomului.

compararea abundenei proteice ntre proteomuri.

compararea activitilor proteinelor ntre proteomuri. Sondele de activitate (ABP) au fost create pn n prezent pentru familii de enzime hidrolitice ce prezint situs activ catalitic cu nucleofili, ns cu ajutorul unei combinaii de metode chimice orientate i neorientate o parte major a proteomului enzimatic ar putea fi acesibil studiului cu ajutorul sondelor de activitate, ducnd la posibilitatea de a msura activitatea proteic, ct i abundena.Studiul proteomului poate conduce la identificarea i validarea unor noi inte pentru medicamente i la construirea de medicamente specifice datelor genetice individuale.

O component principal a acestui domeniu este dat de proiectarea unor reactivi specifici de modificare a proteinelor, care pot fi folosii pentru studierea unor familii de enzime distincte dintr-un proteom. Aceste sonde chimice sunt proiectate s modifice covalent o enzim int astfel nct s poat fi identificat sau/i purificat ulterior. Prin intermediul chimiei organice de sintez, aceste sonde pot fi construite s reacioneze cu familii sau subfamilii de enzime diferite. n cazul n care enzimele utilizeaz un mecanism de atac nucleofilic, sondele pot fi proiectate s modifice reziduuri specifice ale situsului activ ntr-o manier care se bazeaz pe activitatea enzimatic a intei. Astfel de sonde poart denumirea de sonde de activitate (ABP activity based probe) pentru a evidenia nevoia unei enzime active care s faciliteze modificarea covalent. Alte sonde chimice care intesc reziduuri necatalitice din proteine i enzime au fost construite, acestea fiind denumite sonde de afinitate (AFBP affinity based probe). Sondele de afinitate necesit o legare selectiv i strns la int pentru a putea fi utilizate pentru familii diferite de proteine sau enzime. I.1.1. Proiectarea sondelor chimice de activitate (ABP)

Exist dou tipuri de strategii utilizate n construirea sondelor chimice de activitate (Fig. 1). Strategiile orientate au scopul de a inti enzime din familii nrudite. Sondele chimice de activitate care prezint selectivitate pentru anumite clase de enzime au fost generate pe baza a cel puin dou abordri. Fie folosesc un mecanism bazat pe inhibitori ca grupe reactive ce determin o preferin chimic pentru anumite clase de enzime, fie prin ncorporarea unor grupri cu spectru larg i afinitate nalt, care direcioneaz sondele ctre enzime ce mprtesc caracteristici structurale la nivelul situsului activ. n mod implicit, pentru proiectarea ABP este necesar o cunoatere fundamental a mecanismului sau structurii enzimei, la fel ca i a preferinelor de legare a enzimei. Pentru a extinde studiul profilului de activitate al proteinelor (ABPP) pentru enzime mai puin caracterizate, a fost introdus o strategie neorientat prin care sunt sintetizate biblioteci de ABP ce conin electrofili slabi i numeroase grupe de legare, acestea conducnd n mod cooperativ sondele chimice ctre situsurile active ale unor clase de enzime distincte.

Fig. 1 Pricipiul general al tehnicii de studiul al profilului de activitate al proteinelor (ABPP), reproducere din Cravatt2

I.1.2. Structura unei sonde chimice Sondele chimice sunt formate din trei elemente funcionale distincte: o grupare reactiv pentru legarea covalent la enzim, o regiune de legare (spacer) ce poate modula reactivitatea i specificitatea gruprii reactive i o component pentru vizualizare/identificarea i purificarea enzimelor modificate (Fig. 2).

Fig. 2 Structura unei sonde chimice, reproducere din Jeffery19

I.1.2.1. Structura gruprii reactive Probabil cea mai mare provocare n proiectarea unei sonde chimice o reprezint alegerea grupei reactive care s realizeze modificarea covalent a proteinei int. Dificultatea este dat de dualitatea acestei grupri de a fi att reactiv pentru un reziduu specific din protein, ct i inert pentru alte specii reactive din celul. Majoritatea grupelor reactive se prezint sub form de inhibitori sau reactivi pentru marcare de afinitate. Exist patru clase generale de grupe reactive care au fost folosite pentru construirea sondelor chimice (Fig. 3). Primele dou clase, I i II, sunt reprezentate de sonde chimice bazate pe grupe reactive inhibitori i care necesit ca enzima int s reacioneze cu sonda. n cazul primei clase, nucleofilul cheie este reziduul catalitic al enzimei implicate n atacul unui substrat. Astfel de sonde pot fi selective pe baza cunoaterii mecanismului catalitic i sunt de obicei construite pe msura reactivitii atomului nucleofilic specific folosit de clasa de enzime (Ex: sulful utilizat de cistein proteaze). Exemplele de grupe reactive din clasa I sunt reprezentate de epoxizi i aciloximetil cetone peptidice care marcheaz eficient i selectiv cistein proteaze din familiile papainei i caspazei. Aceste grupe reactive utilizeaz un carbon electrofilic care este susceptibil la atacul nucleoflilului din situsul activ al enzimei. n cazul unei sonde epoxid, rezultatul este dat de formarea unei legturi covalente ntre reziduul tiolic din situsul activ i carbonul electrofilic din inelul epoxidic. n prezent, acest tip de grupe reactive sunt cele mai utilizate i se consider c orice grup reactiv care imit un substrat i are un carbon electropozitiv ar putea fi folosit pentru modificarea covalent a unei enzime ce folosete mecanismul de atac nucleofil (Ex: prin resturile de cistein sau serin). A doua clas de sonde chimice conine un electrofil mascat, care este descoperit dup ce sonda acioneaz ca substrat pentru enzima int. Electrofilul mascat este capabil s reacioneze cu resturile nucleofilice apropiate i necatalitice din situsul activ. Dou exemple de inhibitori din clasa II sunt sulbactamul, un inhibitor al -lactamazei folosit n combinaie cu alte antibiotice pentru combaterea rezistenei bacteriilor la antibiotice, i DFPP, o sond utilizat pentru alchilarea protein fosfatazelor. Mecanismul de aciune pentru DFPP implic un atac iniial al nucleofilului din situsul activ asupra fosfotirozinei mimetice, ducnd la defosforilarea sondei. Aceasta conduce la producerea unei chinone ce poate reaciona cu un nucleofil din lanul lateral, de la nivelul situsului activ, n urma acestei reacii avnd loc alchilarea ireversibil a enzimei. Acest tip de grupe reactive are ca dezavantaj major faptul c permite difuzia electrofililor descoperii din zona situsului activ i poate avea loc alchilarea altor situsuri de pe enzima int sau a altor proteine cu resturi nucleofilice pe suprafaa lor. O alt clas de grupe reactive se bazeaz pe utilizarea unui reactiv general de alchilare, care reacioneaz cu inta doar pe baza reactivitii intrinseci a unui rest de aminoacid specific, precum cisteina. Un astfel de exemplu este dat de gruparea iodoacetamidic a sondei marcate cu izotopi radioactivi (ICAT), care poate reaciona cu gruprile sulfhidrice din resturile de cistein. Rezultatul este dat de legarea covalent a sondei de toate grupele sulfhidrice de pe protein.

Aceste trei clase de grupe reactive se utilizeaz pentru construirea sondelor chimice de activitate, iar urmtoarea clas este dat de grupe reactive folosite pentru sonde chimice de afinitate. Acestea difer de sondele de activitate prin faptul c nu necesit o enzim activ pentru realizarea modificrii sale. n cele mai multe cazuri, sunt analogi de substrat care conin un centru reactiv sensibil la atacul unui electrofil sau nucleofil din situsul activ al enzimei sau care poate fi activat prin adugarea ulterioar de chimicale sau radiaie UV. Un astfel de exemplu de grupare reactiv de afinitate este dat de 5-FSBA (5-fluorosulfonilbenzoil adenozin), care a fost utilizat pentru identificarea situsului activ al enzimelor ce leag nucleotide. Acest reactiv se leag la situsul activ al enzimei, aducnd gruparea reactiv fluorosulfonil n apropierea nucleofilior din situsul activ, precum cistein sau lizin. Astfel are loc alchilarea enzimei i pierderea activitii. 5-FSBA este un inhibitor puternic al protein chinazelor, dar i a altor proteine de legare a nucleotidelor.

Fig. 3 Mecanismul de aciune al sondelor chimice, reproducere din Jeffery19

I.1.2.2. Structura regiunii de legare Acest regiune are rolul de a conecta gruparea reactiv de componenta de vizualizare folosit pentru indentificare sau/i purificare. Regiunea de legare poate avea roluri multiple. Principala sa funcie este de a asigura destul spaiu ntre grupa reactiv i componenta de vizualizare pentru a preveni mpiedicarea steric, care de altfel ar putea bloca accesul grupei reactive sau accesibilitatea componentei de vizualizare n scopul purificrii. De obicei, se folosete un lan alchil lung sau un spacer de tip polietilenglicol (PEG). Folosirea unui lan alchil se realizeaz pentru controlul hidrofobicitii i pentru a permite intrarea la nivelul celulelor i esuturilor, n timp ce PEG confer solubilitate n soluii apoase sondelor hidrofobe. De asemenea, spacer-ul poate conine elemente specifice pentru intirea enzimei sau familiei de enzime dorite. Astfel de elemente specifice sunt sub form de peptide sau structuri de tip peptidic, n special pentru sondele care au ca int proteazele - . I.1.2.3. Structura componentei de vizualizare Scopul unei componente de vizualizare n cadrul unei sonde chimice este de a permite n mod simplu i rapid identificarea i purificarea proteinelor modificate de sond. Cele mai utilizate molecule de vizualizare sunt biotina i compui fluoresceni i radioctivi (Fig. 2). Moleculele de semnalizare utilizate n proiectarea unei sonde chimice ar trebui s fie compatibile metodelor de tipul SDS-PAGE, deoarece metodele de separare n gel a proteinelor sunt cele mai simple i mai rentabile. Biotina faciliteaz detecia prin metoda Western Blot folosind o molecul raportor de avidin n locul anticorpului standard, iar compuii fluoresceni i radioactivi pot fi vizualizai prin scanarea direct a gelurilor cu scannere de fluorescen. Moleculele de vizualizare fluorescente sau radioactive prezint cteva avantaje fa de biotin. Ele se pot utiliza ntr-un mod mai rapid, sunt mai sensibile i au un domeniu dinamic mai bun. De asemenea, ele permit multiplexarea probelor bazate pe spectre excitare-emisie care nu se suprapun ale acestora, ceea ce permite folosirea unor sonde chimice cu compui fluoresceni colorai diferit n experimente diferite i obinerea tuturor rezultatelor pe un singur gel. Componenta de vizualizare poate fi ataat sondei chimice nainte de reacia protein-sond sau ulterior acestei reacii, ataarea fluoroforului putndu-se realiza prin click chemistry, printr-o reacie ntre o tripl legtur i o grupare azid (Fig. 4).

Fig. 4 Ataarea fluoroforului prin click chemistry, reproducere din Cravatt2

I.1.3. Aplicaii ale sondelor chimice Sondele chimice pot fi utilizate pentru studierea tuturor aspectelor legate de proteomic, de la expresia i identificarea proteinelor la localizare i reglare celular. De asemenea, ele prezint un rol important n descoperirea i dezvoltarea unor medicamente noi, ct i pentru identificarea locului int al acestora n organism. Sondele chimice asigur o metod prin care se realizeaz concentrarea eforturilor de identificare a intei spre proteine care pot fi uor confirmate i care, cel mai probabil, pot fi inte eficiente pentru medicamente. De asemenea, sondele chimice se pot utiliza pentru validarea experimentelor pe modele celulare sau animale n stagii incipiente ale bolii i validarea intelor iniiale.

Pn n prezent, sondele chimice au fost folosite pentru identificarea cistein proteazelor implicate n procese precum apoptoza, formarea cataractei i infecia cu malaria. Alte sonde chimice au fost folosite pentru studiul profilului enzimelor implicate n evoluia cancerului i rspndirea cancerului la nivel celular. Sondele chimice au un potenial ridicat de a realiza o cretere a numrului de inte pentru medicamente, prin identificarea acestor inte ntr-un mod rapid, sistematizat i uor de neles. Acesta se bazeaz pe proiectarea, sinteza i aplicarea unor sonde chimice relevante.

De asemenea, sondele chimice pot fi utilizate pentru studierea eficienei medicamentelor. Acest proces implic identificarea intei dorite pentru medicament la nivelul proteomului prin realizarea unui test competitiv ntre medicament i sonda chimic. Abilitatea medicamentului de a inhiba o anumit int i nu pe altele poate fi apreciat n cadrul unei probe relevante de esut. Astfel de metode pentru evaluarea eficienei i selectivitii unui medicament prin utilizarea sondelor chimice pot fi desfurate ntr-un numr variat de sisteme precum proteine purificate, lizate celulare, celule vii sau chiar animale vii. Informaiile astfel obinute vor ndrepta eforturile de dezvoltare a medicamentelor spre o cretere a eficienei i selectivitii acestora asupra unei anumite boli.I.2. Sonde chimice utilizate n studiul proteinelor receptorSondele chimice sunt proiectate s modifice covalent o enzim int astfel nct s poat fi identificat sau/i purificat ulterior. Prin intermediul chimiei organice de sintez, aceste sonde pot fi construite s reacioneze cu familii sau subfamilii de enzime diferite.

Sondele de activitate (ABP) au fost create pn n prezent pentru familii de enzime hidrolitice ce prezint situs activ catalitic cu nucleofili, ns cu ajutorul unei combinaii de metode chimice orientate i neorientate o parte major a proteomului enzimatic ar putea fi acesibil studiului cu ajutorul sondelor de activitate.

Sondele chimice de afinitate deriv din sondele de activitate, diferena ntre ele constnd n utilizarea la nivelul unor enzime catalitic activ sau neactive. Sondele de activitate (ABP activity based probe) necesit o enzim activ care s faciliteze modificarea covalent. Alte sonde chimice intesc reziduuri necatalitice din proteine i enzime. Acestea au fost denumite sonde de afinitate (AFBP affinity based probe).

Principiul de construcie al unor astfel de sonde respect principiul general pe baza cruia sunt sintetizate sondele de activitate, la care se adaug elemente suplimentare pentru a face posibil reacia covalent, ireversibil cu proteina. Astfel, sondele de afinitate conin:

un element de afinitate pentru proteina int care s permit formarea complexului necovalent, reversibil cu proteina int;

o grup reactiv capabil sa reacioneze covalent cu un reziduu de aminoacid de pe suprafaa proteinei, sub aciunea unor factori externi precum lumina sau ageni de oxidare;

o component de vizualizare (fluorofor sau biotin) pentru vizualizarea proteinei marcate;

un spacer (aa cum este i n cazul sondelor de activitate propriu-zise) care s asigure o distan convenabil ntre grupa reactiv i fluorofor astfel nct componenta de vizualizare s nu afecteze interacia cu proteina.

Cele mai cunoscute grupe reactive utilizate n acest scop sunt grupele fotoreactive. Sondele care conin o grup reactiv care poate fi activat, pentru legarea covalent, prin iradiere cu radiaie ultraviolet, sunt denumite sonde de fotoafinitate (photoaffinity labels). Funciunile chimice utilizate adesea ca grupe fotoreactive sunt azidele (1, Fig. 5), diazirinele (2, Fig. 5) i compuii carbonilici (3, Fig. 5), cunoscute pentru capacitatea de a genera, sub acinea radiaiei luminoase, specii radicalice reactive, capabile s reacioneze cu reziduurile aminoacizilor din proteine.

Fig. 5 Cele mai utilizate grupe fotoreactive care pot genera, prin iradiere cu radiaie ultraviolet, specii radicalice reactive capabile s reacioneze cu reziduurile aminoacizilor din proteine: fenilazida 1, fenildiazirina 2 i benzofenona 3

n general, grupele fotoreactive sunt alese n funcie de proteina int, dar i de disponibilitatea lor comercial sau de uurina de a fi sintetizate i ncorporate n sondele chimice, la o distan convenabil de regiunea de afinitate. Speciile reactive rezultate prin iradiere conduc ns la o multitudine de produi secundari, ceea ce reprezint un mare dezavantaj al sondelor de fotoafinitate. De aceea, au fost dezvoltate un alt tip de grupe reactive care conin un centru reactiv susceptibil la atacul unui nucleofil sub aciunea unor ageni oxidani adugai suplimentar n mediul de reacie. 3,4-Dihidroxifenilalanina (DOPA, 4, Fig. 6) constituie o astfel de grup reactiv, ntruct sub aciunea periodatului de sodiu genereaz un intermediar orto-chinonic electrofil de tip 6 (Fig. 6), susceptibil la atacul unui reziduu nucleofil din vecintatea situsului activ.

Fig. 6 Aciunea periodatului de sodiu asupra derivatului difenolic 4 cu generarea unui intermediar electrofil orto-chinonic 6

3,4-Dihidroxifenilalanina este o grup reactiv avantajoas datorit faptului c majoritatea proteinelor sunt inerte la aciunea oxidantului, reacia de marcare fiind selectiv, dar i pentru c este un aminoacid ce poate fi uor ncorporat n secvene peptidice, prin sintez pe suport solid.

Fig. 7 Interacia intermediarului orto-chinonic 6 electrofil cu un nucleofil din molecula proteinei cu formarea unei legturi covalente ntre grupa reactiv i protein

Utilizarea 3,4-dihidroxifenilalaninei n studiul interaciilor molecule mici-proteine (Fig. 7), s-a dovedit a fi foarte eficient. Au fost efectuate studii asupra reziduurilor de aminoacizi cu care interacioneaz cel mai bine restul de catecol, observndu-se n primul rnd c grupa nucleofil i gruparea orto-chinonic trebuie s se afle la o distan convenabil, astfel nct s poat avea loc atacul nucleofilului. De asemenea, s-a observat c nu toi aminoacizii reacioneaz cu gruparea orto-chinonic, cei mai reactivi fiind lizina, histidina i cisteina. Avantajul major fa de metodele fotochimice este faptul c periodatul de sodiu necesar pentru formarea grupei chinonice nu afecteaz grupele de pe catenele laterale ale aminoacizilor din proteine cu excepia cisteinei i metioninei24.Pn n prezent, sondele chimice au fost intens utilizate pentru studierea diferitor clase de enzime, iar studiile nu au fost ndreptate dect recent spre investigarea proteinelor receptor la nivelul celulelor vii.

Proteinele receptor sunt proteine care se gsesc la nivelul membranelor sau n citoplasm i de care se pot ataa molecule de semnalizare ce poart denumirea de liganzi. Ei se leag la nivelul receptorilor, manifestnd efect activator sau inhibitor, prin formarea unui complex ligand-receptor.

Aceste studii au fost orientate ctre sinteza de sonde chimice pentru receptorul nicotin acetilcolinei i pentru receptorul GABAB (acid -aminobutiric B). Receptorul nicotin acetilcolinei (nAChR) este un canal de ioni din superfamilia Cys-Loop care devine permeabil pentru cationi la legarea neurotransmitorului acetilcolin. Ca i alte tipuri de canale de ioni, nAChR trece ntr-o stare inactiv ca rspuns la expunerea prelungit la acetilcolin. n aceast stare inactiv, receptorul prezint afinitate ridicat pentru acetilcolin i nicotin, iar inactivitatea predomin n prezena acetilcolinei. Sondele chimice ar putea fi folosite n acest caz pentru caracterizarea interaciilor protein-protein i a modificrilor posttranslaionale asociate cu inactivarea i reactivarea nAChR. Prin urmare, astfel de sonde chimice ar putea fi folositoare pentru investigarea procesului de inactivare n cazul dependenei de nicotin i dereglrilor neuromusculare.

Astfel, a fost sintetizat o sond chimic, numit BPyneTEA (benzofenon-alchintrietilamoniu), care prezint caractersitici ale structurilor printe, ce se leag n mod selectiv la nAChR deschis sau nchis (Fig. 8 ).

Fig. 8 Sonda de afinitate 7 care se leag selectiv la receptorul nAChR conine un grup fotoreactiv (benzofenon, rou), o grup alchinic (verde) utilizat pentru legarea ulterioara cu un fluorofor pentru vizualizarea proteinei marcate printr-o reacie de cicloadiie de formare a unui triazol, grupa de afinitate (acetilcolina, albastru)

Pentru a aprecia efectul acestor caracterstici combinate ntr-o singur sond chimic, aciunea sondei asupra nAChR a fost caracterizat din punct de vedere electrofiziologic i biochimic, conducnd la concluzia c aceast molecul se poate lega i bloca att canalele deschise, ct i pe cele nchise. Pentru a observa distribuia acestei sonde n celule vii, s-a realizat marcarea canalelor deschise i nchise nAChR modificate cu BPyneTEA, printr-o reacie click a BPyneTEA cu biotin funcionalizat cu o grupare azid. S-a observat c BPyneTEA se leag preferenial la canalele nchise, adic n lipsa acetilcolinei. n concluzie, canalele de ioni reprezint o clas de proteine ce poate reprezenta o int pentru studilul profilului de activitate prin intermediul sondelor chimice.

Acidul -aminobutiric (GABA) este principalul neurotransmitor inhibitor din sistemul nervos central i i exercit efectul prin intermediul a dou canale de ioni, receptorii GABAA i GABAC i a receptorilor metabotropici GABAB. Receptorii GABAB sunt rspndii la nivelul creierului i mduvei spinrii i sunt localizai n compartimente pre i post sinaptice. Ei intermediaz inhibiia sinaptic i sunt implicai n numerose tipuri de nocicepie, insuficien cognitiv, epilepsie, spasme i dependen de droguri. Receptorii GABAB reprim influxul de Ca2+ i declaneaz deschiderea canalelor de K+ prin cuplarea cu o protein G i de asemenea, pot ajusta nivelul de adenozin monofosfat ciclic (cAMP). Ei formeaz heterodimeri alctuii din dou subuniti GB1 i GB2. GB1 poate lega GABA, dar nu poate activa proteine G, n timp ce GB2 poate activa proteine G la asamblarea heterodimerului cu GB1.

Dezvoltarea unor sonde chimice fluorescente pentru acest tip de receptori a reprezentat o provocare major, deoarece astfel de molecule ar trebui s conduc la rezultate privind localizarea i funciile receptorilor GABAB n celule vii. innd cont de acestea, a fost sintetizat o sond chimic, avnd n structur sa o parte de afinitate corespunztoare unui anatagonist selectiv al GB1, o grupare diazirin fotolabil care genereaz legarea covalent a sondei la receptor n urma iradierii UV i o component de vizualizare (BODIPY) (Fig. 9).

Fig. 9 Structura chimic a sondei de fotoafinitate 8 care ncorporeaz o regiune de afinitate (albastru), o grupare fotoreactiv (trifluorometilarildiazirin, rou) i o grup fluorescent (4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diazas-indacen BODIPY, verde) i a antagonistului cu selectivitate nalt 9 al receptorului GABAB

Studiile farmacologice au artat c aceast sond conserv potenialul antagonist asupra receptorilor GABAB, iar experimentele de marcare de fotoafinitate i microscopie de fluorescen au condus la concluzia c sonda se leag de receptorii GABAB cu specificitate nalt. De asemenea, aceast abordare prezint avantajul de a conduce la formarea unei legturi covalente permanente ntre sond i receptor pe ntreg procesul de fotoliz, permind studiul dinamicii acestor receptori n celulele vii.

innd cont de aceste ncercri de a extinde utilizarea sondelor chimice spre studiul proteinelor receptor, ne propunem sinteza unei sonde chimice de afinitate pentru receptorul estrogenic. I.3. Proteine receptor i modulatori selectivi ai receptorilor estrogeniciReceptorii sunt proteine care se gsesc la nivelul membranelor sau n citoplasm i de care se pot ataa molecule de semnalizare ce poart denumirea de liganzi. Legarea ligandului la receptor determin formarea unui complex ligand-receptor, iar activitatea biologic a ligandului este realizat printr-un rspuns celular, care difer n funcie de activitatea agonist sau antagonist a ligandului.

Modulatorii selectivi ai receptorilor estrogenici (SERM) reprezint o clas de liganzi sintetici, ce prezint abilitatea de a aciona ca agoniti n unele esuturi i ca antagoniti n altele. Ei se leag la nivelul receptorilor estrogenici, manifestnd efect activator sau inhibitor n funcie de esut, fiind utilizai ca medicamente pentru tratarea sau prevenirea diferitor maladii.

I.3.1. ReceptoriReceptorii sunt proteine care se gsesc la nivelul membranelor sau n citoplasm i de care se pot ataa molecule de semnalizare ce poart denumirea de liganzi (neurotransmitori, hormoni, medicamente, toxine).

Interacia medicament (ligand) (M) farmacoreceptor (R) are loc cu formarea complexului (MR) i cu apariia efectului biologic (E) al medicamentului.Receptorii recunosc specific semnalul chimic reprezentat de anumite molecule, fapt care se datoreaz existenei pe suprafaa receptorului a unui situs de legare, complementar chimic, electric i/sau spaial cu molecula medicamentoas sau endogen.

Complexul MR se realizeaz prin stabilirea unor legturi labile, cum ar fi: legturi ionice, puni de hidrogen, fore Van der Waals. Acest cuplu MR va iniia odat format, reacii enzimatice secveniale n cascad, explicndu-se astfel consecinele funcionale majore ale unor cantiti foarte mici de substan. Receptorii chimici au fost numii farmacoreceptori, deoarece medicamentele se comport ca agoniti sau antagoniti.

La legarea unui agonist de receptor are loc o activare a receptorului astfel nct rspunsul biologic este maxim. Legarea unui antagonist determin blocarea receptorului i, prin urmare, inhibarea legrii altor agoniti. Acelai ligand poate se exercite att activitate agonist, ct i activitate antagonist, ns asupra unor tipuri diferite de celule int.I.3.1.1. Receptori estrogeniciEstrogenii reprezint o clas de compui steroidici, care funcioneaz ca hormoni sexuali principali n organismul feminin. Estrogenii influeneaz numeroase procese fiziologice la mamifere, procese ce includ reproducerea, dar i sntatea cardiovascular, integritatea osoas, comportamentul. Date fiind aceste informaii privind rolul estrogenilor n fiziologia uman, nu este surprinztor faptul c estrogenii sunt implicai n dezvoltarea sau regresia multor boli, precum diferite tipuri de cancer (de sn, ovarian, colorectal, de prostat), osteoporoza, boli neurodegenerative, boli cardiovasculare, obezitate. n multe din aceste boli, estrogenii i transmit efectele prin intermediul receptorilor estrogenici, macromolecule proteice care servesc ca baz n numeroase intervenii terapeutice.

Receptorii estrogenici (ER) sunt membri ai familiei receptorilor nucleari (NR) i se prezint sub dou forme diferite, ER- i ER-. ER- a fost descoperit n jurul anilor 1950 de ctre Elwood V. Jensen, iar ER- a fost descoperit n 1996 de ctre Kuiper. Aceti receptori sunt gsii n cantiti mari la nivelul diferitor tipuri de esuturi. ER- (Fig. 10) se gsete la nivelul celulelor endometriale, celulelor canceroase de la nivelul snilor, celulelor ovariene i hipotalamusului. ER- (Fig. 10) este prezent n cantitate mai mare la nivelul rinichilor, plmnilor, creierului, oaselor, inimii, mucoasei intestinale, prostatei..

Fig. 10 ER- i ER-, reproducere PDB

ER- regleaz diferenierea i ntreinerea esuturilor nervos, osos, cardiovascular i reproductor, iar compuii care moduleaz activitatea transcripional a ER- sunt folosii pentru tratarea osteoporozei, bolilor cardiovasculare i cancerului la sn-.

Fig. 11 Domeniile funcionale ale ER, reproducere din Bourguet

Proteina ER conine 595 de aminoacizi, avnd o greutate molecular de 66 kDa i fiind mprit n ase domenii funcionale, notate A, B, C, D, E i F (Fig. 11). Zonele A i B reprezint domeniul N-terminal, domeniul C reprezint domeniul de legare a ADN-ului (DBD - DNA Binding Domain), domeniul E constituie domeniul de legare a ligandului (LBD Ligand Binding Domain), iar F reprezint domeniul C-terminal. Regiunea D constituie zona de legtur ntre DBD i LBD--. I.3.2. Modulatori selectivi ai receptorilor estrogenici (SERM)Modulatorii selectivi ai receptorilor estrogenici (SERM) reprezint o clas de liganzi sintetici, ce prezint abilitatea de a aciona ca agoniti n unele esuturi (oase, ficat, sistemul cardiovascular), ca antagoniti n alte esuturi (la nivelul snilor i creierului) i att ca agoniti, ct i ca antagoniti la nivelul uterului. Ei se leag la nivelul receptorilor estrogenici, manifestnd efect activator sau inhibitor n funcie de esut, fiind utilizai ca medicamente pentru tratarea sau prevenirea diferitor maladii.

Modulatorul selectiv ideal: acesta ar trebui s prezinte activitate agonist asupra sistemului osos, esutului cardiovascular i sistemului nervos central, i activitate antagonist asupra uterului i esutului mamar. Drept urmare, acest modulator ideal ar mri procesul de refacere i formare a oaselor, ar mbunti profilul lipidic i ar proteja sistemul nervos, fr a crete riscul dezvoltrii unui cancer dependent de estrogen.

I.3.2.1. Tipuri de modulatori selectivi ai receptorilor estrogenici Modulatorii selectivi ai receptorilor estrogenici sunt, de obicei, clasificai ca i compui de generaia a doua, a treia i a patra, sugernd dezvoltarea progresiv a lor, realizat n ncercarea de a mbunti efectele benefice i de a reduce efectele negative produse de primele tipuri de modulatori descoperite. Aceast clasificare nu are, ns, o importan major, deoarece nu descrie o tranziie logic ntre prima i a patra generaie.

Un alt tip de clasificare l reprezint cel realizat n funcie de compuii de baz prezeni n structura modulatorilor, acetia fiind mprii n trei clase (Fig. 12), astfel: modulatori TRIFENILETILENICI: tamoxifen-. modulatori BENZO[b]TIOFENICI: raloxifen. modulatori BENZOPIRANICI: acolbifen.

TamoxifenRaloxifenAcolbifen

Fig. 12 Tipuri de modulatori selectivi ai receptorilor estrogenici

I.3.2.2. Derivai ai benzo[b]tiofenului cu proprietate de SERMDerivaii de benzo[b]tiofen prezint importan n chimia medicinal i pot fi gsii n diverse forme farmaceutice ca de exemplu Sertaconazole (GinedermofixTM), Zileuton (LeutrolTM) i Raloxifene (EvistaTM).

SertaconazoleZileutonRaloxifene

Fig. 13 Derivai de benzo[b]tiofen

Sertaconazolul este utilizat ca fungicid, antibacterian, antiinflamator, antipruritic. Zileutonul este folosit ca inhibitor al 5-lipoxigenazei i al leucotrienelor fiind utilizat i n tratamentul astmului cronic. Un medicament derivat de benzo[b]tiofen utilizat pentru tratarea osteoporozei la femei, dup instalarea menopauzei, este tot un derivat al benzo[b]tiofenului, denumit raloxifen. Extinderea cercetrilor i ncercrile clinice au relevat faptul c raloxifenul poate fi folosit i n prevenirea cancerului la sn, controlul cancerului uterin i tratarea bolii Alzheimer. Studiile efectuate la laboratoarele din Lilly, au permis obinerea unor noi analogi ai raloxifenului cu potenial activitate biologic.Raloxifenul face parte din clasa modulatorilor selectivi ai receptorilor estrogenici, care prezint activitate agonist puternic asupra esutului osos i sistemului cardiovascular i antagonist asupra esutului mamar i al endometrului. Raloxifenul (LY139481) sau hidrocloritul su, cunoscut sub denumirea de keoxifen (LY156758), a fost sintetizat n urm cu aproximativ 20 de ani. Este un derivat al benzotiofenului, avnd formula chimic C28H27NO4S i o mas molecular de 473,584 g/mol. Denumirea sistematic a raloxifenului este 6-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-3-[4-(2-piperidin-1-il)etoxibenzoil]benzo[b]tiofen. Raloxifenul a fost produs din dorina de a se gsi un tratament pentru cancerul la sn. Se leag de receptorii estrogenici i prezint efecte localizate la nivelul diferitor esuturi. Selectivitatea la nivelul esuturilor pe care o prezint raloxifenul poate fi dobndit prin diferite mecanisme determinate de structura ligandului, interaciunea ligandului cu diferite subtipuri ale receptorilor estrogenici n esuturi i evenimentele intracelulare aprute dupa legarea ligandului. Raloxifenul se leag de receptorii estrogenici i inhib creterea celulelor canceroase la nivelul snilor. De asemenea, ajut la meninerea densitii mineralelor n oase, fiind raportat o cretere a acestei densiti (BMD-Bone Mineral Density) la nivelul coloanei vertebrale, a oldului i chiar a ntregului corp, dar se pare c aceast cretere este mai redus ca n cazul terapiei cu estrogeni. n urma experimentelor clinice s-a dovedit c raloxifenul prezint efecte benefice asupra scheletului i din aceast cauz s-a aprobat folosirea sa n tratarea osteoporozei. n plus, s-a dovedit c raloxifenul produce o reducere a concentraiei colesterolului n snge, fiind similar cu efectul terapiei cu estrogeni. Raloxifenul a fost studiat n cadrul studiului STAR (Study of Tamoxifen and Raloxifene), cel mai mare studiu efectuat privind chemoprevenia cancerului la sn. Rezultate recente ale acestui studiu arat c utilizarea n mod regulat a raloxifenului are aceleai efecte benefice n ceea ce privete reducerea riscului apariiei cancerului la sn ca i utilizarea tamoxifenului, ns cauzeaz efecte secundare toxice mult reduse fa de utilizarea tamoxifenului. Un alt studiu efectuat asupra raloxifenului l constituie RUTH (Raloxifene Use for The Heart), prin care se investigheaz dac raloxifenul scade incidena evenimentelor coronariene i riscul apariiei cancerului la sn la femeile ce prezint boli ale inimii. Rezultatele preliminare au artat c raloxifenul nu prezint efecte asupra inimii, dar poate reduce riscul apariiei cancerului la sn la femeile ce prezint boli cardiovasculare.I.3.3. Interacia estradiol-ER i raloxifen-ERDatorit faptului cu terapia cu hormoni prezint numeroase dezavantaje, modulatorii selectivi ai receptorilor estrogenici vin s compenseze aceste neajunsuri, ei fiind intens studiai i utilizai n ultimii ani. Aceasta se datoreaz faptului c prezint o afinitate bun de legare la receptorii estrogenici i efecte secundare reduse.Raloxifenul, ca toi modulatorii selectivi ai receptorilor estrogenici (SERM) sau chiar estrogenii, se poate lega la ER, manifestndu-i activitatea agonist sau antagonist n funcie de esutul asupra cruia acioneaz. Capacitatea de a se lega la ER se numete afinitate de legare.

Afinitatea de legare este exprimat prin valori ale afinitii relative de legare (RBA-Relative Binding Affinity), valoarea pentru estradiol fiind de 100%. Raloxifenul se leag cu o afinitate ridicat de receptorii estrogenici, avnd o valoare RBA = 34%.

17-estradiolul i raloxifenul sunt exemple de liganzi ai receptorului estrogenic, putndu-se recunoate caracteristici asemntoare n modurile de legare ale acestora.

Gruparea hidroxil fenolic a estradiolului (O3) grefat pe nucleul A este poziionat ntre H3 i H6, i formeaz legturi de hidrogen cu Glu353, Arg394 i o molecul de ap. Hidroxilul 17 (O17) a nucleului D formeaz legturi de hidrogen cu His524 din helixul H11 (Fig. 14). Odat ce ligandul este astfel legat, helixul H12 nchide buzunarul hidrofobic, iar cu aceast transformare conformaional, se activeaz funcia AF-2 (unde aminoacizii din poziiile 545, 542 i 538 joac un rol important prin legarea de proteine co-activatoare).

Fig. 14 Interacia estradiolului cu aminoacizii constitutivi ai ER

Raloxifenul este recunoscut prin intermediul gruprilor hidroxil grefate, de ctre domeniul de legare al receptorului estrogenic. Aceste grupri hidroxil interacioneaz cu aceiai aminoacizi ca i estradiolul. Cu toate acestea, helixul H12 a receptorului nu poate nchide buzunarul hidrofobic, deoarece trebuie s fie repoziionat ntre H3 i H5. Deci regiunea AF-2 este mascat i nu poate capta co-activatori.

Fig. 15 Interacia raloxifenului cu aminoacizii constitutivi ai ER

Funcia structural cheie a antiestrogenilor nonsteroidici o constituie lanul lateral alchilaminoetoxidic. Modificri ale distanei dintre atomii de azot i oxigen, modificri ale bazicitii azotului sau existena unor restricii conformaionale ale lanului lateral determin modificri ale activitii antiestrogenice. n plus, ndeprtarea lanului lateral determin pierderea activitii antiestrogenice, acest lan lateral fiind cel care se leag la LBD-ul ER (Fig. 15).Capitolul II. Proiectarea i sinteza unei sonde de afinitate pentru receptorul estrogenicModulatorii selectivi ai receptorilor estrogenici realizeaz interacii necovalente cu receptorii estrogenici, aceste fiind legturi labile, prin urmare se consider c ele sunt motivul pentru care activitatea lor este una sczut. innd cont de toate acestea, ne propunem sinteza unei sonde chimice de afinitate care s pstreze proprietatea de legare necovalent la receptorii estrogenici pe care o prezint raloxifenul, dar care s realizeze i o legare covalent.

II.1. Structura sondei de afinitate pentru receptorul estrogenicScopul proiectului este de a sintetiza o sond chimic de afinitate prin care s realizm marcarea covalent a receptorului estrogenic cu un compus fluorescent, astfel nct s poat fi urmrit distribuia receptorului estrogenic marcat la nivelul esuturilor normale i a celor patogene.

O astfel de sond chimic de afinitate ar trebui s prezinte urmtoarea structur (Fig. 16):

A) o component de afinitate pentru receptorul estrogenic (Fig. 16 - colorat n rou);B) o grupare reactiv (Fig. 16 - colorat n albastru);C) componenta de vizualizare (Fig. 16 - colorat n verde);D) un spacer (Fig. 16 colorat n negru).

Fig. 16 Sonda de afinitate pentru receptorul estrogenic, bazat pe structura raloxifenului

A) Componenta de afinitate (Fig. 16 - colorat n rou) pentru receptorul estrogenic este reprezentat de un derivat de raloxifen, care prezint o afinitate de legare la receptorul estrogenic bun. Aceasta component trebuie s pstreze proprietile raloxifenului de legare necovalent la receptorul estrogenic, prin intermediul gruprilor hidroxil i a azotului piperidinic.B) Gruparea reactiv (Fig. 16 - colorat n albastru) - capabil s prind un nucleofil din molecula receptorului estrogenic, realiznd astfel legarea covalent. O astfel de structur poate fi DOPA, care a fost utilizat intens n astfel de scopuri i poate fi uor oxidat de periodatul de sodiu, formnd o chinon intermediar foarte reactiv, ce poate reaciona uor cu grupri nucleofilice din vecintate.

C) Componenta pentru vizualizare (Fig. 16 - colorat n verde) este reprezentat de un fluorofor. Scopul unei componente de vizualizare n cadrul unei sonde chimice este de a permite n mod simplu i rapid identificarea i purificarea proteinelor modificate de sond. Tripla legtur liber din structura sondei propuse este capabil s reacioneze anterior sau ulterior legrii covalente a sondei la receptor cu o grupare azid ntr-o reacie de tip click, aceasta fiind necesar pentru ataarea fluoroforului. Fluoroforul este necesar pentru a confirma legarea covalent a moleculei int la receptorul estrogenic.

D) Spacer-ul (Fig. 16 colorat n negru) are rolul de a conecta gruparea reactiv de componenta de vizualizare folosit pentru identificare sau/i purificare. Regiunea de legare are ca principal funcie asigurarea unui spaiu suficeint ntre grupa reactiv i componenta de vizualizare pentru a preveni mpiedicarea steric, blocarea grupei reactive sau accesibilitatea componentei de vizualizare n scopul purificrii. Permite deci distana convenabil ntre situsul de legare al moleculei int i cel mai apropiat nucleofil, astfel nct gruparea reactiv DOPA s poat reaciona. Lanuri de polietilenglicol de lungimi variabile vor fi utilizate pentru acest scop.

Realizarea unei legri covalente a receptorului estrogenic la un xenobiotic poate reprezenta punctul de nceput pentru experimentele in vivo prin care s se observe distribuia la nivelul diferitelor esuturi a unui compus marcat fluorescent. Selectivitatea sczut a modulatorilor selectivi ai receptorilor estrogenici ar putea fi mbuntit astfel, dac mecanismele de aciune ar fi complet nelese.II.2. Mecanismul de interacie sond de afinitate receptor estrogenicLegarea unui ligand la receptorul estrogenic determin formarea unui complex ligand-receptor, iar activitatea biologic a ligandului este realizat printr-un rspuns celular, care difer n funcie de activitatea agonist sau antagonist a ligandului.

Complexul ligand-receptor se realizeaz prin stabilirea unor legturi labile, cum ar fi: legturi ionice, puni de hidrogen, fore Van der Waals, legturi electrostatice. Prin urmare, procesul de formare a acestui complex este unul reversibil (Fig. 17).

Fig. 17 Formarea complexului ligand-receptor

Ne propunem sinteza unei sonde chimice de afinitate (compusul 15, Fig. 16) care s pstreze proprietatea de legare necovalent la receptorii estrogenici pe care o prezint raloxifenul, datorit faptului c raloxifenul reprezint modulatorul selectiv cel mai potent la ora actual avnd o bun afinitate de legare la receptorii estrogenici, iar utilizarea sa duce la producerea de efecte secundare mult reduse fa de utilizarea altor modulatori selectivi. Mai mult aceast molecul nou sintetizat va realiza i o legare covalent la receptorii estrogenici, prin intermediul unui bra lateral suficient de lung, astfel nct s permit ieirea din situsul activ al receptorului, i sub influena unor factori externi, n cazul nostru particular periodatul de sodiu (Fig. 18).

Fig. 18 Legarea covalent a sondei la receptorul estrogenic

Pentru atingerea scopului propus i anume de a sintetiza o sond de afinitate pentru receptorul estrogenic a fost necesar parcurgerea urmtoarelor etape i anume:

1. sinteza i analiza structural a componentei de afinitate a sondei de afinitate pentru receptorul estrogenic;

2. asamblarea regiunii de legare (spacer-ului), grupei reactive i a unitii structurale funcionalizat cu tripl legtur (care va permite ataarea unui fluorofor), din structura sondei de afinitate prin sintez de peptide pe suport solid.Aspectele experimentale ct i observaiile legate de cele dou direcii realizate v sunt prezentate n ceea ce urmeaz.Capitolul III. Sinteza i analiza structural a sondei chimice de afinitate pentru receptorul estrogenicSonda de afinitate pentru receptorul estrogenic (Fig. 19) conine elemente eseniale care necesit sinteza individual, n soluie, i asamblarea lor prin utilizarea metodelor de sintez pe suport solid. Design-ul fiecrei componente s-a realizat innd cont de disponibilitatea comercial a materiilor prime, de numrul de etape de sintez necesare, iar pe parcursul desfurrii proiectului au fost aduse mbuntiri prin gsirea unor materii prime alternative sau metode de sintez mai eficiente.

Fig. 19 Structura chimic a sondei chimice de afinitate pentru receptorul estrogenic

Sonda chimic de afinitate pentru receptorul estrogenic este alctuit din componenta de afinitate pentru receptorul estrogenic asigurat de structura raloxifenului (Fig. 19, colorat n rou), grupa reactiv (Fig. 19, colorat n albastru), componenta cu legtur tripl (Fig. 19, colorat n verde) care va permite ataarea unui fluorofor printr-o reacie click i spacer-ul (Fig. 19, colorat n negru).III.1. Sinteza componentei de afinitate a sondei de afinitate pentru receptorul estrogenicComponenta de afinitate pentru receptorul estrogenic deriv de la raloxifen, un compus ce prezint n molecul un scheletului benzo[b]tiofenic i unul piperidinc (Fig. 20).Derivatizarea ulterioar a moleculei raloxifenului trebuie realizat astfel nct s nu fie afectat interacia raloxifenului cu receptorul estrogenic. Singura poziie care ndeplinete aceast condiie este poziia 4 de pe nucleului piperidinic. De asemenea, pentru construirea componentei de afinitate pentru receptorul estrogenic s-a avut n vedere pstrarea elementelor cheie din molecula raloxifenului prin intermediul crora are loc interacia necovalent ntre raloxifen i receptorul estrogenic. Aceste grupe funcionale cheie sunt grupele hidroxil grefate pe scheletul benzo[b]tiofenic, ct i atomul de azot din nucleul piperidinc.

Fig. 20 Structura componentei de afinitate a sondei chimice de afinitate pentru receptorul estrogenic

Pentru sinteza componentei de afinitate pentru receptorul estrogenic a fost necesar s realizm inial sinteza scheletului benzo[b]tiofenic de baz care mai departe a fost pus n reacie cu derivatul piperidinc, realiznd astfel sinteza componentei de afinitate pentru receptorul estrogenic.Astfel, am realizat ntr-o prim etap sinteza scheletului benzo[b]tiofenic, ce va reprezenta componenta de afinitate din cadrul sondei, pornind de la 3-metoxibenzentiol i 2-bromo-4-metoxiacetofenon. Intermediarul obinut, 4-metoxi--[(3-metoxifenil)tio]acetofenon, a fost apoi supus unei reacii de ciclizare sub aciunea acidului polifosforic, ducnd la formarea compusului 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tiofen.Compusul obinut a fost apoi bromurat, rezultnd 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)-3-bromobenzo[b]tiofen. Derivatul bromurat a fost supus unei reacii de substituie nucleofil, reacie ce a decurs n prezen de BuLi i folosind ca solvent tetrahidrofuran anhidru (THF). Aceast reacie s-a realizat la o temperatur de -78oC i sub atmosfer inert (Schema 1).

Schema 1 Sinteza scheletului benzo[b]tiofenic

Ulterior, prin ataarea restului piperidinic la scheletul benzo[b]tiofenic s-a obinut derivatul de raloxifen modificat n poziia 4 de pe nucleul piperidinic, necesar pentru sinteza noii sonde chimice de afinitate pentru receptorul estrogenic. Pentru ataarea derivatului piperidinic (compusul 24, Schema 2) la nucleul benzo[b]tiofenic, a fost realizat o reacie de eterificare, reacie ce a avut loc n prezen de hidrur de sodiu i folosind dimetilformamid anhidr ca solvent. (Schema 2)

Schema 2 Sinteza scheletului benzo[b]tiofenic

Compuii intermediari obinui au fost supui operaiilor de purificare, iar puritatea a fost verificat prin cromatografie n strat subire, folosind ca faz staionar silicagel, iar ca faz mobil acetat de etil i eter de petrol pentru primele reacii i cloroform i metanol pentru ultima reacie. De asemenea, identitatea compuilor sintetizai a fost comfirmat prin metode spectrale (1H RMN, 13C RMN, SM).III.1.1. Sinteza 4-metoxi--[(3-metoxifenil)tio]acetofenonei 19

Fig. 21 4-metoxi--[(3-metoxifenil)tio]acetofenon

La o soluie proaspt preparat de etanol (25 mL), ap (10 mL) i KOH ( 0,028 moli, 1,6 g), la temperatura camerei, s-a adugat 3-metoxibenzentiol (0,022 moli, 3,8 g), iar soluia obinut a fost rcit la 0oC peste care s-a adugat n pictur o soluie format din 2-bromo-4-metoxiacetofenon (0,022 moli, 5 g) n acetat de etil (15 mL), iar reacia a fost lsat sub agitat la temperatura camerei peste noapte. Majoritatea solvenilor au fost ndeprtai la presiune redus, obinndu-se un amestec format dintr-un ulei galben i un solid alb. Acest amestec a fost dizolvat n ap (40 mL) i acetat de etil (40 mL), iar stratul apos a fost extras de dou ori cu porii de acetat de etil (40 mL). Straturile organice reunite au fost splate cu HCl 10%, ap, NaHCO3 saturat, ap i NaCl saturat. Dup uscare pe Na2SO4, solventul a fost evaporat la presiune redus obinndu-se un ulei galben. Uleiul a fost preluat n metanol rece i pstrat la frigider peste noapte, cnd precipit produsul de reacie intermediar. Acesta este filtrat la presiune redus splat cu metanol rece i uscat. n final se obine un solid de culoare alb cu t.t. = 51-53C, randament de reacie 75%. Puritatea compusului a fost verificat prin cromatografie n strat subire, folosind ca faz staionar silicagel, iar ca faz mobil un amestec de EtOAc:EP = 1:6. Rf = 0,45.

Fig. 22 CSS pentru 4-metoxi--[(3-metoxifenil)tio]acetofenon

Formula chimic: C16H16O3S; Masa molecular: 288,36 g/mol; cristale albe; randament 75%; t.t.= 51-53 C; Rf = 0,45. 1H RMN (400 MHz, aceton-d6): = 8,03 (d, 2H, 3J= 9,2 Hz, H2, H6); 7,20 (dd, 1H, 3J= 7,4 Hz, 3J= 8,4 Hz, H5); 7,04 (d, 2H, 3J= 9,2 Hz, H3, H5); 6,97-6,93 (semnale suprapuse, 2H, H2, H6); 6,76 (ddd, 3J= 8,4 Hz; 4J= 2,4 Hz, 4J= 1,2 Hz, 1H, H4); 4,48 (s, 2H, H7); 3,90 (s, 3H, OCH3); 3,78 ppm (s, 3H, OCH3).III.1.2. Sinteza 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tiofenului 20

Fig. 23 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tiofen

Peste 40 g de PPA nclzite la 70oC s-a adugat compusul intermediar sintetizat anterior (4 g, 12,6 moli) timp de 10 minute, soluia devine roie. Dup adugarea sa, amestecul a fost agitat la 70-75oC timp de o or, iar apoi, sub agitare continu, amestecul a fost turnat peste ap cu ghea. Precipitatul galben astfel obinut s-a recuperat prin filtrare i a fost splat cu ap. Produsul a fost purificat prin recristalizri repetate din aceton, randament final al reaciei fiind de 65%. Puritatea compusului a fost verificat prin cromatografie n strat subire, folosind ca faz staionar silicagel, iar ca faz mobil un amestec de EtOAc:EP = 1:6. Rf = 0,42.

Fig. 24 CSS pentru 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tiofen

Formula chimic: C16H14O2S; Masa molecular: 270,35 g/mol; cristale albe; randament 65%; t.t.= 193-194 C; Rf = 0,42.1H RMN (400 MHz, CDCl3): = 7,62 (d, 3J= 6,0 Hz, 1H, H4); 7,60 (d, 3J= 8,0 Hz, 2H, H2, H6); 7,33 (s, 1H, H3); 7,29 (d, 4J= 2,4 Hz, 1H, H7); 6,97 (dd, 3J= 6,0 Hz, 4J= 2,4 Hz, 1H, H5), 6,94 (d, 3J= 8,0 Hz, 2H, H3, H5); 3,88 (s, 3H, OCH3); 3,85 ppm (s, 3H, OCH3).III.1.3. Sinteza 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)-3-bromobenzo[b]tiofenului 21

Fig. 25 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)-3-bromobenzo[b]tiofen

La o soluie de 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)-benzo[b]tiofen (1,49 g, 5,72 mmoli) n 70 L de CHCl3 la 60oC s-a adugat o soluie de brom (0,3 mL) n 10 mL CHCl3 n cantiti mici. Dup adugare, amestecul de reacie s-a rcit la temperatura camerei, iar solventul a fost ndeprtat la presiune redus, rezultnd 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)-3-bromobenzo[b]tiofen sub forma unui solid de culoare alb cu punctul de topire situat ntre 83-85oC, randament 85%. Purificarea compusului a fost realizat prin cromatografie pe coloan, folosind ca faz staionar silicagel, iar ca faz mobil un amestec EtOAc:EP = 1:10. Ca i n cazul compusului anterior, puritatea a fost verificat prin cromatografie n strat subire, folosind ca faz staionar silicagel, iar ca faz mobil un amestec de EtOAc:EP = 1:6. Rf = 0,52.

Fig. 26 CSS pentru 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)-3-bromobenzo[b]tiofen

Formula molecular: C16H13BrO2S; Masa molecular: 349,24 g/mol; cristale albe; randament 85%; t.t.= 83-85 C; Rf = 0,52.1H RMN (400 MHz, CDCl3): = 7,71 (d, 3J= 9,0 Hz, 1H, H4); 7,67 (d, 3J= 8,8 Hz, 2H, H2, H6); 7,25 (d, 4J= 2,4 Hz, 1H, H7); 7,07 (dd, 3J= 9,0 Hz; 4J= 2,4 Hz, 1H, H5); 7,01 (d, 3J= 8,8 Hz, 2H, H3, H5); 3,89 (s, 3H, OCH3); 3,87 ppm (s, 3H, OCH3).III.1.4. Sinteza 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)-3-(4-fluorobenzoil)benzo[b]

tiofenului 23

Fig. 27 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)-3-(4-fluorobenzoil)benzo[b]tiofen

O soluie din derivatul bromurat obinut anterior (200mg, 0,527 mmoli) n 10 mL THF anhidru, a fost rcit la -78oC ntr-o baie de zpad carbonic i aceton. La aceasta s-a adugat BuLi (0,66 mL, 1,6 M n hexan, 1,056 mmoli), urmat de adugarea n pictur a clorurii de 4-fluorobenzoil (0,1 mL, 0,83 mmoli) n 1,5 mL THF anhidru. Apoi amestecul de reacie a fost lsat la agitat peste noapte la temperatura camerei. Amestecul a fost apoi diluat cu 10 mL dietileter, splat cu 10 mL NH4CL saturat i 10 mL de NaHCO3 5%. Dup ce a fost uscat pe Na2SO4, iar solventul a fost ndeprtat la presiune redus, a rezultat 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)-3-(4-fluorobenzoil)-benzo[b]tiofen sub forma unui ulei de culoare galben, a crui puritate a fost verificat prin cromatografie n strat subire, folosind ca faz staionar silicagel, iar ca faz mobil un amestec de EtOAc:EP = 1:9. Rf = 0,33. Randamentul reaciei a fost de 76%. Pentru realizarea acestei reacii a fost necesar utilizarea unui solvent anhidru. Anhidrizarea tetrahidrofuranului a fost realizat prin distilare de pe Na i benzofenon i pstrare sub gaz inert.

Fig. 28 CSS pentru 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)-3-(4-fluorobenzoil)benzo[b]tiofen

Formula chimic: C23H17FO3S; Masa molecular: 392,44 g/mol; ulei galben; randament 76%; Rf = 0,33.1H RMN (250 MHz, CDCl3): = 7,75 (dd, 3JH,H= 8,5 Hz, 4JH,F= 5,5 Hz, 2H, H2, H6); 7,57 (d, 3J= 8,75 Hz, 1H, H4); 7,27-7,22 (semnale suprapuse, 3H, H7, H2, H6); 6,94 (dd, 3J= 8,75 Hz; 4J= 2,2 Hz, 1H, H5); 6,87 (dd, 3JH,H=3JH,F= 8,5 Hz, 2H, H3, H5); 6,68 (d, 3J= 8,75 Hz, 2H, H3, H5); 3,83 (s, 3H, OCH3); 3,68 ppm (s, 3H, OCH3).III.1.5. Sinteza 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tien-3-il]-[4-(N-Boc-amino)-[2-(1-piperidinil)etoxi]fenil]metanonei 25

Fig. 29 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tien-3-il]-[4-(N-Boc-amino)-[2-(1-piperidinil)etoxi]fenil]metanona

Pentru ataarea nucleului piperidinic la nucleul benzo[b]tiofenic, derivatul florurat obinut anterior a fost supus unei reacii de eterificare cu un derivat piperidinic.La o soluie de NaH (16,5 mg, 0,4125 mmoli) n DMF (3 mL) a fost adugat derivatul piperidinic (33 mg, 0,25 mmoli) n pictur. Dup aceasta a avut loc adugarea unei soluii din derivatul florurat obinut anterior (25 mg, 0,04 mmoli) n 2 mL DMF anhidru, iar amestecul de reacie a fost agitat la temperatura camerei timp de 15 minute. Amestecul a fost apoi turnat n ap (20 mL), extras cu acetat de etil (3 X 20 mL) i uscat pe Na2SO4. Solventul a fost evaporat la presiune redus , iar compusul obinut, sub forma unui solid de culoare alb, a fost purificat prin cromatografie pe coloan. Pentru aceasta s-a utilizat ca faz staionar silicagel, iar ca faz mobil un amestec CHCl3:MeOH = 10:1. De asemenea, puritatea acestui compus a fost verificat prin cromatografie n strat subire, folosind aceleai faze ca n cazul cromatografiei pe coloana. Rf obinut a fost 0,35. Randamentul reaciei a fost de 92%. Pentru buna desfurare a acestei reacii a fost utilizat un solvent anhidru, anhidrizarea dimetilformamidei realizndu-se prin distilare la presiune redus de pe P2O5 i pstrare sub gaz inert.

Fig. 30 CSS pentru 6-metoxi-2-(4-metoxifenil)benzo[b]tien-3-il]-[4-(N-Boc-amino)-[2-(1-piperidinil)etoxi]fenil]metanona

Formula chimic: C35H40N2O6S; Masa molecular: 616,77 g/mol; cristale albe; randament 92%; Rf = 0,35.1H RMN (250 MHz, CDCl3): = 7,99 (s, 1H, NH); 7,73 (d, 3J= 8,75 Hz, 2H, H2, H6); 7,50 (d, 3J= 9,0 Hz, 1H, H4); 7,32 (d, 3J= 9,0 Hz; 2H, H2, H6); 7,30 (d, 4J= 2,5 Hz; 1H, H7); 6,93 (dd, 3J= 9,0 Hz; 4J= 2,5 Hz, 1H, H5); 6,78-6,69 (semnale suprapuse, 4H, H3, H5, H3, H5); 4,04 (t, 3J= 6,25 Hz, 2H, H8); 3,86 (s, 3H, OCH3); 3,73 (s, 3H, OCH3), 3,59 (t, 3J= 6,25 Hz, 2H, H9); 2,73 (t (dd suprapus), 2J= 3J= 5,5 Hz, 2H, H10, H14, -CHH); 2,52 (t, (dd suprapus), 2J= 3J= 5,5 Hz, 2H, H10, H14, -CHH); 2,19 (td, 2J= 5,5 Hz, 3J= 2,3 Hz, 2H, H11, H13, -CHH ); 1,94-1,89 (semnale suprapuse, 3H, H11, H13, -CHH i H12); 1,43 ppm (s, 9H, t-Bu).

MS (ES+): m/z: 617,1 [M+H]+.III.2. Asamblarea regiunii de legare (spacer-ului), grupei reactive i a unitii structurale funcionalizat cu tripl legtur din structura sondei de afinitateAsamblarea elementelor constitutive ale sondei de afinitate pentru receptorul estrogenic a fost realizat prin sintez de peptide pe suport solid.Sinteza de peptide pe suport solid are ca principiu general un ciclu repetativ de cuplare-splare-deprotejare-splare. Captul N-terminal liber al unei peptide ataat pe un suport solid este cuplat cu captul C-terminal al unui aminoacid protejat la captul N-terminal. Acesta este apoi deprotejat, formnd un nou capt N-terminal liber cruia i se poate ataa un nou aminoacid. Dup fiecare reacie se pot realiza cicluri de splare pentru ndeprtarea reactivilor n exces, peptida de interes rmnnd legat covalent de rina insolubil folosit ca suport solid.

Exist dou tehnici de sintez de peptide n faz solid (SPPS solid phase peptide synthesis), n funcie de gruparea cu care se realizeaz protejarea: tehnica Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonil) i tehnica Boc (ter-butoxicarbonil).

Fig. 31 Structura gruprilor amino protectoare utilizate n SPSS

Sinteza de peptide n faz solid decurge pornind de la captul C-terminal ctre captul N-terminal. Captul N-terminal al aminoacizilor monomeri poate fi protejat cu una din cele dou grupri prezentate anterior.

Tehnica Fmoc de sintez a peptidelor pe supor solid permite o modalitate de deprotejare mai blnd. Acest metod utilizeaz o baz, de obicei piperidin n DMF pentru a ndeprta gruparea Fmoc, expunnd gruparea amino pentru un nou aminoacid.

Fig. 32 Structura rinii Wang

Odat cu dezvoltarea strategiei Fmoc au fost create diferite rini ca suporturi solide pentru sinteza de peptide. Un astfel de exemplu este dat de rina Wang (compusul 28, Fig. 32), care este cel mai des folosit pentru peptide cu acid carboxilic la captul C-terminal.Dac n schimb se dorete obinerea unui capt C-terminal sub form de amid, atunci se utilizeaz rina Rink (compusul 29, Fig. 33).

Fig. 33 Structura rinii Rink

Desprinderea final a proteinei de pe rin precum i ndeprtarea grupelor protectoare se realizeaz cu acid trifluoracetic (TFA).

Fig. 34 Schema general de sintez de peptide pe suport solid

Pentru scopul nostru, strategia Fmoc este de preferat, iar ca rin s-a ales o rin Wang, avnd grefate grupe reactive hidroxil. Legarea de rin se realizeaz prin formarea unei grupri esterice cu primul aminoacid ataat. Tierea de pe rin se realizeaz prin hidroliza gruprii esterice, dnd astfel posibilitatea obinerii de peptide cu grupe carboxil libere la captul C-terminal (Fig. 34).Peptida 33 (Fig. 36) conine patru resturi de aminoacizi sintetici: aminoacidul derivat de la tetraetilenglicol, aminoacidul funcionalizat cu tripl legtur i aminoacidul derivat de la 3,4-dihidroxifenil alanin (L-DOPA) (Fig. 35) i a fost sintetizat prin strategia Fmoc pe o rin Wang, n acord cu schema general de sintez prezentat n Fig. 34. Toi aminoacizi nenaturali au fost folosii, pentru sinteza peptidei, protejai la grupele funcionale amino cu grupa Fmoc.

Fig. 35 Structura chimic a aminoacizilor utilizai pentru sinteza peptidei 33

Peptida brut a fost tiat de pe rin avnd loc n acela timp i ndeprtarea grupelor hidroxi protectoare, apoi analizat prin cromatografie de lichide de nalt performan (high performance liquid chromatography-HPLC) pe o coloan C18 cu faz invers, utiliznd un gradient liniar 5%-80% ap (0,1% TFA)/acetonitril timp de 15 minute, cu detecie n UV la 230 nm, Rt=8,25 min. Ulterior, peptida a fost purificat prin HPLC, utiliznd o coloan preparativ C18 cu faz invers cu acelai gradient. n Fig. 36 este prezentat cromatograma analitic a peptidei purificate 33.

Fig. 36 Structura chimic a peptidei sintetizate 33 i cromatograma analitic RP-HPLC a peptidei pure 33

Spectrul ES-MS al peptidei 33 prezint picurile corespunztoare ionului molecular [M+H]+ la m/z 872,3 ct i picurile corespunztoare ionilor [M+Na]+ la m/z 894,5 i [M+K]+ la m/z 910,4.

Procedura de sintez a peptidei 33100 mg de rina Wang cu (0,93 mmol/g funciuni reactive) a fost umflat n DMF pentru 2 ore. Aminoacidul Fmoc protejat obinut de la tetraetilenglicolul 30 (2 eq, 53 mg, 112 mol), HBTU (1,96 eq, 54 mg, 141 mol), HOBt (1,96 eq, 19 mg, 141 mol) i DIPEA (12 eq, 74 L, 140 mg, 432 mol) au fost dizolvai n 1,5 mL DMF i agitai mpreun cu rina pentru 2 ore, urmat de splare cu DMF i deprotejarea grupelor amino prin tratare timp de 2x10 minute cu o solutie de 20% piperidin n DMF. Aminoacidul sintetizat 32 (2 eq, 22 mg, 56 mol), HBTU (1,96 eq, 54 mg, 141 mol), HOBt (1,96 eq, 19 mg, 141 mol) i DIPEA (12 eq, 74 L, 140 mg, 432 mol) au fost dizolvai n 1,5 mL DMF i agitai cu rina pentru 2 ore, urmat de splare cu DMF i deprotejarea grupelor amino. Al treilea aminoacid adugat pe rin a fost tot aminoacidul 30, urmnd aceeai procedur. Ultimul aminoacid, derivatul de L-DOPA 31 (2 eq, 120 mg, 186 mol), HBTU (1,96 eq, 54 mg, 141 mol), HOBt (1,96 eq, 19 mg, 141 mol) i DIPEA (12 eq, 74 L, 140 mg, 432 mol) au fost dizolvai n 1,5 mL DMF, iar amestecul a fost turnat peste rin i agitat timp de 2 ore, urmat de splare, deprotejarea grupelor amino i acetilarea grupelor amino prin tratare cu AcOH timp de 2 ore. Monitorizarea reaciilor de cuplaj peptidic a fost realizat dup ataarea fiecrui reziduu prin realizarea testului Kaiser (negativ). (Testul Kaiser: soluia 1: 5 g ninhidrin n 100 mL etanol,soluia 2: 80 g fenol n 20 mL etanol, soluia 3: 2 mL 0,00 1M KCN n 98 mL piridin. Resultate: rina i soluia albastr: positiv, rina i soluia incolor sau slab glbuie: negativ). Rina a fost splat cu 3x3 mL DMF, 1x3 mL MeOH i 3x3 mL CH2Cl2. Produsul rezultat a fost detaat de pe rin prin utilizarea unui mL amestec de rupere (95% TFA, 2,5% ap, 2,5% triisopropilsilan) i agitare pentru 2 ore. Precipitarea produsului s-a fcut cu eter etilic rece. Rina a fost splat cu 1,3 mL TFA i soluia a fost colectat n eter etilic rece. Solidul a fost centrifugat, separat de eter i dizolvat ntr-o cantitate minim de acetonitril-ap (0,1% TFA). Produsul rezultat a fost analizat pe o coloan C18 prin RP-HPLC utiliznd un gradient 5%-80% ap (0,1% TFA)/acetonitril, iar ulterior a fost purificat pe o coloan preparativ C18 utiliznd acelai gradient. Fraciile ce conin produsul au fost unite, ngheate i liofilizate. Identitatea produsului a fost confirmat prin ES-MS.

Peptida HOOC-Teg-Glu()-Teg-DOPA 33

Formula molecular: C39H61N5O17; Masa molecular: 871,92 g/mol, solid alb, randament 61%, Rt=8,25 min (RP-C18, 5%-80% ap (0,1%TFA)/acetonitril) n 15 minute.

III.3. Generaliti privind substanele, tehnicile i aparatele utilizate n sintezele realizateSubstanele chimice necesare pentru realizarea sintezelor au fost procurate de la Aldrich, Fluka i Merck i au fost folosite fr alte purificri.

Solvenii utilizai n sinteze am fost purificai dup ghidul Vogels Textbook of Practical Organic Chemistry. Astfel, tetrahidrofuranul (THF) i toluenul au fost distilai sub curent de gaz inert dup prealabila refluxare n prezen de benzofenon i sodiu metalic, clorura de metilen (DCM) a fost distilat de pe hidrur de calciu, iar dimetilformamida (DMF) de pe pentaoxid de fosfor.Cromatografia n strat subire (CSS) a fost realizat pe plcue cromatografice Merck Kieselgel 60 F254 prin eluie cu solveni adecvai amestecului de substane studiat, iar vizualizarea s-a realizat de cele mai multe ori cu ajutorul lmpii UV la 254 nm.Temperaturile de topire ale compuilor sintetizai s-au realizat prin utilizarea unui aparat electric cu capilare pentru determinarea temperaturii de topire tip STUART S\MP3 i nu au fost corectate.Spectrele de rezonan magnetic nuclear au fost nregistrate la temperatura camerei pe un aparat JEOLLambda 400, Bruker DPX-400, opernd la 400 MHz pentru 1H i 100 MHz pentru 13C i utiliznd ca solvent DMSO-d6, CDCl3 i CD3OD, CD3COCD3 i TMS ca standard intern.

Deplasrile chimice ale protonilor n spectrele de rezonan magnetic nuclear au fost raportate n pri per milion. Probele au fost preparate n tuburi cu diametru de 5 mm utiliznd 0,5 mL de solvent deuterat. Multiplicitile semnalelor au fost abreviate dup cum urmeaz: br-broad, s-singlet, d-dublet, t-triplet, q-cvartet i m-multiplet.

Spectrele de mas au fost nregistrate pe un spectrometru Finnigan LCQ prin tehnica ESI. Rina Wang, aminoacizii, precum i agenii de cuplare pentru sinteza de peptide au fost procurai de la NovaBiochem, Merck, Aldrich. N,N-Dimetilformamida, diclorometanul i metanolul pentru sinteza de peptide au fost procurai de la WVR Germania i au fost utilizai fr purificare.

Apa necesar pentru RP-HPLC a fost obinut utiliznd un sistem Millipore Mili Q Biocel, iar acetonitrilul de puritate analitic a fost achiziionat de la WVR Germania. Analizele RP-HPLC au fost realizate pe un instrument VARIAN Pro Star 210 cu detector n UV utiliznd o coloan analitic C18 VYDAC (300 , 4.6 mm 150 mm, 5 m, 1 mL/min) i un eluent cu gradient liniar ap (0,1% TFA)/ acetonitril. Coloanele analitic i preparativ (C18 VYDAC (300 , 20 mm 250 mm, 10 m, 5 mL/min)) au fost utilizate pentru separarea compuilor peptidici pe acelai instrument. Aparatul Christ Alpha 1-4 LSC a fost utilizat pentru liofilizarea peptidelor.Concluzii i perspective Am observat importana major pe care o posed modulatorii selectivi ai receptorilor estrogenici n tratarea i prevenirea diferitor afeciuni, putnd astfel afirma c sinteza i studiul activitii compuilor acestei clase reprezint un domeniu de mare interes.

Modulatorii selectivi ai receptorilor estrogenici (SERM) sunt compui ce au abilitatea de a aciona ca agoniti n anumite esuturi i antagoniti n altele, prin legarea la receptorii estrogenici, fiind folosii n cazul dereglrilor hormonale ce pot aprea n organism, ce pot determina apariia diferitor afeciuni.

Agonitii posed afinitate pentru receptori i activitate intrinsec, prin urmare la legarea unui agonist are loc activarea ER i apariia unui rspuns biologic.

Antagonitii posed afinitate pentru receptori, dar nu posed activitate intrinsec, prin urmare ei se leag la receptori i i blocheaz, mpiedincnd astfel legarea altor agoniti.

Legarea SERM la receptorii estrogenici se realizeaz prin intermediul unor legturi labile, necovalente, care conduc la formarea unui complex ligand-receptor i astfel la realizarea unui rspuns celular, prin urmare se consider c ele sunt motivul pentru care activitatea lor este una sczut. innd cont de toate acestea, ne propunem sinteza unei sonde chimice de afinitate care s pstreze proprietatea de legare necovalent la receptorii estrogenici pe care o prezint raloxifenul, dar care s realizeze i o legare covalent.Studiul proteomului prin intermediul sondelor chimice poate conduce la identificarea i validarea unor noi inte pentru medicamente i la construirea de medicamente specifice datelor genetice individuale.

n cadrul acestei lucrri am propus sinteza unei sonde chimice de afinitate pentru receptorul estrogenic, bazat pe structura raloxifenului care, pe lng interacia necovalent cu receptorii estrogenici, s realizeze i o legare covalent la acetia. Astfel, am realizat sinteza regiunii de afinitate reprezentat de scheletul benzo[b]tiofenic. Pentru aceasta am reuit s sintetizm compuii intermediari necesari, care au fost apoi purificai i caracterizai prin metode spectrale.

Ca perspective ne propunem ca n etapa urmtoare s realizm cuplajul peptidic n soluie pentru obinerea sondei chimice de afinitate pentru receptorul estrogenic. De asemenea, n cele ce urmeaz vom realiza studiul activitii biologice a acestei sonde chimice.

Cravatt B.F., Sorensen E.J., Curr. Opin. Chem. Biol., 2000, 4, 663.

Evans M.J., Cravatt B.F., Chem. Rev., 2006, 106, 3279.

Thornberry N.A., Peterson E.P., Zhao J.J., Howard A.D., Griffin P.R., Chapman K.T., Biochem., 1994, 33, 3934.

Greenbaum D., Medzihradszky K.F., Burlingame A., Bogyo M., Chem. Biol., 2000, 7, 569.

Therrien C., Levesque R.C., FEMS Microbiol. Rev., 2000, 24, 251.

Betley J.R., Cesaro-Tadic S., Mekhalfia A., Rickard J.H., Denham H., Partridge L.J., Pluckthun A., Blackburn G.M., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2002, 41, 775.

Gygi S.P., Rist B., Gerber S.A., Turecek F., Gelb M.H., Aebersold R., Nat. Biotechnol., 1999, 17, 179.

Colman R.F., Annu. Rev. Biochem., 1983, 52, 67.

Borodovsky A., Kessler B.M, Casagrande R., Overkleeft H.S., Wilkinson K.D., Pleogh H., EMBO J., 2001, 20, 5187.

Borodovsky A., Ovaa H., Nagamalleswari K., Tudeviin G., Wilkinson K.D., Pleogh H., Kessler B.M., Chem. Biol., 2002, 9, 1149.

Wilchek M., Bayer E.A., Methods Enzymol., 1990, 184, 5.

Patricelli M.P., Giang D.K., Stamp L.M., Burbaum J.J., Proteomics, 2001, 1, 1067.

Speers A.E., Cravatt B.F., Chem. Biol., 2004, 11, 535.

Faleiro L., Kobayashi R., Fearnhead H., Lazebnik Y., EMBO J., 1997, 16, 2271.

Baruch A., Greenbaum D., Levy E.T., Nielsen P.A., Gilula N.B., Kumar N.M., Bogyo M., J. Biol. Chem., 2001, 276, 28999.

Greenbaum D.C., Baruch A., Grainger M., Bozdech Z., Medzihradszky K.F., Engel J., Holder A.A., De Risi J., Bogyo M., Science, 2002, 298, 2002.

Jessani N., Liu Y., Humprey M., Cravatt B.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 10335.

Hopkins A.L., Groom C.R., Nat. Rev. Drug Discov., 2002, 1, 727.

Jeffery D.A., Bogyo M., Curr. Opin. Biotechnol., 2003, 14, 87.

Sadakane Y., Hatanaka Y., Anal. Sciences, 2006, 22, 209.

Liu B., Burdine L., Kodadek T., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 15228.

Burdine L., Gillette T.G., Lin H-J., Kodadek T., J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 11442.

Liu B., Archer C.T., Burdine L., Gillette T.G., Kodadek T., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 12348.

Umanah G.K.E., Son C., Ding F., Naider F., Becker J.M., Biochem., 2009, 48, 2033.

Tantama M., Lin W-C., Licht S., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 15766.

Li X., Cao J-H., Li Y., Rondard P., Zhang Y., Yi P., Liu J-F., Nan F-J., J. Med. Chem., 2008, 51, 3057.

Golan D.E., Tashjian A.H. Jr., Armstrong E.J., Armstrong A.W., Principles of Pharmacology:The Pathophysiologic Basis of Drug Therapy, 2008, ediia a II-a, editura Lippincott Williams & Wilkins, 22.

Deroo B.J., Korach K.S., J. Clin. Invest., 2006, 116, 561.

Jensen E.V., Jordan V.C., Clin. Cancer Res., 2003, 9, 1980.

Kuiper G.G., Enmark E., Pelto-Huikko M., Nilsson S., Gustafsson J.A., Proc. Natl. Acad. Sci., 1996, 93, 5925.

Kuiper G.G., Carlsson B., Grandien K., Enmark E., Haggblad J., Nilsson S., Gustafsson J.A., Endocrinology, 1997, 138, 863.

Korach K.S., Science, 1994, 266, 1524.

Gradishar W.J., Jordan V.C., J. Clin. Oncol., 1997, 15, 840.

Bourguet W., Germain P., Gronemeyer H., TiPS, 2000, 21, 381.

Green S., Walter P., Kumar V., Krust A., Bornert J.M., Argos P., Chambon P., Nature, 1986, 320, 134.

36 Kumar V., Green S., Stack G., Berry M., Jin J.R., Chambon P., Cell, 1987, 51, 941.

Kumar V., Green S., Staub A., Chambon P., EMBO J., 1986, 5, 9931.

Riggs B.L., Hartmann L.C., N. Egl.l J. Med., 2003, 348, 618.

HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Arun%20B%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Arun B., HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Anthony%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Anthony M., HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dunn%20B%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Dunn B., HYPERLINK "javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Expert%20Opin%20Pharmacother.');" \o "Expert opinion on pharmacotherapy." Expert Opin. Pharmacoter., 2002, 3, 681.

Fisher B., Redmond C., J. Natl. Cancer Inst., 1991, 83, 127.

King C.M., Carcinogenesis, 1995, 16, 1449.

Gauthier S., Caron B., Cloutier J., Dory Y.L., Favre A., Larouche D., Mailhot J, Ouellet C., Schwerdtfeger A., Leblanc G., Martel C., Simard J., Merand Y., Belanger A., Labrie C., Labrie F., J. Med. Chem., 1997, 40, 2117.

Croxtall J.D.,Plosker G.L, HYPERLINK "http://www.ingentaconnect.com/content/adis/dgs;jsessionid=16dnrq57b5ftq.alice" \o "Drugs" Drugs, 2009, 69, 339.

Lu P., Schrag M.L., Slaughter D.E., Raab C.E., Shou M., Rodrigues A.D., Drug Metab. Dispos., 2003, 31, 1352.

Bradley D. A., Godfrey A.G., Schmid C. R., Tetrahedron Lett., 1999, 40, 5155.

Bryant H. U., Dere W. H., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1998, 217.

Black L.J., Jones C.D., Clark J.H., Clemens J.A., Breast Cancer Res Treat., 1982, 3, 279.

Khovidhunkit W., Shoback D.M., Ann. Intern. Med., 1999, 130, 431.

Phillips C., NCI Cancer Bulletin, 2006, 3, 1.

HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Grady%20D%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Grady D., HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cauley%20JA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Cauley J.A., HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Geiger%20MJ%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Geiger M.J., HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kornitzer%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Kornitzer M., HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mosca%20L%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Mosca L., HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Collins%20P%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Collins P., HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wenger%20NK%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Wenger N.K., HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Song%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Song J., HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mershon%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Mershon J., HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Barrett-Connor%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract" Barrett-Connor E., J. Natl.Cancer Inst., 2008, 100, 854.

Dowers T.S., Qin Z.H.,Thatcher G.R.J., Bolton J.L., Chem.Res.Toxicol, 2006, 19, 1125.

Schmid C.R., Sluka J.P., Duke K.M., Glasebrook A.W., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 523.

Grese T.A., J. Med. Chem., 1997, 40, 146.

Jordan V.C., J. Natl. Cancer Inst., 1998, 90, 967.

Bolton J. L., Chem. Res. Toxicol., 2005, 18, 1485. Bolton J. L., Chem. Res. Toxicol., 2006, 19, 1125. Bolton J. L., Chem. Res. Toxicol., 2007, 20, 1676.

Furniss B.S., Hannaford A.J., Smith P.W.G., Thatchell A.R., Vogels Textbook of Practical Organic Chemistry, 1989, ediia a V-a, editura Longman Scientific & Technical, John Wiley & Sons.

PAGE 25

_1369831717.cdx

_1369837474.cdx

_1369838457.unknown

_1369841544.unknown

_1369842007.cdx

_1369841484.unknown

_1369838770.cdx

_1369837652.cdx

_1369837739.unknown

_1369838456.cdx

_1369838160.cdx

_1369837685.unknown

_1369837507.cdx

_1369837261.cdx

_1369837390.cdx

_1369837434.cdx

_1369837341.cdx

_1369837174.unknown

_1369837227.cdx

_1369836956.cdx

_1369829612.cdx

_1369829614.cdx

_1369829615.cdx

_1369829613.cdx

_1369829608.unknown

_1369829610.cdx

_1369829611.cdx

_1369829609.unknown

_1369829606.cdx

_1369829607.unknown

_1369829604.cdx

_1369829605.cdx

_1338204626.unknown